CN103018363A

CN103018363A - 一种复方中药中游离脂肪酸的含量检测方法

Info

Publication number: CN103018363A
Application number: CN2012105194324A
Authority: CN
Inventors: 刘军锋; 高钧; 韩红梅; 姜海; 胡雪娇
Original assignee: Shenwei Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shenwei Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-06
Also published as: CN103018363B

Abstract

本发明公开了一种复方中药中游离脂肪酸含量的检测方法，该方法用高效液相色谱法测定复方中药中游离脂肪酸含量，并采用紫外检测器检测色谱信号。更进一步地，本发明涉及一种复方中药中亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸或软脂酸中的任意一种或者一种以上的质量检测方法。本发明所述方法具有稳定性好、精密度高、线性范围宽、适用范围宽等特点。

Description

一种复方中药中游离脂肪酸的含量检测方法

技术领域

本发明涉及一种复方中药中有效成分的质量检测方法，具体地说是复方中药中游离脂肪酸的质量检测方法。

技术背景

游离脂肪酸是现有许多中药复方制剂中的重要有效成分。如心脑清软胶囊中的油酸，百多宁注射液中的亚油酸、油酸、软脂酸以及硬脂酸等，都是中药制剂中的活性成分。建立复方中药中游离脂肪酸的质量检测方法是保证药品疗效可靠、稳定的重要手段之一。不过，由于游离脂肪酸熔点较高、具有脂溶性的较长碳链和亲水性的羟基，除紫外末端吸收外，在其它紫外波长下没有吸收，因此，这给快捷、准确地定量检测游离脂肪酸含量带来一定的困难。

目前，检测复方中药制剂中的游离脂肪酸通常是将复方中药制剂中的游离脂肪酸经过甲酯等酯化衍生化处理后，然后再采用气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气质联用色谱法（GC-MS）进行分析。但是，鉴于游离脂肪酸沸点高，其不适合采用气相色谱法进行测定。另外，酯化衍生化处理需进行样品前处理，而不同的样品又需要考察衍生化反应的诸多条件，确定衍生化反应完全定量发生，而最终条件的确定又存在一定的不确定性。因而现有方法检测周期长，工作量大，工作效率低，适用范围窄；再则，如果待检测样品中既含有游离脂肪酸又含有其甲酯的情况下，现有方法仅能测定出被检样品中游离脂肪酸和其甲酯的总量，而不能单独测定游离脂肪酸的含量，因此，其定量结果精密度也比较低。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种方便、高效、稳定性好、适用方位宽的复方中药中游离脂肪酸的质量检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明所提供的复方中药制剂中游离脂肪酸的含量检测方法，它包括以下步骤：

（a）对照品溶液的制备：精确称取一定量的游离脂肪酸对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

（b）供试品溶液的制备：称取一定量的待检测复方中药制剂样品，置于容量瓶中，加体积比浓度为50～100％的甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

（c）用高效液相色谱仪测定对照品溶液和供试品溶液，并采用紫外-检测器检测色谱信号得色谱图；色谱条件与系统适用性试验为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，体积比50:50~90:10的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长是201-205nm；

（d）绘制对照品标准曲线，根据待检测复方中药制剂样品峰面积和标准曲线，计算待检测复方中药制剂样品中游离脂肪酸的含量。

上述步骤（a）或（b）所述的“一定量”是指对照品或供试品（即复方中药制剂样品）的取用量能够满足高效液相色谱仪测定要求即可；

本发明所述的复方中药制剂是指其活性成分含有游离脂肪酸的复方中药制剂，如心脑清软胶囊、百多宁注射液、苏子油软胶囊。

本发明所指游离脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、油酸、硬脂酸或软脂酸中的任意一种或其中两种、两种以上的混合物。

本发明中方法中所述的待检测复方中药制剂优选心脑清软胶囊；所述的游离脂肪酸是亚油酸；所述的对照品溶液的制备为精确称取亚油酸对照品180mg，用甲醇定容至20mL后，再取1ml，用甲醇稀释至50mL，配制亚油酸对照品溶液；所述的供试品溶液的制备为：取心脑清软胶囊内容物0.1-0.2g，用体积比浓度为50～100％的甲醇水溶液定容至25mL后，再取1ml，稀释至25mL，配制供试品样品溶液；所述的色谱条件与系统适用性试验为：碳十八烷基键合硅胶为填充剂，体积比75:25的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长为203nm。

