发明内容
针对上述技术缺陷,本发明的目的之一是提供一种蛹虫草的制备方法。
本发明的另一个目的是提供采用该制备方法制得的蛹虫草。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种蛹虫草的制备方法,该制备方法包括下述步骤:
(1)将蛹虫草菌液注入柞蚕生物茧的蚕蛹,16~18℃下培养7~10天获得僵蛹;
(2)僵蛹经无光照培养5~7天,蛹体表面形成子实体原基;
(3)僵蚕再经光照培养10~15天,光照强度为800~1000勒克斯;之后白天自然光光照培养,晚上光照培养、光照强度为800~1000勒克斯,直至子实体长出子囊壳。
就上述制备方法而言,在所述步骤(1)中,优选地,所述柞蚕生物茧为以卵量母种获得的柞蚕生物茧。所述卵量母种是指直接用于继代繁育柞蚕的柞蚕种。柞蚕生物茧是指按一定程序繁育,并以其活体为原料用于医药保健、食品、化工等生产行业的优质柞蚕茧(除去丝茧)。优选地,所述柞蚕生物茧的蚕蛹出蛹率为85%以上,健蛹率为94~98%。优选地,所述柞蚕生物茧的蚕蛹在注入蛹虫草菌液前经过消毒。
就上述制备方法而言,在所述步骤(1)中,优选地,所述蛹虫草菌液是由以下方法制备的:
a. 将冻干保藏的野生蛹虫草菌种接种至脱脂牛乳,25℃下培养7天后分别接种至斜面复壮培养基和液体复壮培养基,25℃下培养7天,其中按重量份数计,所述斜面复壮培养基的组成为蚕蛹粉10份、蛋白胨10份、全脂奶粉10份、生物素0.01份、琼脂20份、水1000份、pH 5.8;所述液体复壮培养基的组成为蚕蛹粉10份、蛋白胨10份、全脂奶粉10份、生物素0.01份、水1000份、pH 5.8;
b. 将经液体复壮培养基培养得到的蛹虫草菌液注入柞蚕生物茧的蚕蛹,16~18℃下培养10天后,22℃下光照培养30天,确认能否长出子实体;
c. 将能够长出子实体的野生蛹虫草菌种从斜面复壮培养基接种至扩增菌种液体培养基,25℃下培养24小时后振荡培养72小时;其中,按重量份数计,所述扩增菌种液体培养基的组成为蚕蛹粉8份、蔗糖8份、奶粉10份、维生素液20 份、磷酸二氢钾1.5份、磷酸二氢钠1.0份、水1000份、pH 5.0;按重量份数计,所述维生素液的组成为盐酸硫胺素0.1份,核黄素0.025份,吡哆醇0.025份,泛酸钙0.1份,对氨基苯甲酸0.025份,氯化胆碱0.1份,肌醇0.1份,叶酸0.0025份,生物素0.001份,以及蒸馏水1000份。
就上述制备方法而言,在所述步骤(1)中,优选地,所述蚕蛹置于培养盘中培养;优选地,所述蚕蛹置于培养盘中培养且培养时相互不重叠。
就上述制备方法而言,在所述步骤(2)中,优选地,所述僵蚕在无光照培养前经过消毒;更优选地,所述僵蚕在无光照培养前经过消毒并被覆盖塑料薄膜。
优选地,上述制备方法还包括以下步骤:
(4)干燥得到的蛹虫草。
在所述步骤(4)中,更优选地,所述干燥条件为在频率2450±50MH的微波中、50~60℃下干燥至含水量为5~8%。
优选地,上述制备方法还包括以下步骤:
(5)粉碎得到的蛹虫草。
在所述步骤(5)中,更优选地,所述粉碎为先将蛹虫草粗粉碎至20~80目,再经球磨粉碎至150-300目。更优选地,所述球磨粉碎的条件为粉碎时间为3小时,球磨转速为600转/min,罐体温度为15℃,球体温度为20℃。
本发明还提供了根据上述制备方法制备的蛹虫草。
另一方面,本发明还提供了根据上述制备方法制备的蛹虫草在制备药品、保健品、食品或化妆品中的用途。
本发明选择柞蚕生物茧和经过复壮的蛹虫草菌种培育出成品率高(从61.18%提高至90%以上)和质量优质的蛹虫草,并通过采用超微粉碎技术,使产品的分散性、溶解性、吸收性得到根本的改善,大大提高了原料的利用率,以及产品的生物活性、营养成份含量和吸收性,从而提高了其抗疲劳和抗氧化功能。本发明得到的产品的内在质量得到充分改善,从而更具有营养,易于消化吸收,原有的自然风味也得以进一步保留。与已有的蛹虫草菌粉相比,本发明的蛹虫草菌粉主要具有以下特征:(1)淡淡的香味;(2)颜色较深,呈“黄褐色”;(3)手感细腻、光滑、易吸潮,抹在手背皮肤上用指搓即可被皮肤吸收。
