CN115112798B - 一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法 - Google Patents

一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法，属于中药材的质量评价和控制领域，包括以下步骤：S1、供试品溶液制备；S2、GC‑MS、LC‑MS法分别对挥发性/非挥发性成分非靶向成分测定；S3、数据预处理和多元统计分析；S4、以变量重要性投影指标等为筛选指标筛选差异性代谢物，在原始数据中重新提取验证差异性代谢物；S5、对非挥发性和挥发性差异性成分峰面积进行归一化，分别赋予权重，综合评价三七质量；本发明综合液质联用非靶向代谢组学技术和气质联用非靶向代谢组学技术，基于对三七的整体性分析，挖掘差异性成分群，通过赋予权重的方式共同表征三七经验质量。

Description

一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量 的方法
技术领域
本发明涉及中药材的质量评价和控制领域，具体涉及一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法。
背景技术
三七又名山漆、金不换，为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎，在中药临床应用非常广泛，也是我国传统的名贵中药、金疮药。三七性味甘、微苦、温，归肝、胃经，功能与主治是散瘀止血，消肿定痛。用于咳血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等。
当前，三七商品规格等级混乱、质量参差不齐、产地变迁、外源性污染物等问题愈发严峻，三七市场十分混乱。《药材商品规格标准》中以规格大小评判三七质量的方法已无法满足市场需求。传统的质量控制方法是依据产地、外观、颜色、气味、采收季节、头数等多维度等经验法来划分，其中以口尝滋味和鼻嗅气味为关键评价指标，三七以味浓郁，先苦回甜，气浓郁者为佳，这是继承传统的评价三七的重要方法，现今三七的质量评价、商品等级的划分仍沿袭传统的评价方法，但囿于主观经验因人而异，难以客观化表征，迫切需要开展传统经验客观化、标准化研究。
以皂苷类成分含量为主体的质量控制方法是三七质量评价的主流，但缺乏相关生物效应评价支撑研究；且三七中皂苷类成分的含量与规格大小负相关，单纯使用皂苷类成分难以全面反映三七质量。非靶向植物代谢组学是对植物体内源性代谢物的全面、系统的分析，是一种无偏向的代谢组学分析，可以发现差异代谢物，在植物活性物质差异分析、代谢机制和相关代谢网络，尤其是植物品种、产地、收获时间差异性鉴别方面有很好的应用前景；非靶向植物代谢组学在数据采集方法上主要包括了核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)及液质联用(LC-MS)；目前大多数非靶向代谢组学研究仅采用一种数据采集方法，如采用LC-MS手段关注大极性非挥发性成分的差异，或仅采用GC-MS探究挥发性差异成分，暂未有对挥发性成分与非挥发性成分的联合分析方法，而中药本身是一个整体，应当以整体眼光看待，全面研究其化学成分。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法，本发明整合了UHPLC LTQ-Oribitrap MS、GC Q-TOF MS和HS-SPME技术，将液质联用非靶向代谢组学与气质联用非靶向代谢组学技术相结合，对三七的质谱数据进行挖掘，寻找可真实反映三七质量的标志物，并将所述质量标志物群用于三七的质量评价。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法，包括以下步骤：
S1、供试品溶液制备
以70％的甲醇溶液超声提取三七粉末，得到供试品溶液；
S2、挥发性/非挥发性成分非靶向成分测定
采用UHPLC LTQ-Oribitrap MS技术对三七代谢产物提取液进行非靶向成分测定，得到三七非挥发性成分原始数据；采用GC Q-TOF MS和HS-SPME技术对三七粉进行非靶向成分测定，得到三七挥发性成分原始数据；
S3、数据处理
对所述非挥发性成分原始数据和所述挥发性成分原始数据进行预处理和多元统计分析；
S4、数据挖掘
以变量重要性投影指标等为筛选指标筛选差异性代谢物，在原始数据中重新提取验证差异性代谢物；
S5、综合评价
对非挥发性和挥发性差异性成分峰面积进行归一化，分别赋予权重，综合评价三七质量。
优选的，步骤S1所述提取方法是先将三七粉碎并过40目筛，称取过筛后的三七粉末0.600g，加入20mL的体积分数70％的甲醇溶液，超声提取40min，分离提取液，提取液过0.22μm微孔滤膜，得到所述供试品溶液。
优选的，步骤S2所述非挥发性成分非靶向成分测定的方法是：
