CN102947306A

CN102947306A - 作为syk抑制剂的7-(1h-吡唑-4-基)-1,6-萘啶化合物

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Publication number: CN102947306A
Application number: CN2011800318413A
Authority: CN
Inventors: F·L·阿特金森; M·D·巴克尔; C·杜奥尔特; N·S·加顿; J·利德尔; V·K·帕特尔; A·G·S·普雷斯顿; D·M·威尔逊
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2013-02-27
Also published as: JP2013525405A; CA2796954A1; MX2012012614A; BR112012027198A2; EP2563789B1; EA201290910A1; WO2011134971A1; US20130040984A1; SG184513A1; KR20130069653A; EP2563789A1; ES2543426T3; GB201007203D0; UY33359A; AR081138A1; US8633319B2; ZA201207859B; TW201206925A

Abstract

式(I)的化合物或其盐；

Description

作为SYK抑制剂的7-(1H-吡唑-4-基)-1,6-萘啶化合物

本发明涉及具有抗脾酪氨酸激酶（Syk）活性的新型化合物、它们的制备方法、含有它们的可药用制剂和它们在治疗中的用途。

Syk是参与将活化的免疫受体与介导多种多样的细胞反应（包括增殖、分化和吞噬）的信号下游事件结合的非受体酷氨酸激酶。Syk在造血细胞中广泛表达。Syk抑制剂具有潜在的抗炎和免疫调节活性。它们抑制Syk-介导的IgG Fc ε和γ受体和BCR受体信号传导，以致抑制肥大细胞、巨噬细胞和B-细胞的活化和相关的炎性疾病反应和组织损伤。相应地，Syk抑制剂在许多治疗领域，包括类风湿性关节炎、B-细胞淋巴瘤和哮喘/鼻炎的治疗中已引起兴趣。

类风湿性关节炎（RA）是影响大约1%人群的自身免疫病。其以造成骨和软骨的衰弱破坏的关节发炎为特征。使用造成可逆B细胞消耗的利妥昔单抗的近期临床研究（J.C.W. Edwards等人，New Eng. J. Med., 2004, 350, 25: 2572-2581）已表明，靶向B细胞功能是自身免疫病如RA中的适当治疗策略。临床益处与自身反应性抗体（或类风湿因子）的减少相关联，这些研究表明B细胞功能和实际上自身抗体产生对疾病中的持续病理学而言是极为重要的。

使用来自Syk缺乏小鼠的细胞的研究已证实这种激酶在B细胞功能中的非冗余作用。Syk的缺乏以B细胞发展受阻为特征（M. Turner等人, Nature, 1995, 378: 298-302和Cheng等人, Nature, 1995, 378: 303-306）。这些研究与对缺乏Syk的成熟B细胞的研究（Kurosaki等人Immunol. Rev. 2000, 176:19-29）一起证实Syk是B细胞的分化和活化所需的。因此，RA患者中的Syk的抑制有可能阻断B细胞功能和因此减少类风湿因子产生。除Syk在B细胞功能中的作用外，与RA治疗相关的还有在Fc受体（FcR）信号传导中需要Syk活性。在RA中通过免疫复合物活化FcR已表明有助于多种促炎介质的释放。

Wong等人（Expert Opinion Investigational Drugs, 2004, 13 (7): 743-762）已综述了Syk依赖性过程对RA病理学的贡献。

已经公开了对Syk抑制剂R788（fostamatinib disodium, Rigel）的12周临床试验结果：Treatment of rheumatoid arthritis with a syk kinase inhibitor: A twelve-week, randomized, placebo-controlled trial, Arthritis & Rheumatism, 58(11), 2008: 3309-3318。

Syk抑制剂也可用于癌症治疗，尤其是血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤。

研究已表明，在各种原发性B-淋巴瘤肿瘤中以及在B-淋巴瘤细胞系中通过超表达和/或组成性激活异常调节Syk。Syk通过PI3K/AKT途径、PLD途径和AKT独立信号传导激活mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶），其反过来提高B-细胞存活和增殖。Syk的抑制体外造成降低的mTOR活化和FL细胞中的阵挛减轻。在B淋巴瘤（BKS-2）的小鼠模型中用姜黄素抑制Syk激酶引起通过总脾细胞数测得的肿瘤负担的显著降低（Leseux L.等人, Blood 15 Dec 2006, 108(13): 4156-4162和Gururajan M.等人, Journal of Immunology, 2007, 178: 111-121）。

R788（fostamatinib disodium）在B-细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）复发性或难治性患者中的第2期临床试验结果表明这些患者良好耐受该化合物，以及在遭受弥漫性大B-细胞淋巴瘤（DLBCL）和慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）患者中的治疗益处。尽管实际上参与这一试验的患者都具有重病并已用商业疗法治疗失败，但他们中的相当多人特别响应R788的Syk抑制（www.Rigel.com; Friedberg J. W.等人, Blood, 1 April 2010; 115(13): 2578-85）。

Syk抑制剂也可用于治疗哮喘和鼻炎，因为它们在转导与交联FcεR1和/或FcγR1受体相关的下游细胞信号方面是重要的，且它们位于信号级联中的早期。在例如肥大细胞中，在受体-lgE复合物的过敏原交联后的FcεR1信号传导的早期序列涉及首先Lyn（Src家族酪氨酸激酶）和随后Syk。

过敏性鼻炎和哮喘是与超敏反应和涉及包括肥大细胞、嗜酸性细胞、T细胞和树突细胞在内的多种细胞类型的炎性事件相关的疾病。在接触过敏原后，IgE (FcεRI)和IgG (FcγRI)的高亲和力免疫球蛋白受体变得交联并激活肥大细胞和其它细胞类型中的下游过程，导致释放促炎介质和气道致痉原。在例如肥大细胞中，通过过敏原的IgE受体交联导致从预形成颗粒中释放介质，包括组胺，以及合成和释放新合成的脂质介质，包括前列腺素和白三烯。

在过敏性鼻炎治疗的第I/II期研究中鼻内给药的Syk抑制剂R112 (Rigel)表明导致PGD₂（与过敏性鼻漏的改进高度相关的关键免疫介质）的统计学上显著的降低以及在一系列指示剂中安全，由此提供局部Syk抑制剂的临床安全性和效力的最初证据（参见Meltzer E. O.等人，"An intranasal Syk kinase inhibitor (R112) improves the symptoms of seasonal allergic rhinitis in a park environment"; Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2005, 115(4): 791-796）。但是，在进一步第II期临床试验中，对过敏性鼻炎而言，R112据显示与安慰剂相比缺乏效力（www.clinicaltrials.gov Identifier NCT0015089）。

急性和慢性荨麻疹是被认为影响USA总人口的大约25%的常见皮肤病（参见"New concepts in chronic urticaria"; Current Opinions in Immunology, 2008, 20: 709-716）。尽管荨麻疹可被变态反应触发，但在许多情况下病因不明。在广泛水疱存在多于6周时，被定义为慢性自发性荨麻疹。慢性荨麻疹患者中在皮肤中的水疱程度方面有许多病理相似性，通过IgE活化产生过敏原诱发的肥大细胞和嗜碱性细胞脱粒反应。大约40%的慢性自发性荨麻疹患者含有靶向IgE或IgE受体（Fc Ε受体）的血清IgG自身抗体，这些被认为通过肥大细胞和嗜碱性细胞脱粒驱动组胺和其它介质释放。Syk抑制剂会抑制IgE介导的Fc Ε活化后的信号响应和抑制已知牵涉多种疾病中的慢性瘙痒的介质释放。

WO03/057695A1（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.）描述了具有Syk抑制剂活性的新型1,6-萘啶。这些在"Discovery and SAR of Novel [1,6] Naphthyridiness as Potent Inhibitors of Spleen Tyrosine Kinase (SYK)" (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 13 (2003): 1415 -1418)中进一步描述。此后两个更新的专利申请，WO2010/015518A2和WO2010/015520 A1（Boehringer Ingelheim International GmbH）分别描述了4-二甲基氨基-苯基取代的萘啶和取代萘啶。

WO04/035604A2（Millennium Pharmaceuticals, Inc.）公开了人Syk蛋白的结构配合物。

但仍然需要确认作为脾酪氨酸激酶（Syk）抑制剂的其它化合物。

因此，在本发明的第一方面中，本发明提供式(I)的化合物：

其中：

X是O或NH；

R¹是C_2-4烷基、C_3-7环烷基、羟基C_2-4烷基、C_1-2烷氧基C_1-4烷基、三氟甲基C_1-2烷基或苄基；

或其盐（下文称作“本发明的化合物”）。

一方面，X是NH。

在一个实施方案中，R¹是乙基、异丙基、叔丁基、环戊基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、羟乙基、2,2-羟甲基丙基、2,2,2-三氟乙基或苄基。在另一实施方案中，R¹是C_2-4烷基、C_3-7环烷基或C_1-2烷氧基C_1-4烷基。在另一实施方案中，R¹是乙基、叔丁基、-CH₂OCH₃、-CH₂C(CH₃)₂OH、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂OCH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CF₃、苄基或环戊基。在另一实施方案中，R¹是乙基、叔丁基或甲氧基甲基。在另一实施方案中，R¹是乙基或叔丁基。在另一实施方案中，R¹是叔丁基。

要理解的是，本发明包括上述取代基的所有组合。

要认识到，式(I)的化合物包含在哌啶环的3-碳处的手性中心。已经发现，由于更好的药物开发性质，包括更好的生物利用率（如在预测性动物药代动力学研究中测得）和较低的hERG活性，具有S绝对立体化学的那些通常优选。

相应地，在一个实施方案中，本发明提供具有S绝对立体化学的式(I)的化合物。在另一实施方案中，本发明提供具有S绝对立体化学的式(I)的化合物，即式(II)的化合物：

其中：

X和R¹如上定义；

或其盐。

本发明的化合物包括实施例1至11的化合物及其盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物，其选自：

7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺；

7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺；

N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-{1-[(甲氧基)甲基]-1H-吡唑-4-基}-1,6-萘啶-5-胺；

7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氧基)-1,6-萘啶；

1-{4-[5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氨基)-1,6-萘啶-7-基]-1H-吡唑-1-基}-2-甲基-2-丙醇；

2-{4-[5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氨基)-1,6-萘啶-7-基]-1H-吡唑-1-基}乙醇；

N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-{1-[2-(甲氧基)乙基]-1H-吡唑-4-基}-1,6-萘啶-5-胺；

7-(1-环戊基-1H-吡唑-4-基)-N-[(3-氟-3-哌啶基)甲基]-1,6-萘啶-5-胺；

N-[(3-氟-3-哌啶基)甲基]-7-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；

N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；

N-{[(3R)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；

N-[(3-氟-3-哌啶基)甲基]-7-[1-(苯基甲基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；

N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；

N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；和

N-{[(3R)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；

及其盐。

在另一实施方案中，本发明提供式(I)的化合物，其选自：

N-[(3-氟-3-哌啶基)甲基]-7-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺；和

及其盐。

在另一实施方案中，本发明提供式(I)的化合物，其选自：

7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺；和

及其盐。

在另一实施方案中，本发明提供式(I)的化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺

或其盐。

在另一实施方案中，本发明提供式(I)的化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺

或其盐。

在“本发明的化合物”的范围内包括式(I)的化合物及其盐的所有溶剂合物（包括水合物）、络合物、多晶型物、前药、放射性标记的衍生物、立体异构体和光学异构体。

要理解的是，在本文中提到式(I)的化合物及其盐包括游离碱或其盐形式，例如其可药用盐形式的式(I)的化合物。因此，在一个实施方案中，本发明涉及游离碱形式的式(I)的化合物。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物及其盐。在另一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物及其可药用盐。

本发明的化合物可用作Syk的抑制剂。本发明的化合物在hERG结合测定（潜在心脏毒性的关键测量）中表现出低活性。本发明的化合物在细菌回复突变试验（设计用于检测可产生造成基因突变（碱基对置换和移码突变）的遗传损伤的许多不同化学物质的检测）中也是阴性的。

本发明的化合物因此可能用于治疗一些癌症，特别是血红素恶性肿瘤以及涉及B细胞和/或活化巨噬细胞的炎性疾病，以及由不适当的肥大细胞活化造成的疾病，例如变态反应性疾病和炎性疾病。

本文所用的术语“烷基”包括所有饱和直链和支链异构体。例如，C_1-4烷基是指含有至少1个和最多4个碳原子的直链或支链烷基。其代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。

本文所用的术语“烷氧基”包括所有饱和直链和支链异构体。例如，C_1-2烷氧基是指含有至少1个和最多2个碳原子的直链烷氧基。本文所用的“烷氧基”的代表性实例包括但不限于甲氧基和乙氧基。

除非另行规定，本文所用的术语“环烷基”包括具有3至7个环碳原子的碳环环。其代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。环烷基环优选包含5或6个环碳原子。

本文所用的术语“可药用”是指在合理医学判断的范围内适合与人类和动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相当的那些化合物、材料、组合物和剂型。技术人员会认识到可以制备本发明的化合物的可药用盐。

本文所用的术语“可药用盐”是指保持本化合物的所需生物活性并表现出最低不想要的毒理学效应的盐。这些可药用盐可以在该化合物的最终分离和提纯过程中原位制备或通过单独地使纯化的化合物以其游离酸或游离碱形式分别与合适的碱或酸反应来制备。实际上，在本发明的某些实施方案中，可药用盐可能优于各自的游离碱或游离酸，因为这样的盐为该分子提供更大的稳定性或溶解度，由此有利于配制成剂型。

式(I)的化合物是碱性的，因此通常能通过用合适的酸处理来形成可药用酸加成盐。合适的酸包括可药用无机酸和可药用有机酸。代表性的可药用酸加成盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、甲基硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氨基磺酸盐、磷酸盐、乙酸盐、羟基乙酸盐、苯基乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙烯酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、对氨基水杨酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、庚酸盐、邻苯二甲酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、o-乙酰氧基苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、扁桃酸盐、丹宁酸盐、甲酸盐、硬脂酸盐、抗坏血酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、丙酮酸盐、双羟萘酸盐、丙二酸盐、月桂酸盐、戊二酸盐、谷氨酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和萘-2-磺酸盐。在一个实施方案中，本发明提供盐酸盐形式的式(I)的化合物的可药用盐。

式(I)的化合物含有手性中心并因此以独立的对映体或其混合物的形式存在。如果没有指明手性中心的立体化学，该结构意在包括各对映体及其所有混合物。因此，式(I)的化合物可作为外消旋变体（包括外消旋混合物和外消旋体）、对映体富集混合物或作为对映体纯的独立立体异构体使用。本发明包括所有这样的混合物以及纯的独立对映体。通常优选使用纯化的单个对映体形式的式(I)的化合物，例如式(II)的化合物。

可以通过本领域技术人员已知的方法拆分式(I)的化合物的独立对映体。例如，这样的拆分可如下进行（1）通过形成非对映体盐、络合物或其它衍生物；（2）通过与立体异构体特异性试剂选择性反应，例如通过酶促氧化或还原；或（3）通过在手性环境中，例如在手性载体如二氧化硅上使用结合手性配体或在手性溶剂存在下的气液或液相色谱法。技术人员会认识到如果通过上述分离程序之一将所需立体异构体转化成另一化学体，需要进一步的步骤以释放所需形式。或者，可以通过使用光学活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成或通过经不对称转化将一种对映体转化成另一种来合成特定对映体。

本发明的化合物可以固体或液体形式存在。在固态中，本发明的化合物可以以结晶或非晶（无定形）形式或以其混合物形式存在。对结晶形式的本发明的化合物而言，技术人员会认识到，可能形成可药用溶剂合物，其中溶剂分子在结晶过程中并入晶格中。溶剂合物可能涉及非水溶剂，例如但不限于，乙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、四氢呋喃、二氧杂环己烷、DMSO、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯，或它们可能包含水作为并入晶格中的溶剂。其中水是并入晶格中的溶剂的溶剂合物通常被称作“水合物”。水合物包括化学计量水合物以及含有可变量的水的组合物。本发明包括所有这样的溶剂合物。此外，术语溶剂合物包括游离碱化合物的溶剂合物及其任何盐的溶剂合物。

技术人员会进一步认识到，以结晶形式存在的本发明的化合物，包括其各种溶剂合物，可能表现出多晶型现象（即以不同晶体结构存在的能力）。这些不同的晶型通常被称作“多晶型物”。本发明包括所有这样的多晶型物。多晶型物具有相同化学组成，但结晶固态的堆积、几何排列和其它描述性性质不同。多晶型物因此可具有不同物理性质，如形状、密度、硬度、可变形性、稳定性和溶出性质。多晶型物通常表现出不同的熔点、IR光谱和X-射线粉末衍射图，这些可用于识别。技术人员会认识到可以例如通过改变或调节用于制备该化合物的反应条件或试剂来生产不同的多晶型物。例如，温度、压力或溶剂的改变可能产生多晶型物。此外，一种多晶型物可能在某些条件下自发转化成另一多晶型物。

