CN103025740A

CN103025740A - 蛋白酪氨酸激酶活性的抑制剂及其治疗眼科疾病的用途

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Publication number: CN103025740A
Application number: CN2011800297351A
Authority: CN
Inventors: S.雷佩尔; 战莉洁; S.W.克拉里奇; F.雷佩尔; F.高德特; A.韦斯伯格
Original assignee: Methylgene Inc
Current assignee: Methylgene Inc
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: US20110257100A1; EP2563795A4; CN103025740B; AU2011241422A1; WO2011127567A1; CA2796008A1; AR080871A1; US20110257175A1; US8906852B2; UA108878C2; JP2013525286A; EP2563794A4; MX2012012031A; SG184882A1; NZ602954A; TW201204735A; JP2013523846A; US20140315801A1; MY157319A; KR20130058006A

Abstract

本发明涉及作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的化合物及其组合物。所述化合物用于治疗眼科疾病、障碍或病症的方法。所述化合物具有式(I)、(II)或(III)的结构，其中R=(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)。

Description

蛋白酪氨酸激酶活性的抑制剂及其治疗眼科疾病的用途

发明背景

相关申请

本申请要求美国临时申请序列号61/324,803(2010年4月16日提交)的优先权。将上述参考申请的整个教导引入本文中作为参考。

发明领域

本发明涉及抑制蛋白酪氨酸激酶活性的化合物。具体地，本发明涉及以下化合物，其抑制生长因子受体的蛋白酪氨酸激酶活性，从而导致受体信号的抑制，例如导致VEGF受体信号传导和HGF受体信号传导的抑制。更具体地，本发明涉及一种治疗眼科疾病、障碍或病症的化合物、组合物和方法。

现有技术的概述

可以将酪氨酸激酶分类为生长因子受体(例如EGFR、PDGFR、FGFR和erbB2)或非受体(例如c-src和bcr-abl)激酶。受体类型酪氨酸激酶构成大约20个不同的亚家族。非受体类型酪氨酸激酶构成很多亚家族。这些酪氨酸激酶具有不同的生物活性。受体酪氨酸激酶是大的跨细胞膜的酶，并且具有对生长因子的胞外结合区域、跨膜结构域和胞内部分，该胞内部分具有使蛋白中特异性酪氨酸残基磷酸化的激酶的功能，并因此影响细胞增殖。异常或不合适的蛋白激酶活性可以促进与这种异常激酶活性有关的疾病状态的产生。

例如，酪氨酸激酶还促进眼科疾病、障碍和病症(例如年龄相关的黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病(DR))的病理。这种疾病所造成的失明与视网膜新生血管形成的异常有关。血管生成是某些正常生理过程(例如胚胎发生和伤口愈合)的重要组成部分，但异常的血管生成会促进一些病理障碍。新血管的形成是由生长因子(例如VEGF和HGF)调节的，所述生长因子活化受体酪氨酸激酶，引起信号传导途径的起始，导致血浆渗漏成为斑点，引起视力丧失。因此，激酶是治疗与新生血管形成有关的眼病的有吸引力的靶点。

因此，还需要开发控制眼睛的新生血管生成的策略，和开发治疗眼科疾病的策略。

在这里，我们公开了作为蛋白酪氨酸激酶活性的有效抑制剂的小分子。

发明概述

本发明提供新化合物及其组合物。本发明还提供一种用所述化合物或其组合物治疗眼科疾病、障碍或病症的方法。本发明的化合物是激酶活性的抑制剂，所述激酶活性例如：蛋白酪氨酸激酶活性，例如生长因子受体的蛋白酪氨酸激酶活性，或例如受体型酪氨酸激酶信号传导。

在第一方面中，本发明提供具有以下结构的化合物

及其水合物、溶剂合物、可药用盐、前药和复合物，及其外消旋混合物与非外消旋(scalemic)混合物，非对映异构体和对映异构体。

在第二方面中，本发明提供了组合物，其包含本发明的化合物和可药用载体、赋形剂或稀释剂。

在第三方面中，本发明提供了一种治疗眼科疾病、障碍或病症的方法，该方法包括：向有此需要的患者给药治疗有效量的本发明的化合物，或治疗有效量的按照本发明的组合物。在该方面的一些实施方案中，所述疾病是由脉络膜的血管生成所引起的疾病。在该方面的一些实施方案中，所述疾病是年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病或视网膜水肿。在该方面的一些实施方案中，所述患者是哺乳动物，例如灵长类，例如人。

在第四方面中，本发明提供本发明的化合物在制备用于治疗眼科疾病、障碍或病症的药物中的用途。在该方面的一些实施方案中，所述眼科疾病、障碍或病症是由脉络膜的血管生成所引起的。在该方面的一些实施方案中，所述疾病是年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病或视网膜水肿。

在第五方面中，本发明提供本发明的化合物或其组合物在治疗眼科疾病、障碍或病症中的用途。在该方面的一些实施方案中，所述眼科疾病、障碍或病症是由脉络膜的血管生成所引起的。在该方面的一些实施方案中，所述疾病是年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病或视网膜水肿。

上文仅仅总结了本发明的一些方面，本质上并不是用来加以限制。下面将更充分地公开这些方面及其它方面和实施方案。

发明详述

本发明提供新化合物及其组合物。本发明还提供用所述化合物或其组合物治疗眼科疾病、障碍或病症的方法。在本文中涉及的专利和科学文献反映本领域技术人员可以获得的知识。本文引用的授权的专利、公开的专利申请和参考文献以如同每篇具体地和单独地指出的程度在本文中引入作为参考。在不一致的情况下，以本公开为准。

术语“激酶抑制剂”和“激酶活性的抑制剂”，等等，用于鉴定能够与激酶相互作用并抑制其酶活性的化合物。

术语“抑制激酶酶活性”是指降低激酶从供体分子(例如ATP)上转移磷酸基至特异靶分子(底物)的能力。例如，激酶活性的抑制可以至少为大约10%。在本发明的一些实施方案中，激酶活性的这种降低至少为大约25%，或者至少大约50%，或者至少大约75%，或者至少大约90%。在其它实施方案中，激酶活性降低至少95%，或者至少99%。IC₅₀值是可将激酶活性降低至未受抑制的酶活性的50%的激酶抑制剂的浓度。

术语“VEGF受体信号传导的抑制剂”用于鉴定具有本文所定义结构的化合物，其能够与VEGF受体相互作用并能够抑制VEGF受体的活性。在一些实施方案中，这种降低至少为大约50%，或者至少大约75%，或者至少大约90%。在一些实施方案中，活性降低至少95%，或者至少99%。

术语“抑制有效量”代表足够导致抑制激酶活性的剂量。构成“抑制有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、激酶等等而有所不同。抑制有效量通常可以由本领域普通技术人员来确定。激酶可以在细胞中，其也可以在多细胞有机体中。多细胞有机体可以是：例如动物，例如，哺乳动物，例如，人。

在示例性的实施方案中，这种抑制是特异性抑制，即，激酶抑制剂降低激酶从供体分子(例如ATP)上转移磷酸基至特异靶分子(底物)的能力，其浓度比产生其它无关生物学效应所要求的抑制剂的浓度低。例如，产生无关生物学效应所要求的浓度比激酶抑制活性所需要的抑制剂浓度高至少2倍，或者至少5倍，或者至少10倍，或者至少20倍。

因此，本发明提供了一种抑制激酶活性的方法，该方法包括：使激酶与抑制有效量的本发明的化合物或组合物接触。在一些实施方案中，激酶在有机体中。因此，本发明提供了一种抑制有机体中激酶活性的方法，该方法包括：给予有机体抑制有效量的本发明的化合物或组合物。在一些实施方案中，有机体是哺乳动物，例如驯养的哺乳动物。在一些实施方案中，有机体是人。

本文使用的术语“治疗有效量”是本发明化合物的量，当给予患者时，该量可以引起所需要的治疗效果。治疗效果取决于所治疗的疾病和所需要的结果。因此，治疗效果可以是疾病状态的治疗。进一步地，治疗效果可以是抑制激酶活性。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重程度、待治疗患者的年龄等等而有所不同。治疗有效量通常可以由本领域普通技术人员来确定。

在一些实施方案中，治疗效果是治疗眼科疾病、障碍或病症。短语“治疗眼科疾病、障碍或病症”是指本发明的化合物治疗下列疾病的能力：(a)脉络膜的血管生成引起的疾病、障碍或病症，包括但不限于年龄相关的黄斑变性，或(b)糖尿病性视网膜病或视网膜水肿。在术语“治疗眼科疾病、障碍或病症”的一些实施方案中，意指本发明的化合物治疗以下疾病的能力：渗出性和/或炎性眼科疾病、障碍或病症，与视网膜血管渗透性和/或完整性削弱有关的病症，与导致灶性出血的视网膜血管破裂有关的病症，眼底(the back of the eye)疾病，视网膜疾病，或眼前(the front of the eye)疾病，或其它眼科疾病、障碍或病症。

