CN102914597B - 一种中药材麝香的指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药材麝香的指纹图谱质量检测方法。该方法采用气相色谱法建立了麝香的气相色谱指纹图谱，并通过气相色谱-质谱联用分析技术对不同麝香的化学成分进行分析。本发明指纹图谱质量检测方法采用特定的方法处理供试品，并对色谱检测进行了优化，实验证明具有稳定性、精密度和重复性，建立的三种麝香对照指纹图谱具备较好的专属性。本发明还在麝香酮积分与不积分条件下，对三种麝香的相似度进行了研究，为鉴定三种不同麝香的质量提供了更准确的依据。另外本发明采用气相-质谱(GC-MS)联用的方式鉴别得到三种麝香各自的共有化合物，可以作为进一步鉴定人工麝香、家养麝香与天然麝香的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材的指纹图谱质量检测方法，特别涉及一种中药材麝香的指纹图谱质量检测方法。
背景技术
麝香的质量标准收载在2010年版中国药典一部，国家标准规定检查性状、纯度、干燥失重，总灰分及采用气相色谱法测定麝香酮的含量。但由于麝香资源的不断稀缺，人为因素等原因导致麝香质量下降，仅采用现有国家标准难以客观地反映麝香的质量。故很有必要建立一种能较全面地反映麝香中挥发性成分的质量检测方法。
发明内容
本发明目的在于建立一种中药材麝香的指纹图谱质量检测方法。该方法采用气相色谱法建立了麝香的气相色谱指纹图谱，并通过气相色谱-质谱联用分析技术对不同麝香的化学成分进行分析。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供了一种中药材麝香的指纹图谱质量检测方法，该方法采用气相色谱法进行检测，具体包括如下步骤：
供试品溶液制备：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2～2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥12～36小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10～20体积份，密塞，称定重量；冰水中超声处理10～20分钟，功率300W，频率40kHz；取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
色谱条件为：HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：0.8～1.2ml·min-1，进样量：1～3μl，分流比：1～3:1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；检测器温度：280℃；理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000；
测定：将供试品溶液注入气相色谱仪，进行检测，即得。
测得家养麝香的指纹图谱有63个共有峰(包括麝香酮)；以对照指纹图谱麝香酮的保留时间为1，共有峰1～63号的GC相对保留时间分别为：0.139、0.149、0.155、0.163、0.168、0.180、0.190、0.218、0.243、0.252、0.259、0.265、0.298、0.378、0.410、 0.434、0.536、0.658、0.716、0.774、0.782、0.809、0.823、0.841、0.866、0.873、0.880、0.894、0.909、0.920、0.942、1.000、1.035、1.052、1.163、1.176、1.229、1.292、1.348、1.370、1.380、1.440、1.457、1.469、1.743、1.868、1.899、1.914、2.358、2.383、2.401、2.452、2.478、2.500、2.913、3.083、3.165、3.236、3.492、3.502、3.557、3.781、3.857；以对照指纹图谱麝香酮的峰面积为1，1～63号共有峰的峰面积与麝香酮的峰面积比分别为(×10-2)：0.638、0.830、0.641、0.327、0.617、0.402、1.000、1.934、4.220、1.288、0.633、0.286、0.512、1.010、0.549、0.447、0.460、0.539、1.916、0.319、1.000、0.456、0.228、0.339、3.017、2.711、0.261、0.297、0.539、0.924、1.103、100.000、1.034、0.854、0.417、0.388、0.456、1.093、0.553、4.326、2.910、1.042、2.353、2.015、6.598、21.069、0.550、0.830、10.478、5.781、1.221、1.922、1.705、5.091、0.675、0.318、0.264、0.255、16.303、3.845、0.873、0.501、0.250。将家养麝香供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行匹配，相似度应达0.90以上。
