CN102921193B - 以β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法及在手性药物分离中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法及在手性药物分离中的应用，可有效解决毛细管电色谱柱的制备及手性药物分离的问题，其解决的技术方案是，包括有以下步骤：①六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精的制备；②六位单取代的氨化-β-环糊精的制备；③硅烷化硅胶的制备；④β-环糊精键合硅胶手性固定相的制备；⑤毛细管填充柱的制备。本发明价格低廉，低毒，环境污染低，是β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法及在手性分离中的应用上的创新。
Description
技术领域
本发明涉及分离技术，特别是一种以β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法及在手性药物分离中的应用。
背景技术
毛细管电色谱目前是一种较新的分离技术，它主要是基于色谱分离机制进行的。在毛细管中填充、涂敷或键合固定相，使被分离组分在固定相中进行保留和分配。由于毛细管电色谱是基于液相色谱和毛细管电泳技术相结合的一种分离技术，所以它具有良好的选择性和较高的分离效率。根据固定相不同的填充方法，毛细管电色谱可以分为3个亚型，即毛细管开管柱（OTC-CEC），毛细管填充柱（PC-CEC）和毛细管整体柱（MC-CEC）。
填充毛细管电色谱是把固定相填充到毛细管中的一种电色谱技术，它是毛细管电色谱最常用的一种技术，因为它有分离效率高，固定相资源丰富等优点，所以应用范围较广。
环糊精(CD)是一类研究很多的超分子化合物，由于环糊精中的各个葡萄糖基都不能绕糖苷键自由旋转，因此环糊精的形状呈锥体圆桶形。圆筒的内侧是以糖苷氧原子连结C-H组成的环，呈现相对的疏水性，可以接受不同类型的客体化合物，尤其是那些非极性基团。环糊精空穴的外环为一级和二级羟基，使得环糊精外部呈亲水性。CD有多个手性中心，其促使对映体分离的基本原理是在它们之间形成包合物，而不同包合物的稳定常数不同，从而实现分离。由于环糊精类手性选择剂拥有很多手性中心、每个葡萄糖单元都是固定的椅式结构，使得环糊精具有很多结合部位，如β-环糊精有35个不同的结合部位，这种结构使得环糊精比相同的葡萄糖结构和数量的线性多糖拥有多得多的手性识别能力，可以分离更多的对映体。
在 α-CD、β-CD、γ-CD 这 3 种天然 CD 中，α-CD 因空腔较小，γ-CD 因难于制备，价格昂贵，使其应用受到了一定的限制，而 β-CD 制备相对较容易，价格低廉；无毒，无环境污染；其空腔能与大部分客体体积相匹配得到使其得到了广泛应用，因此，本发明的研制成功具有统计学上的意义。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种以β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法及在手性药物分离中的应用，可有效解决毛细管电色谱柱的制备及手性药物分离的问题。
本发明解决的技术方案是，以β-环糊精为起始反应物，采用分步合成法，依次合成六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精、六位单取代的氨化-β-环糊精、硅烷化硅胶以及β-环糊精键合硅胶手性固定相，将β-环糊精键合硅胶手性固定相装填至毛细管柱中，制备成毛细管填充柱，其步骤包括有：①.六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精的制备，②.六位单取代的氨化-β-环糊精的制备，③.硅烷化硅胶的制备，④.β-环糊精键合硅胶手性固定相的制备，⑤.毛细管填充柱的制备。
