CN110007017A - 一种鉴定桑叶是否经霜的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明利用非靶向植物代谢组学技术结合正交信号校正偏最小二乘判别分析区分经霜和未经霜桑叶的方法。具体提供一种鉴定桑叶是否经霜的检测方法，其特征在于：通过下述差异性标志物的相对比值之一种或多种来判别：枸橼酸衍生物/绿原酸、桑皮苷F/绿原酸、和色氨酸/绿原酸。采用本发明的分析方法能够有效区分霜桑叶和桑叶，直观的判别其分类情况，快速、准确地获得了可区分两者的差异性标志物，检测结果准确可靠。

Description

一种鉴定桑叶是否经霜的检测方法
技术领域
本发明属于植物检测领域，具体涉及桑叶是否经霜的检测方法。
背景技术
桑叶为桑科植物桑Morusalba L. 的干燥叶。主治风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤眼花等病症，是中医清热解毒之要药。桑叶中成分复杂，主要含有黄酮类、生物碱类、多糖类、氨基酸类、有机酸类、甾体类、挥发油和钙、铁、锰、锌等微量元素。现代研究发现，桑叶具有多种生物活性如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、减肥及皮肤美白等功效。
代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物，植物代谢组学可对植物提取物中代谢组进行高通量、无偏差的全面分析，较为全面地研究植物复杂代谢过程及其产物，从而为植物研究提供一个整体全面的分析平台，可最大程度地反映中药化学成分间的协同作用，有利于从整体上研究植物代谢物的变化，为分析植物次生代谢网络结构、限速步骤、解析细胞活动过程以及寻找植物间的亲缘关系等等提供了可能，因此近年来植物代谢组学技术在植物研究领域的应用受到广泛关注。
基于不同的研究目的，可以将植物代谢组学分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学是一种无偏向的对植物代谢组进行系统全面分析的代谢组学，靶向代谢组学是一种定向的分析，主要针对某一类目标成分进行分析。目前，非靶向代谢组学分析由于其无偏向特点，可对植物次级代谢产物的差异性进行系统全面研究，其在植物活性物质差异分析、代谢机制和相关代谢网络，尤其是植物品种、产地、收获时间差异性鉴别方面有很好的应用前景。
现代研究表明霜桑叶和未经霜桑叶差异显著。王笃军等研究表明，霜桑叶的镇咳、祛痰效果优于未经霜桑叶（[1] 王笃军,康立欣,赵力,王丹,魏渊,欧阳臻.桑叶经霜对其传统功效清肺润燥作用的影响[J].天然产物研究与开发,2017,29(09):1546-1550+1601.），在前期药理实验中也发现霜桑叶的解热效果优于未经霜桑叶，且持续时间长，由此可见，霜桑叶与未经霜桑叶的药理作用存在差异，临床不可等同使用。
中医历来认为霜桑叶具有上乘品质，《本草图经》中指出“十月霜后，三分二分已落，一分在者，名神仙叶，即采收”，《本草求真》中提到“用腊月不落桑叶”，《百草镜》载“冬至后采者良”。2015版《中国药典》中规定桑叶为桑科植物桑Morusalba L. 的干燥叶，初霜后采收，除去杂质，晒干。未经霜桑叶不能作为桑叶饮片使用。
但霜桑叶和未经霜桑叶人工难以区分，且信服力太弱，颜辉等采用近红外光谱分析霜桑叶和未经霜桑叶，发现10000～8400cm-1的短波近红外波段对鉴别有贡献（[2] 颜辉,韩邦兴,吴琼英,江明珠.近红外光谱结合PLSDA鉴别桑叶收获时间[A].中华中医药学会第十届中药鉴定学术会议暨WHO中药材鉴定方法和技术研讨会论文集，2010年.），但近红外光谱法仅能笼统、模糊地表征含氢基团的吸收差异，不能指认差异的具体来源。
多元统计分析方法是建立在多元统计分布基础上的一类处理多元统计数据方法的总称，常用的多元统计分析方法主要包括多元回归分析、聚类分析、典型相关分析、判别分析、对应分析、主成分分析、因子分析等。正交信号校正偏最小二乘判别分析(orthogonalsignal correction partial least square discrimination，OPLS-DA)，OPLS-DA是一种有监督的检验方法，采用多因变量对多自变量的回归建模方法。OPLS-DA是PLS-DA的扩展，将正交信号校正方法与PLS进行结合。OPLS-DA首先采用正交信号校正技术，将矩阵信息分解成相关和不相关的两类信息，然后滤除与分类无关的信息，使有效信息主要集中在第一个预测成分中。OPLS-DA可以滤除与研究对象无关的噪音，从而对PLS的结果进行修正，判别效果可视化更加明显，提高了模型的分辨能力。与PLS-DA模型相比较，OPLS-DA能够更好地表达样品组间差异，提高模型的有效性和对新样品的预测能力，使分析结果变得简单和易于解释。
目前植物代谢组学已经在不同生长年份人参、山西多种道地药材和京大戟炮制前后化学成分等研究中成功应用（[3] 李震宇,李爱平,张福生,秦雪梅. 植物代谢组学技术在山西道地药材研究中的应用[J]. 中草药, 2013, 07: 785-789.[4]曾颜,侯朋艺,陈晓辉.基于植物代谢组学技术的京大戟炮制前后化学成分变化研究[J]. 中药材, 2016, 03:530-533. ）。