在一些实施方案中，眼科疾病、障碍或病症包括但不局限于：年龄相关的黄斑变性(ARMD)、渗出性的黄斑变性(亦称“湿性”或新生血管性年龄-相关的黄斑变性(湿性-AMD)、黄斑水肿、老年黄斑盘状变性、黄斑囊样水肿、眼睑水肿、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病、急性黄斑视神经网膜病、中心浆液性脉络膜视网膜病、脉络膜视网膜病、脉络膜的新生血管形成、新生血管性黄斑病、新生血管性青光眼、梗阻性的动脉和静脉视网膜病(例如视网膜静脉堵塞或视网膜动脉阻塞)、中心视网膜静脉堵塞、弥散性血管内凝血、视网膜分支静脉阻塞、高血压性的眼底改变、眼睛缺血性综合症、视网膜动脉小动脉瘤、Coat病、近窝区的毛细血管扩张、半侧视网膜静脉阻塞、视神经乳头病(Papillophlebitis)、中心视网膜动脉堵塞、视网膜分枝动脉堵塞、颈动脉疾病(CAD)、霜样树枝状视网膜血管炎、镰状细胞视网膜病及其它血红蛋白病、血管样纹、以病原结果(例如疾病)形式存在的黄斑水肿(例如，糖尿病性黄斑水肿)、眼外伤或眼睛手术、由例如创伤、损伤造成的视网膜局部缺血或退化、葡萄膜炎、虹膜炎、视网膜血管炎、眼内炎、全眼球炎、转移性眼炎、脉络膜炎、视网膜色素上皮炎、结膜炎、睫状体炎、巩膜炎、巩膜外层炎、视神经炎、眼球后的视神经炎、角膜炎、睑炎、渗出性视网膜脱离、角膜溃疡、结膜溃疡、慢性钱币形角膜炎、Thygeson角膜炎、进行性角膜侵蚀性溃疡、由细菌或病毒感染或眼睛手术所引起的眼睛炎性疾病、由对眼睛的物理伤害所引起的眼睛炎性疾病、由眼睛炎性疾病所引起的症状(包括发痒、潮红、水肿和溃疡)、红斑、渗出性多形红斑、结节性红斑、环形红斑、硬化病、皮炎、急性自发水肿、喉水肿、声门水肿、声门下喉炎、支气管炎、鼻炎、咽炎、窦炎、喉炎或中耳炎。

在一些实施方案中，所述眼科疾病、障碍或病症为(a)脉络膜的血管生成引起的疾病、障碍或病症，包括但不限于年龄相关的黄斑变性，或(b)糖尿病性视网膜病或视网膜水肿。

在一些实施方案中，眼睛疾病、障碍或病症包括但不局限于：年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病、视网膜水肿、视网膜静脉堵塞、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病变、视网膜色素性变性、葡萄膜炎、角膜新生血管形成或增殖性视网膜病变。

在一些实施方案中，眼睛疾病、障碍或病症是年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病或视网膜水肿。

因此，本发明提供了一种治疗动物的眼睛疾病、障碍或病症的方法，该方法包括：给予需要这种治疗的动物治疗有效量的本发明的化合物或组合物。在一些实施方案中，动物是哺乳动物，例如驯养的哺乳动物。在一些实施方案中，动物是人。

在一些实施方案中，治疗效果是抑制视网膜新生血管形成。短语“抑制视网膜新生血管形成”是指本发明的化合物阻止眼睛中血管生长的能力，例如，源于视网膜静脉的新血管，例如，阻止源于视网膜静脉的新血管的生长和沿着视网膜的内部(玻璃体)表面的扩展。

在示例性的实施方案中，与非接触的血管的视网膜新生血管形成相比，视网膜新生血管形成被阻止至少25%，或者至少50%，或者至少75%，或者至少90%，或者至少95%，或者至少99%。或者，视网膜新生血管形成得到100%抑制(即，血管的大小或数量没有增加)。在一些实施方案中，与未接触抑制剂的血管相比，短语“抑制视网膜新生血管形成”包括血管的数量或大小衰退。因此，抑制视网膜新生血管形成的本发明的化合物可以引起血管生长阻止、血管生长停止，或引起血管生长的衰退。

因此，本发明提供了一种抑制动物的视网膜新生血管形成的方法，该方法包括：给予需要这种治疗的动物治疗有效量的本发明的化合物或组合物。在一些实施方案中，动物是哺乳动物，例如驯养的哺乳动物。在一些实施方案中，动物是人。

对于本发明的目的来说，本文使用的术语“患者”包括人及其它动物，例如哺乳动物。因此，本发明的化合物、组合物和方法适用于人的治疗和兽用。在一些实施方案中，患者是哺乳患者，例如人。

本文使用的术语“治疗”、“医治”等等，包括有机体中的疾病状态的治疗，并且包括下列中的至少一种：(i)预防疾病状态出现，尤其是，当动物有感染疾病的倾向、但还没有确诊时；(ii)抑制疾病状态，即，部分或完全停止其发展；(iii)减轻疾病状态，即，引起疾病状态的症状的衰退，或改善疾病的症状；和(iv)使疾病状态得到逆转或衰退，例如，消除或治愈疾病。在本发明的一些实施方案中，有机体是动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类，例如，人。正如本领域所已知的那样，相对于局部递送的全身性调节，年龄、体重、基本健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、病症的严重程度等等是必要的，并且本领域普通技术人员可用常规实验确定。在一些实施方案中，本文使用的术语“治疗”、“医治”等等，包括治疗有机体的疾病状态，并且包括上面(ii)、(iii)和(iv)中的至少一种。

给药途径的实例包括但不局限于：全身性给药、眼周给药、眼球后给药、小管内给药、玻璃体腔注射、局部给药(例如，滴眼剂)、结膜下注射、Tenon囊下给药(subtenon)、巩膜睫状体给药(transcleral)、前眼房给药(intracameral)、视网膜下给药、电穿孔法给药和缓释植入物。眼睛状况的其它给药途径、其它注射部位或其它给药形式对本领域技术人员来说是已知的或在他们的认识范围，并且在本发明范围之内。

在本发明的一些实施方案中，给药途径包括：局部给药、结膜下注射、眼内注射，或其它眼睛途径、全身途径，或本领域技术人员已知的患者眼睛手术之后的其它方法。

在本发明的其它实施方案中，给药途径包括：局部给药、眼内给药、巩膜睫状体给药、眼周给药、结膜给药、结膜下给药、前眼房给药、视网膜下给药、结膜下给药、眼球后给药或小管内给药。

在本发明的一些实施方案中，给药途径包括：局部给药(例如，滴眼剂)、全身性给药(例如，口服或静脉内)、用于局部递送的结膜下注射、眼周注射、眼内注射和手术植入。

在本发明的一些实施方案中，给药途径包括：用于局部递送的眼内注射，眼周注射并缓释植入物。

在本发明的一些实施方案中，眼球内注射可以注射到玻璃体(眼内)中、结膜下(结膜下)、眼睛后面(眼球后)、巩膜内、Tenon囊下，或可以是储存形式。

在本发明的一些实施方案中，给药是局部的，包括但不限于表面、玻璃体内、眼周、眼内以及其他对于眼睛、眼和/或眼周组织和空间的局部给药，包括但不限于通过递送装置给药。

本发明的化合物可以形成盐，其也在本发明范围内。

本文使用的术语“盐”表示与无机和/或有机酸形成的酸盐。可药用(即，无毒的(显示出最小或没有不希望有的毒理学效果)，生理学可接受的)盐是优选的，不过其它盐也是有用的，例如，在制备期间可以使用的分离或纯化步骤中。可以如下形成本发明化合物的盐：例如，在介质中，例如，在盐沉淀的介质或水性介质中，将本发明的化合物与适量(例如等量)的酸进行反应，而后冷冻干燥。

含有碱性部分的本发明的化合物(例如胺或吡啶、吡唑或咪唑环)可以与各种有机和无机酸形成盐。酸加成盐的实例包括乙酸盐(例如，与乙酸或三卤乙酸例如三氟乙酸形成的那些盐)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙磺酸盐(例如，2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(例如，2-萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、苯丙酸盐(例如，3-苯丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸酯、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如，与硫酸形成的那些盐)、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐，例如甲苯磺酸盐、十一烷酸盐，等等。

本文使用的术语“可药用盐”是指可以保持上述鉴定的化合物的所需生物活性、并显示出最小或没有不希望的毒理学效果的盐。这种盐的实例包括但不局限于：与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸，等等)形成的盐，和与有机酸形成的盐，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗环血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸和多聚半乳糖醛酸。其它盐包括：本领域技术人员已知的可药用季铵盐，其具体地包括式--NR+Z--的季铵盐，其中R是氢、烷基或苄基，Z是反离子，包括氯离子、溴离子、碘离子、--O-烷基、甲苯磺酸根、甲磺酸根、磺酸根、磷酸根、或羧酸根(例如苯甲酸根、琥珀酸根、乙酸根、乙醇酸根、马来酸根、苹果酸根、柠檬酸根、酒石酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根、桂皮酸根、扁桃酸根、苯甲酸根(benzyloate)和二苯基乙酸根)。

在本发明的一些实施方案中，本发明的化合物的盐可以与手性或外消旋酸或其非对映异构体形成。本发明的手性中心可以具有S或R构型。外消旋形式可以通过物理方法进行拆分，例如，分级结晶、分离或非对映异构体衍生物的结晶或手性柱色谱分离。单一旋光异构体可以如下获得：从手性前体/中间体或从消旋体起始，利用任何合适的方法，包括但不限于：常规方法，例如，与光学活性的酸形成盐，而后结晶。本发明还包含本文所公开的化合物的所有互变异构体形式。