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，色谱柱规格2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为0-4min，98％-80％A；4-13min，80％-70％A，13-15min，70％-68％A；15-22min，68％-67％A，22-29min，67％-50％A，29-36min，50％-10％A，36-37.4min，10％A；柱温30℃，流速0.3ml/min，进样量3μL；质谱条件：离子源为电喷雾电离源，正、负离子模式分别扫描，加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，毛细管电压为±35V，喷雾电压为3.5kV，鞘气流速40arb，辅助气流速10arb；供试品和对照品溶液一级质谱在FT模式下进行全扫描，扫描范围100-1200，二级质谱采用数据依赖性扫描；质谱数据采用Xcalibur软件采集和分析。
优选的，步骤S2所述挥发性成分非靶向成分测定的方法是：
色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱，色谱柱规格30m×250μm×0.25μm，氦气He，进样口温度250℃，起始柱温50℃，不保留，先以10℃/min升至140℃，保持1min，再以1℃/min升至150℃，保持3min，最后以20℃/min升至250℃，保持3min，分流进样，总流量150mL/min，分流比100：1，流速1.5mL/min；质谱条件：离子源温度250℃，电离方式EI，电子能量70eV；质量扫描m/z 50～400，谱图检索采用NIST08s.LIB质谱库进行检索；HS-SPME条件：准确称取20mg三七粉末于样品瓶，制备后加盖封口，通过SPME Arrow(DVB/CWR/PDMS，1.1mm，20mm，120μm)萃取针进行吸附；样品孵育温度60℃，孵育时间10min，萃取温度55℃，萃取时间35min，解吸温度250℃，解吸时间2min。
优选的，步骤S3所述预处理是通过Progenesis QI软件提取UHPLC LTQ-OribitrapMS采集到的不同口尝滋味的三七质谱数据，对数据进行包括峰对齐、数据归一化和质控的预处理；通过MZmine 2.5软件提取GC Q-TOF MS采集到的不同鼻嗅气味的三七质谱数据，对数据进行包括去噪音、解卷积、峰排列、对齐、合并、标准化。
优选的，步骤S3所述多元统计分析是将预处理得到的液质联用非挥发性成分数据导入到SIMCA-P软件，通过PCA对样品类别、相似性、差异性进行分析，表征样品差异，随后进行OPLS-DA分析，获得成分vip值；使用MetaboAnalyst 5.0分析处理气质联用挥发性成分数据，进行PCA分析、OPLS-DA分析。
优选的，步骤S4所述变量重要性投影指标包括P值、vip值和差异倍数(FoldChange，FC)，液质联用非挥发性成分数据筛选条件为：P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8，气质联用挥发性成分数据筛选条件为：P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8，对筛选出的差异性成分在原始数据中重新提取验证，筛选得到能够表征三七质量的差异性成分。
优选的，步骤S5所述综合评价具体是对液质非挥发性差异性成分、气质挥发性差异性成分重新提取得到的峰面积进行归一化处理，并赋予权重进行综合计算：非挥发性差异性成分为评价三七的主要指标，评分占比80％，挥发性差异性成分为评价三七的次要指标，评分占比20％。
本发明的有益效果为：
(1)本发明综合液质联用非靶向代谢组学技术和气质联用非靶向代谢组学技术，分析手段整体、全面，可以全面测定三七大极性非挥发性成分和小极性挥发性成分，基于对三七的整体性分析，创新性地从口尝滋味和鼻嗅气味角度研究三七质量，体现源于临床的传统经验评价中味觉和嗅觉的核心作用，同时应用非靶向代谢组学手段，对主观的味觉和嗅觉进行客观化表征，挖掘真正反映三七口尝滋味和鼻嗅气味的差异性成分，得到的差异性成分群能够反映三七的真实质量。
(2)本发明建立的LC-MS与GC-MS综合分析模式，采用超高效液相色谱-线性离子阱轨道阱串联质谱联用技术(UHPLC LTQ-Oribitrap MS)、气相色谱-四极杆-飞行时间质谱(GC Q-TOF MS)和顶空-固相微萃取(HS-SPME)技术，可同时检测数百种极性跨度巨大的化合物群，全面研究三七大极性分子及挥发性小极性分子差异。创新性的权重赋予方式，可以综合液质联用和气质联用技术，探究可真实反应三七质量、代表三七口尝滋味和鼻嗅气味的质量标志物，并成功区分经验优等三七和劣等三七，为评价三七质量、规范三七市场药材商品标准提供依据。
(3)本发明提供的液质联用、气质联用综合非靶向代谢组学质量评价方法，除了可以应用于中药三七的质量评价，也可以用于其他中药的研究领域。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是液质联用传统经验评价优/劣等三七的PCA图(正离子模式)；
图2是液质联用传统经验评价优/劣等三七的PCA图(负离子模式)；
图3是液质联用传统经验评价优/劣等三七的OPLS-DA图(正离子模式)；
图4是液质联用传统经验评价优/劣等三七的OPLS-DA图(负离子模式)；