但目前还没有报道将植物代谢组学引入桑叶与霜桑叶鉴别的研究，可以对桑叶经霜前后的化学成分变化进行整体全面的考察，并采用OPLS技术获得可区分两者的差异性标志物。
发明内容
本发明旨在建立一种可快速、有效地区分霜桑叶和未经霜桑叶的方法，并从成千上万种可能性中找到差异性标志，进而对其差异性成分进行指认，从而实现准确鉴别霜桑叶和未经霜桑叶，保证桑叶的临床疗效的目的。
本发明利用非靶向植物代谢组学技术结合正交信号校正偏最小二乘判别分析(orthogonal signal correction partial least square discrimination，OPLS-DA)区分经霜和未经霜桑叶的方法。将经霜和未经霜桑叶分别进行前处理后，应用高效液相色谱-质谱方法实现对桑叶经霜过程中代谢组学的测定与分析，然后应用正交偏最小二乘-判别分析模型区分霜桑叶和桑叶，并利用S-plot图和变量权重重要性排序（variableimportance in projection，VIP）预测值分布图辨别影响较大的化合物，最后通过质谱对筛选到的标志物进行了指认。
经过研究，发现枸橼酸衍生物/绿原酸、桑皮苷F/绿原酸、和色氨酸/绿原酸的比值在经霜前后有显著的差异，能够作为鉴定霜桑叶和未经霜桑叶的标志物。
因而，本发明提供一种鉴定桑叶是否经霜的检测方法，其特征在于：通过下述差异性标志物的相对比值之一种或多种来判别：枸橼酸衍生物/绿原酸、桑皮苷F/绿原酸、和色氨酸/绿原酸。
进一步地，其中所用到的标志物是通过非靶向植物代谢组学结合OPLS进行筛选。进而，所述比值是对待测样品进行高效液相色谱-质谱后的图谱的峰面积比值。
进一步地，经霜前枸橼酸衍生物/绿原酸，桑皮苷F/绿原酸和色氨酸/绿原酸比值均低于0.3，优选地低于0.15。
而经霜后枸橼酸衍生物/绿原酸比值均高于0.8，优选高于1.0，桑皮苷F/绿原酸比值均高于0.6，优选高于0.9，色氨酸/绿原酸比值均高于0.6，优选高于0.8。
具体的色谱条件为：色谱柱采用Agilent Zorbax SB-C18，规格为250 mm×4.6mm，5 μm；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱；检测波长320 nm；柱温30 ℃；流速1.0mL·min-1；进样量10 μL。
优选地，所述梯度洗脱为：0~10 min，5%~10%A；10~15 min，10%A；15~25 min，10%A~15%A；25~40 min，15%A；40~45 min，15%~18%A；45~70 min，18%A；70~100 min，18%~100%A；100~108 min，100%A；108~116 min，5%A。
具体的质谱条件采用电喷雾离子源；扫描级数5级；扫描范围：50～1000 m/z；扫描速度26000 m/z·s-1；喷雾气压力35 psi；干燥气温度350 ℃；干燥气流速9 L·min-1；毛细管电压4000 V，分流比4∶1。
在进行色谱之前进行前期处理：将桑叶或桑叶饮片粉碎，过筛，加热回流，冷却至室温，过滤备用。
同时，本发明还提供一种区分经霜和未经霜桑叶的方法，其特征在于：将经霜和未经霜桑叶分别进行前处理后，应用高效液相色谱-质谱方法实现对桑叶经霜过程中代谢组学的测定与分析，然后应用正交偏最小二乘-判别分析模型区分霜桑叶和桑叶，并利用S-plot图和变量权重重要性排序（variable importance in projection，VIP）预测值分布图辨别影响较大的化合物，最后通过质谱对筛选到的标志物进行指认。
其中，所述前处理是将桑叶或桑叶饮片粉碎，过筛，加热回流，冷却至室温，过滤备用。
采用本发明的分析方法能够有效区分霜桑叶和桑叶，直观的判别其分类情况，快速、准确地获得了可区分两者的差异性标志物，检测结果准确可靠（具体可见具体实施方式部分的实施例的结果）。
附图说明
图1桑叶经霜前代谢组指纹图谱
图2桑叶经霜后代谢组指纹图谱
图3 桑叶检测的S-plot图
图4变量权重重要性排序预测值分布图
图5差异性标志物/绿原酸的相对含量(每组左为经霜前，右为经霜后)
具体实施方式
根据下述实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1
1 方法
1.1 供试品溶液的制备
分别取经霜前、后采集桑叶，除去杂质，晒干，粉碎，过三号筛，准确称取样品粉末1 g，加入50 mL水，称定重量，加热回流1h，冷却至室温，补足减失的重量，混匀，过滤，滤液过0.45 μm滤膜，即得。
1.2 色谱条件
色谱柱Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0~10 min，5%~10%A；10~15 min，10%A；15~25 min，10%A~15%A；25~40 min，15%A；40~45 min，15%~18%A；45~70 min，18%A；70~100 min，18%~100%A；100~108 min，100%A；108~116 min，5%A；）；检测波长320 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。