式(I)的化合物可通过下述通用合成方案制备。

方案1：(3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯的合成

a) 2,6-二甲基吡啶、2-氧代-3-哌啶羧酸乙酯、双三氟甲磺酸二水合[(S)-(-)-2,2'-双膦基)-1,1'-联萘基]钯(II)、N-氟苯磺酰亚胺、EtOH；

b) BH₃-THF；

c) BOC₂O、Et₃N、DCM；

d) Tf₂O、Et₃N、DCM；

e) NaN₃、DMF；

f) Pd/C、EtOH。

方案2：1-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑的合成

a) 浓HCl、EtOH；

b) NBS、DCM；

c) 联硼酸频哪醇酯、KOAc、Pd₂(dba)₃、2-(二环己基膦基)-2',4',6'-三异丙基联苯、1,4-二氧杂环己烷。

方案3：1-[(甲氧基)甲基]-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑的合成

a) 碘甲基甲基醚、K₂CO₃、乙腈。

方案4 (X=NH)

其中R = Et、t-Bu、CH₂OMe

a) 2,6-二氯-4-氨基吡啶、2,2-二甲基丙酰氯、Et₃N、DCM

b) nBuLi、(2E)-3-(二甲基氨基)-2-丙烯醛、THF；

c) (3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（见方案1）、DIPEA、NMP；

d) 吡唑硼酸酯、Cs₂CO₃、Pd(PPh₃)₄、1,4-二氧杂环己烷、H₂O；或吡唑硼酸酯、KOH、PEPPSI cat.、DME、EtOH、H₂O；

e) TFA、DCM。

方案5 (X=O): 7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氧基)-1,6-萘啶的合成

a) (3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（见方案1）、NaH、DMF；

b) 1-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑、Cs₂CO₃、Pd(PPh₃)₄、1,4-二氧杂环己烷、H₂O；

c) TFA、DCM。

方案6：7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺的合成

a) (+)-甲醇、DMAP、甲苯、回流；

b) [(S)BINAP]Pd(OTf)₂；(PhSO₂)₂NF；2,6-二甲基吡啶；EtOH；

c) (i) BH₃.DMS；THF；回流；

(ii) Boc₂O；

d) Tf₂O、吡啶；

e) NaN₃、DMF；

f) Pt/C、氢、THF、NH₃(水溶液)；

g) 式(XIX)的化合物、DIPEA、NMP；

h) 式(XIV)的化合物、Pd(di-t-bpf)Cl₂、NaHCO₃、二氧杂环己烷(水溶液)；

i) HCl/二氧杂环己烷、甲苯；

j) (i) NaOH(水溶液)、EtOAc；

(ii) n-BuOAc、TBME。

方案7：5,7-二氯-1,6-萘啶的合成

a) Cu(OAc)₂、tert-BuOK、IPA；

b) TEA、THF、ClCO₂Et；

c) NH₃(水溶液)、HCl(水溶液)；

d) POCl₃、Me₄NCl、回流。

方案8：1-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑的合成

a) EtOH、HCl、回流；

b) NBS、DCM；

c) 回流；

d) BuLi、THF。

式(IV)、(X)、(XI)、(XV)、(XVII)、(XXVII)、(XXVIII)、(XXXV)和(XXXVI)的化合物可商购自例如Sigma-Aldrich UK。

因此，在一个实施方案中，本发明提供制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括使式(III)的1,6-萘啶化合物：

其中P是保护基且X如上定义；

与式(XXVI)的吡唑硼酸酯/酸化合物：

其中R³和R⁴可以相同或不同，各自是氢、C_1-6烷基或R³和R⁴可连接形成任选被最多4个甲基，例如-C(Me)₂C(Me)₂-取代的C_1-3亚烷基；且

R¹如上定义；

在催化剂存在下在常用于硼酸酯/酸偶联的条件下反应；和

此后除去保护基P。

保护基及其去除方式的实例可见于T. W. Greene 'Protective Groups in Organic Synthesis' (J. Wiley and Sons, 1991)。合适的胺保护基包括但不限于磺酰基（如甲苯磺酰基）、酰基（如苄氧基羰基或叔丁氧基羰基）和芳基烷基（如苄基），它们可适当通过水解或氢解除去。其它合适的胺保护基包括可通过碱催化的水解除去的三氟乙酰基（-C(O)CF₃）或可通过酸催化的水解（使用例如三氟乙酸）除去的固相树脂结合的苄基，如Merrifield树脂结合的2,6-二甲氧基苄基（Ellman linker）。

在本发明的一个实施方案中，保护基（P）选自叔丁氧基羰基“BOC”和9-芴基甲氧基羰基“FMOC”。

应指出的是，为了合成效率，在总体合成中尽可能早地，在这种情况下在方案I的第一阶段中获得基本对映体纯的前体。因此，使用光学活性催化剂（双三氟甲磺酸二水合[(S)-(-)-2,2'-双膦基)-1,1'-联萘基]钯(II)）对映选择性氟化在3-位的哌啶核产生对映体富集的氟产物。这随后使用例如制备手性HPLC进一步拆分以产生基本对映体纯的产物。

可以通过上述通用合成方案、在方案1的第一阶段中使用催化剂（双三氟甲磺酸二水合[(-)-2,2'-双膦基)-1,1'-联萘基]钯(II)）的外消旋形式制备式(I)的化合物，因此没有对映体富集，随后全程使用外消旋中间体。可随后由相应的式(I)的外消旋化合物或胺保护的前体通过本领域中已知的用于手性拆分的方法，特别是（制备）手性HPLC制备式(II)的化合物。或者，如果需要，可以在更早期，例如在方案4中在阶段c)后，在外消旋胺偶联到1,6-萘啶核上后进行拆分。

本发明的化合物可用作Syk的抑制剂并因此可能用于治疗一些癌症，特别是血红素恶性肿瘤以及涉及B细胞的炎性疾病，以及由不适当的肥大细胞和嗜碱性细胞活化造成的疾病，例如变态反应性疾病和炎性疾病，如皮肤肥大细胞介导的疾病，包括急性和慢性荨麻疹、肥大细胞增多症、特应性皮炎和自身免疫病如皮肤狼疮和自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮。

它们也可用于治疗涉及肥大细胞的急性病症，如术后肠梗阻。

因此，在一个实施方案中，本发明提供用于治疗的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供用于抑制脾酪氨酸激酶（Syk）的式(I)的化合物或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供抑制脾酪氨酸激酶（Syk）的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

Syk抑制剂可用于癌症治疗，尤其是血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤（SLL/CLL）、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤。

相应地，在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症，例如血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤（SLL/CLL）、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤的式(I)的化合物或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供治疗癌症，尤其是血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤（SLL/CLL）、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤的方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗癌症，例如血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤（SLL/CLL）、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤的药物的用途。

本发明的化合物也可以与本领域中已知的其它种类的癌症化疗剂联合用于癌症化疗。用于非霍奇金淋巴瘤的这种联合中所用的药剂的代表性种类包括利妥昔单抗、BEXXAR（托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗）、匹杉琼和化疗。本发明的化合物的组合也可以与CHOP药物方案（环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松）或CHOP+利妥昔单抗（CHOP+R）联合使用。

本发明的化合物可能用于治疗涉及B细胞和/或巨噬细胞活化的自身免疫病症，例如系统性红斑狼疮（SLE）、Sjorgens综合征、Wegners肉芽肿病和其它血管炎、大疱性类天疱疮和天疱疮、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、巨细胞动脉病、血管球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗自身免疫病症，例如系统性红斑狼疮（SLE）、盘状（皮肤）狼疮、Sjorgens综合征、Wegners肉芽肿病和其它血管炎、大疱性类天疱疮和天疱疮、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、巨细胞动脉病、血管球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供用于治疗类风湿性关节炎的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供用于治疗类风湿性关节炎的化合物7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗自身免疫病症，例如系统性红斑狼疮（SLE）、盘状（皮肤）狼疮、Sjorgens综合征、Wegners肉芽肿病和其它血管炎、大疱性类天疱疮和天疱疮、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、巨细胞动脉病、血管球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗自身免疫病症，例如系统性红斑狼疮（SLE）、盘状（皮肤）狼疮、Sjorgens综合征、Wegners肉芽肿病和其它血管炎、大疱性类天疱疮和天疱疮、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、巨细胞动脉病、血管球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗类风湿性关节炎的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供化合物7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐用于制备用于治疗类风湿性关节炎的药物的用途。

本发明的化合物可能用于治疗有和没有自身抗体状况的慢性特发性荨麻疹（现在也称作慢性自发性荨麻疹）。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗慢性自发性荨麻疹的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供用于治疗慢性自发性荨麻疹的化合物7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗慢性自发性荨麻疹的方法，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供治疗慢性自发性荨麻疹的方法，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的化合物7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗慢性自发性荨麻疹的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供化合物7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐用于制备用于治疗慢性自发性荨麻疹的药物的用途。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗涉及B细胞的炎性疾病的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗涉及B细胞的炎性疾病的方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗涉及B细胞的炎性疾病的药物的用途。

本发明的化合物可能用于治疗由不适当的肥大细胞活化造成的疾病，例如变态反应性疾病和炎性疾病。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗与不适当的肥大细胞和/或嗜碱性细胞活化相关的疾病，包括具有皮肤症状的那些疾病的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗与不适当的肥大细胞和/或嗜碱性细胞活化相关的疾病的方法，其包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供治疗与不适当的肥大细胞和/或嗜碱性细胞活化相关的疾病，包括具有皮肤症状的那些疾病的方法，包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗与不适当的肥大细胞和/或嗜碱性细胞活化相关的疾病的药物的用途。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病，例如慢性阻塞性肺病（COPD）、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、哮喘、重症哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病、皮炎、过敏症、鼻炎、皮肤狼疮、自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮、肥大细胞增多症和过敏反应的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病，例如慢性阻塞性肺病（COPD）、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、哮喘、重症哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病、皮炎、过敏症、鼻炎、皮肤狼疮、自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮、肥大细胞增多症和过敏反应的方法，所述方法包括给予需要其的患者治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病，例如慢性阻塞性肺病（COPD）、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、哮喘、重症哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病、皮炎、过敏症、鼻炎、皮肤狼疮、自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮、肥大细胞增多症和过敏反应的药物的用途。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗涉及不适当的肥大细胞活化的炎性疾病的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗涉及不适当的肥大细胞活化的炎性疾病的方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供治疗涉及不适当的肥大细胞活化的炎性疾病的方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗涉及不适当的肥大细胞活化的炎性疾病的药物的用途。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗涉及不适当的肥大细胞活化的变态反应性疾病的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供治疗涉及不适当的肥大细胞活化的变态反应性疾病的方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在另一实施方案中，本发明提供治疗涉及不适当的肥大细胞活化的变态反应性疾病的方法，所述方法包括给予需要其的患者有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗涉及不适当的肥大细胞活化的变态反应性疾病的药物的用途。

被认为由Syk介导的疾病和病理状况包括涉及肥大细胞活化的炎性和变态反应性疾病，如慢性阻塞性肺病（COPD）、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、重症哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病、慢性和急性荨麻疹，包括慢性自发性荨麻疹和接触性和物理性荨麻疹、皮炎、过敏症、鼻炎、肥大细胞增多症和过敏反应。

本发明的化合物也可以与例如选自抗炎剂、抗胆碱能剂（特别是M₁/M₂/M₃受体拮抗剂）、β₂-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂如抗生素或抗病毒剂、或抗组胺剂的其它种类的治疗剂联合使用。

在另一实施方案中，本发明的化合物也可以与本领域中已知用于治疗自身免疫病的其它种类的治疗剂，例如改善疾病的抗风湿药，包括环孢素、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、强的松、来氟米特和氯喹/羟氯喹以及生物制药剂，如人源化单克隆抗体（mabs），例如包括抗-TNF α阻断剂，如英利昔单抗、依那西普和阿达木单抗和B细胞消除疗法，如利妥昔单抗和奥伐单抗，和抗-Blys mabs如belilumab联合使用。

本发明因此提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及例如选自抗炎剂，如皮质类固醇或NSAID、抗胆碱能剂、β₂-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂如抗生素或抗病毒剂、抗组胺剂、改善疾病的抗风湿药、和生物制药剂如人源化单克隆抗体（mabs）、B细胞消除疗法和抗-Blys mabs的一种或多种其它治疗活性剂的组合。本发明的一个实施方案包括包含式(I)的化合物或其可药用盐以及β₂-肾上腺素受体激动剂和/或抗胆碱能剂和/或PDE-4抑制剂和/或抗组胺剂和/或改善疾病的抗风湿药和/或生物制药剂的组合。

本发明的一个实施方案包括包含一种或两种其它治疗剂的组合。

本领域技术人员清楚的是，如果适当，所述其它治疗成分可以以盐的形式使用，例如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐或前药或作为酯，例如低碳烷基酯或作为溶剂合物，例如水合物以优化该治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特性，如溶解度。还清楚的是，如果适当，该治疗成分可以以光学纯的形式使用。

β₂-肾上腺素受体激动剂的实例包括沙美特罗（其可以是外消旋体或单个对映体，如R-对映体）、沙丁胺醇（其可以是外消旋体或单个对映体，如R-对映体）、福莫特罗（其可以是外消旋体或单个立体异构体，如R,R-立体异构体）、沙甲胺醇、非诺特罗、卡莫特罗、依坦特罗、那明特罗、克仑特罗、吡布特罗、flerbuterol、茶丙喘宁、班布特罗、茚达特罗、特布他林及其盐，例如沙美特罗的昔萘酸盐（1-羟基-2-萘羧酸盐）、沙丁胺醇的硫酸盐或游离碱或福莫特罗的富马酸盐。在一个实施方案中，β₂-肾上腺素受体激动剂是长效β₂-肾上腺素受体激动剂，例如提供大约12小时或更久的有效支气管扩张的化合物。

其它β₂-肾上腺素受体激动剂包括WO02/066422、WO02/070490、WO02/076933、WO03/024439、WO03/072539、WO03/091204、WO04/016578、WO04/022547、WO04/037807、WO04/037773、WO04/037768、WO04/039762、WO04/039766、WO01/42193和WO03/042160中描述的那些。

β₂-肾上腺素受体激动剂的实例包括：

3-(4-{[6-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙基}氨基)己基]氧基}丁基)苯磺酰胺；

3-(3-{[7-({(2R)-2-羟基-2-[4-羟基-3-羟甲基)苯基]乙基}-氨基)庚基]氧基}丙基)苯磺酰胺；

4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-二氯苄基)氧基]乙氧基}己基)氨基]-1-羟乙基}-2-(羟甲基)苯酚；

4-{(1R)-2-[(6-{4-[3-(环戊基磺酰基)苯基]丁氧基}己基)氨基]-1-羟乙基}-2-(羟甲基)苯酚；

N-[2-羟基-5-[(1R)-1-羟基-2-[[2-4-[[(2R)-2-羟基-2-苯基乙基]氨基]苯基]乙基]氨基]乙基]苯基]甲酰胺；

N-2{2-[4-(3-苯基-4-甲氧基苯基)氨基苯基]乙基}-2-羟基-2-(8-羟基-2(1H)-喹啉酮-5-基)乙基胺；和

5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-氨基-2-甲基-丙氧基)-苯基氨基]-苯基}-乙基氨基)-1-羟基-乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮。

β₂-肾上腺素受体激动剂可以是用选自硫酸、盐酸、富马酸、羟基萘甲酸（例如1-或3-羟基-2-萘甲酸）、肉桂酸、取代肉桂酸、三苯基乙酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、萘丙烯酸、苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、2-或4-羟基苯甲酸、4-氯苯甲酸和4-苯基苯甲酸的可药用酸形成的盐的形式。

皮质类固醇的实例可包括WO02/088167、WO02/100879、WO02/12265、WO02/12266、WO05/005451、WO05/005452、WO06/072599和WO06/072600中描述的那些。

抗炎皮质类固醇是本领域中公知的。代表性实例包括丙酸氟替卡松（例如参见美国专利4,335,121）、糠酸氟替卡松（例如参见美国专利7,101,866）、倍氯米松17-丙酸酯、倍氯米松17,21-二丙酸酯、地塞米松或其酯、莫米松或其酯（例如糠酸莫米松）、环索奈德、布地奈德、氟尼缩松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松和6α,9α-二氟-11β-羟基-l6α-甲基-3-氧代-17α-(2,2,3,3-四甲基环丙基羰基)氧基-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代甲酸S-氰基甲酯。在WO02/088167、WO02/100879、WO02/12265、WO02/12266、WO05/005451、WO05/005452、WO06/072599和WO06/072600中描述了抗炎皮质类固醇的其它实例。