本发明的另一方面提供包含本发明的化合物的组合物。例如，在本发明的一些实施方案中，包含本发明的化合物或该化合物的N-氧化物、水合物、溶剂合物、可药用盐、复合物或前药的组合物存在至少约30%的对映异构体或非对映异构体过量。在本发明的一些实施方案中，化合物、N-氧化物、水合物、溶剂合物、可药用盐、复合物或前药存在至少约50%，至少约80%，或甚至至少约90%的对映异构体或非对映异构体过量。在本发明的一些实施方案中，该化合物、N-氧化物、水合物、溶剂合物、可药用盐、复合物或前药存在至少约95%，或者至少约98%且或者至少约99%的对映异构体或非对映异构体过量。在本发明的其他实施方案中，化合物、N-氧化物、水合物、溶剂合物、可药用盐、复合物或前药以基本上外消旋混合物的形式存在。

本发明还包括本发明化合物的前药。术语“前药”代表与载体共价键合的化合物，当给予哺乳动物受试者前药时，前药能够释放活性组分。活性组分的释放发生在体内。前药可以利用本领域技术人员已知的技术制备。这些技术通常可以修饰给定化合物中的合适官能团。然而，这些修饰的官能团通过常规操作或在体内可以重新产生初始官能团。本发明化合物的前药包括其中羟基、氨基、羧基或类似基团被修饰的化合物。前药的实例包括但不局限于：酯(例如，醋酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、本发明化合物中的羟基或氨基官能团的氨基甲酸酯(例如，N,N-二甲基氨基羰基)、酰胺(例如，三氟乙酰基氨基，乙酰胺，等等)，等等。

本发明的化合物可以以原样给予，或以前药形式给予，例如，以体内可水解的酯或体内可水解的酰胺形式给予。包含羧基或羟基的本发明化合物的体内可水解的酯是，例如，在人或动物体内可水解产生母体酸或醇的可药用酯。羧基的合适的可药用酯包括：C₁-C₆烷氧基甲酯(例如，甲氧基甲酯)、C₁-C₆烷酰氧基甲酯(例如，新戊酰氧基甲酯)、酞基酯、C₃-C₈环烷氧基羰基氧基-C₁-C₆烷基酯(例如，1-环己基羰基氧基乙酯)；1,3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲酯(例如，5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲酯；和C₁-C₆烷氧羰基氧基乙酯(例如，1-甲氧羰基氧基乙酯)，并且可以在本发明化合物的任何合适羧基处形成。

含有羟基的本发明化合物的体内可水解的酯包括：无机酯，例如磷酸酯和α-酰氧烷基醚和相关化合物，作为酯的体内水解的结果，其发生分解，得到母体羟基。α-酰氧烷基醚的实例包括乙酰氧基甲氧基醚和2,2-二甲基丙酰氧基-甲氧基醚。可形成羟基的体内可水解酯的选择包括：烷酰基、苯甲酰基、苯乙酰基和取代的苯甲酰基和苯乙酰基、烷氧羰基(得到碳酸烷基酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(N,N-二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(得到氨基甲酸酯)、N,N-二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。苯甲酰基上的取代基的实例包括吗啉代和哌嗪子基(piperazino)，其通过亚甲基连接环氮原子至苯甲酰基环的3-或4-位。含有羧基的本发明化合物的体内可水解的酰胺的合适意义是，例如，N-C₁-C₆烷基或N,N-二-C₁-C₆烷基酰胺，例如N-甲基、N-乙基、N-丙基、N,N-二甲基、N-乙基-N-甲基或N,N-二乙基酰胺。

当给予受试者时，前药通过代谢或化学过程发生化学转化，得到本发明的化合物。

本发明还涉及本发明的化合物的溶剂合物和水合物。术语“溶剂合物”指化合物与化学计量或非化学计量量的一个或多个溶剂分子的分子复合物。化合物或化合物的部分与溶剂的分子复合物可通过分子内非共价力(例如静电力、范德华力或氢键)而稳定。有机化学领域技术人员将理解，很多有机化合物可与获得、制备、合成、沉淀或结晶它们所用的溶剂形成所述复合物。术语“水合物”指其中一个或多个溶剂分子为水的复合物且包括单水合物、半水合物、二水合物、六水合物等。术语“溶剂合物”和“水合物”的含义为本领域技术人员所公知。制备溶剂合物的技术在本领域中是成熟的(参见例如Brittain，Polymorphism in Pharmaceutical solids.Marcel Dekker，New York，1999；Hilfiker，Polymorphism in the Pharmaceutical Industry，Wiley，Weinheim，Germany，2006)。

在该方面的一些实施方案中，所述溶剂为无机溶剂(例如水)。在该方面的一些实施方案中，溶剂为有机溶剂(例如但不限于：醇，例如但不限于甲醇，乙醇，异丙醇等；乙酸、酮、酯等)。某些实施方案中，溶剂是制药领域常用的一种溶剂(例如水、乙醇等)，已知该溶剂对所述溶剂合物所给药的接受者无毒，且在优选的实施方案中不干扰溶质的生物活性。

化合物

本发明涉及具有以下结构的化合物：

及其水合物、溶剂合物、可药用盐、前药和复合物、及其外消旋混合物与非外消旋混合物、非对映异构体和对映异构体。

本发明的化合物通常可以按照下列反应路线制备。上式化合物的互变异构体和溶剂合物(例如水合物)也在本发明范围内。溶剂化的方法在本领域中是熟知的。因此，本发明的化合物可以是游离、水合物或盐形式，并且可以利用下面反应路线中所例示的方法来获得。

下列实施例和制备描述了制备和使用本发明的方法，并且是例示性的，而不是限制性的。应该理解，可以存在属于如本文权利要求所定义的本发明的精神和范围内的其它实施方案。

化合物使用Chemdraw Ultra 10.0版、10.0.4版或8.0.3版(可通过Cambridgesoft.com，100Cambridge Park Drive，Cambridge，MA 02140获得)命名，或是因此衍生而来的。

本文提供的数据显示了本发明的激酶抑制剂的抑制效果。这些数据使人们可以合理地预期，本发明的化合物不但可以用于抑制激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性或其实施方案(例如，VEGF受体信号传导)，而且可以用作治疗眼科疾病、障碍和病症的治疗剂。

合成反应路线和试验方法

可以使用本领域技术人员已知的方法、按照下面例示的反应路线或实施例来制备本发明的化合物。这些反应路线用来例示可用于制备本发明化合物的一些操作。本领域技术人员能够认识到，可以使用其它普通的合成方法。本发明的化合物可以由可商购的起始成分来制备。对于起始成分，可以进行任何种类的替代，以便按照本领域技术人员清楚了解的操作获得本发明的化合物。

所有试剂和溶剂均来自商购并原样使用。在Mercury Plus Varian 400MHz仪器上记录指定溶剂中的¹H-NMR谱。在Agilent MSD仪器上获得低分辨率质谱(LRMS)。在Agilent 1100仪器上进行分析型HPLC：使用Zorbax 3μm，XDB-C8，2.1x 50mm柱；用含有0.1%甲酸的甲醇/水洗脱，其梯度为5-95%甲醇，经15分钟。在Biotage SP1或Biotage SP4仪器上使用

SNAP、SiliaSep^TM或

柱(cartridge)进行自动化柱色谱。使用硅胶(Silia FlashF60，40-63μM，孔径

)进行快速柱色谱。在Gilson 215仪器上使用Phenomenex Luna 15μm，C18(2)100A，250x 21mm柱进行制备型柱色谱，用含有0.05%的甲酸混合物甲醇/水洗脱，其梯度为0-95%甲醇，经至多60分钟。

具体实施例

反应路线1

实施例1

N-[3-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶 -3-基)甲基)]-N-(1-乙基)-N-[3-(2-甲氧基乙基)]脲(2)

将1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-((2-甲氧基乙基氨基)甲基)-吡啶-2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(1，100mg，0.197mmol)和异氰酸乙酯(25μL，0.315mmol)在THF(5mL)中的溶液(超声处理一段时间)在室温搅拌过夜。将该反应混合物浓缩和通过Biotage(SNAP 25g柱；MeOH/DCM，由0/100至10/90，经20CV(柱体积)，然后10/90，5CV)纯化。收集和浓缩所需级分。在AcOEt(含痕量MeOH)/己烷中将残余物共沉淀，通过过滤收集，用己烷洗涤，空气干燥和高真空下干燥，得到标题化合物2(63mg，0.11mmol，56%产率)，其为白色蓬松固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.73(s，1H)，8.52(d，J=5.5Hz，1H)，8.48(d，J=1.6Hz，1H)，8.31(s，1H)，8.24(d，J=8.2Hz，1H)，7.78-7.69(m，2H)，7.38(t，J=9.0Hz，1H)，7.24-7.17(m，1H)，6.64(bd，J=5.4Hz，1H)，6.62-6.56(m，1H)，6.44(t，J=5.4Hz，1H)，4.53(s，2H)，3.44-3.34(m，4H)，3.23(s，3H)，3.12-3.03(m，2H)，2.59-2.52(m，1H)，1.02(t，J=7.1Hz，3H)，0.72-0.58(m，2H)，0.50-0.36(m，2H)。MS(m/z)：579.46(M+H)。

反应路线2

实施例2

N-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3- 基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)甲酰胺(6)

