CN102925280A - 一种微生物油脂的提取及精炼方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物油脂的提取及精炼方法。其特征在于：它包括以下步骤：（1）发酵液后处理：在发酵结束后，将发酵液进行高温瞬时灭活处理；菌液分离得到湿菌体；干燥；（2）微生物油脂提取：在萃取温度不高于60℃的温度条件下萃取微生物油脂,得到混合油；降温至-10～10℃，过滤除去混合油中的杂质及胶质，然后真空脱溶，得到毛油；（3）精炼：碱炼；在碱炼后的体系中先加入活性白土进行脱色，然后加入二氧化硅和活性炭对危害物进行吸附，再过滤除去活性白土、二氧化硅和活性炭；180～190℃脱臭，得到成品油。其是一种适用于微生物油脂的在工业生产上行之有效、可有效降低油脂中危害物含量的提取及精炼方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物油脂的提取及精炼方法。
背景技术
长链多不饱和脂肪酸与人类的营养息息相关。虽然成人能通过前体合成花生四烯酸和二十二碳六烯酸等长链不饱和脂肪酸，但对于婴幼儿来说，其合成能力尚有所欠缺，因此需要及时补充花生四烯酸和二十二碳六烯酸等长链不饱和脂肪酸，以促使婴幼儿大脑及视网膜的发育。为此，世界粮农组织和世界卫生组织联合委员会提出在婴儿配方奶粉中添加花生四烯酸和二十二碳六烯酸。
目前对微生物油脂浸出提取的方法很多，包括公开号为CN101133144A的中国专利中提到的混合植物种子进行压榨的方法，由于微生物细胞是单个细胞，个体承压能力极强，仅仅靠压榨是很难将微生物细胞内的微生物油脂压榨出来，因此该专利后期使用溶剂浸出工艺，但其操作流程过于复杂，同时加入了植物种子，降低了微生物油脂中多不饱和脂肪酸的含量；公开号为CN1447860A的中国专利中提出将微生物细胞收集后通过酶促技术溶解细胞壁后分离出微生物油脂，该方法虽然可以不使用溶剂，但是其提取效果不容乐观；CN1279154C中提到使用二氧化碳超临界萃取技术萃取微生物油脂，而目前对于超临界萃取技术在实验室应用的报道较多，但可以应用于工业生产的还不多见。
除此，目前还没有专门针对微生物油脂精炼技术的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工业生产上行之有效、可有效降低油脂中危害物含量的微生物油脂的提取及精炼方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)发酵液后处理
(1.1)微生物灭活：在发酵结束后，将发酵液进行高温瞬时灭活处理；
(1.2)菌液分离：控制发酵液的温度不高于50℃，通过板框分离发酵液，收集并粉碎滤饼即湿菌体；
(1.3)干燥：对湿菌体进行干燥，得到干菌体；
(2)微生物油脂提取
(2.1)在萃取温度不高于60℃的温度条件下使用己烷、乙醚、石油醚、乙醇、丙酮中的一种从干菌体中萃取微生物油脂，得到混合油；
(2.2)将萃取得到的混合油降温至-10～10℃，过滤除去混合油中的杂质及胶质，然后将过滤得到的的混合油在不高于60℃的温度条件下真空脱溶，得到毛油，真空脱溶后萃取剂的残留量优选≤5000ppm即5000mg/kg；
(3)精炼：
(3.1)碱炼：在毛油中加入有机溶剂正己烷、石油醚或乙醚，然后进行碱炼，中和油脂中的游离脂肪酸，并除去皂脚，再在不高于60℃的温度条件下真空脱溶，真空脱溶后有机溶剂的残留量≤5000ppm即5000mg/kg；
(3.2)去除危害物：在步骤(3.1)碱炼后的体系中先加入活性白土进行脱色，然后加入二氧化硅和活性炭对危害物进行吸附，再过滤除去活性白土、二氧化硅和活性炭；
(3.3)180～190℃脱臭，得到成品油。
按上述方案，所述步骤(1.1)的灭活温度为122±2℃，灭活时间＜20s。
按上述方案，所述步骤(1.3)采用沸腾干燥塔并控制进风温度为70～80℃进行，干燥后干菌体中的水分含量不高于8wt％。
按上述方案，所述步骤(2.1)的萃取剂优选为胶质不溶的丙酮，萃取采用多次重复萃取方式，萃取重复次数为5～10次，萃取剂的体积用量和干菌体的重量比为0.5～5∶1mL/g。