图5是气质联用气味差异较大的三七的PCA图(1为鼻嗅气味较浓组，2为鼻嗅气味较淡组)；
图6是气质联用气味差异较大的三七的OPLS-DA图(1为鼻嗅气味较浓组，2为鼻嗅气味较淡组)；
图7是挥发性差异性成分热图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例涉及一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学评价三七质量的方法，
通过液质联用和气质联用的非靶向代谢组学，结合多变量分析，分析比较不同经验等级的三七，鉴别相关差异性代谢物，以表征三七的口尝滋味和鼻嗅气味，综合评价三七质量；
使用本发明所述方法，邀请5名专家划分三七组别，划分因素可主要归纳为三七的口尝滋味和鼻嗅气味，专家传统经验评价结果如表1。
表1.测试集三七基于口尝滋味和鼻嗅气味的三七传统经验评价结果
采用液质联用非靶向代谢组学方法测定上述16批不同传统经验评价等级三七的大极性非挥发性差异性成分，表征三七的口尝滋味；选取不同经验评价等级三七中鼻嗅气味差异较大的10批，采用气质联用非靶向代谢组学方法测定三七的小极性挥发性差异性成分，表征三七的鼻嗅气味。
初步以P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8作为筛选条件，对16批不同传统经验评价等级三七进行研究，基于液质联用非靶向代谢组学的实验结果，正离子模式下可以得到64个差异性成分，负离子模式下可以得到124个差异性成分。对这188个大极性非挥发性差异性成分，在原始数据中逐一提取峰面积，重新计算P、FC，以P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8作为筛选条件，限定差异性成分峰面积较高的组别峰面积均值＞50000，由此，正离子模式下得到22个差异性成分，负离子模式下得到17个差异性成分，见表2；其中FC＞1.2，即经验评价口尝滋味较优的优等三七中含量高的差异性成分有14个，FC＜0.8的有25个。
表2.液质联用非靶向代谢组学正负离子模式下的差异性成分
初步以P＜0.1，vip＞1，FC＞1.5或＜0.67作为筛选条件，对鼻嗅气味差异较大的10批三七进行研究，基于气质联用非靶向代谢组学的实验结果，共得到差异性成分130个。对这130个小极性挥发性差异性成分，在原始数据中逐一提取峰面积，重新计算P、FC，以P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8作为筛选条件，同时限定差异性成分峰面积较高的一组，其峰面积均值＞1000，由此，得到25个差异性成分，见表3；其中FC＞1.2，即经验评价鼻嗅气味较浓郁的三七中含量高的差异性成分有13个，FC＜0.8的有12个。
表3.气质联用非靶向代谢组学差异性成分
确定差异性成分后，对非挥发性差异性成分和挥发性差异性成分逐一重新提取峰面积，并进行数据归一化，赋予分值，计算三七差异性成分综合评分。
数据归一化公式：
非挥发性差异性成分评分：A1＝∑x(LC-MS,FC＞1.2)-∑x(LC-MS,FC＜0.8)
挥发性差异性成分评分：A2＝∑x(GC-MS,FC＞1.2)-∑x(GC-MS,FC＜0.8)
三七差异性成分综合评分：A＝0.8×A1+0.2×A2
依据公式对上述测试集鼻嗅气味差异较大的10批三七进行研究，经验评价优等的三七评分均高于经验评价劣等的三七，差异性成分综合评分结果完全符合专家经验评价结果，具体分值见表4。
表4.测试集差异性成分综合评分
实施例2
重新收集6批三七样本(验证集)进行专家传统经验评价，专家评价结果见表5；依据测试集的筛选结果，对确立的39个非挥发性差异性成分和25个挥发性差异性成分进行逐一提取，得到6批三七的差异性成分峰面积。依据测试集方法进行数据归一化，赋予分值，计算三七差异性成分综合评分。评分结果完全符合专家经验评价结果，具体分值见表6。
表5.验证集三七传统经验评价结果
编号 年限 存货名称 批号 地理位置 传统经验评价
1 3年 水洗40头 KJYPB1-SQ-180929 云南文山文山市 一等
2 3年 水洗40头 SLQ1-SQ-180920 云南曲靖陆良县 一等
3 3年 水洗40头 KJYPB10-SQ-180929 云南文山文山市 一等
4 3年 水洗40头 XHS-SQ-181013 云南西双版纳勐海县 二等
5 3年 水洗40头 SLQ2-SQ-180916 云南曲靖陆良县 二等
6 3年 水洗40头 S-PLC2-SQ-181013 云南西双版纳勐海县 二等
表6.验证集差异性成分提取及差异性成分综合评分
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由测试验证结果可知，本发明所述方法筛选得到的差异性代谢物可以很好地表征专家传统经验评价结果，以区分经验评价优等三七和经验评价劣等三七。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学检测三七的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、供试品溶液制备