将乙酸酐(150μL，1.17mmol)在甲酸(2mL)中的溶液在室温搅拌20分钟，然后加入一份1(150mg，0.296mmol)。2小时后，滴加200μL的乙酸酐(1.57mmol)。该反应混合物在室温搅拌过夜，通过加入MeOH淬灭并浓缩。通过Biotage(SNAP 25g柱；MeOH/DCM，由0/100至10/90，经20CV，然后10/90，5CV)将残余物纯化，得到标题化合物6(96mg，0.18mmol，76%产率)，其为灰白色蓬松固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：旋转异构体的混合物，8.75(s，1H)，8.60-8.50(m，2H)，8.37和8.34(2s，1H)，8.32-8.23(m，1H)，8.15(s，1H)，7.90-7.77(m，1H)，7.73(dd，J=13.5，2.5Hz，1H)，7.38(t，J=9.0Hz，1H)，7.20(bd，J=10.2Hz，1H)，6.67-6.58(m，2H)，4.60和4.56(2s，2H)，3.46-3.36(m，4H)，3.21和3.19(2s，3H)，2.59-2.51(m，1H)，0.70-0.60(m，2H)，0.47-0.38(m，2H)。MS(m/z)：536.4(M+H)。

反应路线3

实施例3

N-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2,3-二氟苯氧基)噻吩并[3，2-b]吡啶-2-基)-吡啶 -3-基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺(26)

步骤1.(6-(7-(4-氨基-2,3-二氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基) 甲基(2-甲氧基乙基)氨基甲酸叔丁酯(23)

在室温氮气下，向4-氨基-2,3-二氟苯酚(1.471g，10.14mmol)在DMSO(11.5mL)中的经搅拌的溶液中加入叔丁醇钾(1.345g，11.98mmol)。30分钟后，加入(6-(7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基(2-甲氧基乙基)氨基甲酸叔丁酯(22，4.0g，9.22mmol)，并将该反应混合物在100°C加热2.5小时，然后冷却至室温。将该反应混合物倾倒入水中(90mL)，并搅拌30分钟。加入饱和氯化钠水溶液且该混合物在室温搅拌3天。通过过滤收集固体，用水洗涤，空气干燥和高真空下干燥。通过Biotage (40+M柱；AcOEt/己烷：50/50，3CV，从50/50至100%AcOEt，经6CV，然后100%AcOEt，8CV)纯化粗产物，所得物质经乙醚研磨得到标题化合物23(1.94g，3.58mmol，38%产率)，其为灰白色固体。MS(m/z)：543.3(M+H)。

步骤2.(6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2，3-二氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]-吡啶-2-基) 吡啶-3-基)甲基(2-甲氧基乙基)氨基甲酸叔丁酯(24)

在-25°C氮气下向苯胺23(500mg，0.92mmol)和DIPEA(0.8mL，4.61mmol)在THF(18mL)中的经搅拌的溶液中滴加三光气(273mg，0.920mmol)在THF(2mL)中的溶液。在-25°C搅拌该反应混合物且缓慢加入环丙基胺(0.32mL，4.61mmol)。经1.5小时将该反应混合物温热至室温并在室温搅拌过夜。然后将该反应混合物分配于AcOEt和水之间。有机层依次用饱和氯化铵水溶液、1N NaOH和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤和浓缩，得到标题化合物24，其为灰白色固体。粗产物用于下一步骤中而无需任何其他纯化。MS(m/z)：626.6(M+H)。

步骤3.1-环丙基-3-(2,3-二氟-4-(2-(5-((2-甲氧基乙基氨基)甲基)吡啶-2-基) 噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(25)

将中间体24(0.92mmol)和TFA(10mL)在DCM(50mL)中的溶液在室温搅拌3小时。将该反应混合物浓缩，通过加入最少的MeOH和水而稀释。用4N NaOH将pH调节至约pH12。将精细混悬液超声处理15分钟，通过过滤收集，用水洗涤并在高真空下干燥，得到标题化合物25(578mg，0.9mmol，98%产率，TFA盐)，其为淡象牙色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.78-8.61(m，1H)，8.57(d，J=1.6Hz，1H)，8.53(d，J=5.5Hz，1H)，8.33(s，1H)，8.23(d，J=8.2Hz，1H)，8.02(t，J=7.8Hz，1H)，7.90(dd，J=8.1，2.1Hz，1H)，7.28(td，J=9.0，2.1Hz，1H)，7.16-7.01(m，1H)，6.75(d，J=5.3Hz，1H)，3.78(d，J=6.1Hz，2H)，3.41(t，J=5.7Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.65(q，J=6.0Hz，2H)，2.61-2.53(m，1H)，2.30-2.21(m，1H)，0.72-0.58(m，2H)，0.49-0.36(m，2H)。MS(m/z)：526.6(M+H)。

步骤4.N-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2，3-二氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2- 基)-吡啶-3-基)甲基)-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺(26)

将化合物25(100mg，0.156mmol，TFA盐)在乙酸酐(1mL)中的混悬液在室温搅拌2天。通过加入甲醇和水将该反应混合物淬灭。通过过滤收集精细混悬液，依次用水和1N NaOH、水清洗，并空气干燥。通过Biotage(SNAP25g柱；MeOH/DCM，由0/100至10/90，经20CV，然后10/90，5CV)纯化粗产物，得到标题化合物26(34mg，0.06mmol，38%产率)，其为白色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：旋转异构体的混合物，8.57-8.44(m，3H)，8.38和8.34(2s，1H)，8.30和8.24(2d，J=8.2Hz，1H)，8.04(bt，J=8.3Hz，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.32-7.25(m，1H)，6.87(bd，J=2.7Hz，1H)，6.79-6.74(m，1H)，4.71和4.59(2s，2H)，3.54-3.40(m，4H)，3.24和3.21(2s，3H)，2.61-2.53(m，1H)，2.13和2.05(2s，3H)，0.73-0.58(m，2H)，0.50-0.36(m，2H)。MS(m/z)：568.6(M+H)。

反应路线4

实施例4

1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-((4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(74)

步骤1.4-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]-吡啶-2-基) 吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(48)

在室温在氮气下超声处理1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-甲酰基吡啶-2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(47，3g，5.90mmol，乙酸盐)、1-boc-哌嗪(1.65g，8.85mmol)和乙酸(675μL，11.80mmol)在NMP(50mL)中的混悬液3小时以得到溶液，然后加入NaBH(OAc)₃(3.95g，17.70mmol)。该反应混合物在室温搅拌3天，然后通过加入水淬灭。用4N NaOH将pH调节至12-13，并将混悬液搅拌和超声处理1小时。通过过滤收集固体，用水洗涤和空气干燥。通过Biotage(SNAP 50g KP-Sil柱；MeOH/DCM：1/99至10/90，经20CV)将残余物纯化两次。收集所需级分，浓缩，与含痕量甲醇的AcOEt/己烷共沉淀，得到化合物48(1.511g，2.44mmol，41%产率)，其为白色蓬松固体。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.71(s，1H)，8.56(bd，J=2.0Hz，1H)，8.52(d，J=5.5Hz，1H)，8.33(s，1H)，8.25(d，J=8.2Hz，1H)，7.87(dd，J=8.1，2.1Hz，1H)，7.73(dd，J=13.6，2.4Hz，1H)，7.38(t，J=9.1Hz，1H)，7.20(bdd，J=8.8，1.2Hz，1H)，6.65(d，J=5.3Hz，1H)，6.57(bd，J=2.5Hz，1H)，3.57(s，2H)，4H隐藏在水峰中，2.59-2.51(m，1H)，2.42-2.27(m，4H)，1.39(s，9H)，0.72-0.58(m，2H)，0.50-0.36(m，2H)。MS(m/z)：619.4(M+H)。

步骤2.1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)噻吩并[3,2-b]- 吡啶-7-基氧基)苯基)脲(49)

将48(1.456g，2.35mmol)和TFA(15mL)在DCM(50mL)中的溶液在室温搅拌5小时。通过与DCM共蒸发除去TFA，将残余物用水稀释，并用1NNaOH将pH调节至约12-13。所得混悬液超声处理15分钟。通过过滤收集固体，用水洗涤并在高真空下干燥，得到化合物49(1.227g，痕量的TFA)，其为灰白色蓬松固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.76(bs，1H)，8.54(d，J=1.4Hz，1H)，8.52(d，J=5.5Hz，1H)，8.32(s，1H)，8.24(d，J=8.2Hz，1H)，7.85(dd，J=8.1，2.1Hz，1H)，7.73(dd，J=13.5，2.3Hz，1H)，7.38(t，J=9.1Hz，1H)，7.20(bd，J=10.2Hz，1H)，6.64(d，J=5.5Hz，1H)，6.62(bs，1H)，3.58-3.48(m，2H)，2.73-2.64(m，4H)，2.59-2.52(m，1H)，2.38-2.25(m，4H)，0.69-0.62(m，2H)，0.46-0.40(m，2H)，一个NH未找到。MS(m/z)：519.6(M+H)。

步骤3.1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-((4-(2-羟基乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶 -2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(74)

氮气下向化合物49(122mg，0.235mmol，反应路线15)、羟基乙酸(36mg，0.47mmol)和DIPEA(123μL，0.71mmol)在DMF(4mL)中的经搅拌的溶液中加入HATU试剂(224mg，0.59mmol)，且该反应混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物然后通过加入水和1N NaOH淬灭，搅拌2小时，并用DCM萃取。所合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤和浓缩。将残余物通过Biotage纯化两次(SNAP 25g柱；2%的氢氧化铵在MeOH/DCM中的溶液：由0/100至10/90，经20CV；然后是SiliaFlash 40g柱，2%的氢氧化铵在MeOH/DCM中的溶液：由0/100至10/90，经20CV，然后由10/90至15/85，经20CV)，所得物质在用MeOH研磨之后，得到标题化合物74(53mg，0.09mmol，39%产率)，其为白色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.77-8.69(m，1H)，8.57(d，J=1.6Hz，1H)，8.52(d，J=5.5Hz，1H)，8.34(s，1H)，8.26(d，J=8.0Hz，1H)，7.88(dd，J=8.1，2.1Hz，1H)，7.73(dd，J=13.5，2.3Hz，1H)，7.38(t，J=9.1Hz，1H)，7.20(bd，J=9.2Hz，1H)，6.65(d，J=4.9Hz，1H)，6.63-6.56(m，1H)，4.55(t，J=5.5Hz，1H)，4.07(d，J=5.5Hz，2H)，3.60(s，2H)，3.53-3.43(m，2H)，2H被隐藏，2.59-2.51(m，1H)，2.45-2.33(m，4H)，0.72-0.58(m，2H)，0.50-0.36(m，2H)。MS(m/z)：577.5(M+H)。