按上述方案，所述步骤(3.1)的有机溶剂优选为正己烷，正己烷和毛油的体积比为1∶1～5。
按上述方案，所述步骤(3.1)中碱炼所用的碱液为氢氧化钠溶液。
按上述方案，所述步骤(3.2)中活性白土的加入量为毛油的2～5wt％，二氧化硅的加入量为毛油的0.5～3wt％，活性炭的加入量为毛油的0.1～1wt；所述的脱色或吸附为在50±2℃和低于1000pa的绝压条件下，以50～70转/min的搅拌速率搅拌30min以上。
按上述方案，所述步骤(3.2)中活性白土的加入量为毛油的3～4wt％，二氧化硅的加入量为毛油的0.7～1wt％，活性炭的加入量为毛油的0.3～0.5wt％。
按上述方案，所述的步骤(3.3)中真空度为：绝压≤300pa，每批脱臭量≤120kg，脱臭时间为30±5min，脱臭蒸汽使用量为0.9～1.1kg蒸汽/kg油脂，脱臭升温时间和降温时间均≤30min。
本发明的有益效果：
1、在发酵结束后将发酵液使用高温瞬时灭活，可有效控制发酵后处理过程中发酵条件的变化而可能出现的异常发酵；
2、采用胶质难溶的萃取剂进行萃取，然后通过低温过滤可有效去除毛油中的杂质和胶质，从而在后续精炼过程中省去脱胶工艺，避免了高温水化脱胶过程中油脂的氧化变质；
3、采用吸附剂吸附去除危害物，可有效地将油脂中的危害物含量降至极低水平；
4、该方法中步骤(1.2)、(1.3)、(2.1)、(2.2)、(3.1)和(3.2)均低温进行，从而可防止微生物细胞内微生物油脂的氧化；
5、低温小批量脱臭，有效防止了油脂中异构体如反式脂肪酸的产生；
具体实施方式
实施例1
前发酵
1 原始菌株的活化：将使用安倍管保存的高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在28±1℃下培养8天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水制成孢子悬液；
2 种子培养：将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28±1℃下振摇培养48h，摇床振摇转速为200±20转/分钟，液体培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖4％、蛋白胨1％、酵母浸膏3％、基质蒸馏水，pH值为7.2；
3 种子扩大培养：最终发酵罐体积为50m3，因此选取种子罐分别为10m3、1m3，将1.5L步骤(2)的摇瓶种子发酵液接种到1m3的种子扩大发酵罐中，种子培养基中主要原料组分的质量百分比分别为葡萄糖6％、酵母粉1.3％、食用油0.15％、市政自来水，自然pH值，空气量根据需要控制在0.8～1.0m3/m3发酵液/min，罐内压力控制在0.17MPa，在30±2℃培养24h，发酵罐中发酵液的菌浓为25％(体积比)，将该种子发酵液接种入10m3的种子扩大发酵罐进行第二次扩大培养，该种子扩大发酵罐中种子培养基主要原料组分的质量百分比为葡萄糖5％、酵母粉2％、食用油0.2％、市政自来水，自然pH值，空气量根据需要控制在0.8～1.0m3/m3发酵液/min，罐内压力控制在0.19MPa，搅拌速度控制为55转/min，发酵培养28h后，发酵罐中发酵液的菌浓为30％；
(4)将步骤(3)的第二次种子扩大培养液接种到50m3的发酵罐中进行初始发酵，该发酵罐中发酵培养基的主要原料组分按质量百分比计为葡萄糖4.6％、酵母粉1.5％、市政自来水，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.23，配料体积25m3；发酵温度控制在30±2℃、pH值自然变化、空气量需要控制在0.8～1.0m3/m3发酵液/min，罐内压力在0.25MPa，搅拌速度60转/min，在该初始发酵过程中控制葡萄糖含量在3～3.5wt％，当发酵液中葡萄糖含量低于3wt％，开始流加浓度在10～30wt％的无菌葡萄糖溶液至葡萄糖含量达到3.5wt％时终止；并在发酵初始的16h内根据泡沫产生情况加入食用油，食用油加入量按体积百分数计为发酵液体积的0.1～0.3wt％；
