CN102994595B - 一种融合蛋白包涵体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种融合蛋白包涵体的制备方法，包括以下几个步骤：工程菌破碎步骤、包涵体的洗涤步骤、包涵体变性溶解和过滤步骤。本发明的有益效果是：制备得到的包涵体变性溶解液的澄清度显著增加，滤器过滤容量亦明显增加。

Description

一种融合蛋白包涵体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白包涵体的制备方法，尤其涉及一种适合工业化且低成本的Mtb72f融合蛋白包涵体的制备方法。

背景技术

目前来说，高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌在大量合成异源蛋白质时，一般情况下以包涵体的形式存在于细菌内。包涵体由高度聚集的外源蛋白质、核酸及蛋白质合成酶及核糖体组成。其中大部分（50%以上）是克隆外源基因的表达产物，它们具有工程菌表达的外源基因的正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错误的，因而没有生物活性。由于包涵体位于细菌细胞内且没有生物活性，需经细胞裂解后经提取洗涤后变性复性及纯化步骤方能得到有活性的蛋白质。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种融合蛋白包涵体的制备方法，包括以下几个步骤：工程菌破碎步骤、包涵体的洗涤步骤、包涵体变性溶解和过滤步骤。

优选的，所述工程菌破碎步骤包括以下几个步骤：

1）取Mtb72f工程菌菌株接种于发酵罐中按流加补料的方式进行高密度发酵，当发酵液OD_650nm=50时加入IPTG于37℃进行诱导，诱导5小时后收获菌体。按每100g菌体配1L的比例取一定量的菌体添加入预冷的裂解缓冲液（pH=7.0,10mM bis-tris 丙烷）中，得到菌体复溶液。将菌体复溶液用高速均质机均质处理，均质后冷却到5至10℃。

2）将步骤1得到的样品用高压匀浆机进行菌体破碎，所述高压匀浆机压力调节为一级850-900 bars，二级100-150bars、所述一级和二级的总压力为1000±50bars。

3）将步骤2所得到的样品再重复一次步骤2，处理完毕后获得菌体破碎液；

优选的，所述包涵体的洗涤步骤包括以下几个步骤：

4）将步骤3所得到的菌体破碎液中加入等体积的裂解缓冲液，混匀后用高速离心机收集包涵体沉定，离心结束后收集包涵体，添加包涵体清洗缓冲液（pH=7.0,2M尿素，10mMbis-tris 丙烷）至步骤1中菌体复溶时相当的体积，用高速均质机均质处理，

5）用离心机收集包涵体沉淀，再在包涵体沉淀中添加少量清洗缓冲液体后用高速均质处理后制成包涵体悬液。

优选的，所述包涵体的变性溶解步骤包括：将步骤4所述得到的包涵体悬液加入pH=7.0, 浓度为8M尿素的包涵体变性缓冲液溶解完全；

优选的，所述过滤步骤包括将步骤4得到的包涵体变性液直接用滤器进行澄清过滤；或者离心后取上清用滤器进行澄清过滤。

优选的，步骤2中，所述样品进入所述高压匀浆机时温度应控制在5至10℃，所述样品出口时温度为10至25℃。

优选的，收集包涵体沉定时的温度为10至15℃。

优选的，离心过程中温度为10至15℃。

本发明为中国发明专利“用于治疗或预防结核分枝杆菌引起的结核病的新方法”（中国专利申请号：200680023551.3）相关专利，具体涉及表达Mtb72f多肽疫苗的大肠杆菌工程菌的裂解参数的优化和相关的纯化后复性工艺的优化。

200680023551.3披露的Mtb72f生产工艺为：E. coli工程菌的发酵及诱表达，收获工程菌，细胞裂解，包涵体收获及洗涤，包涵体在变性条件下溶解。其后，溶解的包涵体经过滤后直接进行下游纯化及用切向流过滤（超滤）进行复性。原工艺所涉及的细胞裂解步骤为使用高压均浆机进行。其后，包涵体用离心机进行收集并进行清洗。清洗后的包涵体由包含尿素的变性缓冲液充分溶解并过滤后方能进行下一步的纯化步骤。