测得天然麝香的指纹图谱有20个共有峰(包括麝香酮)；以对照指纹图谱麝香酮的保留时间为1，共有峰1～20号的GC相对保留时间分别为：0.200、0.241、0.713、0.791、0.856、1.000、1.034、1.050、1.243、1.640、1.856、2.350、2.372、2.488、2.904、3.157、3.367、3.484、3.494、3.549；以对照指纹图谱麝香酮的峰面积为1，1～20号共有峰的峰面积与麝香酮的峰面积比分别为(×10-2)：0.999、0.328、0.517、1.357、0.541、100.000、0.820、0.917、7.002、5.807、2.214、3.568、1.323、0.776、0.257、0.475、0.214、10.836、1.938、0.328。将天然麝香供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行匹配，相似度应达0.90以上。
测得人工麝香的指纹图谱有25个共有峰(包括麝香酮)；以对照指纹图谱麝香酮的保留时间为1，共有峰1～25号的GC相对保留时间分别为：0.134、0.262、0.278、0.581、0.825、0.839、0.876、1.000、1.061、1.122、1.158、1.177、1.242、1.363、1.525、1.600、1.627、1.696、2.462、2.472、2.510、3.045、3.083、3.487、3.601；以对照指纹图谱麝香酮的峰面积为1，1～25号共有峰的峰面积与麝香酮的峰面积比分别为的相对峰面积分别为(×10-2)：28.517、58.815、0.642、1.122、0.273、0.454、1.206、100.000、0.122、0.123、0.422、0.340、8.018、0.147、1.103、1.175、6.112、3.237、33.865、8.717、0.141、0.413、0.173、2.909、0.272。将人工麝香供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行匹配，相似度应达0.90以上。
上述相似度还可按如方法计算：将麝香供试品指纹图谱去除麝香酮峰的积分后再与 对照指纹图谱进行匹配。
去除麝香酮峰积分后的家养麝香供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度应达0.80以上。
去除麝香酮峰积分后的天然麝香供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度应达0.50以上。
去除麝香酮峰积分后的人工麝香供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度应达0.90以上。
所述供试品溶液的制备优选如下方法：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥24小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10体积份，密塞，称定重量，冰水中超声处理15分钟，功率300W，频率40kHz，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述色谱条件优选为：HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；检测器温度：280℃；理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000；
本发明还提供了另外一种中药材麝香的指纹图谱质量检测方法，该方法采用气相-质谱(GC-MS)联用的方式进行检测，具体包括如下步骤：
供试品溶液制备：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2～2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥12～36小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10～20体积份，密塞，称定重量；冰水中超声处理10～20分钟，功率300W，频率40kHz；取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
色谱条件为：HP-1MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：0.8～1.2ml·min-1，进样量：1～3μl，分流比：1～3∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70eV；扫描范：30-550m/z。
测定：将供试品溶液注入气相色谱仪，采用GC-MC联用，依色谱条件测定，鉴定各 共有峰的化合物。
采用GC-MC联用，测得家养麝香含有的共有化合物有17个，其中7号峰为4-甲基苯酚；10号峰为苯甲酸；21号峰为1-乙基-环十二醇；29号峰为降麝香酮；32号峰为麝香酮；34号峰为1，15-十六碳二烯酸；37号峰为n-十六酸；40号峰为(1S，15S)-二环[13.1.0]十六碳-2-酮；43号峰为顺-9-十六碳醛；46号峰为醋酸去氢表雄酮；49号峰为(3α，5β)-3-羟基-雄甾-17-酮；52号峰为雄酮/异雄酮、；53号峰为二氢雄甾酮；54号峰为(3α，5α，17β)-雄甾-3，17-二醇；59号峰为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇；60号峰为胆甾烷醇；61号峰为(3β，5α)-胆甾-7-烯-3-醇。
采用GC-MC联用，测得天然麝香含有的共有化合物有10个，其中6号峰为麝香酮；8号峰为1，15-十六碳二烯酸；9号峰为n-十六酸；10号峰为油酸；11号峰为醋酸去氢表雄酮；12号峰为(3α，5β)-3-羟基-雄甾-17-酮；14号峰为(3α，5α，17β)-雄甾-3，17-二醇；18号峰为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇；19号峰为胆甾烷醇；20号峰为(3β，5α)-胆甾-7-烯-3-醇。