初始发酵工艺控制见下表1：
表1
注：当菌浓达到40％(体积比)时，发酵液中的微生物细胞数已达到要求，下一步则是细胞转化积累油脂的阶段，菌浓变化不是很大，则无需再对菌浓继续进行检测。
当发酵培养至菌浓达到40％(体积比)，干菌体总油达到40wt％，初始发酵过程结束；
后发酵阶段：使用发酵罐外循环换热系统，将上述初始发酵的发酵液温度在24h内降至25±2℃，同时在此过程中加入0.01～0.02％(重量百分数)的无菌氨水，调节pH值至8.25，并使用发酵罐内盘管换热器维持发酵液温度在25±2℃，空气量根据要求控制在1.0～1.5m3/m3发酵液/min，罐内压力在0.25MPa，继续发酵，在发酵过程中控制葡萄糖含量在1.0～1.5wt％，当葡萄糖含量低于1.0wt％时开始流加浓度为10～30wt％的无菌葡萄糖溶液至葡萄糖含量达到1.5wt％时终止，当花生四烯酸的含量高于40wt％后停止补糖：
后发酵工艺控制见下表2：
表2
当花生四烯酸的含量大于45wt％时，后发酵过程即可结束；
将上述发酵的发酵液进行提取及精炼处理，具体的处理步骤如下：
(1)发酵液后处理：
(1.1)微生物灭活：在发酵结束后，通过高温瞬时灭菌设备将发酵液进行高温瞬时灭活，灭活温度为122±2℃，灭活维持时间为18s；
(1.2)菌液分离：将微生物灭活后发酵液的温度通过板式换热器调节到48±2℃，设定板框压力12MPa，挤压时间120s，通过板框分离发酵液，得到滤饼，然后通过粉碎机粉碎板框分离的滤饼即湿菌体；
(1.3)干燥：控制进风温度70～80℃，使用沸腾干燥塔对湿菌体进行干燥，得到干菌体，每批干燥湿菌体的重量600kg，干燥时间120±20min；
统计生产数据如下：
发酵液体积41m3；
干菌体重量为1754kg；
干菌体水分含量为6.5wt％；
干菌体总油含量为51wt％；
(2)微生物油脂的提取：
(2.1)控制萃取温度不高于60℃，使用丙酮萃取干菌体中的油脂，共萃取7次，每次使用的丙酮量见表3：
表3
| 萃取次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 丙酮用量/m3 | 6 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
(2.2)将7次萃取的混合油合并降温至0℃，使用5μm的过滤器进行过滤，去除油脂中的杂质及胶质，将过滤得到的毛油在60℃以内真空脱溶3h，得到毛油，丙酮溶剂残留经检测为4300ppm。
毛油的质量指标如下表4：
表4
| 浸出方式 | 毛油重量/kg | 酸价 | 过氧化值 | 含磷量/ppm |
| 丙酮萃取 | 793 | 1.27 | 1.82 | ＜10 |
(3)精炼
(3.1)碱炼：在毛油中加入500L正己烷以溶解毛油，然后根据毛油酸价和重量加入相应的氢氧化钠溶液于碱炼罐中进行碱炼，碱炼完成后，使用皂脚过滤器滤出皂脚，该油样经检测测得酸价为0.02mg KOH/kg；然后在60℃以内的温度条件下真空脱溶2.3h，除去正己烷，经检测正己烷溶剂残留为3200ppm；
(3.2)去除危害物：在50±2℃的温度下，控制反应釜的真空度为500pa的绝压，使用吸附剂对油脂中的有害物质进行吸附，具体工艺步骤如下：
先加入15kg的活性白土，在上述温度和真空度下，搅拌30min，搅拌速率为66转/min，搅拌结束后加入5kg的二氧化硅粉末和2kg的活性炭粉末，在上述温度和真空度下，搅拌30min，搅拌速率为66转/min，搅拌结束后过滤，去除吸附剂；
(3.3)脱臭：将上述油脂分7批进行脱臭，每批油脂重量约100kg，脱臭工艺控制为；温度180～190℃，真空度：绝压≤300pa，每批脱臭时间30min，升温时间在10～12min之间，使用板式换热器降温控制油脂降温时间在5～7min，脱臭蒸汽使用量共计700kg，得到成品油，成品油质量统计见下表5；
表5成品油的质量指标
以PAH的去除情况对精炼效果进行比较评价，见表6：