本发明β-环糊精键合硅胶固定相的制备相对较容易，价格低廉，低毒，环境污染低，此外，采用分步合成法能有效的控制产物的结构和纯度，β-CD的空腔与大部分客体体积相匹配，是β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法及在手性分离中的应用上的创新。
附图说明
图1为本发明盐酸舍曲林在CEC模式下的拆分色谱图。
图2为本发明盐酸克伦特罗在CEC模式下的拆分色谱图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明的具体制备过程如下：
①.六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精（β-CD-6-OTs）的制备：
a. β-环糊精重结晶，室温18-25 ℃下，β-环糊精( β-CD )在水中的溶解度为18.8 mg/g，在80℃为196.6 mg/g，β-环糊精与纯水按质量比1:5进行重结晶，在500ml烧杯中加入200 ml蒸馏水，加热至微沸，称取40gβ-环糊精，搅拌加入至溶解，趁热快速抽滤，滤液于冰箱中放置12h，β-环糊精结晶析出，抽滤，得重结晶后的β-环糊精，按上述步骤将β-环糊精重结晶3次，将所得经3次重结晶的β-环糊精置于真空干燥箱中80℃干燥12h，备用；
b. 对甲苯磺酰氯重结晶及其乙腈溶液的制备，称取对甲苯磺酰氯10g，加入30 ml石油醚，置于加热套中加热至60～90℃使之溶解，放置室温18-25℃，并于4 ℃冷藏12 h，抽滤，得重结晶的对甲苯磺酰氯，按上述步骤重结晶3次，再置真空干燥箱中25 ℃干燥4h，得3次重结晶的对甲苯磺酰氯，称取5.04g 3次重结晶的对甲苯磺酰氯溶于15ml乙腈中，成对甲苯磺酰氯乙腈溶液，备用；
c. 六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精合成方法，称取30g步骤a中3次重结晶后的β-环糊精于三颈烧瓶中，加入250ml蒸馏水，室温18-25℃下，逐滴加入浓度为0.335g/ml氢氧化钠溶液10ml，搅拌1h，冰浴中在45-55min内逐滴加入步骤b中制备的对甲苯磺酰氯乙腈溶液15ml，继续搅拌20min，抽滤，滤液用质量浓度为10%的盐酸调至pH=8，4℃冷藏12h，过滤，得固体物，固体物在真空干燥箱中50℃干燥12h，成磺酰化反应粗产物，称取25g 的磺酰化反应粗产物，置于加热套中加水加热，至其完全溶解，再冷却至室温18-25℃，冷藏12h，抽滤，得重结晶产物，按上述步骤重结晶3次，得3次重结晶的产物六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精，再置于真空干燥箱中，在50℃下干燥12h，用NMR及TLC验证六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精的纯度，放于干燥器中，备用；
d. NMR验证β-CD-6-OTs的纯度
以DMSO为溶剂，测试了β-CD、β-CD-6-OTs1H-NMR图谱：
1) β-CD的1H-NMR图谱，1H NMR (400 MHz, DMSO)， δ 5.69 (dd, J = 21.9, 4.3 Hz, 4H), 4.81 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 4.45 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.95 – 3.27 (m, 19H), 3.25 (s, 1H), 2.48 (d, J = 1.5 Hz, 1H)