采用GC-MC联用，测得人工麝香含有的共有化合物有8个，其中：7号峰为十四酸；8号峰为麝香酮；13号峰为n-十六酸；17号峰为油酸；18号峰为硬脂酸；19号峰为普拉雄酮；20号峰为雄酮/异雄酮；24号峰为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇。
所述供试品溶液的制备优选如下方法：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥24小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10体积份，密塞，称定重量，冰水中超声处理15分钟，功率300W，频率40kHz，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述色谱条件优选为：HP-1MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70eV；扫描范：30-550m/z。
本发明所述重量份/体积份的单位对应关系为g/ml的对应关系。
本发明经过实验研究最终确定了技术方案所述的供试品制备方法及色谱检测条件，并验证了该方法的稳定性、精密度和重复性，结果满意。本发明建立了家养麝香、天然麝香、人工麝香的指纹图谱，在麝香酮积分的条件下，各样品对比其对照指纹图谱的相 似度均大于0.90。在麝香酮不积分条件下，三种麝香的相似度发生了变化，说明在麝香酮积分的条件下，样品与对照图谱的整体相似度容易受其左右。去除麝香酮后积分的结果显示，人工麝香的相似度最好(＞0.90)，家养麝香其次(＞0.80)，天然麝香相似度最低(＞0.50)。可能是由于人工麝香为人工合成产物，实验所取得的家养麝香样品产地相对固定、动物来源相对固定，故二者所含成分均相对固定，相似度较高。而天然麝香样品天然麝香药材属于多来源中药材，2010年版中国药典一部规定其为“鹿科动物林麝Moschus berezovskii Flerov、马麝Moschus sifanicus Przewalski或原麝Moschus moschiferus Linnaeus成熟雄体香囊中的干燥分泌物。”由于其为多种属来源，且产地亦多分散，故导致天然麝香成分差异较大，因此去掉权重较大的麝香酮后，整体相似度最低，共有峰数相比前二者少。麝香酮不积分条件下得到的三种麝香相似度的结果，为鉴定三种不同麝香的质量提供了更准备的依据。实验说明本发明建立的三种麝香对照指纹图谱能够具备较好的专属性。
统计采用气相-质谱(GC-MS)联用的方式鉴别得到的三种麝香各自的共有化合物，共有21个，其中有部分化合物为三种麝香均存在的化合物，部分为其它两种麝香的非共有化合物，部分为其它麝香中不存在的化合物。比较三种麝香已知共有物质的异同，及在各自图谱中的分布情况分别如表1和图1-3所示。
表1比较三种麝香已知共有物质的异同
注：N表示存在此类化合物，但不是共有峰；NN表示不存在此类化合物
从上述图表的比较结果可以看出，家养麝香共有成分最多；天然麝香的共有成分较少，成分的差异较家养麝香显著，可能由于麝香产地及来源不同所含化合物有所区别而导致的非共有；人工麝香的成分较为单一，也较为一致，含量相对接近，并且与天然、家养麝香的共有峰差异性较大。三种麝香均共有的化合物有3个，分别是麝香酮、n-十六酸和(3β)-胆甾-5-烯-3-醇。
总体说来，从所含有的化学成分上看，家养麝香、天然麝香的相似度较高，可以作为家养麝香替代天然麝香使用的一部分依据，并结合家养麝香与天然麝香等效性研究实验结果，表明家养麝香与天然麝香在抗炎镇痛等方面药效基本一致。
人工麝香与家养、天然麝香的差异，以甾体类化合物差别最为明显，人工麝香中的雄甾酮类化合物仅有普拉雄酮与雄酮/异雄酮，并且含量均较高(峰面积分别为2000、500左右)，但在天然、家养麝香中却含有多种雄甾酮类物质(保留时间约在67～72min之间)，但普拉雄酮、雄酮/异雄酮含量却很低(峰面积仅为几十)；人工麝香中的胆甾醇类化合物含量较低(以峰面积比较)，仅有(3β)-胆甾-5-烯-3-醇，并且不含家养、天然麝香均共有的胆甾烷醇和(3β，5α)-胆甾-7-烯-3-醇。可以看出，人工麝香以较为单一的成分替代家养及天然麝香中较为复杂的多种同类化合物组成。
以上化合物的区别，可以作为进一步区别人工麝香与家养、天然麝香的依据。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1供试品溶液提取溶剂的选择
取天然麝香(批号：TR1#)，用乙醚、无水乙醇分别对天然麝香TR1#进行超声提取，采用HP-1色谱柱，在气相色谱仪(Agilent 7890A)上进行分析，用气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890A/Agilent 5975C)辅助鉴别，以麝香中两大类主要成分(大环酮类与甾体类)出峰时间范围内的峰数与色谱峰峰面积进行比较。结果显示，无水乙醇作为提取溶剂，色谱图在两类成分的出峰时间范围内信息量均较多；而乙醚作为提取溶剂时，虽然在大环酮类成分出峰时间范围内信息量较多，但甾体类成分出峰时间范围内信息量较少。并且由于乙醚的易挥发性，导致操作难度增大及提取液浓度变化很快。故最终选择无水乙醇为提取溶剂。
实验例2供试品溶液提取方法的选择