可具有对反式抑制的选择性高于反式激活并可用于联合疗法的具有糖皮质激素激动的非类固醇化合物包括下列公开专利申请和专利中涵盖的那些：WO03/082827、W098/54159、WO04/005229、WO04/009017、WO04/018429、WO03/104195、WO03/082787、WO03/082280、WO03/059899、WO03/101932、WO02/02565、WO01/16128、WO00/66590、WO03/086294、WO04/026248、WO03/061651、WO03/08277、WO06/000401、WO06/000398、WO06/015870、WO06/108699、WO07/000334和WO07/054294。

抗炎剂的实例包括非甾体抗炎药（NSAID's）。

NSAID's的实例包括色甘酸钠、奈多罗米钠、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂（例如茶碱、PDE4抑制剂或混合PDE3/PDE4抑制剂）、白三烯拮抗剂、白三烯合成抑制剂（例如孟鲁司特）、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂（例如腺苷2a激动剂）、细胞因子拮抗剂（例如趋化因子拮抗剂，如CCR3拮抗剂）或细胞因子合成的抑制剂，或5-脂肪氧合酶抑制剂。iNOS（诱导型一氧化氮合成酶抑制剂）优选用于口服给药。iNOS抑制剂的实例包括WO93/13055、WO98/30537、WO02/50021、W095/34534和WO 99/62875中公开的那些。CCR3抑制剂的实例包括WO02/26722中公开的那些。

PDE4抑制剂的实例包括顺式-4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己-1-羧酸、2-甲氧羰基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-醇]。也可以是顺式-4-氰基-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己-1-羧酸（也称作西洛司特）及其盐、酯、前药或物理形式（例如参见美国专利5,552,438）。

其它化合物包括来自Elbion的AWD-12-281（Hofgen, N.等人, 15th EFMC Int Symp Med Chem (Sept 6-10, Edinburgh) 1998, Abst P.98；CAS 参考号247584020-9）；命名为NCS-613 (INSERM)的9-苄基腺嘌呤衍生物；来自Chiroscience和Schering-Plough的D-4418；确定为CI-1018 (PD-168787)并属于Pfizer的苯并二氮PDE4抑制剂；Kyowa Hakko在W099/16766中公开的苯并二氧杂环戊二烯衍生物；来自Kyowa Hakko的K-34；来自Napp的V-11294A（Landells, L.J.等人, Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (Sept 19-23, Geneva) 1998] 1998, 12 (Suppl. 28): Abst P2393）；罗氟司特（CAS参考号162401-32-3）和来自Byk-Gulden的pthalazinone（例如参见WO99/47505）；普马芬群（pumafentrine），(-)-p-[(4aR^*,10bS^*)-9-乙氧基-1,2,3,4,4a,10b-六氢-8-甲氧基-2-甲基苯并[c][1,6]萘啶-6-基]-N,N-二异丙基苯甲酰胺，其是Byk-Gulden，如今为Altana已制备并公开的混合PDE3/PDE4抑制剂；Almirall-Prodesfarma正在开发的阿罗茶碱；来自Vernalis的VM554/UM565；或T-440 (Tanabe Seiyaku；Fuji, K.等人, J Pharmacol Exp Ther,1998, 284(1): 162）和T2585。

在公开的国际专利申请WO04/024728 (Glaxo Group Ltd)、WO04/056823 (Glaxo Group Ltd)和WO04/103998 (Glaxo Group Ltd)中公开了其它化合物。

抗胆碱能剂的实例是充当毒蕈碱受体上的拮抗剂的那些化合物，特别是作为M₁或M₃受体的拮抗剂、M₁/M₃或M₂/M₃受体的双重拮抗剂或M₁/M₂/M₃受体的全拮抗剂（pan-antagonist）的那些化合物。通过吸入给药的示例性化合物包括异丙托铵（例如作为溴化物，CAS 22254-24-6，以Atrovent为名出售）、氧托品（例如作为溴化物，CAS 30286-75-0）和噻托（tiotropium）（例如作为溴化物，CAS 136310-93-5，以Spiriva为名出售）。同样感兴趣的是瑞伐托酯（例如作为氢溴酸盐，CAS 262586-79-8）和WO01/04118中公开的LAS-34273。口服给药的示例性化合物包括哌仑西平（CAS 28797-61-7）、达非那新（CAS 133099-04-4或CAS 133099-07-7，作为氢溴酸盐，以Enablex为名出售）、奥昔布宁（CAS 5633-20-5，以Ditropan为名出售）、特罗地林（CAS 15793-40-5）、托特罗定（CAS 124937-51-5或CAS 124937-52-6，作为酒石酸盐，以Detrol为名出售）、奥替溴铵（例如作为溴化物，CAS 26095-59-0，以Spasmomen为名出售）、曲司氯铵（CAS 10405-02-4）和索非那新（CAS 242478-37-1或CAS 242478-38-2，作为琥珀酸盐，也称作YM-905并以Vesicare为名出售）。

其它抗胆碱能剂包括美国专利申请60/487981中公开的化合物，例如：

(3-内)-3-(2,2-二-2-噻吩基乙烯基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷溴化物；

(3-内)-3-(2,2-二苯基乙烯基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷溴化物；

(3-内)-3-(2,2-二苯基乙烯基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷4-甲基苯磺酸盐；

(3-内)-8,8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-噻吩基)乙烯基]-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷溴化物；和

(3-内)-8,8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-吡啶基)乙烯基]-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷溴化物。

其它抗胆碱能剂包括美国专利申请60/511009中公开的化合物，包括例如：

(内)-3-(2-甲氧基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷碘化物；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙腈；

(内)-8-甲基-3-(2,2,2-三苯基-乙基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙酰胺；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙酸；

(内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷碘化物；

(内)-3-(2-氰基-2,2-二苯基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷溴化物；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙-1-醇；

N-苄基-3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙酰胺；

(内)-3-(2-氨甲酰基-2,2-二苯基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷碘化物；

1-苄基-3-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-脲；

1-乙基-3-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-脲；

N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-乙酰胺；

N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-苯甲酰胺；

3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二-噻吩-2-基-丙腈；

(内)-3-(2-氰基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷碘化物；

N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-苯磺酰胺；

[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-脲；

N-[3-((内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2,2-二苯基-丙基]-甲磺酰胺；和

(内)-3-{2,2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰氧基)-氨基]-丙基}-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷溴化物。

其它化合物包括：

(内)-3-(2-氰基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基)-8,8-二甲基-8-氮鎓双环[3.2.1]辛烷碘化物；和

在一个实施方案中，本发明提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及H1拮抗剂的组合。H1拮抗剂的实例包括但不限于美沙吡林、地氯雷他定、amelexanox、阿司咪唑、阿扎他定、氮卓斯汀、阿伐斯汀、溴苯那敏、西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪、氯苯那敏、氯马斯汀、苯甲嗪、卡瑞斯汀、赛庚啶、卡比沙明、地洛他定、多西拉敏、吡啶茚胺、依巴斯汀、依匹斯汀、乙氟利嗪、非索非那定、羟嗪、酮替芬、氯雷他定、左卡巴斯汀、咪唑斯汀、美喹他嗪、米安色林、诺柏斯汀、美克洛嗪、诺司咪唑、奥洛他定、哌香豆司特、吡拉明、异丙嗪、特非那定、曲吡那敏、替美斯汀、异丁嗪和曲普利啶，特别是西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪和非索非那定。在另一实施方案中，本发明提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及H3拮抗剂（和/或反向激动剂）的组合。H3拮抗剂的实例包括例如WO2004/035556和WO2006/045416中公开的那些化合物。可以与式(I)的化合物或其可药用盐联合使用的其它组胺受体拮抗剂包括H4受体的拮抗剂（和/或反向激动剂），例如Jablonowski等人, J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003)中公开的化合物。

在一个实施方案中，提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及皮质类固醇的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及NSAID的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及抗胆碱能剂的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及β₂-肾上腺素受体激动剂的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及抗感染剂的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及抗组胺剂的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及改善疾病的抗风湿药的组合。在另一实施方案中提供包含式(I)的化合物或其可药用盐以及生物制药剂的组合。

本发明的化合物在给药于患者前通常但不一定配制成药物组合物。相应地，在一个实施方案中，本发明涉及包含式(I)的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。在另一实施方案中本发明涉及包含7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。

本发明的药物组合物可以以散装形式制备和包装，其中可以取出安全且有效量的本发明的化合物，然后给予患者，如以粉末或糖浆形式。或者，本发明的药物组合物可以以单位剂型制备和包装，其中各物理离散独立单位含有安全且有效量的本发明的化合物。本发明的药物组合物也可以亚单位剂型制备和包装，其中两个或更多个亚单位剂型提供单位剂型。在以单位剂型制备时，根据制剂的性质，本发明的药物组合物通常含有大约0.1至99.9重量%的本发明的化合物。

此外，本发明的药物组合物可任选进一步包含一种或多种附加的药物活性化合物。

本文所用的“可药用赋形剂”是指涉及为药物组合物提供形式或稠度的可药用材料、组合物或载体。各赋形剂必须在混合时与该药物组合物的其它成分相容，以避免在给药于患者时显著降低本发明的化合物的效力和产生不可药用的组合物的相互作用。此外，各赋形剂当然必须具有足够高的纯度以使其可药用。

包含式(I)的化合物或其可药用盐和可药用赋形剂的本发明的组合物通常作为适合通过所需给药途径给药于患者的剂型提供。例如，剂型包括适合下列途径的那些：(1) 口服给药，如片剂、胶囊剂、囊片、丸剂、口含片（troches）、粉剂、糖浆、酏剂、悬浮液、溶液、乳剂、囊剂（sachet）和扁囊剂（cachet）；(2) 局部皮肤给药，如乳膏剂、软膏、洗剂、溶液、糊剂、喷雾剂、泡沫和凝胶；(3) 吸入，如气雾剂和溶液；(4) 鼻内给药，如溶液或喷雾剂；和(5) 肠胃外给药，如无菌溶液、悬浮液和重构用粉剂。

要认识到，适合口服给药的剂型常用于治疗自身免疫病，包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮；癌症，包括血红素恶性肿瘤；和慢性自发性荨麻疹。适合局部给药于皮肤的剂型常用于治疗特应性皮炎、牛皮癣和慢性和急性荨麻疹病症、和自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮。适合吸入或口服给药的剂型常用于治疗COPD和哮喘；而适合鼻内给药的剂型常用于治疗过敏性鼻炎。

合适的可药用赋形剂随所选的特定剂型而变。此外，可基于它们在该组合物中可发挥的特定功能选择合适的可药用赋形剂。例如，可基于它们有利于产生均匀剂型的能力选择某些可药用赋形剂。可基于它们有利于产生稳定剂型的能力选择某些可药用赋形剂。可基于它们有利于将给药于患者的本发明的化合物从身体的一个器官或部位运载或传送至身体的另一器官或部位的能力选择某些可药用赋形剂。可基于它们提高患者依从性的能力选择某些可药用赋形剂。

合适的可药用赋形剂包括下列类型的赋形剂：稀释剂、填料、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、成粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、湿润剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。技术人员会认识到某些可药用赋形剂可发挥多于一种功能并可根据制剂中存在多少赋形剂和制剂中存在哪些其它成分而发挥备选功能。

技术人员具有本领域的知识和技能，以能让他们选择用于本发明的适当量的合适的可药用赋形剂。此外，技术人员可获得许多描述了可药用赋形剂并可用于选择合适的可药用赋形剂的资源。实例包括Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott Williams & Wilkins), The Handbook of Pharmaceutical Additives (Gower Publishing Limited)和The Handbook of Pharmaceutical Excipients (the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)。

使用本领域技术人员已知的技术和方法制备本发明的药物组合物。在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company)中描述了本领域中常用的一些方法。

口服固体剂型，如片剂通常包含一种或多种可药用赋形剂，其可例如有助于为片剂提供令人满意的加工和压缩特性或提供另外合意的物理特性。这样的可药用赋形剂可选自稀释剂、粘合剂、助流剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、香料、甜味剂、聚合物、蜡或其它溶解度调节材料。

用于局部给药于皮肤的剂型可以例如是软膏、乳膏剂、洗剂、眼药膏、滴眼剂、滴耳剂、浸渍敷料和气雾剂的形式并可含有适当的常规添加剂，包括例如防腐剂、有助于药物渗透的溶剂、和软膏和乳膏剂中的软化剂。这样的局部制剂还可含有相容的常规载体，例如乳膏或软膏基料，和用于洗剂的乙醇或油醇。这样的载体可构成该制剂的大约1重量%至大约98重量%；它们更通常构成该制剂的最多大约80重量%。

用于肠胃外给药的剂型通常包含可通过循环系统容易携带并吸收的流体，特别是静脉流体，即简单化学品，如糖、氨基酸或电解质的无菌溶液。通常用注射用水USP制备这样的流体。在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott Williams & Wilkins)中公开了常用于静脉（IV）使用的流体。这样的IV流体的pH可变并如本领域中已知的那样通常为3.5至8。

用于鼻腔或吸入给药的剂型可方便地配制成气雾剂、溶液、滴剂、凝胶或干粉。

用于局部给药于鼻腔（鼻腔给药）的剂型包括通过加压泵向鼻给药的加压气雾剂制剂和水性制剂。不加压并适合鼻腔给药的制剂是特别感兴趣的。为此目的，合适的制剂含有水作为稀释剂或载体。可以用常规赋形剂，如缓冲剂、张力改性剂等提供向鼻给药用的水性制剂。水性制剂也可以通过雾化向鼻给药。

在计量剂量装置中提供用于鼻腔给药的剂型。该剂型可作为从具有分配喷嘴或分配孔（在使用者向流体分配器的泵机构施力时经此分配计量剂量的流体制剂）的流体分配器传输的流体制剂提供。这样的流体分配器通常带有多个计量剂量的流体制剂的储器，可在相继泵驱动时分配这些剂量。分配喷嘴或孔可构造成插入使用者鼻孔内以将该流体制剂喷施到鼻腔内。在一个实施方案中，该流体分配器具有WO2005/044354A1中描述和图解的一般类型。该分配器具有外壳，其容纳具有安装在用于容纳流体制剂的容器上的压缩泵的流体排放装置。该外壳具有至少一个可用手指操作的侧杆，其可相对于外壳向内移动以在外壳中向上推动容器以使泵将计量剂量的制剂压缩并经由外壳的鼻喷嘴从泵杆中泵出。特别优选的流体分配器具有WO2005/044354A1的图30-40中图解的一般类型。

例如用于吸入给药的气雾剂组合物可包含活性物质在可药用水性或非水溶剂中的溶液或细悬浮液。气雾剂制剂可以以单剂或多剂量以无菌形式存在于密封容器中，该容器可以呈筒形式或再灌装以便通过雾化器或吸入器使用。或者，该密封容器可以是单位分配装置，如单剂鼻吸入器或配有计量阀的气雾剂分配器（计量剂量吸入器），一旦排空该容器的内容物，即将其弃置。

如果该剂型包含气雾剂分配器，其优选含有在压力下的合适推进剂，如压缩空气、二氧化碳或有机推进剂，如氢氟烃（HFC）。合适的HFC推进剂包括1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷和1,1,1,2-四氟乙烷。气雾剂剂型还可以呈泵雾化器形式。加压气雾剂可含有活性化合物的溶液或悬浮液。这可能要求掺入附加赋形剂，例如助溶剂和/或表面活性剂以改进悬浮液制剂的分散特性和均匀性。溶液制剂也可能需要加入助溶剂，如乙醇。还可掺入其它赋形剂改性剂以改进例如该制剂的稳定性和/或味道和/或细粒质量特性（量和/或特性）。

对适合和/或适于吸入给药的药物组合物而言，该药物组合物优选为干粉可吸入组合物。这种组合物可包含粉末基料，如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇或淀粉、式(I)或(II)的化合物或其可药用盐（优选为粒度降低的形式，例如微粉化形式）、和任选性能改进剂，如L-亮氨酸或另一氨基酸、纤维二糖八乙酸酯和/或硬脂酸的金属盐如硬脂酸镁或硬脂酸钙。该干粉可吸入组合物优选包含乳糖和式(I)的化合物或其可药用盐的干粉掺合物。该乳糖优选是乳糖水合物，例如一水合乳糖，和/或优选为吸入级和/或细粒级乳糖。乳糖的粒度优选规定为：90%或更多（按重量计或按体积计）的乳糖粒子小于1000微米（例如10-1000微米，例如30-1000微米）直径，和/或50%或更多的乳糖粒子小于500微米（例如10-500微米）直径。乳糖的粒度更优选规定为：90%或更多的乳糖粒子小于300微米（例如10-300微米，例如50-300微米）直径和/或50%或更多的乳糖粒子小于100微米直径。任选地，乳糖的粒度规定为：90%或更多的乳糖粒子小于100-200微米直径，和/或50%或更多的乳糖粒子小于40-70微米直径。最重要地，优选大约3至大约30%（例如大约10%）（按重量计或按体积计）的粒子小于50微米或小于20微米直径。例如，但不限于，合适的吸入级乳糖是E9334乳糖（10%细粒）（Borculo Domo Ingredients, Hanzeplein 25, 8017 JD Zwolle, Netherlands）。