本发明中方法中所述的待检测复方中药制剂优选百多宁注射液；所述的游离脂肪酸是亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸；所述的对照品溶液的制备为：精确称取亚油酸对照品150mg、油酸对照品480mg、软脂酸对照品90mg和硬脂酸对照品30mg，用甲醇定容至20mL后，再取1ml，用甲醇稀释至50mL，配制混合标准品溶液；所述的供试品溶液的制备为：取百多宁注射液0.3-0.5g，用体积比浓度为50～100％的甲醇水溶液定容至25mL，再取1ml，稀释至20ml，配制供试品溶液；所述的色谱条件与系统适用性试验是：十八烷基键合硅胶为填充剂，体积比65:35的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长为203nm。

本发明中方法中所述的待检测复方中药制剂优选苏子油软胶囊，所述的游离脂肪酸是α-亚麻酸；所述的对照品溶液的制备为：精确称取α-亚麻酸对照品100mg、用甲醇定容至25mL后，再取1ml，用甲醇稀释至50mL，配制α-亚麻酸对照品溶液；所述的供试品溶液的制备为：取苏子油软胶囊内容物100mg，用甲醇定容至25mL，再取1ml，稀释至50ml，配制供试品溶液；所述的色谱条件与系统适用性试验是：十八烷基键合硅胶为填充剂，体积比90∶10的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长为203nm。

本发明方法采用高效液相色谱法，直接测定游离脂肪酸含量，并采用低波长紫外吸收检测，克服了上述游离脂肪酸检测方法的不足，是一种高效、可靠的游离脂肪酸测定方法。

本发明方法，无需对复方中药样品中的游离脂肪酸进行酯化衍生化反应，直接采用高效液相色谱法测定游离脂肪酸。这可以剔除样品中已经存在的脂肪酸酯对测定的干扰。另外，采用201～205nm的紫外光进行检测，克服了有些脂肪酸结构中没有共轭双键，在光谱紫外中高波长区域没有吸收的困难。

本发明的实验研究表明，本发明的质量检测方法在不同复方中药的不同游离脂肪酸检测中，具有稳定性好、精密度高、线性范围宽、适用范围宽等特点。

综上所述，本发明的质量检测方法，具有检测结果准确、信号良好、准确定量的特点，可用于不同复方中药品种中游离脂肪酸的含量测定、质量控制以及药品的质量检测。

具体实施方式

下述实施例用于进一步详细说明和理解本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。

实施例1心脑清软胶囊中亚油酸的含量检测

实验试剂与仪器

试剂：心脑清软胶囊（成分精制红花油、冰片、维生素E、维生素B6.），市售，由神威药业有限公司生产；亚油酸对照品购于SIGMA公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。

仪器：高效液相色谱仪（美国Agilent公司，1200型，紫外-检测器）。

色谱条件：色谱柱AgilentXDB ODS色谱柱（4.6×250mm,5μm）；流动相乙腈-水（体积比75:25）；检测波长203nm；流速1ml/min；柱温35℃。

1、对照品溶液配制

称取亚油酸对照品180mg，精密称定，用甲醇定容至20ml，精密吸取1ml，用甲醇稀释至50ml，制得0.18mg/ml的亚油酸对照品溶液。

2、供试品溶液配制

称取心脑清软胶囊内容物140mg，精密称定，用甲醇定容至25ml，精密吸取1ml，用甲醇稀释至25ml，制得样品溶液。

3、仪器精密度试验

精密吸取亚油酸对照品溶液5μl，进样分析，连续6次，计算峰面积，RSD为0.6%。

4、标准曲线绘制和线性范围

精密吸取亚油酸对照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0μl，进样分析，以亚油酸进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线为y=1732.9x+12.38（r=0.9999），亚油酸在0.09μg～1.8μg范围内，线性关系良好。

5、方法精密度试验

称取心脑清软胶囊内容物样品140mg，精密称定，平行6份，按实施例1中供试品溶液配制方法制备，各吸取5μl进样分析，采用标准曲线法计算亚油酸含量，计算含量的RSD为1.0%。

6、亚油酸含量测定结果

分别称取10批心脑清软胶囊样品，精密称定，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，各吸取5μl进样分析，采用标准曲线法计算亚油酸含量，结果见表1。

表1心脑清软胶囊中亚油酸含量测定结果

批次	称样量/mg	峰面积	含量/%
				1	134.44	1700.9	90.6
2	179.78	2288.7	91.3
				3	138.17	1756.2	91.0
4	135.28	1733.6	91.8
				5	135.10	1660.2	88.0
6	171.17	2192.7	91.9
				7	135.04	1717.9	91.1
8	133.65	1677.3	89.8
				9	129.68	1657.7	91.5
10	149.34	1897.4	91.0

