CN103869020B

CN103869020B - 一种鉴别天然麝香和人工麝香的方法

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Publication number: CN103869020B
Application number: CN201410120482.4A
Authority: CN
Inventors: 马群; 解素花; 乔延江; 顾海鸥; 杜菁; 刘永刚
Original assignee: BEIJING TONGRENTANG Co Ltd; Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: BEIJING TONGRENTANG Co Ltd; Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2034-03-28
Also published as: CN103869020A

Abstract

本发明公开了一种鉴别天然麝香与人工麝香的方法，所述方法以二十六酸和二十八酸作为对照品，采用超高效合相色谱串联质谱方法进行定性鉴别。本发明方法用于鉴别天然麝香与人工麝香，样品前处理简单，检测快速、准确、环保。

Description

一种鉴别天然麝香和人工麝香的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种鉴别天然麝香和人工麝香的方法。

背景技术

天然麝香(Moschus)是一味名贵、稀有的中药材，是鹿科动物林麝Moschus berezovskii Flerov、马麝Moschus sifanicus Przewalski或原麝Moschus moschiferus Linnaeus成熟雄体香囊中的干燥分泌物。麝为国家一级保护野生动物，天然麝香的来源、产量均十分有限，目前临床使用的多为人工麝香。

人工麝香是根据天然麝香的化学成分研发的国家一类新药，其化学成分的种类和含量与天然麝香十分相似，主要含有麝香酮、芳活素、海可素等，其中麝香酮是主要活性成分。与人工麝香相比，天然麝香还含有许多种未知的微量成分，且这些微量成分中有些其本身即具有生物活性，有些与其它药物配伍后产生新的药理活性物质，发挥整体调节作用，而人工麝香中不含有这些成分。这也是国家规定药品中使用人工麝香不能写成麝香的原因之一。例如，天然麝香中含有抗炎多肽，其抗炎效果较氢化可的松更为显著，而人工麝香中没有此类抗炎多肽的成分，其抗炎效果不及天然麝香等。

天然麝香与人工麝香的价格差距悬殊，且天然麝香中很多有效生物成分如麝香吡啶、抗炎蛋白等是人工麝香所不具有的。为了控制麝香药材的质量，《中国药典》(2010年版)规定了外观检查和麝香酮含量测定。然而，外观检查项目受人为因素影响较大，麝香酮含量测定则因合成品的掺杂而影响其检验意义。因此，需要一种能够快速、准确地鉴别天然麝香与人工麝香的方法。

梁颖、汪小根(GC-MS法初步分析天然麝香与人工麝香，《中药新药与临床药理》，2005年，第16卷第3期，p204-205)报道了以麝香吡啶、3-甲基环十三酮作为专属性成分，采用GC-MS法鉴别天然麝香和人工麝香，该方法可准确鉴别天然麝香与人工麝香，但存在如下不足：提取试剂采用苯，毒性大；供试品前处理时间长，1.5h以上；分离时间长，专属性成分的保留时间在20min以上。

周健等(应用红外光谱技术鉴别中药麝香的真伪，光谱学与光谱分析，2010年，第30卷第9期，p2368-2371)报道了采用傅里叶变换-红外光谱(FTR-IR)法对天然麝香和人工麝香进行研究，发现二者红外谱图十分相似，有共同的吸收峰且大多数强度一致，难以鉴别；虽然采用二阶导数谱图的对比与分析，发现天然麝香和人工麝香在某些峰上出现差异，但是差异较小，难以确切地将二者区分开。

超高效合相色谱(UPC²)是一种高分离度，高灵敏度，高分析速度、低成本的新型分离技术，它基于超临界流体色谱(SFC)原理的分析系统，以液体和超临界气体的混合物作为流动相，可直接进样分析不同溶剂类型的萃取物，分析温度低，易于质谱检测器串联使用。

发明内容

发明人在研究天然麝香和人工麝香的化学成分时发现，天然麝香中含有两种微量的直链脂肪酸——二十六酸(分子式C₂₆H₅₂O₂)和二十八酸(分子式C₂₈H₅₆O₂)，而在人工麝香中未发现这两种化学成分。当使用超高效合相色谱串联质谱法(UPC²-MS)进行检测时，二十六酸和二十八酸色谱峰具有良好的分离度，且样品前处理简单，检测高效。因此，可将这两种化学成分作为鉴别天然麝香和人工麝香的指标性成分。

本发明的目的在于提供一种以二十六酸和二十八酸为指标性成分，以超高效合相色谱串联质谱法鉴别天然麝香与人工麝香的方法，该方法准确、高效、操作简单。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种鉴别天然麝香与人工麝香的方法，所述方法以二十六酸和二十八酸作为对照品，采用超高效合相色谱串联质谱法进行鉴别，包括如下步骤：