披露的发明专利中高压均质机细胞破碎为实验室小型设备，处理量低；另一方面，压力设为11，000±100psi （即在750bar-760bar之间），为了使工程菌破碎完全，需重复处理5次。而在操作过程中，为了保存目标蛋白活性和质量，每次破碎前需将悬液预冷至10℃以下，由于破碎的低效率和过于繁琐的操作导致整个细胞裂解时间过长，会影响蛋白的质量，并且不适合大规模的工业化生产。故用工业级的高压均质机进行工艺放大时需调整压力参数减少破碎次数。我们在研究中发现，在使用存在一、二级分级调节阀为模式的工业级高压均质机时，在一级阀压力大于或等于750 bar，总压力为1000bar的情况下，经两次处理工程菌细菌都能完全破碎，但将操作压力限定在一个狭窄的范围时（一级阀压力为850bar-900bar,二级阀压力为100bar-150bar）时，经两次破碎处理，下游制备得到的包涵体变性溶解液的澄清度显著增加（浊度显著下降），滤器过滤容量亦明显增加。更重要的是，下游纯化结果表明目标蛋白纯度显著提高。

具体实施方式

对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1：

菌体复溶：

取Mtb72f工程菌菌株接种于发酵罐中按流加补料的方式进行高密度发酵。当发酵液OD650nm=50时加入IPTG于37℃进行诱导，诱导5小时后收获菌体。取一定量的菌体（≥16L发酵收获时的菌体量），加入预冷的裂解缓冲液，调节菌体复溶液至OD₆₅₀nm≈60。将菌体复溶液用高速均质机均质处理，均质后冷却到≤10℃。

实施例2

菌体破碎：

将冷却匀浆后的样品用高压匀浆机进行菌体破碎，高压匀浆机压力调节为二级100-150bars、一级850-900 bars，破碎总压力为1000±50bars；匀浆机入口样品温度应控制在≤10℃，出口样品温度必须≤25℃。同一批样品破碎处理两次，处理完毕后获得菌体破碎液。

实施例3

菌体破碎液离心及清洗：

在菌体破碎液中加入同体积的裂解缓冲液，混匀后用工业规模的离心机（如管式高速离心机）收集包涵体沉定，过程温度小于15℃。离心结束后收集包涵体，添加包涵体清洗缓冲液至菌体复溶时相当的体积，用高速均质（如Ultra Turrax T50） 均质处理，后用离心机收集包涵体沉淀，过程温度同样小于15℃。重复一次包涵体清洗和离心操作步骤。收集包涵体，添加少量清洗缓冲液体后用高速均质处理后制成包涵体悬液交纯化工序。

实施例4：

包涵体变性溶解及过滤：

缓慢将包涵体悬液样品滴加入包涵体溶解缓冲液中（体积为对应的菌体收获液的1/2），搅拌器300rpm、室温不断搅拌约2h。然后进行包涵体变性液过滤。料液可直接用深层滤器（如PALL公司的Supracap系列）进行澄清过滤；亦可采用离心（如8000g离心15min）后取上清用囊式滤器进行澄清过滤。滤液的浊度应小于10NTU，用于包涵体目标蛋白的纯化。

实施例5

处理16L菌液对应的菌体：

菌体复溶，细胞破碎参数为：第一次破碎：一级阀压力：750bars，二级阀压力：200bars；第二次破碎：一级阀压力：900bars，二级阀压力：100bars。

实施例6

处理16L菌液对应的菌体：

菌体复溶。菌体破碎时，细胞破碎参数为：一级阀压力：900bars，二级阀压力：100bars，破碎操作两次。

实施例5和实施例6的包涵体所用的高压均质机为Niro Soavi公司。

实施例5和实施例6具有相同的离心及清洗操作：在菌体破碎液中加入同体积的裂解缓冲液，混匀后用管式高速离心机（型号：GQ75,16500g，进料速度400ml/min)收集包涵体沉定，过程温度小于15℃。离心结束后收集包涵体，添加包涵体清洗缓冲液至菌体复溶时相当的体积，用高速均质（如Ultra Turrax T50） 均质处理，后用管式高速离心机（型号：GQ75,16500g，进料速度200ml/min)收集包涵体沉淀，过程温度同样小于15℃。重复一次包涵体清洗和离心操作步骤。收集包涵体，添加少量清洗缓冲液体后用高速均质处理后制成包涵体悬液交纯化工序。

包涵体清洗后进行包涵体变性溶解，实施例5和实施例6的步骤相同：取相当于8L收获菌体来源的包涵体悬液缓慢将包涵体悬液样品滴加入包涵体溶解缓冲液中（体积约为4L），搅拌器300rpm、室温不断搅拌约2h。然后进行包涵体变性液过滤。

不同破碎压力下的制备的包涵体变性液取样，用浊度计检测样品浊度并用深层滤器（PALL公司的PDH4，有效过滤面积为26cm²）进行过滤。过滤时，速度控制在3.4ml/min。随着过滤量的增加，过滤压力渐增，当过滤压力显示达到15psi上限时，停止过滤。根据滤过液体积计算深层滤器单位面积的过滤容量。同时，分别对滤前、滤后液取样，用浊度计检测样品浊度，并用SDS-PAGE蛋白电泳结合考马斯亮蓝染色法检测过滤前后等稀释度和等体积上样条件下的目标蛋白条带的光密度比值，计算回收率。结果见表1。