7、回收率试验

称取心脑清软胶囊样品70mg，精密称定，平行6份，加入一定量的亚油酸对照品，按照实施例1中供试品溶液制备方法配制供试品溶液，测定含量，计算回收率，平均回收率为99.7%，RSD为0.3%。

实施例2心脑清软胶囊中亚油酸的含量检测

实验试剂与仪器

试剂：心脑清软胶囊（市售，由神威药业有限公司生产）；亚油酸对照品购于SIGMA公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。

1、对照品溶液配制

2、供试品溶液配制

称取批次1心脑清软胶囊内容物140mg，精密称定，用50%甲醇定容至25ml，精密吸取1ml，用50%甲醇水溶液(V/V)稀释至25ml，制得样品溶液，平行制备3个样品。

3、亚油酸含量测定结果

将上述供试品溶液，各吸取5μl进样分析，采用标准曲线法计算亚油酸含量，结果见表2。

表2批次1心脑清软胶囊中亚油酸含量测定结果

样品	称样量/mg	峰面积	含量/%
				1	133.08	1685.9	90.6
2	136.58	1725.6	90.5
				3	140.02	1768.3	90.5

实施例3心脑清软胶囊中亚油酸的含量检测

实验试剂与仪器

1、对照品溶液配制

2、供试品溶液配制

称取批次1心脑清软胶囊内容物140mg，精密称定，用75%甲醇定容至25ml，精密吸取1ml，用75%甲醇水溶液(V/V)稀释至25ml，制得样品溶液，平行制备3个样品。

3、亚油酸含量测定结果

将上述供试品溶液，各吸取5μl进样分析，采用标准曲线法计算亚油酸含量，结果见表3。

表3批次1心脑清软胶囊中亚油酸含量测定结果

样品	称样量/mg	峰面积	含量/%
				1	138.54	1748.3	90.4
2	142.56	1805.2	90.7
				3	146.32	1854.4	90.8

实施例4百多宁注射液中游离脂肪酸的含量检测

实验试剂与仪器

试剂：百多宁注射液（由鸦胆子油和薏苡仁油按照等体积混合后，以注射用卵磷脂为主要乳化剂，运用高压匀制法制备而成的油相为10%（wt）的静脉注射用亚微乳剂），共3批次；亚油酸对照品、油酸对照品、软脂酸对照品、硬脂酸对照品均购于SIGMA公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。

色谱条件：色谱柱Agilent XDB ODS色谱柱（4.6×250mm，5μm）；流动相乙腈-水（体积比65:35）；检测波长203nm；流速1ml/min；柱温25℃。

1、对照品溶液配制

分别称取亚油酸对照品150mg、油酸对照品480mg、软脂酸对照品90mg和硬脂酸对照品30mg，精密称定，置于20ml容量瓶中，甲醇定容至20ml。再分别精密吸取1ml，用甲醇稀释至50ml，制得浓度分别为0.15mg/ml、0.48mg/ml、0.09mg/ml、0.03mg/ml的混合标准品溶液。

2、供试品溶液配制

取百多宁注射液0.4g，用甲醇定容至25mL，再取1ml，用甲醇稀释至20ml，配制样品

溶液。

3、仪器精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μl，进样分析，连续6次，计算亚油酸、油酸、软脂酸、硬脂酸各个峰面积RSD，分别为0.6%、0.8%、0.4%、0.9%。

4、标准曲线绘制和线性范围

分别精密吸取混合标准品溶液3μl、5μl、10μl、15μl、20μl，进行液相色谱分析，以各标准品的质量为横坐标、峰面积为纵坐标，分别进行线性回归分析，得各回归方程：亚油酸y=9.8413x-0.0214（r=0.9997），线性范围：45-300ng；油酸y=11.01x-0.0091（r=0.9995），线性范围：144-960ng；软脂酸y=11.236x-0.0105（r=0.9999），线性范围：27-180ng；硬脂酸y=3.346x+0.0032（r=0.9998），线性范围：9.7-65ng。

5、方法精密度试验

称取百多宁注射液样品0.4g，精密称定，平行6份，按实施例4中供试品溶液制备方法制备供试品溶液，各吸取10μl进样分析，采用标准曲线法计算样品中亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸的含量，计算含量的RSD分别为1.6%、1.8%、2.0%、2.5%。