(1)分别称取二十六酸、二十八酸对照品适量，精密称定，加溶剂分别配制成浓度为1～10μg／mL的二十六酸对照品溶液和浓度为1～10μg／mL的二十八酸对照品溶液；或者

分别称取二十六酸、二十八酸对照品适量，精密称定，加溶剂配制成二十六酸和二十八酸的浓度均为1-10μg/mL的混合对照品溶液；

(2)称取麝香样品适量，精密称定，加入所述麝香样品质量200-500倍量的溶剂，超声提取10-30分钟，过滤，得供试品溶液；

(3)分别精密吸取所述二十六酸对照品溶液和所述二十八酸对照品溶液各1～10μL，注入超高效合相色谱串联质谱仪，得到二十六酸对照品总离子流图和二十八酸对照品总离子流图；或者

精密吸取所述混合对照品溶液1-10μL，注入超高效合相色谱串联质谱仪，得到混合对照品总离子流图；

(4)精密吸取所述供试品溶液1-10μL，注入超高效合相色谱串联质谱仪，得到供试品总离子流图，根据二十六酸和二十八酸的准分子离子峰精确质量数，在所述供试品总离子流图基础上进一步获得供试品提取离子流图；

当所述供试品提取离子流图中在与所述二十六酸对照品总离子流图中的二十六酸色谱峰和所述二十八酸对照品总离子流图中的二十八酸色谱峰保留时间基本相同的位置上同时显示色谱峰时，或者所述供试品提取离子流图中在与所述混合对照品总离子流图中的二十六酸色谱峰和二十八酸色谱峰保留时间基本相同的位置上同时显示色谱峰时，所述麝香样品为天然麝香；否则为人工麝香。

一般来说，二十六酸对照品和二十八酸对照品的纯度较高，例如在95％以上，或者98％以上，可以直接采用所述二十六酸对照品总离子流图和二十八酸对照品总离子流图，或者采用所述混合对照品总离子流图进行质谱峰的标示。本领域技术人员应当理解，当采用的二十六酸对照品和二十八酸对照品的纯度不够高，其中存在影响二十六酸或二十八酸色谱信号的干扰成分时，也可以在所述二十六酸和二十八酸总离子流图基础上进一步得到二者的提取离子流图，用于质谱峰的标示。

发明人发现，麝香供试品溶液中二十六酸和二十八酸的质谱峰信号容易受到麝香样品中其他化学成分信号的干扰，从而导致假阳性结果出现，因此本发明方法中采用了供试品溶液的提取离子流图，以除去其他化学成分的信号干扰，以更直观地判断供试品溶液中是否含有二十六酸和二十八酸。

本发明中，超高效合相色谱条件和质谱条件可根据本领域公知的方法确定。

在一种优选的实施方案中，步骤(3)和步骤(4)中，超高效合相色谱条件为：

高压填充的C18硅胶键合相色谱柱；流动相A为二氧化碳，流动相B为体积比为50∶50∶0.1-0.5的甲醇-乙腈-甲酸；流速为1.0-2.0mL／min；柱温为30℃-40℃；补偿液采用流速0.3-0.8mL／min的甲醇；背压为1500psi；设置如下梯度洗脱程序：0到1min时，流动相B体积比为1-3％；1到2min时，流动相B体积比由1-3％升高到2-4％；2到3min时，流动相B体积比为2-4％；3到6min时，流动相B体积比由2-4％升高到3-9％；

所述质谱条件为：

电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压为2.2-2.7kV；锥孔电压：30V；电离源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃；气体流速为45-55L／h；脱溶剂流速为800L／h。

本领域技术人员应当理解，所述梯度洗脱程序中“1到2min时，流动相B体积比由1～3％升高到2-4％”、“3到6min时，流动相B体积比由2-4％升高到3-9％”的表述中，“升高”表示后者的数值高于前者。例如“1到2min时，流动相B体积比由1-3％升高到2-4％”中，尽管“1-3％”和“2-4％”的取值范围有重叠，但在本发明中，在“2-4％”范围内的取值应当高于“1-3％”范围内的取值。

在一种优选的实施方式中，所述超高效合相色谱条件中，0到1min时，流动相B体积比为1-3％；1到2min时，流动相B体积比由1-3％升高到3.2-4.0％；2到3min时，流动相B体积比为3.2-4.0％；3到6min时，流动相B体积比由3.2-4.0％升高到4.1-9.0％。

在一种更优选的实施方式中，所述超高效合相色谱条件中，0到1min时，流动相B体积比为3％；1到2min时，流动相B体积比由3％升高到3.5％；2到3min时，流动相B体积比为3.5％；3到6min时，流动相B体积比由3.5％升高到7％。