2) β-CD-6-OTs的1H-NMR图谱，1H-NMR (400 MHz, DMSO)，δ 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.70 (s, 20H), 4.89 – 4.74 (m, 8H), 4.5–3.3(m, 47H), 2.42 (s, 3H)
从β-CD 1H-NMR图谱中分析可以得到δ5.8 ppm和 δ5.7 ppm分别是β-CD C2位 和C3位羟基上氢的信号峰，δ4.8 ppm 是β-CD H1氢的信号峰，然而δ4.5 ppm 是β-CD C6位羟基上氢的信号峰，化学位移在3.7～3.2 ppm是β-CD H2–H6 氢的信号峰。
β-CD-6-OTs的1H-NMR图谱中分析可以得到，有新的信号峰出现，化学位移在7.41～7.72 ppm之间的峰为苯环上氢的信号峰；同时在δ4.8 ppm 旁边也有新的信号峰出现，它是环糊精取代位置氢的信号峰；化学位移在4.6～4.2 ppm是β-CD-6-OTs C6位羟基上氢的信号峰；化学位移在3.7～3.5 ppm和3.4～3.2 ppm 分别是环糊精H6，H3，H5 和 H4，H2氢的信号峰；并且在δ2.4 ppm也出现了新的信号峰，它是β-CD-6-OTs取代基团-CH3上氢的信号峰。β-CD-6-OTs和β-CD的核磁共振氢谱相比较，有很多新的信号峰出现，可以看到β-CD-6-OTs中苯环的特征峰δ7.41和δ7.72。1H-NMR图谱表明，对甲苯磺酰氯成功修饰了环糊精上羟基，成功合成了β-CD-6-OTs，表明本发明研制成功。
e. TLC验证β-CD-6-OTs的纯度
以硅胶板为固定相，丁酮—甲醇—水比例为8:1:4（v/v/v）做为展开剂，以β-CD为参照物，研究了磺酰化反应产物经纯化后，制备的β-CD-6-OTs和未反应完全的β-CD的分离。结果表明，制备的β-CD-6-OTs经过重结晶纯化后，在β-CD相应的位置没有斑点，表明得到较纯的β-CD-6-OTs。β-CD-6-OTs和β-CD的相对比移值为1.5。
试验中，六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精合成反应常用氢氧化钠水溶液和无水吡啶为反应溶剂，但对两种方法进行对比，发现采用氢氧化钠水溶液作为反应溶剂时，反应条件容易、毒性较小、环境污染小。所以本发明选用以氢氧化钠水溶液为反应溶剂，进行磺酰化反应。
②.六位单取代的氨化-β-环糊精的制备：
称取步骤①的c步骤中制备的六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精3.0g，溶于45ml乙二胺，均匀混合后，于80℃下反应4h，反应结束后，旋蒸除去未反应的过量乙二胺，再将剩余的混合物均匀分散在-10 ℃的冰丙酮中，沉淀析出粗产物，粗产物用体积浓度为10%的甲醇溶液溶解，再用丙酮沉出，如此反复3-5次，得沉出物，真空干燥后，得白色产物，即为六位单取代的氨化-β-环糊精，用核磁共振氢谱表征制备的六位单取代氨化-β-环糊精；
用核磁共振氢谱表征制备的六位单取代氨化-β-环糊精：以DMSO为溶剂，测试了六位单取代的氨化-β-环糊精1H-NMR图谱。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 5.69 (s, 14H C2–OH，C3–OH), 4.81 (s, 7H C1–H), 4.45 (s, 6H C6–OH), 3.81 –3.19 (m, 42H, C3–H, C5–H, C6–H, C2–H, C4–H), 2.08– 1.81 (m, 4H,NH2–CH2CH2–NH–).
化学位移在2.1 ppm处的峰为烷基上氢的信号。1H-NMR图谱表明，乙二胺成功地将酰氯基团取代，修饰成氨化环糊精。氨化环糊精和酰氯化环糊精核磁共振氢谱相比较，可以看到氨化环糊精中苯环的特征峰消失。说明第二步反应成功且得到较纯的氨化环糊精。