任选地，特别对干粉可吸入组合物而言，吸入给药用的药物组合物可包含在以条或带形式纵向安装在合适的吸入装置内的多个密封剂量容器（例如含有干粉组合物）中。该容器可按需要破裂或剥开，且例如该剂干粉组合物可通过经由如GlaxoSmithKline出售的DISKUS^?装置之类的装置吸入给药。例如在GB 2242134 A中描述了DISKUS^?吸入装置，在这样的装置中，至少一个粉末形式的药物组合物的容器（该容器优选是以条或带形式纵向安装的多个密封剂量容器）限定在可剥离地相互固定的两个构件之间；该装置包含：划定所述容器的打开位置的工具；用于在打开位置剥离开所述构件以打开容器的工具；和与打开的容器连通的出口，使用者可经此从打开的容器中吸入粉末形式的药物组合物。

用于鼻内给药的本发明的组合物也可适合以干粉制剂形式通过吹入法给药。

对吸入给药剂型而言，如果式(I)的化合物或可药用盐以干粉形式或在悬浮液中存在，那么其优选为粒度降低形式。优选通过微粉化获得或可获得粒度降低形式。通过大约0.5至大约10微米的D50值规定粒度降低的（例如微粉化的）化合物或可药用盐的优选粒度（例如使用激光衍射法测得）。

要认识到，当本发明的化合物与常通过吸入、静脉、口腔、局部或鼻内途径给药的其它治疗剂联合给药时，所得药物组合物可通过相同途径给药。

本发明的化合物可方便地以例如1微克至2克的量给药。确切剂量当然取决于患者的年龄和状况以及所选的特定给药途径。

生物试验方法

可根据下列检测法测试本发明的化合物的体外活性：

1. 碱性SYK酶活性

将在检测缓冲液（20mM TRIS pH 7.4, 0.01% BSA, 0.1% Pluronic F-68）中稀释16倍的3微升SYK 溶胞产物添加到Greiner低体积384孔黑板中的含有0.1微升各种浓度的化合物或DMSO媒介物（1.7%最终）的孔中。在室温下预培养15分钟后，通过添加在检测缓冲液中的含有Y7 Sox肽（Invitrogen Cat. # KNZ3071, 最终5μΜ）、ATP（最终35μΜ）和MgCl₂（最终10mM）的3微升底物试剂，引发该反应。在底物添加后15分钟和55分钟在Envision板读数仪（Perkin Elmer Life Sciences, Waltham, MA, USA）上测量荧光强度（λ_ex 360/λ_em 485）之前在室温下培养该反应。

基本如上所述测试实施例1、2、3、4、5、7、8、9A、9B、10、11A和11B的化合物（游离碱形式）并各自被发现在此测定中具有<1 μΜ的平均IC₅₀值。基本如上所述测试实施例1、2、3、4和6的化合物的盐酸盐并各自被发现在此测定中具有<1 μΜ的平均IC₅₀值。

基本如上所述测试实施例1、2、3、4、5、7、8、9A、9B、10、11A和11B的化合物（游离碱形式）并各自被发现在此测定中具有≥ 7.0的平均pIC₅₀值。例如，发现实施例1、2、3和4（游离碱形式）分别具有7.6 (n = 7)、7.7 (n = 10)、7.2 (n = 11)和8.1 (n = 11)的平均值。基本如上所述测试实施例1、2、3、4和6的化合物的盐酸盐并各自被发现在此测定中具有≥ 6.5的平均pIC₅₀值。

本领域技术人员会认识到体外结合测定和功能活动的细胞基测定具有可变性。相应地，要理解的是，上述IC₅₀和pIC₅₀的值仅是示例性的。

SYK溶胞产物的制备

i. 拉莫斯细胞溶胞产物的制备

拉莫斯B细胞（伯基特淋巴瘤的人类B细胞，clone 296.4C10, ATCC）在培养基（RPMI-1640, Sigma；补充了2mM L-谷氨酰胺, Gibco；10mM Hepes, Sigma；1 mM丙酮酸钠, Sigma；10% v/v热灭活FCS, Gibco）中悬浮培养。在Corning Cellstacks (6360 cm²)中以1升体积培养细胞并每日监测存活率和细胞密度。细胞保持在<1.5 x 10e6/ml和>92%生存率。

由冷冻拉莫斯细胞的Large Scale Intermediate Aliquots (LSIA's)进行大规模生产运行，因为发现这产生比由拉莫斯细胞的连续生长培养生产更大的再生性。

在四个步骤中生成该大规模生产运行细胞：

1. 将LSIA解冻到1 x Cellstack中；

2. 将培养扩展至4 x Cellstack；

3. 从4扩展至12 x Cellstacks；

4. 收取所有12个Cellstacks。

将Cellstacks收取在2升离心瓶中，使用Sorvall Mistral离心机，2000rpm, 10分钟, 4℃，(2L x 2x10⁶细胞/ml = 总共4 x 10⁹细胞)。

(为细胞扩产的情况标注：如果细胞密度超过1.8 x 10e6/ml或存活率降低90%以下，刺激后获得的Syk prep可能具有较低活性）。

在成规模进行细胞生长时，拉莫斯细胞的反复传代也看起来对Syk活性具有有害作用（在小规模培养中情况看起来并非如此）-始终推荐为大规模preps使用LSIA's和模块化扩产。

ii. 用抗-IgM Ab刺激拉莫斯细胞以产生Syk & 溶胞产物的制备

使用15ug/ml（最终浓度）抗-IgM抗体以20x10⁶细胞/ml刺激细胞。在收取后（如上所述），在Corning 500毫升离心瓶中将总共4 x 10⁹细胞再悬浮在180毫升预热（37℃）DPBS中。将20毫升150ug/ml的抗-IgM抗体添加到各500毫升离心瓶中（在预热至37℃的DPBS中配制工作储液）。在添加抗IgM抗体后，细胞在37℃下培养正好5分钟。在刺激5分钟后，向各瓶中加入300毫升冰冷DPBS以停止刺激（温度降至~12℃），随后细胞在2000rpm下离心（Sorvall Legend RT+离心机 - 预冷至4℃）。通过再悬浮在冰冷DPBS中，洗涤细胞并如上离心。然后将细胞丸粒以150ul/1x10⁷细胞的比率在含有1% triton-x-100的冰冷裂解缓冲液中裂解（即48毫升裂解缓冲液）。在添加裂解缓冲液后，将细胞上下吸移并在冰上保持15分钟。然后通过离心获得澄清的溶胞产物（Sorvall Evolution RC (SLA-1500转子, ~20,000g (~14,500rpm), 45min, 4℃）。

在测定之前，等分溶胞产物，在干冰上速冻并储存在-80℃下。

材料

拉莫斯细胞: 伯基特淋巴瘤的人类B细胞, 克隆296.4C10 (ATCC)

生长培养基: 500ml RPMI, 10%热灭活FCS, 2mM L-谷氨酰胺, 2mM HEPES, 1 mM丙酮酸钠

RPMI: Sigma R0883, stores CT5652

胎牛血清: Gibco 10099-141, stores CT2509

L-谷氨酰胺: 200mM, Gibco 25030, stores CT3005

HEPES: 1 M, Sigma H0887, stores CT5637

丙酮酸钠: 100mM, Sigma S8636, stores CT7741

抗-IgM Ab: 在PBS中的羊抗人IgM ((Fab')2片段). Invitrogen, 定制制品（无叠氮化物和低内毒素水平）。Catalogue no. NON0687, Lot 1411913. 2.74mg/ml

DPBS: Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水, Sigma D8537

裂解缓冲液: 50mM TRIS pH7.5 + 150mM NaCl + 1% Triton-X-100 + 2mM EGTA + 1:100稀释的抑制剂混合物（磷酸酶抑制剂混合物set II, calbiochem cat no. 524625 & 蛋白酶抑制剂混合物set V, calbiochem cat no. 539137)

Triton-X-100: Roche 10 789 704 001 (GI 198233X, SC/159824). 作为在水中的20%储液配制

EGTA: Sigma E4378。作为固体直接添加到缓冲液中。

2. B细胞活性测定

2.1. 拉莫斯pErk测定

测定原理

使用抗-IgM刺激拉莫斯B细胞（伯基特淋巴瘤的人类B细胞）。这导致Syk补充到B细胞受体中。Syk的随后自磷酸化导致引发信号级联以致通过Erk MAP激酶途径活化B细胞。因此Erk被磷酸化并通过免疫捕捉测定法检测随后的细胞溶解。

用抗-IgM刺激拉莫斯细胞

在96孔聚丙烯板中在25微升体积的检测培养基（含有10%热灭活的胎牛血清、1% L-谷氨酰胺的RPMI）中以2.5x10⁵/孔的密度接种细胞。加入25微升适当稀释的化合物溶液并将板在37℃下用5% CO₂培养30分钟。在37℃下用5微升羊抗人IgM的Fab'₂片段（最终5微克/毫升）刺激细胞7分钟。在4℃下添加55微升2x RIPA裂解缓冲液，将细胞溶解2小时。此时溶胞产物可在-80℃下冷冻。

pErk MSP测定

将50微升细胞溶胞产物转移到抗-pErk1/2（Thr/Tyr: 202/204；185/187）捕捉抗体涂布的96孔MSD板中并在4℃下培养16小时或在室温下培养3小时。洗涤该板并在室温下加入抗-pErk检测抗体（25微升/孔）1小时。将其取出，加入150微升MSD读数缓冲液并测量所得电化学发光信号。

化合物制备

化合物作为在DMSO中的10mM储液制备并在DMSO中使用9次相继5倍稀释制备稀释系列。该稀释系列用检测培养基进一步1:100稀释以提供5x10^-5至2.56x10^-11 M的最终受试浓度范围。使用Biomek 2000和Biomek Nx自动化机器人移液系统制备化合物稀释液。

基本如上所述测试实施例1、2、3和4的化合物（盐酸盐形式）并各自被发现在此测定中具有<1 μΜ的平均IC₅₀值。

基本如上所述测试实施例1、2、3和4的化合物（盐酸盐形式）并各自被发现在此测定中具有≥ 6.5的平均pIC₅₀值。例如，发现实施例1、2、3和4（盐酸盐形式）分别具有7.4 (n = 2)、7.2 (n = 4)、7.0 (n = 2)和7.5 (n = 4)的平均值。

2.2 CD69全血测定

测定原理

使用抗-IgM离体刺激全血B细胞。这导致Syk补充到B细胞受体中。Syk的随后自磷酸化导致引发信号级联以致如细胞表面上的活化标志CD69的表达所示的B细胞活化。通过流式细胞术检测CD20/CD69+ve全血B细胞。

用抗-IgM刺激全血B细胞

将100微升肝素化人血添加到含有1微升适当稀释的化合物溶液的5毫升聚丙烯管中并在37℃下用5% CO₂培养25分钟。在前述条件下用10微升羊抗人IgM的Fab'₂片段（43微克/毫升最终浓度）刺激B细胞另外3.5小时。通过在室温下添加2毫升Lyse/Fix缓冲液10分钟，红血细胞溶解，所有其它细胞固定。

CD69测定

使用小鼠抗人CD20 FITC和小鼠抗人CD69 PE结合抗体的混合物将细胞染色。通过流式细胞术检测样品中存在的CD20/CD69+ve B细胞。

化合物制备

化合物作为在DMSO中的10mM储液制备，在DMSO中进一步稀释至1 mM，并在DMSO中使用7次相继3倍稀释制备稀释系列以提供1x10^-5至4.57x10^-9 M的最终受试浓度范围。使用Biomek 2000自动化机器人移液系统制备化合物稀释液。

基本如上所述测试实施例1、2、3、4、7、8、9A、9B、10、11A和11B的化合物（游离碱形式）并各自被发现在此测定中具有<1 μΜ的平均IC₅₀值。基本如上所述测试实施例1、2、3、4和6的化合物的盐酸盐并各自被发现在此测定中具有<1 μΜ的平均IC₅₀值。

基本如上所述测试实施例1、2、3、4、5、7、8、9A、9B、10、11A和11B的化合物（游离碱形式）并各自被发现在此测定中具有≥ 6.0的平均pIC₅₀值。例如，发现实施例1、2、3和4（游离碱形式）分别具有6.5 (n = 2)、6.8 (n = 2)、6.6 (n = 2)和6.8 (n = 2)的平均值。基本如上所述测试实施例1、2、3、4和6的化合物的盐酸盐并各自被发现在此测定中具有≥ 6.0的平均pIC₅₀值。

3. hERG活性 - 对hERG的Cy3B多非利特氟-配体结合测定

通过氟-配体^§(Cy3b-多非利特)荧光偏振检测法测定化合物效力。

在检测缓冲液（25mM HEPES, 1.2mM MgCl₂、100mM KCl和0.1% pluronic，使用5M KOH将pH调节至7.4）中用1.0nM氟-配体^§培养表达hERG的CHO-K1膜^*（60微克/毫升）。该测定中的最终钾浓度为100mM。在室温下混合70分钟后，在暗处，将10微升分配到含有0.1微升在DMSO中的受试化合物的黑色LV Greiner 384-孔板的各孔中。在Acquest? / Analyst?成像仪上读数之前使板平衡2小时。使用11点抑制曲线（50μΜ的最高检测浓度和1:3逐步稀释）生成pIC₅₀数据，使用ABase和XC50施加六参数曲线拟合以分析数据和生成曲线拟合。

基本如上所述测试实施例1、2、3、4、5、7、8、9A、9B、10、11A和11B的化合物（游离碱形式）并各自被发现在此测定中具有大于10μΜ的平均IC₅₀值。基本如上所述测试实施例1、2、3、4和6的化合物的盐酸盐并各自被发现在此测定中具有大于20μΜ的平均IC₅₀值。

基本如上所述测试实施例1、2、3、4、5、7、8、9A、9B、10、11A和11B的化合物并各自被发现在此测定中具有小于5.0的平均pIC₅₀值。基本如上所述测试实施例1、2、3、4和6的化合物的盐酸盐并各自被发现在此测定中具有小于5.0的平均pIC₅₀值。

^* CHO-K1膜

将稳定表达人hERG受体的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养至80%融合，接着通过胰蛋白酶化和随后以500g离心10分钟来收取。在膜生成之前在-80C下冷冻细胞丸粒。冷冻的丸粒在冰上解冻，在10体积的膜缓冲液（50mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2x10-6M Pepstatin A）中再悬浮并匀浆。膜悬浮液在500g下离心20分钟，弃置丸粒，上清液再以48,000g旋转30分钟。在二次离心后，将含有膜馏分的剩余丸粒再悬浮在适当体积（每毫升冷冻细胞丸粒使用4毫升）中并检测蛋白质浓度。

^§ 氟-配体（八氢苯并[2",3"]吲嗪并[8",7":5',6']吡喃并[3',2':3,4]吡啶并[1,2]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐（国际申请no. PCT/EP2010/050228, 公开no. WO2010/097248A1 (Glaxo Group Ltd), J.M.C. 2007, 50(13), 2931-2941中描述的TFA盐）。

在硅烷化的4毫升管瓶中将作为在乙腈（100微升）中的溶液的N-[4-({2-[(6-氨基己基)(2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲磺酰胺（1.508毫克）添加到固体Cy3B-ONSu（14-{2-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-2-氧乙基}-16,16,18,18-四甲基-6,7,7a,8a,9,10,16,18-八氢苯并[2",3"]吲嗪并[8",7":5',6']吡喃并[3',2':3,4]吡啶并[1,2-a]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐（1.7毫克，WO9931181）中。加入第二部分乙腈（100微升），接着加入Hunig's碱（0.9微升）。加入两份（2 x 50微升）二甲基甲酰胺并将反应混合物减压浓缩。将残留物再溶解在二甲基甲酰胺（200微升）中。加入Hunig's碱（0.9微升）并将该混合物涡旋混合22小时。将反应混合物蒸发至干，再溶解在乙腈/水/乙酸（5/4/1, ~500微升）中，过滤并施加到半制备Spherisorb ODS2 HPLC柱上，其用下列梯度洗脱（流速 = 5ml/min, AU 5.0, 214nm, AU 2, 256nm, A=0.1%TFA/水, B= 90%乙腈/10%水/0.1% TFA）: t=0min: B=5%；t=10min: B=5%；t = 30min: B=25%；t=90min: B=55%；t=105min: B=100%；t=120min: B = 100%。主要组分在46%和48%B之间洗脱并收集在一个馏分中，将其蒸发至干并将该紫色固体转移到使用甲醇作为溶剂的管瓶中。减压除去甲醇，该紫色固体用无水醚研磨。该固体在干燥枪中在1mbar下干燥整夜以产生标题化合物（1.2毫克）。