在一种优选的实施方式中，所述超高效合相色谱条件中，所述流动相B为体积比为50∶50∶0.1的甲醇-乙腈-甲酸，所述流速为1.6mL／min，所述补偿液的流速为0.3mL／min的甲醇；所述质谱条件中，毛细管电压为2.5kV，所述气体流速为50L／h。

所述色谱柱可选用例如Waters ACQUITY UPC²HSS C18SB色谱柱。

采用上述超高效合相色谱条件，可实现二十六酸和二十八酸的色谱峰与它们各自相邻的色谱峰的完全基线分离，分离度良好，运行时间短，可重现性好。

采用上述质谱条件，二十六酸和二十八酸的质谱信号检测灵敏度高，获得的质谱峰强度较高，有利于这两种成分的确认。

所述“保留时间基本相同”，是指对照品色谱图中二十六酸和／或二十八酸的保留时间与供试品色谱图中的保留时间的误差在±10％范围内，优选在±5％范围内。这是由于受仪器、色谱柱、流动相、试验条件等影响，同一化合物的保留时间会发生漂移，这是本领域技术人员是容易理解的。

上述鉴别方法，步骤(1)和(2)的顺序可以互换，步骤(3)和(4)的顺序可以互换。

步骤(1)和(2)所述溶剂可选自乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或甲醇，优选为乙酸乙酯或正己烷。

步骤(1)中配制所述对照品溶液与步骤(2)中配制所述供试品溶液使用的溶剂可以相同，也可以不同，优选使用相同的溶剂。

优选地，步骤(1)中所述二十六酸对照品溶液中二十六酸的浓度为5-10μg／mL，所述二十八酸对照品溶液中二十八酸的浓度为5-10μg/m，所述混合对照品溶液中二十六酸和二十八酸的浓度均为5-10μg／mL。

与现有的鉴别天然麝香与人工麝香的技术相比，本发明的鉴别方法的优点在于：

(1)首次采用二十六酸和二十八酸这两种脂肪酸类成分作为指标性成分，以超高效合相色谱串联质谱法鉴别天然麝香和人工麝香，这两种成分用少量常规有机溶剂超声即可充分提取出来，分析前处理方法简单。

(2)采用本发明方法，麝香供试品溶液中二十六酸和二十八酸成分可实现完全基线分离，运行时间短。例如在本发明优选的超高效合相色谱条件和质谱条件中，两种指标性成分的保留时间在6分钟以内，耗时短，且质谱信号检测灵敏度高，能够高效、准确地鉴别天然麝香和人工麝香。

(3)本发明采用超高效合相色谱串联质谱法，超高效合相色谱的主要流动相为CO₂，流体黏度小，与高效液相色谱法使用的液体流动相扩散率更高、更有利于传质；与气相色谱法相比，CO₂单独作为流动相可在更低的温度下实现分离，更好地检测到本发明的指标性成分二十六酸和二十八酸；此外，CO₂成本低且无毒，有利于保护环境和实验人员的健康。

(4)经过对多批天然麝香和人工麝香的验证，本发明方法对天然麝香和人工麝香的鉴定结果准确无误。

附图说明

图1为混合对照品溶液总离子流图。

图2为天然麝香样品总离子流图。

图3为人工麝香样品总离子流图。

图4为天然麝香样品提取离子流图。

图5为人工麝香样品提取离子流图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步说明，但并不用于限制本发明的保护范围。

实施例中使用Waters AcQuity超高效合相色谱串联质谱仪；二十六酸对照品和二十八酸对照品均购自上海易利生物科技有限公司，批号分别为M0388、M1342，纯度均≥98％；天然麝香，人工麝香购自北京同仁堂股份有限公司；乙腈、甲醇试剂为色谱纯，其他试剂为分析纯。

实施例1天然麝香与人工麝香的鉴别方法

1.混合对照品溶液的制备：

精密称取二十六酸对照品和二十八酸对照品各0.5mg，置于50mL容量瓶中，加入正己烷溶剂溶解，定容，即得。

2.供试品溶液的制备：

精密称取待测麝香样品约0.05g，置于锥形瓶中，加入乙酸乙酯10mL，超声10min，过滤，即得。

3.测试方法：

分别取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效合相色谱串联质谱仪，按照如下超高效合相色谱条件和质谱条件，分别得到对照品溶液总离子流图和供试品溶液总离子流图，然后根据二十六酸和二十八酸的准分子离子峰精确质量数，在所述供试品总离子流图基础上进一步获得供试品提取离子流图。

其中，超高效合相色谱(UPC²)的分离条件为：

色谱柱：ACQUITY UPC²HSS C18SB

流动相A：二氧化碳

流动相B：甲醇-乙腈-甲酸(体积比50∶50∶0.1)