实施例5

步骤1.2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸(S)-2-(4-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基酯(74-A)

氮气下向74(117mg，0.20mmol)、Boc-L-缬氨酸(132mg，0.61mmol)和DMAP(25mg，0.20mmol)在无水DMF(4ml)中的经搅拌的溶液中加入DCC试剂(251mg，1.22mmol)，且该反应混合物在室温搅拌24小时。将该反应混合物分配于AcOEt和饱和碳酸氢钠水溶液之间。分离后，有机层依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(Snap 25g柱；MeOH/DCM：由1/99至10/90，经20CV，然后10/90，5CV)将残余物纯化，得到所需产物74-A(151mg，0.195mmol，96%产率)，其为无色-白色粘性泡沫。MS(m/z)：776.7(M+H)。

步骤2.2-氨基-3-甲基丁酸(S)-2-(4-((6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基酯(80)。

将所述Boc-缬氨酸酯74-A(151mg，0.195mmol)与HCl(0.49ml，1.95mmol，在1,4-二

烷中的4M溶液)在无水DCM(10ml)中的溶液的混悬液在室温搅拌2.5小时。将该反应混合物浓缩并用饱和碳酸氢钠水溶液稀释。水溶液用含有痕量甲醇的DCM萃取。所合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(Silia Flash 12g柱；2%的氢氧化铵在MeOH/DCM中的溶液：由1/99至15/85，经20CV，然后由15/85至20/80，经10CV)将残余物纯化，得到所需产物80(80mg，0.118mmol，60%产率)，其为灰白色粘性固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：旋转异构体的混合物，8.73(s，1H)，8.58(bd，J=1.4Hz，1H)，8.52(d，J=5.3Hz，1H)，8.34(s，1H)，8.26(dd，J=8.1，0.7Hz，1H)，7.88(dd，J=8.2，2.2Hz，1H)，7.73(dd，J=13.6，2.4Hz，1H)，7.38(t，J=9.0Hz，1H)，7.20(dd，J=9.0，1.4Hz，1H)，6.65(dd，J=5.3，0.8Hz，1H)，6.59(bd，J=2.5Hz，1H)，4.84(d，J=14.7Hz，1H)，4.77(d，J=14.9Hz，1H)，3.63-3.58(m，2H)，3.50-3.37(m，4H)，3.20(d，J=5.1Hz，1H)，2.59-2.51(m，1H)，2.47-2.33(m，4H)，2.00-1.60(m，3H)，0.92(d，J=6.8Hz，3H)，0.86(d，J=6.8Hz，3H)，0.72-0.58(m，2H)，0.50-0.36(m，2H)。MS(m/z)：577.6和676.7(M+H)。

反应路线5

实施例6

1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-((2-(甲基磺酰基)乙基氨基)甲基)吡啶-2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(100)

步骤1.N-((6-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基)-2-(甲硫基)乙酰胺(95)

向化合物94(300mg，0.759mmol)在二氯甲烷(20mL)中的混悬液中加入2-(甲硫基)乙基胺(141μL，1.518mmol)和乙酸(87μl)。在室温搅拌20分钟后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(482mg，2.276mmol)。该反应混合物在室温搅拌16小时。然后用DCM稀释该反应混合物，用1N NaOH洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过Biotage (Snap 50g；MeOH/DCM：0/100至20/80，经20CV)纯化粗产物，得到标题化合物95(357mg，定量产率)。MS(m/z)：471.5(M+H)。

步骤2.(6-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基 (2-(甲硫基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(96)

将95(357mg，0.759mmol)、Boc-酸酐(414mg，1.897mmol)、DMAP(93mg，0.759mmol)和三乙胺(106μL，0.61mmol)在DCM(20mL)中的混合物在室温搅拌过周末。然后浓缩该反应混合物，用乙酸乙酯稀释，并依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化铵水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(SNAP 100g柱；MeOH/DCM：由0/100至20/80，经20CV)将残余物纯化，得到标题化合物96(220mg，0.386mmol，50%产率)。MS(m/z)：571.6(M+H)。

步骤3.(6-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基 (2-(甲基磺酰基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(97)

向96(220mg，0.386mmol)在MeOH(29mL)和水(10mL)中的溶液中加入Oxone^TM(486mg，0.790mmol)。该反应混合物搅拌过夜，浓缩，用1NNaHSO₃溶液处理，水相用乙酸乙酯萃取。有机萃取物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。粗品97(232mg，0.385mmol)用于下一步骤中而无需任何其他纯化。MS(m/z)：603.6(M+H)。

步骤4.(6-(7-(4-氨基-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)甲基 (2-(甲基磺酰基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(98)

向97(232mg，0.385mmol)在MeOH(17.5mL)和水(1.75mL)中的溶液中加入氯化铵(62mg，1.16mmol)和铁粉(215mg，3.85mmol)。将该反应混合物加热至回流2小时，然后置于室温。用Celite^TM过滤混悬液，用MeOH洗涤，浓缩滤液。通过Biotage(SNAP 25g柱；MeOH/DCM：由0/100至20/80，经20CV)将残余物纯化，得到标题化合物98(241mg，定量产率)。MS(m/z)：573.7(M+H)。

步骤5.(6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)吡啶 -3-基)甲基(2-(甲基磺酰基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(99)

在-25°C向98(115mg，0.20mmol)在THF(20mL)中的溶液中先后加入DIPEA(140μl，0.80mmol)和三光气(59.6mg，0.20mmol)。在-25°C搅拌该反应混合物1小时，然后加入环丙基胺(71μL，1.00mmol)，并将该反应混合物温热至室温。搅拌过夜后，通过加入甲醇将该反应混合物淬灭，浓缩，并且分配于EtOAc和饱和氯化铵水溶液之间。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，并且浓缩。通过Biotage(Snap 25g；MeOH/DCM：由0/100至20/80，经20CV)纯化粗产物，得到标题化合物99(120mg，0.18mmol，91%产率)。MS(m/z)：656.6(M+H)。

步骤6.1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-((2-(甲基磺酰基)乙基氨基)甲基)-吡啶-2- 基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(100)

向99(120mg，0.18mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入TFA(5.6mL)。该反应混合物在室温搅拌过夜，浓缩，用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(SNAP 25g柱；MeOH/DCM：由0/100至20/80，经20CV)纯化粗产物，得到标题化合物100(90mg，0.13mmol，72%产率，TFA盐)，其为灰白色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.74(s，1H)，8.60(s，1H)，8.52(d，J=5.2Hz，1H)，8.34(s，1H)，8.26(d，J=8.4Hz，1H)，7.91(d，J=8.0Hz，1H)，7.73(dd，J=13.6，2.4Hz，1H)，7.38(t，J=8.8Hz，1H)，7.20(d，J=10.0Hz，1H)，6.64(d，J=5.2Hz，1H)，6.61(s，1H)，3.84(s，2H)，3.35-3.25(m，2H)，3.05(s，3H)，3.02-2.90(m，2H)，2.59-2.50(m，1H)，0.69-0.62(m，2H)，0.46-0.40(m，2H)。MS(m/z)：556.5(M+H)。

反应路线6

实施例7

1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(1-(2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡唑-4-基) 噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(151)

步骤1：2-(1-((1,3-二氧杂环戊烷-2-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶(145)

向144(3.57g，8.57mmol)在DME(50mL)和水(5mL)的混悬液中加入1-((1,3-二氧杂环戊烷-2-基)甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(2g，7.14mmol)、CsF(3.25g，21.42mmol)、NaHCO₃(1.799g，36mmol)和Pd(PPh₃)₄(0.825g，0.714mmol)，并将该反应混合物加热至回流过夜。将该混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并用水洗涤。收集有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。所得固体用Et₂O研磨，得到标题化合物145(3g，95%产率)，其为米色固体。MS(m/z)=443.51(M+H)。

步骤2：2-(4-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[32-b]吡啶-2-基)-1H-吡唑-1- 基)乙醛(146)

向145(900mg，2.034mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入3M HCl(30mL)，并将该反应混合物加热至回流24小时。将该混合物冷却至室温，并且浓缩。残余的水溶液用固体碳酸氢钠处理，然后用DCM萃取。收集有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。粗品醛146(810mg，100%产率)用于下一步骤中而无需另外的纯化。MS(m/z)=399.3(M+H)。

步骤3：2-((2-(4-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1H-吡唑 -1-基)乙基)(甲基)氨基)乙醇(147)

向146(810mg，2.033mmol)在DCM(40mL)中的溶液中加入HOAc(0.233mL，4.07mmol)和2-(甲基氨基)乙醇(305mg，4.07mmol)，且该反应混合物在室温搅拌一小时。加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.293g，6.10mmol)，且该混合物在室温搅拌过夜。将该混合物然后用饱和NaHCO₃溶液稀释然后加入固体NaHCO₃以中和酸。收集DCM层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩，得到标题化合物147(930mg，100%产率)，其直接用于下一步骤而无需另外的纯化。MS(m/z)=458.50(M+H)。