③. 硅烷化硅胶的制备：
本发明用γ-(2，3-环氧丙氧) 丙基三甲氧基硅烷（KH-560）作为担体， KH-560的乙氧基与硅胶表面的硅羟基反应，制备得到硅烷化硅胶，即硅胶KH-560。
本发明通过-Si-O-Si-键将KH-560键合到硅胶表面。由于空间位阻效应，不可能KH-560的三个甲氧基都与硅醇基反应，而甲氧基在含水的条件下可以水解成羟基。所以本反应必须在无水条件下进行。
a 试剂与器皿的处理
分子筛（分子筛是结晶态的硅酸盐或硅铝酸盐，由硅氧四面体或铝氧四面体通过氧桥键相连而形成，分子尺寸大小通常为0.3-2.0nm的孔道和空腔体系，从而具有筛分分子的特性）置于马弗炉中，在400℃下活化4h，然后置于玻璃器皿中，冷却后迅速倒入甲苯中，除去甲苯中的微量水分子，得到无水甲苯，反应所需的玻璃器皿反应前均在115-125℃（最好为120℃）干燥；
b. 硅胶活化
硅胶活化的目的是将硅胶表面的金属离子除去，使硅胶表面的硅醇基裸露的更多，从而使更多的环糊精可以键合到硅胶的表面，以提高键合量；
称取1.0 g高效液相色谱硅胶(3 μm)，加到三口烧瓶内，用7.5ml 质量浓度为20% 的盐酸溶液，110℃加热搅拌回流6 h，在室温18-25℃下过滤，以超纯水洗涤滤饼，直至pH呈中性，在真空干燥箱中120℃下干燥12h，得活化后的硅胶，置于干燥器中备用；
c. 硅胶KH-560合成
称取上述活化后的硅胶0.5g于三颈瓶中，加入5ml无水甲苯和30 μl三乙胺，形成混悬液，在氮气保护下加入250 μl KH-560，100～120 ℃搅拌回流10 h，反应完成后，抽滤，依次用无水甲苯，无水乙醚，丙酮，甲醇各洗涤3次，80℃真空干燥12 h，得到硅烷化硅胶，即硅胶KH-560；
将硅胶KH-560进行元素分析，元素分析实测的结果为N：0%；C：5.9%；H：1.1%；碳元素含量的增加表明KH-560成功地键合到了硅胶表面。
④.β-环糊精键合硅胶手性固定相的制备：
固定相键合通常有两种不同的方法：（1）先将环糊精接到空间臂一端，再把空间臂另一端键合到硅胶表面上；（2）先将硅胶键合到空间臂一端，再将环糊精接到空间臂另一端。这两种方法，无论采用哪一种都要将固定相键合到硅胶的表面，所以键合这一步反应非常关键，直接关系到整个合成实验的成败。
本发明采用先将硅胶键合到空间臂一端，再将环糊精接到空间臂另一端的方法。
将步骤③的步骤c中制备的硅胶KH-560置于真空干燥箱120℃真空干燥12h，称取0.2g干燥后的硅胶KH-560和步骤②中制备的六位单取代氨化-β-环糊精1.0g，置于单口烧瓶中，再加入10ml无水甲苯，氮气保护，110℃加热搅拌回流10h，反应完成后，抽滤，用甲醇、丙酮和水洗涤3-5次，60℃于真空干燥箱中干燥12h，得β-环糊精键合硅胶手性固定相；键合固定相的元素分析，元素分析实测的结果为N：0.27 %；C：13.4 %；H：2.1 % ，氮元素的增加证明环糊精键合固定相键合成功。
研制中，采用硅胶与硅烷化试剂在无水甲苯体系中，氮气保护，70～80℃加热回流进行反应，生成-Si-O-Si-，这样就把硅烷化试剂键合到硅胶表面。同时也有文献报道，硅胶与硅烷化试剂在DMF体系中，进行反应。文献报道，也有先制成环糊精衍生物，再将环糊精衍生物与KH-560在DMF体系中，氮气保护下80℃反应4h，相当于先在环糊精上接上适当长度的空间臂，之后再与硅胶在DMF体系中，氮气保护下110℃反应24h，即再将空间臂另一端键合到硅胶上。也有采用硅胶与硅烷化试剂在DMF体系中，80～90℃加热回流反应，生成-Si-O-Si-，把硅烷化试剂键合到硅胶表面。
本发明采用将硅胶与KH-560先发生硅烷化反应，先将硅胶键合到空间臂一端，得到硅胶KH-560，再将其与氨化环糊精在无水甲苯体系中，氮气保护，110℃反应10h，成功而且简便地得到β-环糊精键合硅胶手性固定相，简单、效果好。