流速：1.6mL／min

柱温：40℃

进样量：2uL

补偿液：0.3mL／min的甲醇

背压：1500psi

梯度洗脱程序见表1：

表1

质谱(MS)检测条件为：

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式

毛细管电压：2.5kV 锥孔电压：30V

电离源温度：120℃ 脱溶剂温度：500℃

气体流速：50L／h 脱溶剂流速：800L／h

4.结果判定：

图1为混合对照品溶液总离子流图，其中峰1为二十六酸色谱峰，保留时间为5.08min，峰2为二十八酸色谱峰，保留时间为5.68min。

图2和图3分别为天然麝香和人工麝香的供试品溶液的总离子流图，色谱峰比较多，不能清楚地显示在5.08min和5.68min附近是否有色谱峰。为了直观地显示出供试品溶液色谱图中是否含有二十六酸和二十八酸，根据二十六酸和二十八酸的准分子离子峰的精确质量数，分别为395.372和423.401，在图2和图3基础上进一步提取得到二十六酸和二十八酸的提取离子流图，分别得到图4和图5。从图4和图5可以直观地看出，图4在5.06min和5.67min处具有色谱峰，说明其含有二十六酸和二十八酸；图5在5.08min和5.68min附近不具有色谱峰，说明其不含有二十六酸和二十八酸。由图4和图5可直观、准确地判断，图4为天然麝香的色谱图，图5的为人工麝香色谱图。

本发明方法样品前处理方法简单，指标性成分出峰时间短，保留时间均在6分钟内，质谱信号检测灵敏度高。通过对多批天然麝香和人工麝香的验证，上述方法鉴别天然麝香与人工麝香方法所得结果准确无误。

Claims

1.一种鉴别天然麝香与人工麝香的方法，所述方法以二十六酸和二十八酸作为对照品，采用超高效合相色谱串联质谱法进行鉴别，包括如下步骤：

(1)分别称取二十六酸、二十八酸对照品适量，精密称定，加溶剂分别配制成浓度为1-10μg/mL的二十六酸对照品溶液和浓度为1-10μg/mL的二十八酸对照品溶液；或者

(4)精密吸取所述供试品溶液1-10μL，注入超高效合相色谱串联质谱仪，得到供试品总离子流图，根据二十六酸和二十八酸的准分子离子峰精确质量数在所述供试品总离子流图基础上进一步获得供试品提取离子流图；

其中，步骤(3)和步骤(4)中，

超高效合相色谱条件为：高压填充的C18硅胶键合相色谱柱；流动相A为二氧化碳，流动相B为体积比为50∶50∶0.1-0.5的甲醇-乙腈-甲酸；流速为1.0-2.0mL/min；柱温为30℃-40℃；补偿液采用流速0.3-0.8mL/min的甲醇；背压为1500psi；设置如下梯度洗脱程序：0到1min时，流动相B体积比为1～3％；1到2min时，流动相B体积比由1～3％升高到2-4％；2到3min时，流动相B体积比为2-4％；3到6min时，流动相B体积比由2-4％升高到3-9％；

质谱条件为：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压为2.0-2.7kV；锥孔电压：30V；电离源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃；气体流速为45-55L/h；脱溶剂流速为800L/h；

当所述供试品提取离子流图中在与所述二十六酸对照品总离子流图中的二十六酸色谱峰和所述二十八酸对照品总离子流图中的二十八酸色谱峰保留时间基本相同的位置上同时显示色谱峰时，或者所述供试品提取离子流图中在与所述混合对照品总离子流图中的二十六酸色谱峰和二十八酸色谱峰保留时间基本相同的位置上同时显示色谱峰时，所述麝香样品为天然麝香，否则为人工麝香；

所述“保留时间基本相同”，是指对照品色谱图中二十六酸和/或二十八酸的保留时间与供试品色谱图中的保留时间的误差在±10％范围内。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0到1min时，流动相B体积比为1-3％；1到2min时，流动相B体积比由1-3％升高到3.2-4.0％；2到3min时，流动相B体积比为3.2-4.0％；3到6min时，流动相B体积比由3.2-4.0％升高到4.1-9.0％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0到1min时，流动相B体积比为3％；1到2min时，流动相B体积比由3％升高到3.5％；2到3min时，流动相B体积比为3.5％；3到6min时，流动相B体积比由3.5％升高到7％。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱条件中，所述流动相B为体积比为50∶50∶0.1的甲醇-乙腈-甲酸，所述流速为1.6mL/min，所述补偿液的流速为0.3mL/min的甲醇；所述质谱条件中，毛细管电压为2.5kV，所述气体流速为50L/h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)所述溶剂可选自乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或甲醇。

6.根据权利要求1-3、5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述二十六酸对照品溶液中二十六酸的浓度为5-10μg/mL，所述二十八酸对照品溶液中二十八酸的浓度为5-10μg/mL，所述混合对照品溶液中二十六酸和二十八酸的浓度均为5-10μg/mL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述溶剂与步骤(2)所述溶剂是同一种溶剂。