N-[4-({2-[(6-氨基己基)(2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲磺酰胺

将粗制N-[4-({2-[[6-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)己基](2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲磺酰胺（142毫克）溶解在甲基胺（33%在乙醇中，10毫升，0.216）中并在22℃下静置48小时。减压蒸发过量试剂，油性残留物与另外两份乙醇共沸。将粗制产物溶解在乙腈/水/乙酸（5/4/, <2ml）中，将一半施加到Phenomenex Jupiter C18 HPLC柱上并使用下列梯度洗脱（流速 = 10ml/min, AU 20.0, 214nm, AU 10, 256nm, A= 0.1%TFA/水, B= 90%乙腈/10%水/0.1% TFA）: t=0min: B=5%；t=10min: B=5%；t=100min: B=35%；t=115min: B=100%；t=130min: B = 100%。汇集主要含有较慢洗脱组分（>90%）的馏分并蒸发产生标题化合物 (14.9毫克）。将剩余粗制物施加到该C18柱上，但修改梯度：t=0min: B=5%；t=10min: B=5%；t=15min: B=10%；t=95min: B=30%；t=110min: B=100%；t=125min: B = 100%。合并主要含有所需产物的馏分并如前蒸发产生标题化合物（21.3毫克~ 80%纯度）。该材料不经进一步提纯即使用。

N-[4-({2-[[6-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)己基](2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲磺酰胺

将2-[6-([2-(4-氨基苯基)乙基]{2-[(4-氨基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（108.3毫克）溶解在DCM（5毫升）中并在冰浴中冷却至0-4℃。加入Hunig's碱（0.227毫升），接着逐滴加入甲磺酰氯（0.051毫升）。该反应在0-4℃下保持0.5小时，然后使其缓慢升温至室温。在3小时后，将反应混合物蒸发至干并原样用于下一步骤。

2-[6-([2-(4-氨基苯基)乙基]{2-[(4-氨基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮

将2-[6-([2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（0.35克）溶解在乙醇（40毫升）、水（5毫升）和乙酸（5毫升）的混合物中，所得溶液在减压下脱气。加入10%碳载钯（56%糊料，0.27克）并将所得混合物在氢气氛（大气压）下剧烈搅拌12小时。反应混合物经Celite?过滤并用乙醇洗涤。将滤液和洗液蒸发至干以产生标题化合物（0.313克），其不经进一步提纯即使用。

2-[6-([2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮

将[2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}胺（253毫克）和2-(6-溴己基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（1186毫克）溶解在DMF（4毫升）中并通过添加DIPEA（0.665毫升）碱化。将该反应搅拌120小时。将反应混合物蒸发至干并将残留物溶解在DCM中，使该溶液吸收到二氧化硅垫上并在用下列梯度洗脱的二氧化硅筒（12克）上提纯：(A = DCM, B= 甲醇) t=0min: B=10%；t=7.5min: B=0%；t=22.5min: B=5%。在~15%B下洗脱所需产物（等度），溶液蒸发至干以产生标题化合物（0.364克）。

[2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}胺

在22℃下将[[2-(4-硝基苯基)乙基]胺（498.9毫克）和111-[(2-溴乙基)氧基]-4-硝基苯2-溴乙基4-硝基苯基醚（513毫克）溶解在DMF（5毫升）中并加入DIPEA（0.872毫升）。使反应混合物在22℃下静置60小时，蒸发至干并将残留物溶解在DCM中。使该化合物吸收到二氧化硅上并在用甲醇/DCM梯度（0-15%）洗脱的二氧化硅筒（12克）上分两批提纯。汇集含有纯产物的馏分并减压除去溶剂。所得标题化合物作为深黄色油分离，其在高真空下部分凝固（253毫克）。

4. 细菌突变筛查检测（艾姆斯试验）

细菌突变检测（艾姆斯试验）是专门设计成检测可产生造成基因突变（碱基对置换和移码突变）的遗传损伤的许多不同化学物质的短期回复突变检测。

该试验使用几个组氨酸依赖性鼠伤寒沙门氏菌菌株和几个色氨酸依赖性大肠杆菌菌株，它们各自带有分别在组氨酸或色氨酸操纵子中的各种基因中的不同突变。这些突变充当通过不同机制造成DNA损伤的诱变剂的热点。

简言之，细菌在试验前培养10小时。在顶层琼脂中补充痕量组氨酸、生物素和色氨酸并等分，接着添加所需受试制品、媒介物或阳性对照物，接着添加适当的细菌悬液，和外源性哺乳动物氧化代谢系统（S9-mix）或缓冲液。将最终混合物倒在基本琼脂板（minimal agar plate）上，其随后在回复体集落计分之前倒置和培养。

在含有痕量组氨酸或色氨酸的基本培养基琼脂板上生长受试菌株时，只有能回复到组氨酸或色氨酸不依赖性的那些细菌能形成集落。每个板的自发诱导的回复体集落数相对恒定。但是，在板中加入诱变剂时，每个板的回复体集落数提高，通常以剂量相关方式。

常规使用的菌株是鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98、TA100 TA1535和TA1537和大肠杆菌WP2 uvrA (pKM101 )。

在存在和不存在外源性哺乳动物氧化代谢系统（S9-mix）的情况下进行检测以模拟哺乳动物代谢。

最高受试浓度是允许易溶化合物的最多5000微克/板的最大暴露的浓度，或溶解度或毒性极限（取较低的那个）。如果化合物溶解度是限制因素，所选最大浓度是在培养期结束时在处理板上肉眼观察到化合物沉淀物的最低浓度。

在所有试验中包括适当的媒介物和阳性对照。

在存在和不存在S9-mix的情况下进行单一突变检测（使用平板掺入法）（由用于媒介物对照组的4个复制板及用于阳性对照组和受试制品的2个复制板构成）。

在检查平板的毒性迹象（即降低的背景菌苔生长（缩减）、针－点（pin-dot）/假回复体（pseudorevertant）集落的存在和/或集落数的减少）后，通常对平板的菌落形成电子计分。还评估（肉眼）平板的化合物沉淀。如果发生化合物沉淀，会在最低处理浓度（在此在培养期结束时在试验板上观察到化合物沉淀物）下停止各菌株的菌落形成计分。

记录各板上的集落数并计算在所用试验制品的各浓度下的平均值。平均值也表示为平均并行媒介物对照值的比率（即增加倍数）。此外，记录任何观察到的沉淀物或毒性。

如果任何处理水平下的数据显示出并行媒介物对照值（TA98、TA100 TA102 WP2 uvrA (pKM101)和WP2 (pKM101))的≥2倍或并行媒介物对照值（TA1535和TA1537）的≥3倍的响应以及剂量相关响应，结果被认为是阳性的。

如果任何菌株的数据显示出接近如上详述的2或3倍阈值的剂量相关响应但没有超过它，结果被认为含糊并需要进一步测试才能明晰化。

该试验方法基于细菌致突变性测试的既定程序 [Maron, 1983；Green, 1984；Ames, 1975；Garner, 1972；Green, 1976；Ames, 1973]并符合下列监管方针的一般原则。

实施例1、2、3和4的化合物（游离碱形式）在此测定中是阴性的。

COM (2000) Guidance on a Strategy for Testing of Chemicals for Mutagenicity, Committee on Mutagenicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment, December 2000。

ICH-S2A (1996) "Specific Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests for Pharmaceuticals", in: Federal Register, April 1996 (61 FR 18199)。

ICH-S2B (1997) "A Standard Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals", in: Federal Register, November 1997 (62 FR 62472)。

Gatehouse, D.G., Wilcox, P., Forster, R., Rowland, I.R.和Callander, R.D. (1990) Bacterial Mutation Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.), Basic Mutagenicity Test: UKEMS Recommended Procedures. Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp. 1361。

OECD (1997) "Bacterial Reverse Mutation Test", in: OECD Guideline for the Testing of Chemicals, Test Guideline 471。

中间体和实施例

综述

所有温度按℃计。

联硼酸频哪醇酯是指4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-联-1,3,2-二氧杂环戊硼烷

BH₃.DMS是指硼烷二甲基硫醚络合物

BH₃-THF是指硼烷四氢呋喃络合物

BINAP是指2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘

[(S)BINAP]Pd(OTf)₂是指(S)-2,2'-双(二苯基膦基)-1,1-联萘基双(乙腈)三氟甲磺酸钯(II)

BOC是指叔丁氧基羰基

BOC₂O是指二碳酸二叔丁酯

BuOH是指丁醇

tert-BuOK是指叔丁醇钾

n-BuOAc是指乙酸正丁酯

ClCO₂Et是指氯甲酸乙酯

Cs₂CO₃是指碳酸铯

Cu(OAc)₂是指乙酸铜

CV是指柱体积

DCM是指二氯甲烷

DIPEA是指N,N-二异丙基乙基胺

DMAP是指4-二甲基氨基吡啶

DME是指二甲氧基乙烷

DMSO是指二甲亚砜

DMF是指N,N-二甲基甲酰胺

Et₃N是指三乙基胺

Et₂O或醚是指二乙醚

EtOAc是指乙酸乙酯

EtOH是指乙醇

FMOC是指9-芴基甲氧基羰基

h是指小时

HCl是指盐酸

H₂O是指水

HPLC是指高效液相色谱法

IPA是指异丙醇

K₂CO₃是指碳酸钾

KOAc是指乙酸钾

KOH是指氢氧化钾

LCMS是指液相色谱法-质谱法

MDAP是指质量指向性自动制备（mass directed autoprep）

Me₄NCl是指四甲基氯化铵

MeOD是指氘化甲醇

min是指分钟

nBuLi是指正丁基锂

NBS是指N-溴代琥珀酰亚胺

NaHC0₃是指碳酸氢钠

Na₂S0₄是指硫酸钠

NaN₃是指叠氮化钠

NMP是指N-甲基吡咯烷酮

(PhSO₂)₂NF或NFSI是指N-氟苯磺酰亚胺

Pd/C是指碳载钯

PdCl₂.dppf是指[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯

Pd₂(dba)₃是指三(二亚苄基丙酮)二钯(0)

Pd(PPh₃)₄是指四(三苯基膦)钯(0)

Pd(di-t-bpf)Cl₂是指1,1'-双(二-叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯

PEPPSI是指吡啶增强的预催化剂制备稳定化和引发（Pyridine-Enhanced Precatalyst Preparation Stabilization and Initiation）

POCl₃是指三氯氧磷

Pt/C是指碳载铂

r.t.是指室温

Rt是指停留时间

TBME是指叔丁基甲基醚

TEA是指三乙基胺

TFA是指三氟乙酸

Tf₂O是指三氟甲磺酸酐

THF是指四氢呋喃

使用Bruker DPX 400MHz，参照四甲基硅烷记录¹H NMR谱。

在Acquity UPLC BEH C18柱（50mm x 2.1 mm i.d.，1.7微米填料直径）上在40℃下进行LC/MS（方法A），用使用氨溶液调节至pH 10的在水中的10 mM碳酸氢铵（溶剂A）和乙腈（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：0-1.5min 1-97% B，1.5-1.9min 97% B，1.9-2.0min 100% B，流速为1毫升/分钟。UV检测是来自210纳米至350纳米波长的总计信号。在Waters ZQ 质谱仪上使用交替扫描正和负电喷雾记录质谱。电离数据四舍五入至最近的整数。

在Acquity UPLC BEH C18柱（50mm x 2.1 mm i.d.，1.7微米填料直径）上在40℃下进行LC/MS（方法B），用0.1% v/v甲酸水溶液（溶剂A）和0.1% v/v甲酸的乙腈溶液（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：0-1.5min 3-100% B，1.5-1.9min 100% B，1.9-2.0min 3% B，流速为1毫升/分钟。UV检测是来自210纳米至350纳米波长的总计信号。在Waters ZQ 质谱仪上使用交替扫描正和负电喷雾记录质谱。电离数据四舍五入至最近的整数。

在Acquity UPLC BEH C18柱（50mm x 2.1 mm i.d.，1.7微米填料直径）上在40℃下进行LC/MS（方法C），用0.1% v/v三氟乙酸水溶液（溶剂A）和0.1% v/v三氟乙酸的乙腈溶液（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：0-1.5min 3-100% B，1.5-1.9min 100% B，1.9-2.0min 3% B，流速为1毫升/分钟。UV检测是来自210纳米至350纳米波长的总计信号。在Waters ZQ 质谱仪上使用交替扫描正和负电喷雾记录质谱。电离数据四舍五入至最近的整数。

MDAP（方法A）。在XBridge C18柱（100mm x 30 mm i.d.，5微米填料直径）上在环境温度下进行HPLC分析，用使用氨溶液调节至pH 10的在水中的10 mM碳酸氢铵（溶剂A）和乙腈（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：

时间（分钟）	流速（毫升/分钟）	%A	%B
				0	40	85	15
1	40	85	15
				10	40	45	55
11	40	1	99
				15	40	1	99

UV检测是来自210纳米至350纳米波长的平均信号。在Waters ZQ质谱仪上使用交替扫描正和负电喷雾记录质谱。电离数据四舍五入至最近的整数。

MDAP（方法B）。在XBridge C18柱（100mm x 30 mm i.d.，5微米填料直径）上在环境温度下进行HPLC分析，用使用氨溶液调节至pH 10的在水中的10 mM碳酸氢铵（溶剂A）和乙腈（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：

时间（分钟）	流速（毫升/分钟）	%A	%B
				0	40	85	15
1	40	85	15
				20	40	45	55
21	40	1	99
				25	40	1	99

MDAP（方法C）。在Sunfire C18柱（150mm x 30 mm i.d.，5微米填料直径）上在环境温度下进行HPLC分析，用0.1% v/v三氟乙酸水溶液（溶剂A）和0.1% v/v三氟乙酸的乙腈溶液（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：

时间（分钟）	流速（毫升/分钟）	%A	%B
				0	40	100	0
3	40	100	0
				3.5	30	100	0
24.5	30	70	30
				25	30	1	99
32	30	1	99

UV检测是来自210纳米至350纳米波长的平均信号。在Waters ZQ 质谱仪上使用交替扫描正和负电喷雾记录质谱。电离数据四舍五入至最近的整数。

MDAP（方法D）。在Sunfire C18柱（150mm x 30 mm i.d.，5微米填料直径）上在环境温度下进行HPLC分析，用使用氨溶液调节至pH 10的在水中的10 mM碳酸氢铵（溶剂A）和乙腈（溶剂B）使用下列洗脱梯度洗脱：

硅胶色谱技术包括在预填充柱（SPE）或手动填充快速柱上的自动化(Flashmaster, Biotage SP4)技术或手动色谱法。

当在化合物或试剂的名称后给出商业供应商的名称时，例如“化合物X (Aldrich)”或“化合物X / Aldrich”，这意味着化合物X可获自商业供应商，如所述商业供应商。

类似地，当在化合物名称后给出文献或专利参考资料时，例如化合物Y（EP 0 123 456），这意味着在所述参考资料中描述了该化合物的制备。

使用化合物命名程序"ACD Name Pro 6.02"获得上述实施例的名称。

中间体1：(3S)-3-氟-2-氧代-3-哌啶羧酸乙酯

在冰浴中在0℃下将2,6-二甲基吡啶（31.7克，296毫摩尔）(Aldrich)经30分钟逐滴添加到2-氧代-3-哌啶羧酸乙酯（101.2克，591毫摩尔）(Aldrich)、双三氟甲磺酸二水合[(S)-(-)-2,2'-双膦基)-1,1'-联萘基]钯(II)（3.14克，2.96毫摩尔）(Sodeoka, M等人, Synlett 1997, 463-466；Fujii, A等人J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5450-5458) (Aldrich)和N-氟苯磺酰亚胺（242.0克，768毫摩尔）(Aldrich)在乙醇（500毫升）中的悬浮液中。在添加过程中使温度保持在大约10℃，然后随着冰融化升温至室温整夜。围绕烧瓶（3升）颈的固体的存在表明在夜里可能已发生放热。LCMS表明存在产物。过滤反应，固体用乙醇，然后DCM（200毫升）洗涤。NMR证实没有固体产物。蒸发液体并再溶解在DCM（3500毫升）中。有机物用饱和氯化铵溶液（300毫升）洗涤，水相用DCM（2x200毫升）再萃取。将合并的有机物蒸发并再溶解在DCM（300毫升）中，经硅藻土（celite）过滤并用DCM（200毫升）洗涤。使有机溶液静置整夜（密封，因此没有蒸发）- 出现细沉淀物。该混合物再经硅藻土（celite）过滤并用DCM洗涤。