⑤.毛细管填充柱的制备：
将上述β-环糊精键合硅胶手性固定相按已申请专利的方法填充到毛细管柱中，并烧制柱塞，制备成毛细管填充柱；（此步骤已申请专利，申请公开号为：CN102512849A）
⑥.毛细管电色谱拆分：色谱柱在采用毛细管电色谱模式对手性药物进行拆分中的应用。
应用实例：
下面采用本发明制得的β-环糊精键合硅胶手性固定相填充的毛细管柱，对盐酸舍曲林和盐酸克伦特罗进行手性拆分。
毛细管电色谱模式拆分手性药物的图谱见图1和图2，从图1中可以看出盐酸舍曲林可以达到基线分离，而图2盐酸克伦特罗只能达到部分分离。证明了本发明制得的β-环糊精键合硅胶手性固定相填充的毛细管柱，并且应用毛细管电色谱模式拆分手性药物具有可行性，也为环糊精衍生物手性固定相应用到毛细管电色谱中奠定了基础。
盐酸舍曲林和盐酸克伦特罗参数对比：
| 流动相 | 毛细管柱 | |
| 盐酸舍曲林 | 乙腈/磷酸盐=20：80 | 40cm×100 μm i.d（填充长度15 cm） |
| 盐酸克伦特罗 | 磷酸盐缓冲溶液 | 40cm×100 μm i.d（填充长度15 cm） |
本发明成功制备了毛细管填充柱β-环糊精键合硅胶固定相，相比目前其他合成方法，采用分步合成法能有效的控制了产物的结构和纯度，并且选用了毒性较小的反应物，此外，本发明使用此固定相成功拆分了药物，为毛细管填充柱的研究起到推动作用，使毛细管电色谱能得以更广泛的应用。
Claims (2)
1.一种以β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法，其特征在于，以β-环糊精为起始反应物，采用分步合成法，依次合成六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精、六位单取代的氨化-β-环糊精、硅烷化硅胶以及β-环糊精键合硅胶手性固定相，将β-环糊精键合硅胶手性固定相装填至毛细管柱中，制备成毛细管填充柱；具体包括以下步骤：
①.六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精的制备：
a.在烧杯中加入200ml蒸馏水，加热至微沸，称取40gβ-环糊精，搅拌加入至溶解，趁热快速抽滤，滤液于冰箱中放置12h，β-环糊精结晶析出，抽滤，得重结晶后的β-环糊精，按上述步骤β-环糊精重结晶3次，将所得3次重结晶的β-环糊精置于真空干燥箱中80℃干燥12 h，备用；
b.对甲苯磺酰氯重结晶及其乙腈溶液的制备，称取对甲苯磺酰氯10g，加入30ml石油醚，置于加热套中加热至60～90℃使之溶解，放置室温18-25℃，并于4℃冷藏12h，抽滤，得重结晶的对甲苯磺酰氯，按上述步骤重结晶3次，再置真空干燥箱中25℃干燥4h，得3次重结晶的对甲苯磺酰氯，称取5.04g 3次重结晶的对甲苯磺酰氯溶于15ml乙腈中，成对甲苯磺酰氯乙腈溶液，备用；
c.六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精合成方法，称取30g步骤a中3次重结晶后的β-环糊精于三颈烧瓶中，加入250ml蒸馏水，室温18-25℃下，逐滴加入浓度为0.335g/ml氢氧化钠溶液10ml，搅拌1h，冰浴中在45-55min内逐滴加入步骤b中制备的对甲苯磺酰氯乙腈溶液15ml，继续搅拌20min，抽滤，滤液用质量浓度为10%的盐酸调至pH=8，4℃冷藏12h，过滤，得固体物，固体物在真空干燥箱中50℃干燥12h，成磺酰化反应粗产物，称取25g的磺酰化反应粗产物，置于加热套中加水加热，至其完全溶解，再冷却至室温18-25℃，冷藏12h，抽滤，得重结晶产物，按上述步骤重结晶3次，得3次重结晶的产物六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精，再置于真空干燥箱中，在50℃下干燥12h，用NMR及TLC验证六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精的纯度，放于干燥器中，备用；