表6PAH的去除情况
注：NA-未检测出
由上表说明：本工艺能有效控制成品油中的有害物，满足食品安全的要求。
实施例2：
前发酵
1 原始菌株的活化：将使用安倍管保存的高山被孢霉菌株接种到PDA斜面培养基上，在28±1℃下培养9天，选取菌丝和孢子生长旺盛的PDA培养基平板，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水制成孢子悬液；
2 种子培养：将孢子悬液接种于摇瓶培养基中，在28±1℃下振摇培养48h，摇床振摇转速为200±20转/分钟，液体培养基中主要原料组分的质量百分比为葡萄糖5％、蛋白胨1.5％、酵母浸膏2％、基质蒸馏水，pH值为7.0；
3 种子扩大培养：最终发酵罐体积为200m3，因此种子罐分别为50m3、5m3，500L，将1L摇瓶种子发酵液接种到500L的种子扩大发酵罐中，在30±2℃的温度下培养24h，发酵罐中发酵液的菌浓为20％(体积比)，将该发酵液接种入5m3的发酵罐中进行第二次扩大培养28h后，发酵罐中发酵液的菌浓为24％(体积比)，继续将发酵液接种入50m3的发酵罐中进行第三次扩大培养24h后，发酵罐中发酵液的菌浓为30％(体积比)，三级种子罐扩培时空气量根据需要均控制在0.8～1.0m3/m3发酵液/min，罐内压力分别控制在0.15MPa、0.17MPa和0.19MPa，搅拌速度为57转/min。三级种子罐扩培时种子培养基中主要原料组分的质量百分比分别为葡萄糖6％、6％和5％、酵母粉1.5％、1.3％和2％、食用油0.1％、0.15％和0.2％、市政自来水，自然pH值；
4将步骤(3)的第三次种子扩大培养液接种到500m3的发酵罐中进行初始发酵，该发酵罐中发酵培养基的主要组成成分按质量百分比计为葡萄糖5％、酵母粉2％、市政自来水，用氢氧化钠溶液调节pH值为6.35，配料体积120m3；将发酵罐温度控制在30±2℃、pH值自然变化、空气量需要控制在0.8～1.0m3/m3发酵液/min，罐内压力在0.27MPa，搅拌速度65转/min，在该初始发酵过程中控制葡萄糖含量在3～3.5wt％，当发酵液中葡萄糖含量低于3wt％，开始流加浓度在10～30wt％的无菌葡萄糖溶液至葡萄糖含量达到3.5wt％时终止；并在发酵16h内根据泡沫产生情况加入食用油，食用油加入量按体积百分数计为发酵液体积的0.1～0.3wt％；
初始发酵工艺控制见下表7：
表7
当发酵培养至发酵液菌浓达到40％(体积比)，干菌体总油达到40wt％，初始发酵过程结束；
后发酵阶段：使用发酵罐外循环换热系统，将发酵液温度在24h内降至25.3℃，同时在此过程中加入氨水，调节pH值至8.1，并使用发酵罐内盘管换热器维持发酵液温度在25±2℃，空气量根据要求控制在1.0～1.5m3/m3发酵液/min，罐内压力在0.3MPa，继续发酵，在发酵过程中控制葡萄糖含量在1.0～1.5wt％，当葡萄糖含量低于1.0wt％时，开始流加浓度为10～30wt％的无菌葡萄糖溶液至葡萄糖含量达到1.5wt％时终止，当花生四烯酸的含量高于40wt％后停止补糖：
后发酵工艺控制见下表8：
表8
当干菌体油脂中花生四烯酸含量达到45wt％时，后发酵过程即可结束；
将上述发酵的发酵液进行提取及精炼处理，具体的处理步骤如下：
(1)发酵液后处理
(1.1)微生物灭活：在发酵结束后，通过高温瞬时灭菌设备将发酵液进行高温瞬时灭活，，灭活温度为122±2℃，灭活维持时间15s；
(1.2)菌液分离：将灭活后发酵液的温度通过板式换热器调节到48±2℃，设定板框压力10MPa，挤压时间120s，通过板框分离发酵液，然后通过板框分离发酵液，得到滤饼，然后通过粉碎机粉碎板框分离的滤饼即湿菌体；(1.3)干燥：控制进风温度70～80℃，使用沸腾干燥塔对湿菌体进行干燥，每批干燥湿菌体重量600kg，干燥时间120±20min；
统计生产数据如下：
发酵液体积170m3；
干菌体重量为7430kg；
干菌体的水分含量为5.76％；
干菌体的总油含量50.5％；
(2)微生物油脂提取：
(2.1)使用丙酮萃取微生物干细胞中的油脂，萃取温度不高于60℃，一共萃取6次，分别使用丙酮量见表9：