1.3 质谱条件
采用电喷雾离子源；扫描级数5级；扫描范围：50～1000 m/z；扫描速度26000 m/z·s-1；喷雾气压力35 psi；干燥气温度350 ℃；干燥气流速9 L·min-1；毛细管电压4000 V，分流比4∶1。
1.4 方法学
取供试品溶液，按1.2项的条件，进样6次，对该方法的精密度进行考察；取该供试品6份，分别按1.1项的方法制备供试品溶液，按1.2项的条件分别测定，对该制备方法的重现性进行考察；另取该供试品按1.1项的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，考察样品的稳定性。
1.5 数据分析
将色谱数据（AIA格式）导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004年A版），首先选定参比图谱，采用中位数的方法进行多点校正，匹配后生成指纹图谱共有模式的对照图谱，并计算各样品与对照图谱的相似度。将色谱数据（AIA格式）导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004年A版），生成指纹图谱的对照图谱，计算各样品与对照图谱的相似度。
将指纹图谱数据集矩阵导入SIMCA-P 14.1软件（Umetrics，Umea，Sweden）进行OPLS-DA。建立OPLS-DA模型时，先对数据进行permutation分析，假设检验次数设为200；对两组数据的差异性进行整体分析，得到S-plot图和变量权重重要性排序（variableimportance in projection，VIP）预测值分布图，选取位于S-plot图两端并且VIP＞1的点作为差异性标志物。
采用DataAnalysis对正、负离子模式总离子流图进行分析，根据相对保留时间、碎片离子信息和分子式匹配软件，结合Scifinder、Chemspider等数据库以及相关文献报道对差异性标志物进行鉴定。
2 结果
2.1 方法学试验结果
进行了样品的精密度试验、稳定性试验、重复性试验，各主要色谱峰（色谱图见图1,2）。
2.1.2 精密度实验
取A1样品，按“1.2”项下色谱条件进行测定，重复进样6次，记录特征图谱，6次测定图谱特征峰的相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于3%，仪器精密度良好。
2.1.3重复性实验
取A1样品，按“1.2”项下制备6份样品，分别测定，6份样品特征峰相对保留时间的RSD小于1%，相对峰面积的RSD小于3%，表明方法的重复性良好。
2.1.4稳定性实验
取新制备的A1样品提取液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样，测定图谱特征峰相对保留时间的RSD为0.09%～0.61%，相对峰面积的RSD为0.584%～2.89%，表明该方法处理的桑叶提取液在24 h内稳定。
综上，结果表明，仪器精密度良好，实验方法的重复性良好，供试液在24 h内稳定。
2.2 OPLS-DA结果分析
S-plot图（图3）中S型曲线上的每一个点代表一个化合物，差异性化合物分布在S型曲线的上下两端。S曲线上端应为霜桑叶中高表达的化合物，下端为桑叶中高表达的化合物。在0.95的置信区间内，VIP>1的化合物在两组分类中发挥重要作用，结合各变量的VIP值选取排序前3的化合物（图4），霜桑叶与桑叶的差异性标志物为色谱峰1、23、14。
2.3 差异性标志物的质谱解析
通过分析各级质谱图提供的碎片离子信息，推测差异性标志物分别为枸橼酸衍生物、桑皮苷F、色氨酸。
表1 差异性标志物的质谱解析
峰号 保留时间 ESI- ESI+ 分子量 分子式 化合物 文献
1 6.448 405→191→111 407 406 unknown 枸橼酸衍生物 [5]
23 74.107 611→565→403→241 589→427→339 566 C<sub>26</sub>H<sub>30</sub>O<sub>14</sub> 桑皮苷F [6]
14 45.428 203→159→130 205→188 204 C<sub>11</sub>H<sub>12</sub>N<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 色氨酸 [7,8]
（其中：文献[5] Spínola, V.; Pinto, J.; Castilho, P.C. Identification andquantification of phenolic compounds of selected fruits from Madeira Islandby HPLC-DAD-ESI-MSn and screening for their antioxidant activity. Food Chem.2015, 173, 14–30.