步骤4：碳酸叔丁基(2-((2-(4-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2- 基)-1H-吡唑-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)酯(148)

向147(930mg，2.033mmol)在DCM(40mL)中的溶液中加入Boc₂O(1.331g，6.10mmol)和DMAP(49.7mg，0.407mmol)，且该反应混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化(洗脱液EtOAc至20%MeOH的EtOAc溶液)，得到标题化合物148(420mg，37%产率)，其为棕色油状物。(MS(m/z)=558.49(M+H)

步骤5：碳酸(2-((2-(4-(7-(4-氨基-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1H- 吡唑-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)叔丁基酯(149)

向148(420mg，0.753mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中加入氯化铵(81mg，1.506mmol)在水(5mL)中的溶液和锌粉(197mg，3.01mmol)，并将该反应混合物加热至回流3小时。将该混合物冷却至室温然后过滤，减压下浓缩滤液。将残余物溶解于DCM中并用水洗涤。收集有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩，得到标题化合物149(397mg，100%产率)，其直接用于下一步骤而无需另外的纯化。MS(m/z)=528.49(M+H)。

步骤6：碳酸叔丁基(2-((2-(4-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并 [3,2-b]吡啶-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)酯(150)

在0°C氮气下向149(0.397mg，0.752mmol)和吡啶(0.183mL，2.257mmol)在DMF(20mL)中的经搅拌的溶液中加入氯甲酸苯酯(295mg，1.881mmol)，且该反应混合物在0°C搅拌2小时。加入环丙基胺(215mg，3.76mmol)，并在55°C将该反应混合物加热5小时。将该反应混合物分配于EtOAc和饱和碳酸氢钠溶液之间，然后用饱和氯化铵溶液和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过柱色谱纯化粗产物(EtOAc至30%MeOH的EtOAc溶液)，得到标题化合物150(150mg，33%产率)，其为白色固体。MS(m/z)=611.70(M+H)。

步骤7：1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(1-(2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H- 吡唑-4-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(151)

向150(150mg，0.246mmol)在DCM(10mL)中的溶液中加入HCl的二

烷溶液(0.307mL，1.118mmol)，且白色沉淀在室温搅拌2小时。将该混合物用饱和NaHCO₃溶液稀释并搅拌10分钟，然后分层。收集有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤和浓缩。通过柱色谱将残余物纯化(洗脱液EtOAc至30%MeOH的EtOAc溶液)，得到标题化合物151(100mg，80%产率)，其为白色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.43(d，J=5.48Hz，1H)，7.84(s，1H)，7.77(s，1H)，7.63(m，1H)，7.47(s，1H)，7.17(m，2H)，7.03(s，1H)，6.45(d，J=5.48Hz，1H)，4.92(s，1H)，4.27(t，J=6.26Hz，2H)，3.56(t，J=5.08Hz，2H)，2.95(t，J=6.26Hz，2H)，2.60(m，3H)，2.34(s，3H)，0.91(m，2H)，0.72(m，2H)。MS(m/z)=511.60(M+H)。

反应路线7

实施例8

N-((2-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1-甲基 -1H-咪唑-5-基)甲基)-2-羟基-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺(209)

步骤1：乙酸2-(((2-(7-(2-氟-4-硝基苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基)(2-甲氧基乙基)氨基)-2-氧代乙基酯(206)

向158(423mg，0.925mmol)在DMF(18mL)中的溶液中加入2-乙酰氧基乙酸(164mg，1.387mmol)、DIPEA(0.565mL，3.24mmol)和HATU试剂(1055mg，2.77mmol)。该反应混合物在室温搅拌1小时，然后加入NaHCO₃饱和溶液(200mL)和EtOAc(300mL)。形成白色沉淀，其通过过滤收集和丢弃。收集滤液的有机层，用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到浅黄色固体，其用乙醚研磨得到标题化合物206(570mg，111%产率，粗品)，其用于下一步骤中而无需另外的纯化。MS：558(MH)+。

步骤2：乙酸2-(((2-(7-(4-氨基-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基)(2-甲氧基乙基)氨基)-2-氧代乙基酯(207)

将由206(300mg，0.538mmol)、氯化铵(24.75mg，0.463mmol)和铁粉(255mg，4.57mmol)组成的反应混合物在乙醇(6mL)/水(3.0mL)中加热至回流1小时。趁热将该反应混合物过滤和浓缩。通过Biotage (MeOH/DCM，0-20%，SNAP 25g柱)将残余物纯化，得到标题化合物207(133mg，0.252mmol，47%产率)，其为白色固体。MS：528(MH)+。

步骤3：乙酸2-(((2-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2- 基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基)(2-甲氧基乙基)氨基)-2-氧代乙基酯(208)

在0°C，向207(130mg，0.246mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入DIPEA(0.172mL，0.986mmol)和三光气(43.9mg，0.148mmol)。该反应混合物在0°C搅拌1小时，然后加入环丙基胺(70.3mg，1.232mmol)。将该反应混合物温热至室温并搅拌1小时，然后浓缩。将残余物通过Biotage(MeO/DCM，0-20%，SNAP 25g柱)纯化，得到标题化合物208(104mg，0.170mmol，69%产率)，其为白色固体。MS：611(MH)+。

步骤4：N-((2-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2- 基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基)-2-羟基-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺(209)

向208(104mg，0.170mmol)在THF(18mL)中的溶液中加入LiOH(32.6mg，1.362mmol)在水(6mL)中的溶液，且该混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩。通过Biotage(MeOH/DCM，0-20%，SNAP 25g柱)将残余物纯化，得到标题化合物209(40mg，0.070mmol，41%产率)，其为白色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.75(s，1H)，8.55(d，1H，J=5.3Hz)，7.94(s，1H)，7.75(dd，1H，J1=2.3Hz，J2=13.5Hz)，7.41(t，1H，J=9.0Hz)，7.24-7.22(m，1H)，7.09(s，1H)，6.70(d，1H，J=5.5Hz)，6,60(m，1H)，4.74(s，2H)，4.68-4.66(m,1H)，4.24(d，2H，J=5.7Hz)，3.87(s，3H)，3.45(m，2H)，3.35(s，3H)，3.28(m，2H)，2.60-2.57(m，1H)，0.71-0.67(m，2H)，0.48-0.45(m，2H)。MS：569.6(MH)+。

192：实施例9

实施例9

1-((2-(7-(4-异丙基氨基羰基氨基-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)-1- 甲基-1H-咪唑-5-基)甲基)-3-异丙基-1-(2-甲氧基乙基)脲(192)

化合物192通过与合成化合物209的反应路线7中所用的相似操作获得，其中在步骤1中用三光气和异丙基胺代替DIPEA和HATU试剂存在下的2-乙酰氧基乙酸，以及在步骤3中用异丙基胺代替环丙基胺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：8.67(s，1H)，8.49(d，J=5.5Hz，1H)，7.89(s，1H)，7.68(dd，J1=2.6Hz，J2=13.5Hz，1H)，7.34(t，J=9.0Hz，1H)，7.12-7.09(m，1H)，6.94(s，1H)，6.64(d，J=5.5Hz，1H)，6.14-6.09(m，2H)，4.55(s，2H)，3.83(s，3H)，3.80-3.74(m，2H)，3.38-3.27(m，4H)，3.21(s，3H)，2.06-1.04(m，12H)。MS(m/z)=598.6(M+H)。

反应路线8

实施例10

1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-羰基)吡啶-2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(234)

步骤1：6-(7-(4-(3-环丙基脲基)-2-氟苯氧基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基)烟酸 (225)

在室温向醛47(200mg，0.446mmol)在DMF(10mL)中的混悬液中加入

(330mg，0.535mmol)，该反应混合物在50°C搅拌16小时。将该反应混合物冷却至0°C，用1N HCl水溶液(20mL)处理，并在室温再搅拌一小时。通过过滤收集所得沉淀，用水(30mL)洗涤并干燥。粗产物用MeOH研磨，得到标题化合物225(165mg，80%产率)，其为米色固体。NMR(400MHz，CD₃OD)δ(ppm)：9.66(bs，1H)，8.98(dd，J=1.9，0.9Hz，1H)，8.51(d，J=5.5Hz，1H)，8.31(s，1H)，8.22(dd，J=8.1，1.9Hz，1H)，8.17(dd，J=8.1，0.9Hz，1H)，7.77(dd，J=13.7，2.5Hz，1H)，7.45(bs，1H)，7.37(t，J=9.1Hz，1H)，7.26(dd，J=8.9，1.5Hz，1H)，6.62(d，J=5.3，0.8Hz，1H)，2.60-2.52(m，1H)，0.69-0.56(m，2H)，0.50-0.37(m，2H)。[未见羧基OH]。MS：465.3(MH)⁺

步骤2：1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(5-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-羰基)吡啶 -2-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(234)