将合并的有机层加载到1500g硅胶柱上并在companion XL上提纯，用环己烷中的0-100%乙酸乙酯梯度洗脱。通过LCMS识别适当的馏分，合并，除去溶剂以产生黄色固体状的标题化合物，其在高真空下干燥1小时（92.2克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.52min, MH⁺ 190。

手性分析HPLC（25cm Chiralpak IA, col.no.IAOOCE-MC024, 15%EtOH/C7, 1 ml/min, 波长215nm, RT）表明富集快速洗脱物 - 44% ee。将化合物与具有不同对映体富集度的另外三个批次合并并使用制备HPLC进一步提纯215克的材料以将快速洗脱物的对映体过量改进至>99%。

根据下列方法分批制备样品：在温和加热和声处理下将乙基-3-氟-2-氧代-3-哌啶羧酸酯（25克）溶解在乙醇（450毫升）中。该溶液随后经带有1微米玻璃纤维膜的Pall Acrodisc 37mm注射器过滤器过滤以除去细粒和未溶解的材料。用乙醇将滤过溶液调节至500毫升总体积以得出标称浓度为50毫克/毫升的溶液。

制备HPLC细节如下：

。

中间体2：(3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

将(3S)-3-氟-2-氧代-3-哌啶羧酸乙酯（50克，264毫摩尔）溶解在THF（100毫升）中并逐滴加入硼烷-THF络合物（793毫升，793毫摩尔，1M溶液）。该混合物在回流下加热24小时，冷却至室温并通过添加甲醇（150毫升）猝灭硼烷。加入2M HCl（200毫升）并将该混合物加热至回流20分钟，然后冷却并真空蒸发。将残留物悬浮在DCM（500毫升）中并加入三乙胺（111毫升，793毫摩尔），接着加入BOC酐（73.6毫升，317毫摩尔）。将该混合物搅拌3小时，然后用水（100毫升）和0.5M HCl（100毫升）洗涤，干燥并蒸发产生浅黄色结晶固体状的(3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（52.85克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.80min, MH⁺ 234。

中间体3：(3S)-3-氟-3-({[(三氟甲基)磺酰基]氧基}甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

在-10℃下经20分钟将三氟甲磺酸酐（24.06毫升，142毫摩尔）添加到(3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（30.2克，129毫摩尔）和三乙胺（23.46毫升，168毫摩尔）在DCM（100毫升）中的溶液中。将该混合物搅拌2小时，使其升温至0℃，然后用水和盐水洗涤，干燥并蒸发产生深棕色油状的(3S)-3-氟-3-({[(三氟甲基)磺酰基]氧基}甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（50.2克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.23min, MH⁺ 366。

中间体4：(3S)-3-(叠氮基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

将叠氮化钠（9.79克，151毫摩尔）添加到(3S)-3-氟-3-({[(三氟甲基)磺酰基]氧基}甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（50克，137毫摩尔）在DMF（200毫升）中的溶液中并将该混合物加热至80℃ 1小时。取样并用水猝灭，用醚萃取，并将醚层真空蒸发。残留物通过NMR分析，表明原材料完全消耗。

将该混合物冷却，用水（1升）稀释并用EtOAc（2 x 300毫升）萃取。用水（2 x 300毫升）洗涤溶剂，干燥并蒸发产生琥珀油状的(3S)-3-(叠氮基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（36.7克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.12min, MH⁺ 259。

中间体5：(3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

将(3S)-3-(叠氮基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（36克，139毫摩尔）溶解在乙醇（500毫升）中并在氮气下添加到Pd/C（2.6克，1.222毫摩尔）中。该混合物在大气压下氢化整夜。过滤该悬浮液并将滤液真空蒸发以产生浅黄色油状的(3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（32.7克）。¹H NMR (CDCl₃) 3.75-3.52ppm (2H, 2xm, 2xCH), 3.30ppm (1H, dd, CH), 3.20ppm (1H, m, CH), 2.90-2.73ppm (2H, m, CH₂), 1.96-1.72ppm (2H, 2xm, CH₂), 1.70-1.58ppm (1H, m, CH), 1.57-1.43ppm (10H, m+s, CH + 3xCH₃), 1.32ppm (2H, br.s, NH₂)。

中间体6：N-(2,6-二氯-4-吡啶基)-2,2-二甲基丙酰胺

2,6-二氯-4-氨基吡啶（10克，61.3毫摩尔）(Aldrich)和三乙胺（10.69毫升，77毫摩尔）在二氯甲烷（DCM）（75毫升）中合并并在冰浴中冷却。逐滴加入在DCM（15毫升）中的2,2-二甲基丙酰氯（8.30毫升，67.5毫摩尔）(Aldrich)并在使其升温整夜的同时搅拌该混合物，从而产生清澈的深橘色溶液。LCMS表明良好转化成产物。该溶液用水和饱和NaHCO₃（各100毫升）洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩产生深橘色固体。将粗产物吸收于最低量的DCM中并施加到320g Companion XL硅胶柱上，用环己烷中的0% EtOAc洗脱2CVs，然后用环己烷中的0-15% EtOAc洗脱12CVs，然后在15%下保持2CV。合并适当的馏分并蒸发产生黄色固体状的标题化合物（11.59克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.13min, MH⁺ 247/249。

中间体7：5,7-二氯-1,6-萘啶

将N-(2,6-二氯-4-吡啶基)-2,2-二甲基丙酰胺（1克，4.05毫摩尔）在氮气下吸收于THF（10毫升）中并冷却至<-70℃。经30分钟添加正丁基锂（4.05毫升，10.12毫摩尔，在己烷中的2.5M溶液），以使温度保持低于-60℃，然后在-70℃以下搅拌1小时。经30分钟加入在THF（2毫升）中的(2E)-3-(二甲基氨基)-2-丙烯醛（0.607毫升，6.07毫摩尔），以使温度保持低于-60℃。该反应在-70℃以下搅拌20分钟，然后使其升温至室温。LCMS表明没有留下原材料，因此用5M HCl（5毫升）猝灭反应并回流整夜。LCMS表明良好转化成产物，因此将反应冷却至室温。该反应混合物用固体K₂CO₃碱化并用EtOAc（4x25毫升）萃取。合并的有机物用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩产生棕色固体。将粗产物施加至samplet并使用40+M柱，用环己烷中的12%二乙醚洗脱2CVs，然后用环己烷中的12%-63%二乙醚洗脱10CVs，然后在63%下保持5CVs。合并适当的馏分并蒸发产生黄色固体状的标题化合物（0.42克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.89min, MH⁺ 199/201。

中间体8：(3R)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

向在NMP（20毫升）中的5,7-二氯-1,6-萘啶（5.01克，25.2毫摩尔）和(3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（5.32克，22.90毫摩尔）中加入DIPEA（8.00毫升，45.8毫摩尔）并将该混合物在氮气下在100℃下搅拌72小时。冷却该反应并在乙酸乙酯与水之间分配（各200毫升）。水相用乙酸乙酯洗涤，合并的有机物用水洗涤并除去溶剂。将残留物溶解在DCM中并加载到100g硅胶SNAP柱上并在SP4上提纯，用环己烷中的0-50%乙酸乙酯洗脱17CVs。合并适当的馏分并除去溶剂以产生浅橙色固体状的标题化合物，其在高真空下干燥2小时（7.61克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.12min, MH⁺ 395/397。

中间体9：1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑

将(1,1-二甲基乙基)肼盐酸盐（1.02克，8.19毫摩尔）(Aldrich)、1,1,3,3-四(甲氧基)丙烷（1.344克，8.19毫摩尔）(Aldrich)和盐酸（0.672毫升，8.19毫摩尔）在乙醇（10毫升）中的混合物在回流下加热。形成溶液。在16小时后，反应已结束，因此真空浓缩以产生粗产物。将其溶解在甲醇中并经过氨基丙基柱（20克），用甲醇洗脱。合并的滤液真空浓缩以产生奶油胶（cream gum）状的标题化合物（210毫克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.74min, MH⁺ = 125.6。

中间体10：4-溴-1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑

向1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑（6.1克，49.1毫摩尔）在二氯甲烷（DCM）（200毫升）中的冰冷溶液中加入N-溴代琥珀酰亚胺（8.74克，49.1毫摩尔）。将其升温至环境温度并搅拌18小时。不存在原材料，因此用硫代硫酸钠水溶液猝灭该反应混合物。有机物用水（2 x 500毫升）洗涤并经过疏水熔块（hydrophobic frit）。将滤液真空浓缩以产生橙棕色油，其在静置时变成紫色（7.402克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.03 min, MH⁺ = 203, 205。

中间体11：1-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑

将4-溴-1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑（2.4克，11.82毫摩尔）、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-联-1,3,2-二氧杂环戊硼烷（3.00克，11.82毫摩尔）、乙酸钾（2.90克, 29.5毫摩尔）、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)（0.108克，0.118毫摩尔）、2-(二环己基膦基)-2',4',6'-三异丙基联苯基（0.225克，0.473毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（30毫升）中的混合物用氮气脱气。将反应混合物分入2个微波管瓶中并在微波中在110℃下加热1.5小时。没有留下原材料，因此反应经bond elut储器过滤，残留物用乙酸乙酯洗涤。将滤液真空浓缩以产生粗产物。将其溶解在DCM中并经由二氧化硅（50克）提纯，用DCM中0-50%乙酸乙酯梯度洗脱。合并适当的馏分并在真空中浓缩以产生米色固体状的标题化合物（1.68克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.08min, MH⁺ = 250.8。

中间体12：1-[(甲氧基)甲基]-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑

将4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑（400毫克，2.061毫摩尔）(Aldrich)溶解在乙腈（25毫升）中并在35℃下搅拌5分钟。加入碘甲基甲基醚（0.873毫升，10.31毫摩尔）和碳酸钾（1424毫克，10.31毫摩尔）并使该混合物在35℃下搅拌3小时。

LCMS表明不完全反应。使该混合物在35℃下搅拌另外1小时。LCMS表明没有进展，因此加入2当量（349微升）烷基化剂并使该混合物在35℃下搅拌30分钟。然后加入氯化铵。使该混合物在乙酸乙酯和水之间分配。水层用乙酸乙酯再萃取，合并的有机相用水洗涤，使用疏水熔块干燥并浓缩成油。该油在50g二氧化硅上使用SP4提纯并用0-100%乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱。在废物中发现产物，将其浓缩产生油状的标题化合物（260毫克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.84min, MH⁺ = 238.85。

中间体13：(3R)-3-({[7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-1,6-萘啶-5-基]氨基}甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

在氮气下向2-5毫升微波管瓶中加入碳酸铯（990毫克，3.04毫摩尔）和1-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑（292毫克，1.317毫摩尔）(Boron Molecular)。将(3R)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（400毫克，1.013毫摩尔）溶解在1,4-二氧杂环己烷（4毫升）和水（0.8毫升）中并一等份加入。将氮气鼓过所得悬浮液~2分钟。然后一次性加入四(三苯基膦)钯(0)（117毫克，0.101毫摩尔）并将氮气鼓过该黄色悬浮液另外~1分钟。密封微波管瓶并在微波反应器中在150℃下加热1小时。LCMS表明反应已完成。该反应在水（20毫升）和乙酸乙酯（20毫升）之间分配。水层用乙酸乙酯（2 x 20毫升）进一步萃取，合并的有机物用盐水（10毫升）洗涤。将有机物干燥（Na₂SO₄）并真空浓缩。

使用相同量和反应条件如上重复该反应。合并两个粗制批，使用100g Biotage硅胶柱提纯和用0-100%乙酸乙酯/环己烷梯度洗脱。合并适当的馏分并在真空中浓缩以产生无色油状的标题化合物（811毫克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.88min, MH⁺ 455。

中间体14：(3R)-3-[({7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-基)氨基)甲基]-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

向(3R)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（1.300克，3.29毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（10毫升）中的溶液中加入1-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑（0.906克，3.62毫摩尔）、碳酸铯（2.145克，6.58毫摩尔）、四(三苯基膦)钯(0)（0.114克，0.099毫摩尔）和水（2毫升）。该反应混合物在微波中在130℃下加热2小时。LCMS显示产物主峰而没有原材料。将反应混合物经10g 硅藻土（celite）过滤并在乙酸乙酯与水之间分配（100ml X 2）。有机层用盐水（100毫升）洗涤，蒸发溶剂并溶解在最低量的DCM中。将其加载到100g硅胶柱上并在SP4上提纯，用环己烷中的20-90%乙酸乙酯洗脱22CVs。收集适当的馏分并蒸发溶剂。产物在高真空干燥整夜以产生黄色结晶固体状的标题化合物（1.586克）。

LCMS (方法B): Rt = 1.00min, MH⁺ 483。

中间体15：(3R)-3-氟-3-{[(7-{1-[(甲氧基)甲基]-1H-吡唑-4-基}-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

向在DME（5毫升）、水（2.5毫升）、乙醇（5.00毫升）中的(3R)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（650毫克，1.646毫摩尔）中加入1-[(甲氧基)甲基]-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑（1.03克，4.33毫摩尔）、氢氧化钾（3.95毫升，3.95毫摩尔，1M水溶液）和PEPPSI（112毫克，0.165毫摩尔）。将反应在氮气下在130℃下回流4夜。LCMS显示作为产物的主峰。反应混合物经硅藻土（celite）过滤并除去溶剂。将残留物溶解在DCM中并加载到25g硅胶柱上并在SP4上提纯，用环己烷中的50-100%乙酸乙酯梯度洗脱。合并适当的馏分并除去溶剂以产生黄色油，其在高真空下干燥整夜以产生黄色固体/薄膜形式的标题化合物（813毫克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.86min, MH⁺ 471。

中间体16：(3S)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氧基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

向(3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（1.406克，6.03毫摩尔）在DMF（20毫升）中的冰冷溶液中加入氢化钠（0.313克，7.84毫摩尔）（在矿物油中的60%分散体）。将其搅拌15分钟，再加入5,7-二氯-1,6-萘啶（1.2克，6.03毫摩尔）。将其升温至室温并搅拌4小时。反应已完成，因此用氯化铵水溶液小心猝灭，然后在氯化铵水溶液与乙酸乙酯之间分配。分离层，水层用乙酸乙酯再萃取。合并的有机物用盐水洗涤并在真空中浓缩产生粗产物。将其溶解在DCM中并通过二氧化硅（50g）提纯，用DCM中的0-50%乙酸乙酯梯度洗脱。将适当的馏分真空浓缩以产生奶油泡沫胶形式的标题化合物（1.91克）。

LCMS: Rt = 1.18min, MH⁺ = 395.85。

中间体17：(3S)-3-({[7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-1,6-萘啶-5-基]氧基}甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯

将(3S)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氧基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（1.1克，2.78毫摩尔）、1-乙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑（0.679克，3.06毫摩尔）和碳酸铯（2.263克，6.95毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（16毫升）和水（3毫升）中的混合物用氮气脱气，然后添加四(三苯基膦)钯(0)（0.096克，0.083毫摩尔）。将其在回流下加热18小时。该反应在乙酸乙酯和氯化铵水溶液之间分配。水层用乙酸乙酯再萃取，合并的有机物用盐水洗涤，经过疏水熔块并在真空中浓缩产生粗产物。将其溶解在DCM中并通过二氧化硅(20g)提纯，用DCM中的乙酸乙酯梯度洗脱。产物在纯乙酸乙酯中洗脱。合并适当的馏分并在真空中浓缩以产生粉色奶油泡沫形式的标题化合物（1.10克）。

LCMS: Rt = 1.21 min, MH⁺ = 456.09。

实施例1. 7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺

向(3R)-3-({[7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-1,6-萘啶-5-基]氨基}甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（811毫克，1.784毫摩尔）在DCM（6.1毫升）中的溶液中加入三氟乙酸（3.16毫升，41.0毫摩尔）并将其在环境温度下搅拌2小时。此时间后反应已完成，因此真空浓缩以产生粗产物。将其溶解在甲醇中并加载到SCX柱(70g)上并用甲醇（3个柱体积）和在甲醇中的2M氨洗脱。

将来自氨馏分的滤液真空浓缩以产生黄色油（653毫克）。该游离碱（553毫克）通过高pH制备MDAP提纯（方法A）。合并适当的管瓶并在真空中浓缩以提供黄色固体状的标题化合物（265毫克）。