取减压干燥后的天然麝香(批号：TR1#)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，振摇2分钟，按如下四种实验方案提取：A、冰浴超声5分钟，放置至室温，用试剂补足重量，摇匀，静置过夜；B、冰浴超声15分钟，放置至室温，用试剂补足重量，摇匀；C、静置2小时；D、静置4小时。实验结果显示，A、B两种方案提取较完全，由于方案B耗时最短，节约时间，故选取方案B冰浴超声15分钟，放置至室温，用试剂补足重量，摇匀。
实验例3气相色谱柱的选择
选用无水乙醇、乙醚为提取溶剂，用实验例2提取方案B对10批家养麝香进行超声提取，进样分析。分别实验了以下三种的色谱柱：①HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm、②DB-1701弹性石英毛细管柱30m×0.32mm×0.25μm、③HP-5弹性石英毛细管柱30m×0.32mm×0.25μm，在Agilent GC-6890N型气相色谱仪上进行分析，以色谱峰数为指标进行数据归纳，结果见表2。
表2家养麝香醚提液与醇提液在不同色谱柱上分析总峰数比较
结果表明，以无水乙醇作为溶剂超声提取10批家养麝香，用HP-1色谱柱进行分析所得色谱峰总出峰数最多，而其它两种色谱柱进行分析，总出峰数较少，部分成分不能出峰。为了较完整地分析麝香中的成分，故选用HP-1弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。
由同一色谱柱分析时，乙醚为提取溶剂得到的色谱峰数明显少于无水乙醇提取得到的色谱峰数，再次表明，本发明用无水乙醇为提取溶剂较为合适。
实验例4气相色谱条件的选择
1、不同程序升温的选择
实验依次选择了不同程序升温方法对供试品(取家养麝香YJ4#，按实施例1所述方法制备)进行研究。升温速率慢，组分流出时间长；升温速率快，组分分离不好，不利于分析研究。为了将组分尽可能分离同时考虑色谱分析时间不至于太长，并且结合毛细 管色谱柱的适用温度范围，本实验尝试了多种程序升温方法，如表3-表6所示。
表3程序升温条件1
表4程序升温条件2
表5程序升温条件3
表6程序升温条件4
分析家养麝香YJ4#所得图谱，结果显示，在分析时间120分钟以内，程序升温条件4所得的色谱图，分离效果好，色谱峰信息较多，且色谱峰分布较均匀，故确定为本发明所用的程序升温方法。
2、不同分流比的选择
使用HP-5毛细管柱，进样体积相同的情况下，考察了不同分流比1∶1、5∶1、10∶1对家养麝香各组分检测结果的影响。结果表明采用1∶1的分流比，得到色谱峰数目最多， 且色谱峰响应值较大。而采用5∶1、10∶1的分流比，峰面积小的色谱峰基本消失，得到的色谱峰数目明显减少，响应明显降低，未能充分表征麝香的化学成分。故选择分流比为1∶1。
3、不同进样体积的比较
考察了不同进样体积：1μl、2μl、3μl对检测结果的影响，结果采用2μl和3μl的进样体积，所得色谱峰数目均较多。进样体积1μl所得的色谱峰数目较少，而选择3μl时有些在2μl独立出峰的组分合并了其它组分，考虑到溶剂膨胀系数和对GC色谱系统的保护，最后选择进样体积为2μl。
4、不同流速的比较
选择不同的流速：1ml/min和0.8ml/min对供试品进行研究。结果表明流速降低不但色谱峰的分离度未明显改善，反而使色谱峰减少。为了对气相色谱图各组分进行较全面的考察，确定本文发明用的流速为1ml/min。
实验例5气相色谱指纹图谱测定方法的方法学考察
以家养麝香JY3#为样品，分别对空白溶剂的影响、稳定性、精密度、重复性进行考察。
1.溶剂空白试验
以提取溶剂无水乙醇作为空白样品直接进气相色谱仪，考察无水乙醇溶剂的干扰。结果显示空白溶剂对指纹图谱区无干扰。
2.稳定性试验
取同一份家养麝香样品(JY3#)，按照实施例1所述的方法进行供试品的制备和检测。分别于0h、2h、4h、8h、12h、18h、24h进行测定。将图谱导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以平均数法、时间窗0.2s进行匹配。测得的色谱指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度分别为：1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000。结果表明，样品在24小时内稳定。
3.精密度试验
取同一份家养麝香样品(JY3#)，按照实施例1所述的方法进行供试品的制备和检测。连续进样5次，考察仪器精密度。观察所得色谱指纹图谱的色谱组成，无明显变化。将图谱导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以平均数法、时间窗0.2s进行匹配。测得的色谱指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度分别为：1.000、1.000、1.000、1.000、1.000。结果表明该方法精密度符合要求。
4.重复性试验
取同一批次家养麝香样品(JY3#)6份，按照实施例1所述的方法进行供试品的制备和检测。观察所得色谱指纹图谱的色谱组成，无明显变化。将图谱导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以平均数法、时间窗0.2s进行匹配。测得的色谱指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度分别为：1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，1.000。结果表明该方法重复性良好。
附图说明：
图1家养麝香已知共有化合物编号
图2天然麝香已知共有化合物编号
图3人工麝香已知共有化合物编号