在0°C向酸225(300mg，0.646mmol)在DMF(10mL)中的经搅拌的溶液中加入HOBT(198mg，1.292mmol)、EDC(248mg，1.292mmol)和1-甲基-4-(哌啶-4-基)哌嗪(118mg，0.646mmol)。该反应混合物在室温搅拌过夜，用NaHCO₃饱和溶液稀释，并用EtOAc萃取。萃取物用无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过Biotage(MeOH/EtOAc，0-50%，25g柱)将残余物纯化三次，然后用Gilson[MeOH/H2O，50-95%，HCOOH(0.05%)]纯化，得到标题化合物234(50mg，0.079mmol，12.29%产率)，其为单甲酸盐。NMR(400MHz，CD₃OD)δ(ppm)：8.67(dd，J1=0.8Hz，J2=2.1Hz，1H,)，8.48(s，1H)，8.47(s，1H)，8.19(dd，J1=0.8Hz，J2=8.3Hz，1H)，8.16(s，1H)，7.97(dd，J1=2.2Hz，J2=8.2Hz，1H)，7.65(dd，J1=2.4Hz，J2=13.1Hz，1H)，7.29(t，1H，J=8.8Hz，H)，7.20-7.18(m，1H)，6.65(dd，J1=0.8Hz，J2=5.5Hz，1H)，3.83(br.s，1H)，3.24(br s，1H)，3.01(br.s，6H)，2.85(br.s，3H)，2.76-2.70(m，2H)，2.67(s，3H)，2.61-2.57(m，1H)，2.02(br.s，1H)，1.91-1.85(b r.s，1H)，1.56-1.49(b r.s，2H)，0.78-0.74(m，2H)，0.55-0.51(m，2H)。MS：630.4(MH)⁺

反应路线9

实施例11

1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(1-(2-吗啉代乙基)-1H-咪唑-4-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(265)

步骤1.1-(2,2-二乙氧基乙基)-4-碘-1H-咪唑(260)

向4-碘咪唑(10g，51.6mmol)和溴乙醛二乙基缩醛(9.31mL)在DMSO(30mL)中的经搅拌的溶液中加入K₂CO₃(10.69g，77mmol)。将该反应混合物在110°C加热16小时。冷却至室温后，将该反应混合物用水稀释并用AcOEt萃取。有机萃取物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(SNAP 80g柱；AcOEt/Hex：由0/100至50/50，经20CV)将残余物纯化。收集和浓缩所需级分，得到标题化合物260(11.29g，36.4mmol，71%产率)，其为黄色油状物。MS(m/z)：310.97(M+H)。

步骤2.7-氯-2-(1-(2,2-二乙氧基乙基)-1H-咪唑-4-基)噻吩并[3,2-b]吡啶 (261)

在-15°C向7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶(9.26g，54.6mmol)在THF(88mL)中的经搅拌的溶液中加入n-BuLi(21.84mL，54.6mmol)。30分钟后，在-15°C加入0.5M ZnCl₂在THF中的溶液(109mL，54.6mmol)，并经45分钟将该反应混合物温热至室温。加入四(三苯基膦)钯(0.841g，0.73mmol)和碘260(11.29g，36.4mmol)在THF(33mL)中的溶液并将该混合物加热至回流3小时，然后浓缩。将残余物用水和氢氧化铵稀释，并用DCM萃取。有机萃取物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(SNAP 80g柱；AcOEt/Hex：由0/100至100/0，经20CV)将残余物纯化，所得物质用MTBE研磨，得到标题化合物261(1.2g，3.41mmol，9%产率)，其为浅棕色固体。MS(m/z)：437.45(M+H)。

步骤3.4-(2-(1-(2,2-二乙氧基乙基)-1H-咪唑-4-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氧基)-3-氟苯胺(262)

向4-氨基-2-氟苯酚盐酸盐(1.39g，8.53mmol)在DMSO(20mL)中的经搅拌的溶液中加入t-BuOK(1.99g，17.76mmol)。30分钟后，加入氯化物261(2.5g，7.11mmol)，并将该反应混合物在100°C加热1小时。

在一个单独的烧瓶中，用t-BuOK(1.99g，17.76mmol)处理4-氨基-2-氟苯酚盐酸盐(1.39g，8.53mmol)在DMSO(20mL)中的溶液，并在100°C将所得苯酚盐溶液加入初始反应混合物中。30分钟后，将该混合物倾倒入水(300mL)中形成沉淀，其通过过滤收集和高真空下干燥，得到标题化合物262(2.86g，6.46mmol，91%产率)，其为浅棕色固体。MS(m/z)：443.44(M+H)。

步骤4.1-环丙基-3-(4-(2-(1-(2,2-二乙氧基乙基)-1H-咪唑-4-基)噻吩并 [3,2-b]吡啶-7-基氧基)-3-氟苯基)脲(263)

在0°C向胺262(2.86g，6.46mmol)和吡啶(1.04mL，12.93mmol)在DMF(50mL)中的经搅拌的溶液中加入氯甲酸苯酯(973μl，7.76mmol)。30分钟后，在0°C加入环丙基胺(1.14mL，16.16mmol)，并将该反应混合物在60°C加热45分钟。再加入环丙基胺(1mL，14.18mmol)，并将该反应混合物在60°C再加热10分钟。冷却至室温后，将该反应混合物通过加入水淬灭，形成沉淀。通过过滤收集固体，用水洗涤并真空干燥2小时。通过Biotage(SNAP 80g柱；MeOH/DCM：由0/100至10/90，经20CV)将残余物纯化。收集所需级分，浓缩，用MTBE研磨并在高真空下干燥，得到标题化合物263(2.95g，5.61mmol，87%产率)，其为粉色固体。MS(m/z)：526.60(M+H)。

步骤5.1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(1-(2-氧代乙基)-1H-咪唑-4-基)噻吩并[3,2-b] 吡啶-7-基氧基)苯基)脲(264)

向缩醛263(2.95g，5.61mmol)在AcOH/H₂O(20/20mL)中的溶液中加入浓HCl(2mL)，并将该反应混合物在90°C加热1小时。将该反应混合物浓缩，用水和4M NaOH稀释至pH为10，形成沉淀，其通过过滤收集，用水洗涤并真空干燥。然后通过Biotage(SNAP 100g柱；2%的氢氧化铵在MeOH/DCM中的溶液：由0/100至15/85，经20CV)纯化该物质，得到标题化合物264(1.2g，2.66mmol，47%产率)，其为棕色固体。MS(m/z)：484.51(M+H)。

步骤6.1-环丙基-3-(3-氟-4-(2-(1-(2-吗啉代乙基)-1H-咪唑-4-基)噻吩并 [3,2-b]吡啶-7-基氧基)苯基)脲(265)

向264(200mg，0.443mmol)、吗啉(46μl，0.532mmol)和AcOH(51μl，0.886mmol)在NMP(10mL)中的溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(282mg，1.329mmol)，并且该反应混合物在室温搅拌18小时。用水将该反应混合物淬灭并用DCM萃取。有机萃取物依次用饱和氯化铵溶液和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。通过Biotage(SNAP 40g柱；2%的氢氧化铵在MeOH/DCM中的溶液：由0/100至15/85，经20CV)和Gilson (Phenomenex，Luna 15μ，C18(2)100A，250x50.0mm，15μm；含0.05%的甲酸的MeOH/水：经60分钟由20/80至95/5，流速：30mL/分钟)将残余物纯化，得到标题化合物265(30mg，0.057mmol，13%产率，甲酸盐)，其为白色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：9.52(bs，1H)，8.41(d，J=5.6Hz，1H)，8.36(bs，1H)，7.92(d，J=1.2Hz，1H)，7.78(d，J=1.2Hz，1H)，7.71(dd，J=2.4和14.0Hz，1H)，7.65(s，1H)，7.33(t，J=9.2Hz，1H)，7.32(bs，1H)，7.22(dd，J=1.6和8.8Hz，1H)，6.54(d，J=5.6Hz，1H)，4.14(t，J=6.0Hz，2H)，3.57(t，J=4.4Hz，4H)，2.66(t，J=6.4Hz，2H)，2.58-2.51(m，1H)，2.49-2.40(m，4H)，0.64-0.59(m，2H)，0.43-0.39(m，2H)。MS(m/z)：523.55(M+H)。

药物组合物

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和可药用载体、赋形剂或稀释剂。可以利用本领域众所周知的任何方法配制本发明的组合物，并且可以通过任何途径给药，包括但不限于：表面、玻璃体内、眼周、眼内以及其他对于眼睛、眼和/或眼周组织和空间的局部给药，包括通过递送装置给药。在一些实施方案中，可以通过口服途径给药。

载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于给药途径。本文使用的术语“可药用”是指与生物系统(例如细胞、细胞培养物、组织或有机体)相容的无毒物质，而且不会妨碍活性组分的生物活性的效果。因此，除了抑制剂之外，按照本发明的组合物还可以含有稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂，及本领域众所周知的其它物质。可药用制剂的制备描述在例如下列中：Remington's Pharmaceutical Sciences，第十八版，A.Gennaro，Mack PublishingCo.,Easton，Pa.，1990。

活性化合物包含在可药用载体、赋形剂或稀释剂中，其数量应该足够给予患者治疗有效量，并且在所治疗的患者中不会引起严重的毒性作用。可以基于所递送的母体化合物的重量，计算可药用衍生物的有效剂量范围。如果衍生物本身显示出活性，则可以按照上面的方法、使用衍生物的重量来估计有效剂量，或用本领域技术人员已知的其它方式。

试验实施例

VEGF活性的抑制

下列方案用于试验本发明的化合物。

试验实施例1

体外受体酪氨酸激酶试验(VEGF受体KDR)

该试验测定了化合物抑制重组体人类VEGF受体酶活性的能力。

将1.6-kb cDNA(相当于VEGFR2(KDR)的催化区域)(Genbank登录号AF035121氨基酸806至1356)克隆到pDEST20Gateway载体(Invitrogen)的PstI位点上，用于制备该酶的GST-标记的型式。按照制造商的说明书(Invitrogen)，使用Bac-至-BacTM体系，该结构用于产生重组体杆状病毒。

