CN110208396A - 一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法 - Google Patents

一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量同时测定的方法，应用于含量测定技术领域。本发明方法属于高效液相色谱法，包括液相色谱条件的筛选、溶液的配制和样品测定。本发明用同一个液相色谱条件即可同时测定伊维菌素和克洛索隆两种主药的含量，降低了原方法分别测定的操作复杂性，提高了检测效率。

Description

一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高 效液相色谱法
技术领域
本发明涉及一种复方注射液含量测定方法，具体涉及一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法。
背景技术
伊维菌素克洛索隆注射液为我公司研发的兽用复方制剂驱虫药，主要成分为伊维菌素和克洛索隆，注射液的规格为每1ml含伊维菌素 10mg、克洛索隆100mg。其中伊维菌素为大环内酯类抗寄生虫药，克洛索隆为磺胺类驱虫药，其余成分为溶剂、抗氧剂等辅料。由于该品种在中国兽药典、国家其他法定标准中无收载，国外药典例如美国药典中虽有该复方注射液标准的收载，但标准中含量测定的方法采用的是两种方法分别测定，这就需要建立两种不同的色谱条件并分别配制对照品溶液和供试品溶液，操作复杂。
发明内容
本发明提供了一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主成分含量的高效液相色谱法，该方法的发明简化了原方法中分别测定时溶液的配制和测定的操作复杂性，使得伊维菌素克洛索隆注射液含量的测定更加准确、方便、高效。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：
(A)液相色谱条件的选定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，0.5％的醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱；检测波长为254nm；克洛索隆峰与伊维菌素峰分离良好，伊维菌素H2B1a峰与伊维菌素H2B1b峰分离度大于3.0。
(B)溶液的配制
对照品溶液的配制：取克洛索隆对照品和伊维菌素对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成同时包含克洛索隆和伊维菌素的对照品溶液，每ml对照品溶液中包含0.4mg克洛索隆、0.04mg伊维菌素。
供试品溶液的配制：取伊维菌素克洛索隆注射液适量，加甲醇稀释制成每ml供试品溶液中含0.4mg克洛索隆、0.04mg伊维菌素。
(C)样品的测定
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行梯度洗脱，按外标法以峰面积计算供试品溶液的浓度。
本发明的进一步改进在于，梯度洗脱的具体过程为：0-10分钟用流动相A、流动相B组成的混合流动相进行洗脱，10-30分钟用流动相A、B、C组成的混合流动相洗脱，30-40分钟用流动相A、流动相B组成的混合流动相进行洗脱；所述流动相A、B混合流动相中包含体积比65％的流动相A和35％的流动相B，所述流动相A、B、C混合流动相包含体积比7％的流动相A、60％的流动相B和33％的流动相C。
由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：
本发明用同一个液相色谱条件即可同时测定伊维菌素与克洛索隆两种主成分的含量，原来的方法需进行四次液相色谱测试和配制四种溶液，现在只需进行两次液相色谱测试和配制两种溶液即可，缩短了液相色谱检测的时间和操作，提高了效率。本发明方法经过方法学系统的验证，准确度高，重现性好，适于在质量控制标准中采用，有利于大面积推广使用。
本发明所述方法中，伊维菌素和克洛索隆的浓度含量与峰面积之间存在良好的线性关系，因此本发明方法中伊维菌素和克洛索隆的含量计算方法可以通过简单的外标法计算得到，计算方法简单。
(一)关于本发明方法的专属性
(1)克洛索隆对照品溶液的配制：取克洛索隆对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含0.4mg克洛索隆的溶液，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)。
(2)伊维菌素对照品溶液的配制：取伊维菌素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含0.04mg伊维菌素的溶液，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。
(3)混合对照品溶液的配制：分别取克洛索隆、伊维菌素对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.4mg克洛索隆和 0.04mg伊维菌素的溶液，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图3)。
(4)供试品溶液的配制：取伊维菌素克洛索隆注射液0.2ml置 50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图4)。
色谱检测结果见表1。
表1对照品溶液与供试品溶液的专属性对比
由表1可知，对照品溶液色谱图中与供试品溶液色谱图中主峰的保留时间一致，供试品溶液中主峰与相邻杂质峰的分离度符合要求，该方法的专属性良好。
(二)关于方法的准确性和重现性
对伊维菌素克洛索隆注射液采用本方法同时测定两种主药的含量，并分别采用2015版中国兽药典中伊维菌素含量测定方法及USP 中克洛索隆含量测定方法测定，测定结果见表2，本方法6次含量测定结果的RSD分别为0.28％、0.39％，已收载方法6次测定结果的RSD 分别为0.35％、0.52％，证明本方法的准确度与重现性均符合要求。
表2准确度及重现性实验结果
(三)关于本发明方法中溶液浓度与峰面积的线性关系
分别取克洛索隆、伊维菌素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含0.8mg克洛索隆和0.08mg伊维菌素的溶液，分别精密量取上述溶液3ml、4ml、5ml、6ml、7ml置10ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样，记录色谱图。分别以峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x作图，其回归方程分别为：克洛索隆：y克洛索隆＝3×1010x-260290(R2＝0.9998)，伊维菌素：y伊维总＝3× 1010x-48415(R2＝0.9991)，结果见表3和图5-6。
表3溶液浓度与峰面积测定结果
由表3和图5-6可得，本发明方法测定的克洛索隆在0.2585-0.6031mg/ml浓度范围、伊维菌素在0.02255-0.05262mg/ml 浓度范围内线性关系良好。
附图说明
图1为克洛索隆对照品溶液的液相色谱图，
图2为伊维菌素对照品溶液的液相色谱图，
图3为混合对照品溶液的液相色谱图，
图4为供试品伊维菌素克洛索隆注射液溶液的液相色谱图
图5为克洛索隆溶液浓度与峰面积的线性关系图，
图6为伊维菌素溶液浓度与峰面积的线性关系图。
具体实施方式
对本发明做进一步详细说明：
(A)色谱条件的选定
采用高效液相色谱仪(Waters e2695)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，0.5％的醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相 B，甲醇为流动相C，按下表进行梯度洗脱；检测波长为254nm；要求克洛索隆峰与伊维菌素峰分离良好，伊维菌素H2B1a峰与伊维菌素H2B1b峰分离度大于3.0。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 流动相C(％)
0～10 65 35 0
10～12 65→7 35→60 0→33
12～30 7 60 33
30～31 7→65 60→35 33→0
31～40 65 35 0
(B)对照品溶液的制备
分别取克洛索隆、伊维菌素对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.4mg克洛索隆和0.04mg伊维菌素的溶液。
(C)供试品溶液的配制
取伊维菌素克洛索隆注射液0.2ml置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(D)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，即得。
测得结果：克洛索隆、伊维菌素的含量分别为99.6％、101.2％。