6、样品中脂肪酸含量测定

分别精密称取3批百多宁注射液，按实施例4中供试品溶液配制方法制备供试品溶液，各吸取10μl进样分析，采用标准曲线法计算样品中亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸的含量，结果见表4。

表4百多宁注射液中游离脂肪酸含量（%）测定结果

批号	称样量/g	亚油酸含量/%	油酸含量/%	软脂酸含量/%	硬脂酸含量/%
						1	0.42	2.15	5.92	1.21	0.50
2	0.40	2.13	5.88	1.23	0.49
						3	0.41	2.09	5.94	1.30	0.49

7、回收率试验

称取百多宁注射液样品0.2g，精密称定，平行6份，分别加入一定量的亚油酸对照品、油酸对照品、软脂酸对照品和硬脂酸对照品，按照实施例4中供试品溶液配制方法配制供试品溶液，测定亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸的含量，计算回收率，结果平均回收率分别为99.5%、98.7%、99.2%和101.3%，RSD分别为0.8%，0.6%，1.0%，1.3%。

实施例5百多宁注射液中游离脂肪酸的含量检测

实验试剂与仪器

试剂：百多宁注射液（实施例4中制备的样品），共3批次；亚油酸对照品、油酸对照品、软脂酸对照品、硬脂酸对照品均购于SIGMA公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。

色谱条件：色谱柱AgilentXDB ODS色谱柱（4.6×250mm，5μm）；流动相乙腈-水（体积比65:35）；检测波长203nm；流速1ml/min；柱温25℃。

1、对照品溶液配制

2、供试品溶液配制

分别精密称取3批百多宁注射液0.4g，用50%(V/V)甲醇定容至25mL，再取1ml，用50%(V/V)甲醇水溶液稀释至20ml，配制样品溶液。

3、样品中脂肪酸含量测定结果

将上述供试品溶液，各吸取10μl进样分析，采用标准曲线法计算样品中亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸的含量，结果见表5。

表5百多宁注射液中游离脂肪酸含量（%）测定结果

批号	称样量/g	亚油酸含量/%	油酸含量/%	软脂酸含量/%	硬脂酸含量/%
						1	0.43	2.10	5.96	1.17	0.52
2	0.39	2.08	5.93	1.26	0.46
						3	0.41	2.03	5.89	1.29	0.53

实施例6百多宁注射液中游离脂肪酸的含量检测

实验试剂与仪器

1、对照品溶液配制

2、供试品溶液配制

分别精密称取3批百多宁注射液0.4g，用80%（V/V）甲醇定容至25mL，再取1ml，用80%(V/V)甲醇水溶液稀释至20ml，配制样品溶液。

3、样品中脂肪酸含量测定结果

将上述供试品溶液，各吸取10μl进样分析，采用标准曲线法计算样品中亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸的含量，结果见表6。

表6百多宁注射液中游离脂肪酸含量（%）测定结果

批号	称样量/g	亚油酸含量/%	油酸含量/%	软脂酸含量/%	硬脂酸含量/%
						1	0.42	2.06	5.99	1.19	0.54
2	0.41	2.13	5.95	1.21	0.49
						3	0.41	2.05	5.85	1.32	0.49

实施例7苏子油软胶囊中α-亚麻酸含量检测

实验试剂与仪器

试剂：苏子油软胶囊（成分苏子油.），市售，福州三爱药业有限公司生产；α-亚麻酸对照品购于SIGMA公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。

仪器：高效液相色谱仪（美国Agilent公司，1200型，紫外检测器）。

色谱条件：色谱柱Agilent XDB ODS色谱柱（4.6×250mm,5μm）；流动相乙腈-水（体积比90:10）；检测波长205nm；流速1ml/min；柱温30℃。

3、对照品溶液配制

称取α-亚麻酸对照品100mg，精密称定，用甲醇定容至25ml，精密吸取1ml，用甲醇稀释至50ml，制得0.08mg/ml的α-亚麻酸对照品溶液。

4、供试品溶液配制

称取苏子油软胶囊内容物100mg，精密称定，用甲醇定容至25ml，精密吸取1ml，用甲醇稀释至50ml，制得样品溶液。

3、仪器精密度试验

精密吸取α-亚麻酸对照品溶液5μl，进样分析，连续6次，计算峰面积，RSD为0.7%。

4、标准曲线绘制和线性范围

精密吸取α-亚麻酸对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μl，进样分析，以α-亚麻酸进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线为y=7376.6x-1.354（r=0.9999），α-亚麻酸在0.08μg～0.8μg范围内，线性关系良好。