用重组体杆状病毒构建体(construct)感染后，GST-VEGFR2806-1356蛋白在Sf9细胞(Spodoptera frugiperda)中表达。简要地，在72小时期间，在27℃，在旋转振荡器上以120rpm的速度搅拌，使生长在悬浮液中、并保持在无血清培养基(Sf900II，补充有庆大霉素)中的Sf9细胞(细胞密度大约2X 10⁶个细胞/ml)感染上述病毒(0.1的多重性感染(MOI))。在398g下离心采集受感染细胞(采集15分钟)。将细胞沉淀在-80℃冷冻，直到进行纯化为止。

在细胞提取和纯化中描述的所有步骤是在4℃进行的。将感染上GST-VEGFR2806-1356重组体杆状病毒的冷冻Sf9细胞沉淀解冻，并平缓地再悬浮在缓冲液A(PBS，pH7.3，补充有1μg/ml胃酶抑素，2μg/ml抑肽酶和亮肽素，50μg/ml PMSF，50μg/ml TLCK和10μM E64和0.5mM DTT)中，每克细胞使用3ml缓冲液。将悬浮液用Dounce进行均化，并将1%Triton X-100加入到匀浆中，而后将其在22500g下、在4℃离心30分钟。上清液(细胞提取物)用作GST-VEGFR2806-1356纯化的起始原料。

将上清液装填到用PBS(pH7.3)平衡的GST-琼脂糖柱(Sigma)上。用PBS(pH7.3)+1%Triton X-100洗涤4CV、用缓冲液B(50mM Tris，pH8.0，20%甘油和100mM NaCl)洗涤4CV之后，将结合的蛋白用5CV的缓冲液B(补充有5mM DTT和15mM谷胱甘肽)逐步洗脱。将得自于该色谱步骤的富集GST-VEGFR2806-1356的馏分进行收集(基于U.V.示踪，即具有高O.D.280的馏份)。最后的GST-VEGFR2806-1356蛋白制剂浓度大约为0.7mg/ml，纯度大约70%。将纯化的GST-VEGFR2806-1356蛋白原料制成等分样品，并在-80℃冷冻，而后在酶催试验中使用。

在DELFIATM试验(Perkin Elmer)中测定VEGFR/KDR的抑制。将底物聚(Glu4,Tyr)固定到黑色高度结合的聚苯乙烯96孔板中。将涂覆的板洗涤，并在4℃保存。在试验期间，将酶在冰上、在聚丙烯96孔板中用抑制剂和Mg-ATP预先培养4分钟，然后转入涂覆的板中。随后在30℃进行激酶反应10-30分钟。对于VEGFR/KDR，试验中的ATP浓度是0.6μM(2X Km)。酶浓度是5nM。培养之后，用EDTA淬灭激酶反应，并洗涤板。通过用铕标记的抗磷酸酪氨酸MoAb进行培养，检测磷酸化产物。洗涤板之后，利用时间分辨荧光法，在Gemini SpectraMax读数器(Molecular Devices)中检测结合的MoAb。在浓度范围内评价化合物，并测定IC₅₀值(得到50%酶活性抑制的化合物的浓度)。结果示于表1中。在该表中，“a”表示小于50纳摩尔的IC₅₀值；“b”表示大于或等于50但小于100纳摩尔的IC₅₀值；“c”表示浓度大于或等于100但小于250纳摩尔的IC₅₀值；“d”表示大于或等于250纳摩尔的IC₅₀值。

表1

化合物编号	VEGFR IC₅₀(μM)
		2	a
6	a
		26	a
74	a
		80	a
100	a
		151	a
192	b
		209	a
234	a
		265	a

试验实施例2

VEGF-依赖性Erk磷酸化

细胞和生长因子：HUVEC细胞购买于Cambrex Bio Science Walkersville,Inc，并且按照供应商说明书进行培养。对于表达Sf9细胞的杆状病毒，使用Gateway克隆技术(Invitrogen)，克隆VEGF₁₆₅的全长编码序列。用条件培养基(conditioned media)纯化VEGF₁₆₅，使用NaCl梯度洗脱(HiTrap肝素柱(GEHealthcare Life Sciences))，而后使用咪唑梯度洗脱(HiTrap螯合柱(GEHealthcare Life Sciences))，然后缓冲保存在PBS(补充有0.1%BSA并过滤消毒)中。

细胞试验：将细胞接种在96孔板中(8000个细胞/孔)，并生长48小时。然后将细胞在血清和不含生长因子的介质中培育过夜，并接触化合物稀释物1.5小时。在介质中培养15分钟之后，将VEGF165(150ng/ml)细胞溶解在冰冷的溶解缓冲液(50mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，1.5mM MgCl₂，1%Triton X-100，10%甘油)中，该缓冲液含有1mM的4-(2氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、200μM原钒酸钠、1mM氟化钠、10μg/mL亮肽素、10μg/mL抑肽酶、1μg/mL胃酶抑素和50μg/mLNa-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐，并进行Western印迹，以便检测抗磷酸基ERK1/2(T202/Y204)(Cell SignalingTechnologies)。

Western印迹分析：将得自于单处理孔的溶解产物样品在5-20%SDS-PAGE凝胶上分离，按照制造商说明书，使用Immobilon聚偏氟乙烯膜(Amersham)进行免疫印迹。在Tris-缓冲盐水(含有0.1%Tween 20净化剂(TBST))中洗涤印记，并探测对磷酸基-Thr202/Tyr204-ERK(细胞信号传导技术)的抗体。按照制造商的说明书，使用成像和密度测定分析的Storm显像密度计(GE Healthcare；800PMT，100nM分辩率)，进行化学荧光检测(Amersham，ECL plus)。使用4-参数拟合模型，在稀释度范围内的值用于制作IC₅₀曲线。使用GraFit 5.0软件，计算这些曲线。

试验实施例3

体内脉络膜的新生血管形成(CNV)模型

该试验测定了化合物抑制CNV进展的能力。CNV是造成患有年龄相关的黄斑变性(AMD)的患者严重视力丧失的主要原因。

雄性Brown-Norway大鼠(Japan Clea Co.,Ltd.)用于这些研究。

通过腹膜内注射戊巴比妥使大鼠麻醉，并用0.5%托比卡胺和0.5%盐酸去氧肾上腺素(phenylephrine hydrochloride)使右侧散瞳。使用Green laserPhotocoagulator(Nidex Inc.,Japan)的狭缝灯输送体系，在视网膜血管之间使右眼接受6次激光灼伤，Healon^TM(AMO Inc)的显微镜玻片用作接触镜。激光功率是100或200mW(0.1秒)，斑点直径是100μm。在激光灼伤的时候，观察到鼓泡产生，这是Bruch's膜破裂的迹象，其对于CNV产生是重要的。

激光辐照之后(第0天)，使用SAS软件(SAS institute Japan，R8.1)，基于体重将大鼠分到各个组中。动物麻醉和右侧散瞳(上述)之后，通过在第3天注射(10μL/眼睛)10nmol/眼睛或3nmol/眼睛的剂量，使动物的右眼接受化合物或载体。将化合物溶解或悬浮在CBS、PBS或其它合适的载体中，而后注射。

在第10天，用乙醚使动物麻醉，通过尾静脉注射高分子量异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖(SIGMA，2×10⁶MW)(20mg/大鼠)。FITC-葡聚糖注射之后大约30分钟，用乙醚或二氧化碳将动物安乐死，取出眼睛，并用10%福尔马林中性缓冲溶液固定。固定超过1小时之后，通过从眼球上除去角膜、晶状体和视网膜，获得RPE-脉络膜-巩膜铺片。在显微镜载玻片上，将铺片固定在50%甘油中，使用荧光显微镜(Nikon Corporation，激发滤片：465-495nm，吸收滤片：515-555nm)，给激光灼伤的部分照像。使用Scion成像，通过测定在像片上观察到的过荧光面积，获得CNV面积。

6个灼伤的平均CNV面积用作CNV面积的独立单位值，将化合物治疗组的平均CNV面积与赋形剂治疗组的平均CNV面积进行比较。本发明一些化合物的结果示于表2中，并且表示为CNV进展的%抑制(“A”表示大于或等于60%抑制，“B”表示≥40%至<60%抑制)。

表2

试验实施例4

兔子中VEGF诱导的视网膜血管渗透

材料和方法

该试验评价了化合物抑制VEGF诱导的视网膜血管渗透的能力。血管渗透是罹患年龄相关的黄斑变性(AMD)的患者中严重视力丧失的原因。用戊巴比妥将雌性荷兰兔(~2kg；Kitayama LABES CO.，LTD，Nagano，Japan)麻醉，并用0.4%的奥布卡因盐酸盐将其局麻。用0.5%托吡卡胺滴眼液散瞳后，将所测试物质或载体注射入玻璃体腔。静脉内注射重组人VEGF₁₆₅(500ng；Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO)，48小时后测量玻璃体荧光素浓度。兔子用戊巴比妥麻醉，随后通过耳静脉注射荧光素钠(2mg/kg)。用0.5%托吡卡胺滴眼液散瞳，并且在荧光素注射30分钟后使用FM-2Fluorotron Master(Ocumetrics，Mountain View，CA)测量眼荧光素水平。在距光轴后端沿光轴0.25mm处的数据点，获得玻璃体中的荧光素浓度。玻璃体荧光浓度视为荧光素从视网膜血管漏出。将所测试化合物处理组中的平均荧光峰与载体治疗组相比。与载体处理组相比，化合物26和74对于荧光素的漏出显示了显著的抑制。