以70％的甲醇溶液超声提取三七粉末，得到供试品溶液；
S2、挥发性/非挥发性成分非靶向成分测定
采用UHPLC LTQ-Oribitrap MS技术对三七代谢产物提取液进行非靶向成分测定，得到三七非挥发性成分原始数据；采用GC Q-TOF MS和HS-SPME技术对三七粉进行非靶向成分测定，得到三七挥发性成分原始数据；
所述挥发性成分非靶向成分测定的方法是：
色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱，色谱柱规格30m×250μm×0.25μm，氦气He，进样口温度250℃，起始柱温50℃，不保留，先以10℃/min升至140℃，保持1min，再以1℃/min升至150℃，保持3min，最后以20℃/min升至250℃，保持3min，分流进样，总流量150mL/min，分流比100：1，流速1.5mL/min；质谱条件：离子源温度250℃，电离方式EI，电子能量70eV；质量扫描m/z 50～400，谱图检索采用NIST08s.LIB质谱库进行检索；HS-SPME条件：准确称取20mg三七粉末于样品瓶，制备后加盖封口，通过SPME Arrow萃取针进行吸附；样品孵育温度60℃，孵育时间10min，萃取温度55℃，萃取时间35min，解吸温度250℃，解吸时间2min；
所述非挥发性成分非靶向成分测定的方法是：
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，色谱柱规格2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度为0-4min，98％-80％A；4-13min，80％-70％A，13-15min，70％-68％A；15-22min，68％-67％A，22-29min，67％-50％A，29-36min，50％-10％A，36-37.4min，10％A；柱温30℃，流速0.3mL/min，进样量3μL；质谱条件：离子源为电喷雾电离源，正、负离子模式分别扫描，加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，毛细管电压为±35V，喷雾电压为3.5kV，鞘气流速40arb，辅助气流速10arb；供试品和对照品溶液一级质谱在FT模式下进行全扫描，扫描范围000-0200，二级质谱采用数据依赖性扫描；质谱数据采用Xcalibur软件采集和分析；
S3、数据处理
对所述非挥发性成分原始数据和所述挥发性成分原始数据进行预处理和多元统计分析；
S4、数据挖掘
以变量重要性投影指标为筛选指标筛选差异性代谢物，在原始数据中重新提取验证差异性代谢物；
所述变量重要性投影指标包括P值、vip值和差异倍数FC，液质联用非挥发性成分数据筛选条件为：P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8，气质联用挥发性成分数据筛选条件为：P＜0.1，vip＞1，FC＞1.2或＜0.8，对筛选出的差异性成分在原始数据中重新提取验证，筛选得到能够表征三七质量的差异性成分；
S5、综合评价
对液质非挥发性差异性成分、气质挥发性差异性成分重新提取得到的峰面积进行归一化处理，并赋予权重进行综合计算：
非挥发性差异性成分评分：A1＝∑x(LC-MS,FC＞1.2)-∑x(LC-MS,FC＜0.8)；
挥发性差异性成分评分：A2＝∑x(GC-MS,FC＞1.2)-∑x(GC-MS,FC＜0.8)；
非挥发性差异性成分为评价三七的主要指标，评分占比80％，挥发性差异性成分为评价三七的次要指标，评分占比20％。
2.根据权利要求1所述的一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学检测三七的方法，其特征在于，步骤S1所述超声提取方法是先将三七粉碎并过40目筛，称取过筛后的三七粉末0.600g，加入20mL的体积分数70％的甲醇溶液，超声提取40min，分离提取液，提取液过0.22μm微孔滤膜，得到供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学检测三七的方法，其特征在于，步骤S3所述预处理是通过Progenesis QI软件提取UHPLC LTQ-OribitrapMS采集到的不同口尝滋味的三七质谱数据，对数据进行包括峰对齐、数据归一化和质控的预处理；通过MZmine 2.5软件提取GC Q-TOF MS采集到的不同鼻嗅气味的三七质谱数据，对数据进行包括去噪音、解卷积、峰排列、对齐、合并、标准化。
4.根据权利要求1所述的一种基于液质联用、气质联用非靶向代谢组学检测三七的方法，其特征在于，步骤S3所述多元统计分析是将预处理得到的液质联用非挥发性成分数据导入到SIMCA-P软件，通过PCA对样品类别、相似性、差异性进行分析，表征样品差异，随后进行OPLS-DA分析，获得成分vip值；使用MetaboAnalyst 5.0分析处理气质联用挥发性成分数据，进行PCA分析、OPLS-DA分析。
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