图4家养麝香JY1～20#的原始图谱
图5由20批家养麝香产生的对照指纹图谱(对照图谱生成方法：平均数法)
图6天然麝香TR1～14#的原始图谱
图7由14批天然麝香产生的对照指纹图谱(对照图谱生成方法：平均数法)
图8人工麝香RG1～6#的原始图谱
图9由6批人工麝香产生的对照指纹图谱(对照图谱生成方法：平均数法)
下面以20批家养麝香(JY1～20#)、14批天然麝香(TR1～14#)、6批人工麝香(RG1～6#)为例，详细介绍麝香指纹图谱质量检测方法。
实施例1.家养麝香气相色谱指纹图谱质量检测方法
仪器：气相色谱仪：Agilent 7890A型，超声波提取器：KQ-300E型(300W、40KHZ)。
检测方法：
GC色谱条件：HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟。检测器温度：280℃。理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000。
供试品溶液的制备：分别取20批家养麝香样品(JY1～20#)，每批经减压干燥24小时后，研成粉末，过5号筛，取约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，冰水中超声处理(功率300W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
将供试品溶液注入气相色谱仪，即得色谱图(见图4)。利用国家药典委员会中药色谱 指纹图谱相似度评价系统，经过数据导入，多点校正和数据匹配，以平均数法建立对照指纹图谱，如图5所示。根据峰匹配结果，以峰面积为参数，计算出待测指纹图谱与对照图谱的整体相似度，结果显示相似度在0.931～0.998之间，如表7所示。
表7家养麝香JY1～20#GC指纹图谱相似度结果
实施例2.家养麝香气相色谱指纹图谱质量检测方法
在实施例1步骤的基础上，将20批家养麝香的色谱图去除麝香酮峰的积分，再将数据导入评价系统，进行匹配，以平均数法建立对照指纹图谱。计算所得整体相似度结果在0.835～0.984之间，如表8所示。
表8家养麝香JY1～20#GC指纹图谱相似度结果(去掉麝香酮积分)
由上表可以看出，在麝香酮不积分的情况下，其它组分色谱峰面积的波动对相似度的影响有更进一步的呈现，能够更客观地反映麝香酮以外物质的差异及色谱图的相似程度。20批家养麝香的数据表明，20批家养麝香样品中所含有的成分较为一致，整体相似度较好，在麝香酮不积分的情况下，相似度可达0.80以上。
由匹配结果可知，20批家养麝香中有63个共有峰(包括麝香酮)。各共有峰的GC保留时间与峰面积，及以麝香酮峰(编号32)的GC保留时间为1，计算所得各共有峰的相对保留时间如表9所示。
实施例3.家养麝香GC-MS联用指纹图谱质量检测方法
仪器：气相色谱-质谱联用仪：Agilent 7890A/Agilent 5975C、超声波提取器：KQ-300E型(300W、40KHZ)。
检测方法：
GC-MS色谱条件：HP-1 MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟。离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70eV；扫描范围(m/z)30-550。
供试品溶液的制备：分别取20批家养麝香样品(JY1～20#)，每批经减压干燥24小时后，研成粉末，过5号筛，取约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，冰水中超声处理(功率300W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
将供试品溶液注入气相色谱仪，采用GC-MS联用，鉴定各共有峰的化合物。借助色谱峰的相对保留时间、总离子流图峰形等各相关信息，进行各色谱峰的识别及化合物谱库检索，通过谱库检索得到其中17个化合物，结果如表10。
表10 GC-MS鉴定20批家养麝香63个共有峰中的17个化合物
实施例4.天然麝香气相色谱指纹图谱质量检测方法
仪器：气相色谱仪：Agilent 7890A型，超声波提取器：KQ-300E型(300W、40KHZ)。
检测方法：
GC色谱条件：HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟。检测器温度：280℃。理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000。
供试品溶液的制备：分别取14批天然麝香样品(TR1～14#)，每批经减压干燥24小时后，研成粉末，过5号筛，取约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，冰水中超声处理(功率300W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
将供试品溶液注入气相色谱仪，即得色谱图(见图6)。利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经过数据导入，多点校正和数据匹配，以平均数法建立对照指纹图谱，分别如图7所示。根据峰匹配结果，以峰面积为参数，计算出待测指纹图 谱与对照图谱的整体相似度，结果显示相似度在0.951～0.993之间，如表11所示。
表11天然麝香TR1～14#的GC指纹图谱相似度结果
实施例5.天然麝香气相色谱指纹图谱质量检测方法
在实施例4步骤的基础上，将14批天然麝香的色谱图去除麝香酮峰的积分，再将数据导入评价系统，进行匹配，以平均数法建立对照指纹图谱。计算所得整体相似度结果在0.521～0.834之间，如表12所示。