¹H NMR (d6-DMSO) 8.65ppm (1H, dd, CH), 8.70ppm (1H, br.d, CH), 8.33ppm (1H, s, CH), 8.05ppm (1H, s, CH), 7.77ppm (1H, br.t, NH), 7.37ppm (1H, dd, CH), 7.25ppm (1H, s, CH), 4.19ppm (2H, q, CH₂), 3.95ppm (2H, m, CH₂), 2.85-2.50ppm (4H, 3xm, 2xCH₂), 1.90-1.54ppm (4H, 2xm, 2xCH₂), 1.42ppm (3H, t, CH₃)。

HPLC (柱: Luna 3u C18(2) , #409663-12, 以1毫升/分钟运行8分钟时间，洗脱剂: 0-95%梯度的0.05% TFA/乙腈，在0.05% TFA/水中, 波长220nm): Rt = 2.49min。

旋光度= -25.9 (c. 1.1在甲醇中, T=23.6C)。

HCl盐的制备：

将100毫克游离碱溶解在DCM（1毫升）中并向其中加入HCl（1.0M在Et₂O中）（0.357毫升，0.357毫摩尔）。立即沉淀橙色固体。排出残留溶剂，所得橙色固体在真空中干燥以提供HCl盐形式的标题化合物（120毫克），其为橙色固体状。

LCMS (方法B): Rt = 0.45min, MH⁺ 355。

实施例2. 7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺

将(3R)-3-[({7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-基}氨基)甲基]-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（1.586克，3.29毫摩尔）溶解在DCM（5毫升）中并加入三氟乙酸（5.06毫升，65.7毫摩尔）。将该反应在20℃下搅拌20分钟。LCMS显示产物的主峰。将该反应混合物加载到20g SCX柱上并用甲醇洗涤。该化合物用2M氨的甲醇溶液洗脱。从氨馏分中蒸发溶剂并在高真空下保持2小时以产生黄色结晶固体（1.171克）。该游离碱（1.12克）通过高pH制备MDAP（方法B）提纯。合并适当的馏分，真空浓缩并在高真空下保持整夜以产生黄色结晶固体状的标题化合物（688.1毫克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.52min, MH⁺ 383。

¹H NMR (MeOD) 8.80ppm (1H, dd, CH), 8.58ppm (1H, dd, CH), 8.32ppm (1H, s, CH), 8.08ppm (1H, s, CH), 7.39ppm (1H, dd, CH), 7.25ppm (1H, s, CH), 4.24ppm (1H, dd, CH), 3.82ppm (1H, dd, CH), 2.95-2.63ppm (4H, 2xm, 2xCH₂), 2.00-1.69ppm (4H, 3xm, 2xCH₂), 1.65ppm (9H, s, 3xCH₃)。

HCl盐的制备：

将50毫克该游离碱溶解在二氯甲烷（DCM）（1毫升）中并向其中加入HCl（1.0M在Et₂O中）（0.13毫升）。排出溶剂整夜，所得产物在真空中干燥1小时以产生HCl盐形式的标题化合物（56.6毫克），其为橙色固体状。

LCMS (方法B): Rt = 0.53min, MH⁺ 383。

实施例2. 7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基］-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺 - 备选制备

向(3R)-3-[({7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-基}氨基)甲基]-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（2.24克，4.64毫摩尔）在DCM（14毫升）中的溶液中加入TFA（8.22毫升，107毫摩尔）并将其在环境温度下搅拌2小时。此时间后反应已完成，因此真空浓缩以产生粗产物。将其溶解在甲醇中并加载到SCX柱(50g)上。其用甲醇洗脱（3CVs）且产物用甲醇中的2M氨作为游离碱洗脱。

将来自氨馏分的滤液真空浓缩以产生黄色泡沫（1.55克）。

其中一部分（305毫克）通过高pH MDAP进一步提纯以提供标题化合物（265毫克）。

LCMS (方法C): Rt = 0.56min, MH⁺ 383。

旋光度= -34.2 (c. 1.01，在甲醇中, T=23.6℃)。

实施例3. N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基)-7-{1-[(甲氧基)甲基]-1H-吡唑-4-基)-1,6-萘啶-5-胺

向在DCM（10毫升）中的(3R)-3-氟-3-{[(7-{1-[(甲氧基)甲基]-1H-吡唑-4-基}-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（813毫克，1.728毫摩尔）中加入三氟乙酸（2毫升，26.0毫摩尔）并在室温下搅拌2小时。LCMS显示作为主峰的产物。除去溶剂，溶解在甲醇中并加载到预平衡的50g SCX柱上。用甲醇洗涤并用2M氨的甲醇溶液洗脱。从氨馏分中除去溶剂并将残留物在高真空下干燥整夜。残留物在大规模高pH MDAP（方法D）上提纯。合并适当的馏分并除去溶剂。所得产物在高真空下干燥1小时以产生黄色固体状的标题化合物（349毫克）。

LCMS (方法B): Rt = 0.43min, MH⁺ 371。

¹H NMR (MeOD) 8.84ppm (1H, br.d, CH), 8.60ppm (1H, br.d, CH), 8.44ppm (1H, s, CH), 8.18ppm, (1H, s, CH), 7.44ppm (1H, dd, CH), 7.31 ppm (iH, s, CH), 5.49ppm (2H, s, CH₂), 4.25-3.87ppm (2H, 2xdd, CH₂), 3.38ppm (3H, s, CH₃), 3.21-2.75ppm (4H, 3xm, 2xCH₂), 2.10-1.75ppm (4H, 2xm, 2xCH₂)。

旋光度= -27.7 (c. 0.74在甲醇中, T=23.6℃)。

HCl盐的制备：

将47毫克该游离碱溶解在二氯甲烷（DCM）（1毫升）中并加入少量甲醇和HCl（1.0M在Et₂O中）（0.127毫升，1当量）。除去溶剂，残留物在高真空下干燥整夜以产生HCl盐形式的标题化合物（48.5毫克），其为浅橙/黄色固体状。

LCMS (方法B): Rt = 0.43min, MH⁺ 371。

实施例4. 7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氧基)-1,6-萘啶

向(3S)-3-({[7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-1,6-萘啶-5-基]氧基}甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（1.1克，2.415毫摩尔）在DCM（3毫升）中的溶液中加入三氟乙酸（3毫升，38.9毫摩尔）并将其在室温下搅拌3小时。反应已完成，因此真空浓缩以产生粗产物。将该TFA盐溶解在甲醇中并加载到SCX柱(20g)上。用甲醇洗脱杂质，产物用甲醇中的2M氨洗脱。将滤液真空浓缩以产生奶油胶状固体（620毫克）。其通过大规模MDAP（方法C）提纯。合并适当的管瓶并在真空中浓缩产生TFA盐形式的产物。为了形成游离碱，将其溶解在甲醇中并通过用甲醇洗脱的SCX柱(20g)提纯。该产物用甲醇中的2M氨洗脱。将滤液真空浓缩以产生透明玻璃形式的标题化合物（500毫克）。

LCMS (方法C): Rt = 0.51 min, MH⁺= 355.9。

¹H NMR (MeOD) 8.92ppm (1H, dd, CH), 8.57ppm (1H, br.d, CH), 8.30ppm (1H, s, CH), 8.10ppm (1H, s, CH), 7.58ppm (1H, s, CH), 7.51 ppm (1H, dd, CH), 4.68ppm (2H, m, CH₂), 4.26ppm (2H, q, CH₂), 3.30-2.60ppm (4H, 3xm, 2xCH₂), 2.20-1.62ppm (4H, 3xm, 2xCH₂), 1.52ppm (3H, t, CH₃)。

旋光度= -7.6 (c. 0.79在甲醇中, T=23.6℃)。

HCl盐的制备：

将115毫克该游离碱溶解在DCM（2毫升）中并向其中加入在二乙醚中的1M HCl（0.32毫升）。其在氮气下排出并在真空中干燥以产生HCl盐形式的标题化合物（74毫克），其为奶油固体状。

LCMS (方法C): Rt = 0.51 min, MH⁺ = 356。

实施例5至11

类似地制备下列其它实施例：

名称	R-	用于形成硼酸酯的烷基化剂^§	立体化学	LCMS MH⁺	LCMS Rt (min)
						Ex 5: 1-{4-[5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氨基)-1,6-萘啶-7-基]-1H-吡唑-1-基}-2-甲基-2-丙醇	-CH₂C(Me)₂OH		纯手性	399	0.42 (方法B)
Ex 6: 2-{4-[5-({[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}氨基)-1,6-萘啶-7-基]-1H-吡唑-1-基}乙醇	-CH₂CH₂OH		纯手性	371	0.38 (方法B)
						Ex 7: N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-{1-[2-(甲氧基)乙基]-1H-吡唑-4-基}-1,6-萘啶-5-胺	-CH₂CH₂OMe		纯手性	385	0.43 (方法B)
Ex 8: 7-(1-环戊基-1H-吡唑-4-基)-N-[(3-氟-3-哌啶基)甲基]-1,6-萘啶-5-胺	-环戊基		外消旋	395	0.59 (方法C)
						Ex 9对映体A: N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺	-CH₂CF₃		纯手性	409	0.50 (方法B)
Ex 9对映体B: N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺	-CH₂CF₃		纯手性	409	0.51 (方法B)
						Ex 10: N-[(3-氟-3-哌啶基)甲基]-7-[1-(苯基甲基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺	-苄基	非合成-可购得硼酸酯(Aldrich)	外消旋	417	0.6 (方法C)
Ex 11对映体A: N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺	CH(Me)₂		纯手性	369	0.46 (方法B)
						Ex 11对映体B: N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-7-[1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-1,6-萘啶-5-胺	CH(Me)₂		纯手性	369	0.47 (方法B)

^*使用FMOC保护的哌啶而非BOC保护的哌啶制备实施例11，并以FMOC保护的式(I)分离对映体

^§-烷基化剂可购自例如Sigma-Aldrich UK (Aldrich)。

对方案6的工艺描述

阶段a): 2-氧代-3-哌啶羧酸(1S,2R,5S)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己酯的制备

将4-二甲基氨基吡啶（0.35wt），(+)-薄荷醇（0.95wt）和2-氧代-3-哌啶羧酸乙酯（1wt）溶解/悬浮在甲苯（10vol）中。将该混合物加热至回流并搅拌7天，定期蒸馏溶剂并补充新鲜甲苯。将该反应混合物冷却至25℃并用两份5%w/w HCl水溶液（4 vol）和随后水（4 vol）洗涤。将有机相减压浓缩以产生无色油状的标题化合物。

双三氟甲磺酸[(S)-2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘基]双(乙腈)钯(ll)的制备，用于阶段b)的催化剂

将乙酸钯(1wt)溶解在乙腈(4vol)中并在20±3℃下搅拌1小时。将该反应混合物冷却至0±3℃并经30分钟缓慢加入三氟甲磺酸（0.75vol, 1.9当量）。在0±3℃下搅拌15分钟后，将该反应混合物加热至20±3℃并搅拌另外30分钟。加入(S)-BINAP（2.77wt, 1当量），接着用乙腈(0.6vol)洗涤并将该混合物在20±3℃下搅拌2.5小时。缓慢加入二异丙基醚(10vol)以产生浆料，其老化30分钟。抽吸滤除固体并用乙腈:二异丙基醚（1:3, 8vol）和二异丙基醚(8vol)洗涤。该产物随后在真空中在20±3℃下干燥至恒定探针温度。

阶段b): (3S)-3-氟-2-氧代-3-哌啶羧酸(1S,2R,5S)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己酯的制备

将2-氧代-3-哌啶羧酸(1S,2R,5S)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己酯(1wt)溶解在乙醇(1.5vol)中并加入N-氟苯磺酰亚胺（NFSI）(1.07wt)，接着在20℃下加入[(S)-BINAP]Pd(CH₃CN)₂(OTf)₂ (0.038wt)。残留NFSI和催化剂用乙醇（3vol）洗涤。将夹套冷却至0℃并缓慢装入2,6-二甲基吡啶(0.21 vol)，使温度保持低于20℃。然后将夹套温度提高至20℃。将反应混合物搅拌24小时，冷却至0℃并搅拌另外2小时。通过过滤分离固体，用乙醇(3vol)洗涤并在真空下在40℃下干燥。将干燥的粗制固体装入反应器，并加入二氯甲烷(5vol)。二氯甲烷相相继用2M NaOH水溶液(3vol)、水(3vol)、5%w/w HCl水溶液(3vol)和水(3vol)洗涤。将二氯甲烷萃取物转移到旋转蒸发器中并在减压下与正庚烷溶剂交换以产生流动浆料和大约11vol的最终体积。产物通过过滤分离，用庚烷(3vol)洗涤并在真空下在40℃下干燥。

阶段c): (3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯的制备

将(3S)-3-氟-2-氧代-3-哌啶羧酸(1S,2R,5S)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己酯（1当量，1wt）悬浮在无水THF(6vol)中并用硼烷二甲基硫醚络合物（6当量，1.9vol）处理。所得溶液在63-66℃下搅拌40-46小时。将该反应混合物冷却至0±5℃并经30-90分钟缓慢添加到冷（0±5℃）甲醇(3vol)中，使内部温度保持低于15℃。观察到剧烈气体释放和发泡。经10-15分钟加入2M盐酸(4vol)，使内部温度保持低于15℃。将该混合物在回流(60-65℃)下搅拌30-90分钟然后冷却至20-25℃。加入甲苯(4vol)，将该混合物搅拌15分钟，然后过滤。分离滤液，下方的酸性水相流走。滤饼用2M盐酸(2vol)洗涤，洗液用于甲苯相的二次萃取。下方的酸性水相流走，与第一酸性水相合并并冷却至5±5℃。该溶液用氢氧化钠（5当量，0.668wt）处理并在10-20℃下搅拌直至固体溶解。加入二-叔丁基二碳酸酯（1.1当量，0.802wt）在二氯甲烷(2vol)中的溶液并用更多的二氯甲烷(2vol)冲洗。将该两相混合物剧烈搅拌15小时，过滤，滤饼用二氯甲烷(2vol)洗涤。下方的有机相流走。滤饼用二氯甲烷(2vol)洗涤，这种洗液用于萃取水相。二氯甲烷萃取物用水(4vol)洗涤并真空浓缩。残留的油在Buchi上在40℃下干燥。加入庚烷(4vol)并将该混合物真空浓缩。在蒸发接近结束时，该混合物用标题化合物(0.001wt)接种，将所得浆料浓缩至小体积并用庚烷(4vol)稀释。该浆料在Buchi上在40℃下旋转20-36分钟，冷却并在20±5℃下旋转1小时。抽吸收集固体，用庚烷(2 x 1vol)洗涤并在真空中在35±5℃下干燥。

阶段d): (3S)-3-氟-3-({[(三氟甲基)磺酰基]氧基}甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯的制备

在氮气气氛下在20℃下使吡啶(3vol)中的(3S)-3-氟-3-(羟甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯(1wt)溶解。将所得溶液冷却至-10℃，然后以使内部温度保持低于5℃的速率加入三氟甲磺酸酐(0.80vol)。将反应混合物在-10℃下搅拌4小时，然后通过TLC监测完成度。将该批料升温至0℃，加入乙酸异丙酯(8vol)，接着加入柠檬酸水溶液（5.8wt柠檬酸在5.8vol水中）。将该混合物在20℃下搅拌15分钟，然后分离层。有机层相继在20℃下用另一柠檬酸水溶液（5.8wt柠檬酸在5.8vol水中）洗涤，接着用碳酸氢钠水溶液（0.35wt NaHC0₃在水4.65vol中）和水(5vol)洗涤。在旋转蒸发器上将有机相蒸发至干以产生橙色油状的标题化合物。

阶段e): (3S)-3-(叠氮基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯的制备

在20℃下将(3S)-3-氟-3-({[(三氟甲基)磺酰基]氧基}甲基)-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯(1 wt)溶解在N,N,-二甲基甲酰胺(3vol)中并加入叠氮化钠（1.1当量，0.20wt）。将所得悬浮液在20-30℃下搅拌6小时。加入TBME (5vol)和水(9vol)。将该混合物搅拌5分钟并分离层。水相用TBME (5vol)萃取，并合并TBME相。合并的有机物用水（2 x 5vol）洗涤，过滤并减压浓缩以产生橙色油状的标题化合物。