②.六位单取代的氨化-β-环糊精的制备：
称取步骤①的c步骤中制备的六位单取代的对甲苯磺酰-β-环糊精3.0g，溶于45ml乙二胺，均匀混合后，于80℃下反应4h，反应结束后，旋蒸除去未反应的过量乙二胺，再将剩余的混合物均匀分散在-10℃的冰丙酮中，沉淀析出粗产物，粗产物用体积浓度为10%的甲醇溶液溶解，再用丙酮沉出，如此反复3-5次，得沉出物，真空干燥后，得白色产物，即为六位单取代的氨化-β-环糊精，用核磁共振氢谱表征制备的六位单取代氨化-β-环糊精；
③.硅烷化硅胶的制备：
用γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，即KH-560作为担体，利用KH-560的乙氧基与硅胶表面的硅羟基反应，制备得到硅烷化硅胶，即硅胶KH-560，方法是：
a.硅胶活化
将硅胶表面的金属离子除去，使硅胶表面的硅醇基裸露的更多，从而使更多的环糊精可以键合到硅胶的表面，以提高键合量，方法是：称取1.0g高效液相色谱硅胶，加到三口烧瓶内，用7.5ml质量浓度为20%的盐酸溶液，110℃加热搅拌回流6h，在室温18-25℃下过滤，以超纯水洗涤滤饼，直至pH呈中性，在真空干燥箱中120℃下干燥12h，得活化后的硅胶，置于干燥器中备用；
b.硅胶KH-560合成
称取上述活化后的硅胶0.5g于三颈瓶中，加入5ml无水甲苯和30μl三乙胺，形成混悬液，在氮气保护下加入250μl KH-560，100～120℃搅拌回流10h，反应完成后，抽滤，依次用无水甲苯，无水乙醚，丙酮，甲醇各洗涤3次，80℃真空干燥12h，得硅烷化硅胶，即硅胶KH-560；
④.β-环糊精键合硅胶手性固定相的制备：
将步骤③的b步骤中制备的硅胶KH-560置于真空干燥箱120℃真空干燥12h，称取0.2g干燥后的硅胶KH-560和步骤②中制备的六位单取代氨化-β-环糊精1.0g，置于单口烧瓶中，再加入10ml无水甲苯，氮气保护，110℃加热搅拌回流10h，反应完成后，抽滤，用甲醇、丙酮和水洗涤3-5次，60℃于真空干燥箱中干燥12 h，得β-环糊精键合硅胶手性固定相；
⑤.毛细管填充柱的制备：
将β-环糊精键合硅胶手性固定相填充到毛细管柱中，并烧制柱塞，制备成毛细管填充柱，具体的制备方法为：
A、石英毛细管柱预处理：先用1 mol/L NaOH溶液将石英毛细管柱活化1h，再用蒸馏水冲洗干净；
B、柱塞的制备：将长度为30~50cm，内径为100μm的石英毛细管柱，取粒度为5μm的润湿的硅胶，利用毛细管的虹吸作用吸入柱孔长0.8~1.2 cm的润湿的硅胶，在18~25℃晾干成白色固体之后，用导线热剥器5档进行烧制，用加热钳夹紧石英毛细管柱有硅胶部分，在300~500℃烧制20s，成白色固体柱塞；
C、装柱：白色固体柱塞制备好后，再将粒度为3μm的硅胶加入二氧六环-氯仿，二氧六环与氯仿的体积比1︰1，混合均匀，成硅胶与二氧六环-氯仿的匀浆液，将制备好的白色固体柱塞固定在匀浆柱下端，将匀浆柱固定在装柱机上，往匀浆柱中装满配置好的匀浆液，开始装柱，装柱机的流速为4~6 ml/min，压力10~20 MPa，装柱时间为40~60min，装填完毕即成毛细管填充柱。
2.根据权利要求1所述的以β-环糊精为键合固定相的毛细管电色谱柱的制备方法，其特征在于，所述的无水甲苯是将分子筛置于马弗炉中，在400℃下活化4h，然后置于玻璃器皿中，冷却后迅速倒入甲苯中，除去甲苯中的微量水分子，得到无水甲苯，反应所需的玻璃器皿反应前均在115-125℃干燥。
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