表9
| 萃取次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 丙酮用量m3 | 14 | 7 | 4 | 4 | 4 | 4 |
(2.2)将多次萃取的混合油合并降温至0℃，使用5um的过滤器进行过滤，去除油脂中的杂质及胶质，过滤的混合油在60℃以内真空脱溶脱溶5h，得到毛油，溶剂残留检测为3800ppm。
毛油的质量指标见表10：
表10
| 浸出方式 | 毛油重量/kg | 酸价 | 过氧化值 | 含磷量/ppm |
| 丙酮萃取 | 2880 | 1.53 | 1.34 | ＜10 |
(3)精炼
(3.1)碱炼：用5000L的正己烷溶解2880kg的毛油，在碱炼罐中，根据毛油酸价和重量加入相应的氢氧化钠溶液进行碱炼，碱炼完成后，使用皂脚过滤器滤出皂脚，取油样检测酸价，测得酸价为0.03mgKOH/kg；然后在60℃以内真空脱溶，除去正己烷，脱溶时间6.5h，正己烷溶剂残留检测为2340ppm；
(3.2)去除危害物：在50±2℃的温度下，控制反应釜的真空度为700pa的绝压，使用吸附剂对油脂中的有害物质进行吸附，工艺方式如下：
先加入120kg的活性白土，在上述温度和真空度下，搅拌30min，搅拌强度为66转/min，搅拌结束后加入油脂重量25kg的粉末二氧化硅和油脂重量12kg的粉末活性炭，在上述温度和真空度下，搅拌30min，搅拌强度为60转/min，搅拌结束后过滤，去除吸附剂；
(3.3)脱臭：将上述油脂分为28批进行脱臭，每批油脂重量约100kg，脱臭工艺控制为温度180～190℃，真空度：绝压≤300pa，每批脱臭时间30min，油脂升温时间在10～12min之间，使用板式换热器降温，每批油脂降温时间在5～7min，脱臭蒸汽使用量共计2700kg，得到成品油，成品油质量指标见表11；
表11成品油的质量指标
以PAH的去除情况对精炼效果进行比较评价，见表12：
表12PAH的去除情况
注：NA-未检测出
Claims (9)
1.一种微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：它包括以下步骤：
（1） 发酵液后处理
（1.1）微生物灭活：在发酵结束后，将发酵液进行高温瞬时灭活处理；
（1.2）菌液分离：控制发酵液的温度不高于50℃，通过板框分离发酵液，收集并粉碎滤饼即湿菌体；
（1.3）干燥：对湿菌体进行干燥，得到干菌体；
（2） 微生物油脂提取
（2.1）在萃取温度不高于60℃的温度条件下使用己烷、乙醚、石油醚、乙醇、丙酮中的一种从干菌体中萃取微生物油脂,得到混合油；
（2.2）将萃取得到的混合油降温至-10～10℃，过滤除去混合油中的杂质及胶质，然后将过滤得到的的混合油在不高于60℃的温度条件下真空脱溶，得到毛油；
（3）精炼
（3.1）碱炼：在毛油中加入有机溶剂正己烷、石油醚或乙醚，然后进行碱炼，中和油脂中的游离脂肪酸，并除去皂脚，再在不高于60℃的温度条件下真空脱溶；
（3.2）去除危害物：在步骤（3.1）碱炼后的体系中先加入活性白土进行脱色，然后加入二氧化硅和活性炭对危害物进行吸附，再过滤除去活性白土、二氧化硅和活性炭；
（3.3）180～190℃脱臭，得到成品油。
2.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（1.1）的灭活温度为122±2℃，灭活时间＜20s。
3.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（1.3）采用沸腾干燥塔并控制进风温度为70～80℃进行，干燥后干菌体中的水分含量不高于8wt%。
4.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（2.1）的萃取剂优选为丙酮，萃取采用多次重复萃取方式，萃取重复次数为5～10次，萃取剂的体积用量和干菌体的重量比为0.5～5：1 mL/g。