5、方法精密度试验

称取同一批次苏子油软胶囊内容物样品100mg，精密称定，平行6份，按上述供试品溶液制备方法制备，各吸取5μl进样分析，采用标准曲线法计算α-亚麻酸含量，计算含量的RSD为1.2%。

6、亚油酸含量测定结果

分别称取6批苏子油软胶囊样品，精密称定，按实施例7中供试品溶液的配制方法制备供试品溶液，各吸取5μl进样分析，采用标准曲线法计算α-亚麻酸含量，结果见表7。

表7苏子油软胶囊中α-亚麻酸含量测定结果

批次	称样量/mg	峰面积	α-亚麻酸含量/%
				1	103.23	3025.5	79.5
2	105.08	3120.4	80.5
				3	98.62	2998.3	82.4
4	96.35	2859.6	80.4
				5	104.71	3103.7	80.3
6	98.32	2993.6	82.5

7、回收率试验

称取苏子油软胶囊样品50mg，精密称定，平行6份，加入一定量的α-亚麻酸对照品，按照上述供试品溶液制备方法配制供试品溶液，测定含量，计算回收率，平均回收率为100.3%，RSD为0.5%。

Claims

1.一种复方中药制剂中游离脂肪酸的含量检测方法，其特征在于它包括以下步骤：

（c）用高效液相色谱仪测定对照品溶液和供试品溶液，并采用紫外-检测器检测色谱信号得色谱图；色谱条件与系统适用性试验为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，体积比50∶50～90∶10的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长是201—205nm；

（d）绘制对照品标准曲线，根据待检测复方中药制剂样品峰面积和标准曲线，计算待检测复方中药样品中游离脂肪酸的含量。

2.根据权利要求1所述的复方中药制剂中游离脂肪酸的含量检测方法，其特征在于所述的游离脂肪酸为亚油酸、亚麻酸、油酸、硬脂酸或软脂酸中的任意一种或其中两种、两种以上的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的复方中药制剂中游离脂肪酸的质量检测方法，其特征在于所述的待检测复方中药制剂是心脑清软胶囊；所述的游离脂肪酸是亚油酸；所述的对照品溶液的制备为：精确称取亚油酸对照品180mg，用甲醇定容至20mL后，再取1ml，用甲醇稀释至50mL，配制亚油酸对照品溶液；所述的供试品溶液的制备为：取心脑清软胶囊内容物0.1-0.2g，用体积比浓度为50～100％的甲醇水溶液定容至25mL后，再取1ml，稀释至25mL，配制供试品样品溶液；所述的色谱条件与系统适用性试验为：碳十八烷基键合硅胶为填充剂，体积比75∶25的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长是203nm。

4.根据权利要求1或2所述的复方中药制剂中游离脂肪酸的含量检测方法，其特征在于所述复方中药制剂是百多宁注射液；所述的游离脂肪酸是亚油酸、油酸、软脂酸和硬脂酸；所述的对照品溶液的制备为：精确称取亚油酸对照品150mg、油酸对照品480mg、软脂酸对照品90mg和硬脂酸对照品30mg，用甲醇定容至20mL后，再取1ml，用甲醇稀释至50mL，配制混合标准品溶液；所述的供试品溶液的制备为：取百多宁注射液0.4g，用50～10体积比浓度为50～100％的甲醇水溶液定容至25mL，再取1ml，稀释至20ml，配制供试品溶液；所述的色谱条件与系统适用性试验为：十八烷基键合硅胶为填充剂，体积比65∶35的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长是203nm。

5.根据权利要求1或2所述的复方中药制剂中游离脂肪酸的含量检测方法，其特征在于所述复方中药制剂是苏子油软胶囊；所述的游离脂肪酸是α-亚麻酸；所述的对照品溶液的制备为：精确称取α-亚麻酸对照品100mg、用甲醇定容至25mL后，再取1ml，用甲醇稀释至50mL，配制α-亚麻酸对照品溶液；所述的供试品溶液的制备为：取苏子油软胶囊内容物100mg，用甲醇定容至25mL，再取1ml，稀释至50ml，配制供试品溶液；所述的色谱条件与系统适用性试验是：十八烷基键合硅胶为填充剂，体积比90∶10的乙腈：水为流动相，流速为1ml/min，检测波长是203nm。