从表1可见：实施例5和实施例6之间比较，细胞破碎总压力都达到1000bars，但一级阀压力较高的后者制备的包涵体质量较好，相应的变性液浊度较低，提高了一次性滤器的过滤容量，降低了过滤成本。

表1 不同破碎压力下制备的包涵体变性溶解及过滤结果

其中，浊度根据浊度计测得，而回收率根据上文提到的SDS-PAGE目标蛋白光密度值比较而得。

实施例7-9皆选用18L的菌液，操作方法如实施例5和6的方法相同，不同操作压力参数下不同纯化批结果比较，见表2。

表2 破碎压力下制备的包涵体纯化结果

从表2可知，不同操作压力下制备的包涵体其对应的纯化产量一致，但质量存在区别。在一级阀压力为800bars，二级阀压力为200bars的情况下制备的包涵体，其对应的纯化样品纯度较高，未检测出宿主残余蛋白。

实验设备与材料说明：

1、包涵体变性液的澄清过滤：样品以瓶式离心机进行离心（8000g, 20min）后取上清，用Sartorius的囊式滤器（Sartopore 2–400，0.45um-0.2um）进行过滤。

2、Q-Sepharose F.F层析柱参数：填装柱直径 = 200 mm, 截面积 = 314 cm2, 柱床高度 = 13.5 cm, 填装体积约 4.24 L。

3、羟基磷灰石 (CHT)层析柱参数：总共 200g柱料填装于XK50/30 柱中,柱床高度=15cm。

4、蛋白含量检测：微克BCA法，按Pierce公司的相关试剂操作书进行操作。

5、宿主蛋白（HCP）检测：Western blotting法检测，一抗为Anti-HCP 豚鼠抗血清，二抗为兔抗豚鼠IgG抗体，TMB法进行显色。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种融合蛋白包涵体的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：工程菌破碎步骤、包涵体的洗涤步骤、包涵体变性溶解和过滤步骤；所述工程菌破碎步骤为：

1)取Mtb72f工程菌菌株接种于发酵罐中按流加补料的方式进行高密度发酵，当发酵液OD650nm＝50时加入IPTG于37℃进行诱导，诱导5小时后收获菌体；

取一定量的菌体加入预冷的裂解缓冲液，得到菌体复溶液，调节菌体复溶液至OD650nm＝60，再将菌体复溶液用高速均质机均质处理，均质后冷却到5至10℃；

2)将步骤1得到的样品用高压匀浆机进行菌体破碎，所述高压匀浆机压力调节为一级850-900bars，二级100-150bars、所述一级和二级的总压力为1000±50bars；所述样品进入所述高压匀浆机时温度应控制在5至10℃，所述样品出口时温度为10至25℃；

3)将步骤2所得到的样品再重复一次步骤2，处理完毕后获得菌体破碎液。

2.如权利要求1所述的融合蛋白包涵体的制备方法，其特征在于，所述包涵体的洗涤步骤为：

4)将步骤3所得到的菌体破碎液中加入等体积的pH＝7.0，浓度为10mM的bis-tris丙烷裂解缓冲液，混匀后用高速离心机收集包涵体沉淀，离心结束后收集包涵体，添加包涵体清洗缓冲液至步骤1中菌体复溶时相当的体积，用高速均质机均质处理；

5)用离心机收集包涵体沉淀，再在包涵体沉淀中添加清洗缓冲液体后用高速均质处理后制成包涵体悬液。

3.如权利要求2所述的融合蛋白包涵体的制备方法，其特征在于，所述包涵体的变性溶解步骤为：将步骤4所述得到的包涵体悬液加入pH＝7.0，浓度为8M尿素的包涵体变性缓冲液溶解完全。

4.如权利要求3所述的融合蛋白包涵体的制备方法，其特征在于，所述过滤步骤为将步骤4得到的包涵体变性液直接用滤器进行澄清过滤；或者离心后取上清用滤器进行澄清过滤。

5.如权利要求2所述的融合蛋白包涵体的制备方法，其特征在于，收集包涵体沉淀时的温度为10至15℃。

6.如权利要求2所述的融合蛋白包涵体的制备方法，其特征在于，离心过程温度同样时的温度为10至15℃，离心速度为20000rpm，样品泵入速度200-240mL/min，离心入口温度为5-10℃，离心出口温度为5-15℃。