5.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（3.1）的有机溶剂优选为正己烷，正己烷和毛油的体积比为1：1～5。
6.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（3.1）中碱炼所用的碱液为氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（3.2）中活性白土的加入量为毛油的2～5wt%，二氧化硅的加入量为毛油的0.5～3wt%，活性炭的加入量为毛油的0.1～1wt；所述的脱色或吸附为在50±2℃和低于1000pa的绝压条件下，以50～70转/min的搅拌速率搅拌30min以上。
8.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述步骤（3.2）中活性白土的加入量为毛油的3～4wt%，二氧化硅的加入量为毛油的0.7～1wt%，活性炭的加入量为毛油的0.3～0.5wt%。
9.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取及精炼方法，其特征在于：所述的步骤（3.3）中真空度为：绝压≤300pa，每批脱臭量≤120kg，脱臭时间为30±5min，脱臭蒸汽使用量为0.9～1.1 kg蒸汽/kg油脂，脱臭升温时间和降温时间均≤30min。
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Owner name: CABIO BIOENGINEERING (WUHAN) CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: CABIO BIOENGINEERING (HUBEI) CO., LTD. Effective date: 20130729 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 436070 EZHOU, HUBEI PROVINCE TO: 430063 WUHAN, HUBEI PROVINCE |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20130729 Address after: 430063 Hubei city of Wuhan province Optics Valley Road 1 International Business Center Juxian building A 5F Applicant after: Chia lung Biological Engineering (Wuhan) Co., Ltd. Address before: 436070 Gedian economic and Technological Development Zone, Hubei, Ezhou Applicant before: Chia Chia Bioengineering (Hubei) Co., Ltd. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 430074 Wuhan Province, East Lake New Technology Development Zone, high tech Avenue, No. 999, No. Patentee after: Limited by Share Ltd Biotechnology (Wuhan) Co., Ltd. Address before: 430063 Hubei city of Wuhan province Optics Valley Road 1 International Business Center Juxian building A 5F Patentee before: Chia lung Biological Engineering (Wuhan) Co., Ltd. |