Claims (4)

1.一种同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法，其特征在于包括如下步骤：
(A)液相色谱条件的选定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，0.5％的醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱；检测波长为254nm；克洛索隆峰与伊维菌素峰分离良好，伊维菌素H2B1a峰与伊维菌素H2B1b峰分离度大于3.0；
(B)溶液的配制
对照品溶液的配制：取克洛索隆对照品和伊维菌素对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成同时包含克洛索隆和伊维菌素的对照品溶液，每ml对照品溶液中包含0.4mg克洛索隆、0.04mg伊维菌素；
供试品溶液的配制：取伊维菌素克洛索隆注射液适量，加甲醇稀释制成每ml供试品溶液中含0.4mg克洛索隆、0.04mg伊维菌素；
(C)样品的测定
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行梯度洗脱，按外标法以峰面积计算供试品溶液的浓度。
2.根据权利要求1所述的同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法，其特征在于：流动相A中冰醋酸的浓度为0.1％-0.8％。
3.根据权利要求2所述的同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法，其特征在于：流动相A中冰醋酸的浓度为0.5％。
4.根据权利要求1所述的同时测定伊维菌素克洛索隆注射液中两种主药含量的高效液相色谱法，其特征在于所述步骤C中，梯度洗脱的具体过程为：0-10分钟用流动相A、流动相B组成的混合流动相进行洗脱，10-30分钟用流动相A、B、C组成的混合流动相洗脱，30-40分钟用流动相A、流动相B组成的混合流动相进行洗脱；所述流动相A、B混合流动相中包含体积比65％的流动相A和35％的流动相B，所述流动相A、B、C混合流动相包含体积比7％的流动相A、60％的流动相B和33％的流动相C。
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