表12天然麝香TR1～14#的GC指纹图谱相似度结果(去掉麝香酮积分)
由上表可以看出，去掉麝香酮积分后，整体相似度结果发生了明显变化，表明各批次天然麝香的除麝香酮外的其它物质具有一定的差异性，从一定程度上反映了天然麝香多种属的特点。通过14批天然麝香的数据表明，在麝香酮不积分的情况下，天然麝香样品的相似度可达0.50以上。
由匹配结果可知，14批天然麝香中有20个共有峰(包括麝香酮)。各共有峰的GC保留时间与峰面积，及以麝香酮峰(编号6)的GC保留时间为1，计算所得各共有峰的相对保留时间如表13所示。
实施例6.天然麝香GC-MS联用指纹图谱质量检测方法
仪器：气相色谱-质谱联用仪：Agilent 7890A/Agilent 5975C、超声波提取器：KQ-300E型(300W、40KHZ)。
检测方法：
GC-MS色谱条件：HP-1 MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟。离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70eV；扫描范围(m/z)30-550。
供试品溶液的制备：分别取14批天然麝香样品(TR1～14#)，每批经减压干燥24小时后，研成粉末，过5号筛，取约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，冰水中超声处理(功率300W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
将供试品溶液注入气相色谱仪，采用GC-MS联用，鉴定各共有峰的化合物。借助色谱峰的相对保留时间、总离子流图峰形等各相关信息，进行各色谱峰的识别及化合物谱库检索，通过谱库检索得到其中10个化合物，结果如表14。
表14 GC-MS鉴定14批天然麝香20个共有峰中的10个化合物
实施例7.人工麝香谱气相色指纹图谱质量检测方法
仪器：气相色谱仪：Agilent 7890A型，超声波提取器：KQ-300E型(300W、40KHZ)。
检测方法：
GC色谱条件：HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟。检测器温度：280℃。理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000。
供试品溶液的制备：分别取6批人工麝香样品(RG1～6#)，每次约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，冰水中超声处理(功率300W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
将供试品溶液注入气相色谱仪，即得色谱图(见图8)。利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经过数据导入，多点校正和数据匹配，以平均数法建立对照指纹图谱，如图9所示。根据峰匹配结果，以峰面积为参数，计算出待测指纹图谱与对照图谱的整体相似度，结果显示相似度在0.987～0.997之间，如表15所示。
表15人工麝香RG1～6#的GC指纹图谱相似度结果
| RG1# | RG2# | RG3# | RG4# | RG5# | RG6# | |
| 对照指纹图谱 | 0.987 | 0.995 | 0.995 | 0.995 | 0.994 | 0.997 |
实施例8人工麝香谱气相色指纹图谱质量检测方法
在实施例7步骤的基础上，将6批人工麝香色谱图去除麝香酮峰的积分，再将数据导入评价系统，进行匹配，以平均数法建立对照指纹图谱。计算所得整体相似度结果在0.923～0.983之间，如表16所示。
表16人工麝香RG1～6#的GC指纹图谱相似度结果(去掉麝香酮积分)
由上表可以看出，去掉麝香酮积分后，6批人工麝香的整体相似度仍在0.90以上，反映了较好的相似度关系，说明了人工麝香所含成分的一致性。
由匹配结果可知，6批人工麝香中有21个共有峰(包括麝香酮)。各共有峰的GC保留时间与峰面积，及以麝香酮峰(编号6)的GC保留时间为1，计算所得各共有峰的相对保留时间如表17所示。
表17人工麝香RG1～6#共有峰的保留时间、相对保留时间与峰面积
实施例9人工麝香谱GC-MS联用指纹图谱质量检测方法
仪器：气相色谱-质谱联用仪：Agilent 7890A/Agilent 5975C、超声波提取器：KQ-300E型(300W、40KHZ)。
检测方法：
GC-MS色谱条件：HP-1MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1∶1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟。离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量： 70eV；扫描范围(m/z)30-550。
供试品溶液的制备：分别取6批人工麝香样品(RG1～6#)，每次约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，冰水中超声处理(功率300W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
将供试品溶液注入气相色谱仪，采用GC-MS联用，鉴定各共有峰的化合物。借助色谱峰的相对保留时间、总离子流图峰形等各相关信息，进行各色谱峰的识别及化合物谱库检索，通过谱库检索得到其中8个化合物，结果如表18。