阶段f): (3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯的制备

用氮气吹扫氢化容器。将(3S)-3-(叠氮基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯(1wt)溶解在THF(11 vol)中并装入该容器，用THF (2vol)冲洗。加入浓氨水溶液（~33% wt溶液，2vol），接着加入10%碳载铂（Johnson Matthey type 128；-50%湿, 8.3%wt）。排空该容器并用氮气吹扫3次。反应容器用氢气吹扫，开始搅拌并在大气压下进行氢化，保持20℃的内部温度38.5小时（通过LCMS测得反应完成）。排空该容器并用氮气吹扫三次，内容物通过CUNO Zetacarbon过滤器（R55SP）。该容器用THF(3vol)洗涤并使其通过之前使用的过滤器。将合并的有机物在旋转蒸发器上浓缩至干。

阶段g): (3R)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯的制备

将5,7-二氯-1,6-萘啶（1当量，1wt）、(3R)-3-(氨基甲基)-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯（1.1当量，1.28wt）和二异丙基乙基胺（2当量，1.75vol）在NMP (6vol)中的混合物在110±5℃下搅拌17小时。将该溶液冷却至70-75℃并在65-75℃下经47分钟加入水(6vol)。将该混合物在65-75℃下老化50分钟，然后冷却至45℃以产生浆料。将该混合物缓慢冷却至20-25℃，然后老化2.25小时。抽吸收集固体。滤饼用1:2v/v NMP/水（2vol），然后水（2 x 4vol）洗涤并在真空中在40±5℃下干燥。由于固体仍含有相当大量的NMP（16.2%w/w），其在1:1v/v NMP/水（7.3vol）中再制浆。将该浆料加热至65℃并在65-66℃下搅拌1小时。将该浆料冷却至20-25℃并老化3天。抽吸收集固体。滤饼用1:2v/v NMP/水（2vol），然后水（2 x 4vol）洗涤并在真空中在40±5℃下干燥。

阶段h) & i): 7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺二盐酸盐（实施例2的盐酸盐）的制备

将(3R)-3-{[(7-氯-1,6-萘啶-5-基)氨基]甲基}-3-氟-1-哌啶羧酸1,1-二甲基乙酯(1wt)、1-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑(0.76wt)、碳酸氢钠(0.64wt)和1,1'-双(二-叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯(0.00825wt)溶解/悬浮在1,4-二氧杂环己烷(8vol)和水(2vol)中。将该混合物加热至回流并搅拌3小时。将该混合物冷却至20±3℃以形成悬浮液。在真空下滤出固体。滤液通过真空蒸馏浓缩至2vol。加入甲苯(10vol)。该溶液用水(5vol)洗涤，然后在60-65℃下与Silicycle Si-Thiol衍生化硅胶(1wt)一起搅拌2小时。该混合物在60-65℃下过滤，滤饼用甲苯(2vol)洗涤。然后将有机滤液加热至60-63℃并经30分钟加入在1,4-二氧杂环己烷中的4M氯化氢（2.9vol）。将该混合物在60-63℃下搅拌5小时。将所得浆料冷却至20±3℃并老化15.5小时。抽吸滤出固体并用甲苯(2 x 2vol)洗涤。产物在真空中在40±3℃下干燥至恒定探针温度。

阶段j): 7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺（实施例2）的制备

将7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺二盐酸盐(1wt)溶解/悬浮在水(10vol)中并用乙酸乙酯（2 x 5vol）洗涤。酸性水相用32% NaOH (0.6vol)碱化至pH 10并用乙酸乙酯（2 x 5vol）萃取。萃取物用水中的5%w/v氯化钠（5vol）洗涤。合并的萃取物在Buchi上浓缩成固体。将该残留物悬浮在乙酸正丁酯(2.8vol)中并加热至73-78℃以完成溶解。该溶液用0.2vol 管线清洗（line wash）经5μΜ 多米尼克汉德过滤器（domnick hunter filter）管线过滤。将该溶液冷却至45-50℃并用标题化合物(0.001wt)接种。将该混合物冷却至40-45℃并老化50分钟。该浆料在40-45℃下用TBME (3vol)稀释30分钟，并在40-45℃下老化1小时。将该浆料冷却至20-23℃并老化16小时。过滤固体，用1:1 v/v乙酸正丁酯/TBME (1 vol)，接着TBME (2 x 2vol)洗涤并在真空中在40±5℃下干燥至恒定探针温度。

对方案7的工艺描述

阶段a): 2-(2-乙氧基-2-氧乙基)烟酸和2-(2-异丙氧基-2-氧乙基)烟酸的制备

在氮气气氛下在30±5℃下向反应器中装入叔丁醇钾（3当量），接着异丙醇（9vol）。搅拌该混合物以溶解。在冷却至~30℃后，在氮气气氛下在<40℃下缓慢加入乙酰乙酸乙酯（2当量）。在搅拌1-2小时后，在35±5℃下装入乙酸铜（0.1当量），接着2-氯烟酸（1当量）。此后用异丙醇（1vol）冲洗。将该反应混合物在氮气气氛下加热至78±3℃至少4小时，然后取样。在得到成功样品结果后，将反应冷却至30±5℃并用水，接着稀HCl猝灭以将pH调节至6-7。

反应混合物在<50 ℃下真空蒸馏浓缩成4-5体积。加入10% NaCl溶液，接着乙酸乙酯。追加稀HCl以将pH调节至2.5-3.0。该双相混合物随后经硅藻土（celite）床过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤（两次）。分离乙酸乙酯层和水层，然后水层用乙酸乙酯反萃取（两次）。乙酸乙酯相用水和5%NaCl水溶液洗涤。有机相在真空下在<50℃下蒸馏至1-2体积。加入甲苯并将该混合物再蒸馏至1-2体积。重复这一甲苯添加/蒸馏步骤。将所得甲苯悬浮液冷却至30±5℃并用己烷(10vol)处理。该悬浮液在30±5℃下搅拌1-2小时，然后过滤。固体用己烷(2vol)洗涤，然后卸载，在真空(NLT 650 mm Hg)下在52.5±2.5 ℃下干燥10小时。

阶段b) & c): 1,6-萘啶-5,7(6H,8H)-二酮的制备

将四氢呋喃(9vol)装入反应器中，接着加入原材料酯（1当量）并用四氢呋喃(1vol)冲洗。将该混合物在氮气气氛下冷却至-2.5±7.5℃，然后用三乙胺（1.35当量）和随后氯甲酸乙酯（1.25当量）处理。该反应在-2.5±7.5℃下搅拌1小时，然后取样。在得到成功结果后，该反应小心地用氨水处理，搅拌，然后加入水。在<5℃下加入稀HCl以将pH调节至6.5-7.5。该混合物在真空下在<40 ℃下蒸馏至12-14体积并冷却至7.5±2.5℃。该悬浮液在7.5±2.5℃下搅拌~1小时，然后过滤。固体用水（1 vol）洗涤，然后卸载，在真空(NLT 650 mm Hg)下在52.5±2.5 ℃下干燥12.0小时。

阶段d) & e): 5,7-二氯-1,6-萘啶的制备

将三氯氧磷(3vol)在30±5℃下装入反应器，接着加入1,6-萘啶-5,7(6H,8H)-二酮（1当量）、四甲基氯化铵（1.05当量）并用三氯氧磷(0.5vol)冲洗。将该混合物加热至103.5±3.5℃并搅拌最少36小时。然后将该反应冷却至60±5℃并取样。在得到成功样品后，加入甲苯(4vol)，该混合物通过在真空(NLT 650 mm Hg)和<60℃温度下蒸馏浓缩至2-3体积。追加甲苯(2vol)，再将该混合物在真空下蒸馏至2-3体积。这种甲苯添加/蒸馏循环再重复一次，然后将该混合物冷却至47.5±2.5℃并用四氢呋喃(8vol)和乙酸乙酯(8vol)处理。将该混合物冷却至30±5℃并倒入预冷至5.0±5.0℃的15%碳酸钠水溶液(15vol)中。与乙酸乙酯(3vol)一起追加四氢呋喃(3vol)以冲洗初始反应器。仍在5±5℃下，用另外15%碳酸钠水溶液(5vol)缓慢处理该混合物并搅拌15-30分钟。将温度升至22.5±2.5℃并通过添加15%碳酸钠水溶液或稀HCl来将pH调节至7-8。加入乙酸乙酯（5vol），接着硅藻土（celite）。搅拌该混合物，然后过滤。该硅藻土（celite）床用乙酸乙酯（2x2vol）洗涤。滤液在<55℃下在真空(NLT 650 mm Hg)下蒸馏至30±5体积。加入水（2vol）并再蒸馏至~30vols。重复这种水添加/蒸馏循环直至通过GC测得四氢呋喃、甲苯和乙酸乙酯含量各自为NMT 3.0%（% w/w）。此时，加入水（10vol），将该混合物加热至42.5±2.5℃并搅拌30-60分钟。产物在42.5±2.5℃下通过过滤分离并用水（2x3vol）洗涤。将滤饼吸干，然后卸载并装入单独反应器中。加入水（20vol），将该悬浮液加热至42.5±2.5℃并在42.5±2.5℃下搅拌30-60分钟。过滤产物并用水（2x3vol）洗涤，吸干，然后转移到真空炉中并在52.5± 2.5℃下在真空(NLT 650 mm Hg)下进一步干燥8±2小时。

对方案8的工艺描述

阶段a): 1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑（中间体9）的制备

向1,1,3,3-四甲氧基丙烷（3.82千克，23.27摩尔）和叔丁基肼盐酸盐（2.9千克，23.27摩尔）在乙醇（24.54千克）中的混合物中加入浓HCl（4.72千克，46.55摩尔），以使温度保持低于50℃。然后将反应混合物快速加热至回流。在大约2小时后，将反应取样并通过NMR分析。合格标准为留下<3.0%原材料。在得到合格结果后，将该溶液冷却，用水（8.29千克）稀释并真空蒸发（T<50℃, p<-0.08MPa）直至除去大约所有原始乙醇。该溶液用10M NaOH(水溶液)碱化，用EtOAc（11.11 kgx2）萃取，有机相用饱和氯化铵溶液（4.3ml/g x 2）和盐水（4.3ml/g）洗涤，然后蒸发产生棕色液体状的标题化合物（2.08千克，72%收率）（GC纯度99.70%a/a）。

阶段b): 4-溴-1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑（中间体10）的制备

向1-(叔丁基)吡唑（1.75千克，14.09摩尔）在二氯甲烷（12.9千克）中的冰冷溶液（0℃至10℃）中逐份加入NBS（2.63千克，14.79摩尔）。将该溶液在0℃下搅拌直至1-(叔丁基)吡唑的含量<30% (GC)，然后升温至RT并搅拌直至所取样品通过GC显示<1.0%。在得到合格结果后，将10%亚硫酸氢钠水溶液添加到反应混合物中直至KI-淀粉没有变成蓝色。有机相随后用5% NaCl溶液和盐水相继洗涤，然后蒸发产生棕色液体状的标题化合物（2.67千克，93.4%收率；GC纯度99.1%a/a）。

阶段c): 频哪醇硼酸异丙酯的制备

向20升四颈瓶中加入硼酸三异丙酯（261.0克，1.388摩尔）和频哪醇（142.5克，1.207摩尔）并加热至~90℃达12-16小时。反应完成的标准是通过GC，频哪醇<4.0%。在完成后，反应转化成蒸馏并收集产物馏分（在174-178℃下沸腾）。在运行的六个20升批次中在80-90%th收率范围内以无色油状获得标题产物。GC记录87-96%的纯度，但¹H NMR表明产物非常纯。[不符值归因于产物对GC条件的不稳定性]。

阶段d): 1-(1,1-二甲基乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑（中间体11）的制备

向20升四颈瓶中加入4-溴-(叔丁基)吡唑（1.15千克，5.66摩尔）和THF（9.2升），然后将该混合物冷却至-78℃至-85℃并在此温度下用nBuLi（6.23摩尔）逐滴处理。在添加后，该溶液在相同温度下搅拌1小时并逐滴加入频哪醇硼酸异丙酯（1.47千克，7.92摩尔）。在搅拌~3小时后反应完成（通过GC，原材料<1.0%a/a），然后添加水（2.3升）以猝灭该反应；通过添加3.45千克1M HCl，将pH调节至8-9。水相用TBME（3.45L x 2）萃取，合并的有机相用5% NaCl（3.45L x 2）和水（3.45升）相继洗涤。将有机相蒸发产生粗产物。在随后从庚烷中重结晶后，以63.5%th总收率作为白色固体获得纯产物（GC纯度99.7%a/a）。（运行两个20升反应，然后在庚烷重结晶中合并）。

Claims

1.式(I)的化合物：

其中：

X是O或NH；

R¹是C_2-4烷基、C_3-7环烷基、羟基C_2-4烷基、C_1-2烷氧基C_1-4烷基、三氟甲基C_1-2烷基或苄基;

或其盐。

2.根据权利要求1的化合物或其盐，其中X是NH。

3.根据权利要求1或2的化合物或其盐，其中R¹是C_2-4烷基、C_3-7环烷基或C_1-2烷氧基C_1-4烷基。

4.根据权利要求1的化合物或其盐，其中R¹是乙基、叔丁基、-CH₂OCH₃、-CH₂C(CH₃)₂OH、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂OCH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CF₃、苄基或环戊基。

5.根据权利要求4的化合物或其盐，其中R¹是叔丁基。

6.根据权利要求1至5中任一项的化合物或其盐，其具有S绝对立体化学。

7.化合物或其盐，其选自：

及其盐。

8.化合物或其盐，其选自：

及其盐。

9.化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺

或其盐。

10.化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺

或其盐。

11.根据权利要求1至10中任一项的化合物或其盐，其中所述盐是可药用盐。

12.根据权利要求11的化合物或其盐，其中所述可药用盐是盐酸盐。

13.药物组合物，包含如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂。

14.药物组合物，包含7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂。

15.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于治疗。

16.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于抑制脾酪氨酸激酶（Syk）。

17.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于治疗自身免疫病症。

18.根据权利要求17使用的化合物或其可药用盐，其中所述自身免疫病症选自系统性红斑狼疮（SLE）、盘状（皮肤）狼疮、Sjorgens综合征、Wegners肉芽肿病和其它血管炎、大疱性类天疱疮和天疱疮、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、巨细胞动脉病、血管球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎。

19.根据权利要求18使用的化合物或其可药用盐，其中所述自身免疫病症是类风湿性关节炎。

20.化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐，用于治疗类风湿性关节炎。

21.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于治疗慢性自发性荨麻疹。

22.化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐，用于治疗慢性自发性荨麻疹。

23.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于治疗癌症。

24.根据权利要求23使用的化合物或其可药用盐，其中所述癌症选自血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤（SLL/CLL）、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤。

25.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于治疗与不适当的肥大细胞和/或嗜碱性细胞活化相关的疾病。

26.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐，用于治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病。

27.根据权利要求26使用的化合物或其可药用盐，其中所述炎性疾病和/或变态反应性疾病选自慢性阻塞性肺病（COPD）、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、哮喘、重症哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病、皮炎、过敏症、鼻炎、皮肤狼疮、自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮、肥大细胞增多症和过敏反应。

28.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗自身免疫病症的药物的用途。

29.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗癌症的药物的用途。

30.如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病的药物的用途。

31.抑制脾酪氨酸激酶（Syk）的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐。

32.治疗自身免疫病症的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐。

33.根据权利要求32的治疗自身免疫病症的方法，其中所述自身免疫病症选自系统性红斑狼疮（SLE）、盘状（皮肤）狼疮、Sjorgens综合征、Wegners肉芽肿病和其它血管炎、大疱性类天疱疮和天疱疮、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、巨细胞动脉病、血管球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎。

34.根据权利要求33的治疗方法，其中所述自身免疫病症是类风湿性关节炎。

35.治疗类风湿性关节炎的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐。

36.治疗慢性自发性荨麻疹的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐。

37.治疗慢性自发性荨麻疹的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的化合物，其是7-[1-(1,1-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-{[(3S)-3-氟-3-哌啶基]甲基}-1,6-萘啶-5-胺或其可药用盐。

38.治疗癌症的方法，其包括给予需要其的患者治疗有效量的如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐。

39.根据权利要求38的治疗癌症的方法，其中所述癌症选自血红素恶性肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，包括滤泡性（FL）、套细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤（SLL/CLL）、伯基特和弥漫性大B细胞（DLBCL）淋巴瘤。

40.治疗与不适当的肥大细胞和/或嗜碱性细胞活化相关的疾病的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐。

41.治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病的方法，其包括给予需要其的对象治疗有效量的如权利要求11或权利要求12中所定义的化合物或其可药用盐。

42.根据权利要求41的治疗炎性疾病和/或变态反应性疾病的方法，其中所述炎性疾病和/或变态反应性疾病选自慢性阻塞性肺病（COPD）、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、哮喘、重症哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病、皮炎、过敏症、鼻炎、皮肤狼疮、自身免疫性大疱病症包括天疱疮和类天疱疮、肥大细胞增多症和过敏反应。