文献[6] Lee, S.H.; Choi, S.Y.; Kim, H.; Hwang, J.S.; Lee, B.G.; Gao,J.J.; Kim, S.Y. Mulberroside F Isolated from the Leaves of Morus albaInhibits Melanin Biosynthesis. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25, 1045–1048.
文献[7]田欢,翟俊乐,李孟秋,刘新民,常琪,潘瑞乐,张泽生,廖永红.LC-MS/MS法测定小鼠脑组织中色氨酸及其3种代谢物[J].食品工业科技,2016,37(01):315-319+330.
[8]梅辉. 基于LC-MS/MS法的色氨酸合成代谢组学分析平台的构建[D].江南大学,2010.）
2.4 差异性标志物相对比值的鉴别
峰12为绿原酸，图3中可见峰12相对稳定，且为负偏差，同一样品中，以正偏差变化率较高的峰与负偏差变化最小的峰面积的比值为指标（图5），可对经霜前后桑叶进行区分，经霜前后三个指标均存在极为显著的统计学差异（P < 0.001）。此3指标可共同验证，共同作为可靠指标对经霜前后桑叶进行区分。
对未知桑叶样品，采用本发明所用指纹图谱条件进行检测，根据色谱峰1、23、14（分别为枸橼酸衍生物、桑皮苷F、色氨酸）的峰面积与峰12（为绿原酸）的比值，即可判断未知桑叶样品是否经霜，具体见表2。由此可见枸橼酸衍生物、桑皮苷F、色氨酸分别与绿原酸的峰面种比值差异十分明显，能够作为可靠指标对经霜前后桑叶进行区分。
表2 差异性标志物的峰面积相对比值
名称 经霜前 经霜后
枸橼酸衍生物/绿原酸 0.15±0.05 1.05±0.48
桑皮苷F/绿原酸 0.14±0.07 0.98±0.48
色氨酸/绿原酸 0.13±0.09 0.89±0.49

Claims (10)

1.一种鉴定桑叶是否经霜的检测方法，其特征在于：通过下述差异性标志物的相对比值之一种或多种来判别：枸橼酸衍生物/绿原酸、桑皮苷F/绿原酸、和色氨酸/绿原酸。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：其中的标志物是通过非靶向植物代谢组学技术结合OPLS进行测定。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述比值是对待测样品进行高效液相色谱-质谱后的图谱的峰面积比值。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：经霜前枸橼酸衍生物/绿原酸，桑皮苷F/绿原酸和色氨酸/绿原酸图谱的峰面积比值均低于0.3，优选地低于0.15。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：经霜后枸橼酸衍生物/绿原酸图谱的峰面积比值均高于0.8，优选高于1.0，桑皮苷F/绿原酸图谱的峰面积比值均高于0.6，优选高于0.9，色氨酸/绿原酸图谱的峰面积比值均高于0.6，优选高于0.8。
6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：色谱柱采用Agilent Zorbax SB-C18，规格为250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱；检测波长320 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱为：0~10 min，5%~10%A；10~15 min，10%A；15~25 min，10%A~15%A；25~40 min，15%A；40~45 min，15%~18%A；45~70 min，18%A；70~100 min，18%~100%A；100~108 min，100%A；108~116 min，5%A。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：质谱条件采用电喷雾离子源；扫描级数5级；扫描范围：50～1000 m/z；扫描速度26000 m/z·s-1；喷雾气压力35 psi；干燥气温度350 ℃；干燥气流速9 L·min-1；毛细管电压4000 V，分流比4∶1。
9.如权利要求2至8任一项所述的检测方法：在进行色谱之前进行前期处理：将桑叶或桑叶饮片粉碎，过筛，加热回流，冷却至室温，过滤备用。
10.一种区分经霜和未经霜桑叶的方法，其特征在于：将经霜和未经霜桑叶分别进行前处理后，应用高效液相色谱-质谱方法实现对桑叶经霜过程中代谢组学的测定与分析，然后应用正交偏最小二乘-判别分析模型区分经霜和未经霜桑叶，并利用S-plot图和变量权重重要性排序预测值分布图辨别影响较大的化合物，最后通过质谱对筛选到的标志物进行指认，优选地，所述前处理是将桑叶或桑叶饮片粉碎，过筛，加热回流，冷却至室温，过滤后用于高效液相色谱-质谱分析。
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