表18 GC-MS鉴定6批人工麝香25个共有峰中的8个化合物
Claims (9)
1.一种中药材麝香的指纹图谱检测方法，该方法采用气相色谱法进行检测，其特征在于该方法包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2～2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥12～36小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10～20体积份，密塞，称定重量；冰水中超声处理10～20分钟，功率300W，频率40kHz；取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
色谱条件：HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：0.8～1.2ml·min-1，进样量：1～3μl，分流比：1～3:1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；检测器温度：280℃；理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000；
测定：将供试品溶液注入气相色谱仪，进行检测，即得。
2.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于：
测得家养麝香的指纹图谱有63个共有峰，包括麝香酮；以对照指纹图谱麝香酮的保留时间为1，共有峰1～63号的GC相对保留时间分别为：0.139、0.149、0.155、0.163、0.168、0.180、0.190、0.218、0.243、0.252、0.259、0.265、0.298、0.378、0.410、0.434、0.536、0.658、0.716、0.774、0.782、0.809、0.823、0.841、0.866、0.873、0.880、0.894、0.909、0.920、0.942、1.000、1.035、1.052、1.163、1.176、1.229、1.292、1.348、1.370、1.380、1.440、1.457、1.469、1.743、1.868、1.899、1.914、2.358、2.383、2.401、2.452、2.478、2.500、2.913、3.083、3.165、3.236、3.492、3.502、3.557、3.781、3.857；以对照指纹图谱麝香酮的峰面积为1，1～63号共有峰的峰面积与麝香酮的峰面积比分别为：0.638、0.830、0.641、0.327、0.617、0.402、1.000、1.934、4.220、1.288、0.633、0.286、0.512、1.010、0.549、0.447、0.460、0.539、1.916、0.319、1.000、0.456、0.228、0.339、3.017、2.711、0.261、0.297、0.539、0.924、1.103、100.000、1.034、0.854、0.417、0.388、0.456、1.093、0.553、4.326、2.910、1.042、2.353、2.015、6.598、21.069、0.550、0.830、10.478、5.781、1.221、1.922、1.705、5.091、0.675、0.318、0.264、0.255、16.303、3.845、0.873、0.501、0.250；
测得天然麝香的指纹图谱有20个共有峰，包括麝香酮；以对照指纹图谱麝香酮的保留时间为1，共有峰1～20号的GC相对保留时间分别为：0.200、0.241、0.713、0.791、0.856、1.000、1.034、1.050、1.243、1.640、1.856、2.350、2.372、2.488、2.904、3.157、3.367、3.484、3.494、3.549；以对照指纹图谱麝香酮的峰面积为1，1～20号共有峰的峰面积与麝香酮的峰面积比分别为：0.999、0.328、0.517、1.357、0.541、100.000、0.820、0.917、7.002、5.807、2.214、3.568、1.323、0.776、0.257、0.475、0.214、10.836、1.938、0.328；
测得人工麝香的指纹图谱有25个共有峰，包括麝香酮；以对照指纹图谱麝香酮的保留时间为1，共有峰1～25号的GC相对保留时间分别为：0.134、0.262、0.278、0.581、0.825、0.839、0.876、1.000、1.061、1.122、1.158、1.177、1.242、1.363、1.525、1.600、1.627、1.696、2.462、2.472、2.510、3.045、3.083、3.487、3.601；以对照指纹图谱麝香酮的峰面积为1，1～25号共有峰的峰面积与麝香酮的峰面积比分别为的相对峰面积分别为：28.517、58.815、0.642、1.122、0.273、0.454、1.206、100.000、0.122、0.123、0.422、0.340、8.018、0.147、1.103、1.175、6.112、3.237、33.865、8.717、0.141、0.413、0.173、2.909、0.272。
3.如权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于将麝香供试品指纹图谱去除麝香酮峰的积分后再与对照指纹图谱进行匹配。
4.如权利要求1、2或3所述的指纹图谱检测方法，其特征在于所述供试品溶液的制备方法为：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥24小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10体积份，密塞，称定重量，冰水中超声处理15分钟，功率300W，频率40kHz，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.如权利要求1、2或3所述的指纹图谱检测方法，其特征在于色谱条件为：
HP-1弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为N2，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1:1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；检测器温度：280℃；理论塔板数按麝香酮峰计算应不低于20000。
6.一种中药材麝香的指纹图谱检测方法，该方法采用气相-质谱联用的方式进行检测，其特征在于该方法包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2～2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥12～36小时，研成粉末，过5号筛，精密称定；置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10～20体积份，密塞，称定重量；冰水中超声处理10～20分钟，功率300W，频率40kHz；取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
色谱条件：HP-1MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：0.8～1.2ml·min-1，进样量：1～3μl，分流比：1～3:1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70eV；扫描范围：30-550m/z；
测定：将供试品溶液注入气相色谱仪，采用GC-MS联用，依色谱条件测定，鉴定各共有峰的化合物。
7.如权利要求6所述的指纹图谱检测方法，其特征在于：
采用GC-MS联用，测得家养麝香含有的共有化合物有17个，其中7号峰为4-甲基苯酚；10号峰为苯甲酸；21号峰为1-乙基-环十二醇；29号峰为降麝香酮；32号峰为麝香酮；34号峰为1,15-十六碳二烯酸；37号峰为n-十六酸；40号峰为(1S,15S)-二环[13.1.0]十六碳-2-酮；43号峰为顺-9-十六碳醛；46号峰为醋酸去氢表雄酮；49号峰为(3α,5β)-3-羟基-雄甾-17-酮；52号峰为雄酮/异雄酮、；53号峰为二氢雄甾酮；54号峰为(3α,5α,17β)-雄甾-3,17-二醇；59号峰为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇；60号峰为胆甾烷醇；61号峰为(3β,5α)-胆甾-7-烯-3-醇；
采用GC-MS联用，测得天然麝香含有的共有化合物有10个，其中6号峰为麝香酮；8号峰为1,15-十六碳二烯酸；9号峰为n-十六酸；10号峰为油酸；11号峰为醋酸去氢表雄酮；12号峰为(3α,5β)-3-羟基-雄甾-17-酮；14号峰为(3α,5α,17β)-雄甾-3,17-二醇；18号峰为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇；19号峰为胆甾烷醇；20号峰为(3β,5α)-胆甾-7-烯-3-醇；
采用GC-MS联用，测得人工麝香含有的共有化合物有8个，其中：7号峰为十四酸；8号峰为麝香酮；13号峰为n-十六酸；17号峰为油酸；18号峰为硬脂酸；19号峰为普拉雄酮；20号峰为雄酮/异雄酮；24号峰为(3β)-胆甾-5-烯-3-醇。
8.如权利要求6或7所述的指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：取家养麝香、天然麝香或人工麝香0.2重量份，家养麝香、天然麝香在称重前需经减压干燥24小时，研成粉末，过5号筛；精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10体积份，密塞，称定重量，冰水中超声处理15分钟，功率300W，频率40kHz，取出，放至室温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
9.如权利要求6或7所述的指纹图谱检测方法，其特征在于色谱条件为：
HP-1MS弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度：250℃，载气为He，流速：1ml·min-1，进样量：2μl，分流比：1:1，程序升温：初始温度80℃，保持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至160℃，再以每分钟1℃的速率升温至200℃，保持20分钟，再以每分钟5℃的速率升温至260℃，保持20分钟；离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃，GC-MS接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70eV；扫描范围：30-550m/z。
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