本发明的制备方法包括获得生物茧种、储存、取蛹消毒、蛹虫草菌种复壮、出草试验、扩制、接种蚕蛹、上盘培养、上架培养、下架干制、超微粉碎、包装储存等,详见附图1。与现有技术相比,本发明对茧种进行了选育,对蛹虫草菌种进行复壮和出草试验,选用出草率达100%的菌种进行生产,培育出的蛹虫草成品率达到90%以上,比采用其他大茧或种茧高出20~30%;本发明采用培养盘直接进行上架立体培养,省去了洗瓶上瓶工序,提高工作效率20%(一培养盘相当于20罐头瓶);本发明得到的蛹虫草于干燥后直接进行超微粉碎,粉碎粒径为150~300目,以菌粉形态储存,省去冷藏和采收等工序,节省空间,降低成本,适于产业化生产。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规商购得到。
实施例1
柞蚕生物茧种于当年11月中下旬入库储存,储存温度为-1~2℃、储存湿度为50~60%,储存厚度为30cm。蛹期标准:出蛹率90%,健蛹率94%。
1. 蚕蛹的处理:在生产前1~2天,将柞蚕生物茧放入割茧机孔内距离切割刀尖下约0.1~0.5mm处,然后开始向同一方向旋转割茧器,切割刀快速将茧层切开,蚕蛹自然从茧壳脱落到盛蛹器内,每盘200个蛹,不准重叠,然后将蚕蛹用传送机传入到消毒室内,先通过自动喷雾器向蛹体表面喷淋水2分钟,后用传送机传入消毒液喷淋2分钟,最后用纯净水喷淋2分钟,进入接种室待用。
2. 蛹虫草菌种的处理:菌种为冻干法保藏的野生蛹虫草菌种,于生产前2个月开始进行菌种激活。
2-1 菌种激活培养基为脱脂牛乳1000ml,分装至容量为100ml的三角瓶中,每瓶25ml,灭菌,冷却;取出5支冻干保藏的菌种,编号,在无菌条件下,将冻干保藏的菌瓶盖取下,用接种针将菌种块移入激活培养基中,每个菌号5瓶,接完种后放入25℃温度培养室中培养7天。
2-2 蛹虫草菌种的复壮:
按常规方法制备斜面复壮培养基,其配方为:蚕蛹粉10g,蛋白胨10g,全脂奶粉10g,生物素10毫克,水1000ml,琼脂20g,pH 5.8。
按常规方法制备液体复壮培养基,其配方为:蚕蛹粉10g,蛋白胨10g,全脂奶粉10g,生物素10毫克,水1000ml,pH 5.8。
于无菌室内的洁净工作台上,每个菌号接入50支斜面固体菌种和3瓶激活的液体菌种,放入培养室培养,温度为25℃,培养7天。
出草试验:用注射器吸取得到的蛹虫草菌液,将蛹虫草菌液注入体表经消毒的蚕蛹,每瓶菌液注入100个蚕蛹;前10天在16~18℃温度下培养,后30天提高温度至20~22℃并增加光照,光照强度为1000勒克斯,培养至长出子实体,选择能够100%出子实体的菌种进行菌种扩制。
2-3 制备菌种扩增液体培养基,其配方为:蚕蛹粉8g、蔗糖8g、奶粉10g、维生素液20ml、磷酸二氢钾1.5g、磷酸二氢钠1.0g、硫酸镁0.5g、水1000ml,pH 5。所述维生素液按下列配方组成:盐酸硫胺素100毫克,核黄素25毫克,吡哆醇25毫克,泛酸钙100毫克,对氨基苯甲酸25毫克,氯化胆碱100毫克,肌醇100毫克,叶酸2.5毫克,生物素1毫克,加蒸馏水1000毫升。按配方精确称取配方的各成分配制培养基,其中将蚕蛹粉加水煮沸、过滤后,在将滤液加入其余培养基成分的混合物中,定容,充分搅拌,分装在培养容器中,装量为容器的3/10;然后在1.2公斤/每平方米压力下进行灭菌,时间为30分钟;灭菌后,经冷却,在培养基内接入经验证长出子实体的菌种(来自斜面复壮培养基),在25℃温度下培养24小时,然后放入液体菌种振荡器中,振荡培养72小时。
2-4 菌种检验:
2-4-1外观形态检查:菌球大小均匀,直径在0.5~1mm之间,菌液透明,培养前后无明显变化,无酸味或其它异味;
2-4-2 pH值检查:培养后的pH值在5.8左右;
2-4-3显微镜检查:一般是细菌、酵母菌和放线菌,细菌多数运动活跃,在镜下呈现杆状;酵母菌的个体较大,为圆形,有的能产芽孢;放线菌的特征为菌丝较纤细,呈现分枝状,菌丝内无横隔。
3. 培养僵蛹
3-1接种蚕蛹:在接种车间内,于洁净工作台上,无菌条件下,将经检验合格的菌液注入连续接种器内,然后按上针头(型号为12号),启动机器注入蛹体,每个蛹为0.5~1mm。
3-2 上盘培养:将接种后的蚕蛹放入培养盘内,每盘为200个左右,以不出现重叠为佳;然后放入僵蛹室内培养僵蛹,温度为16~18℃,培养时间为10天;4天后开始检查,及时检出烂蛹。
4. 僵蛹上盘培养:将盘内僵蛹进行消毒,消毒过程为将僵蛹用传送机传入到消毒室内,先通过自动喷雾器向蛹体表面喷淋自来水2分钟,后用传送机传入消毒液喷淋2分钟,最后用纯净水喷淋2分钟。经消毒的僵蛹摆入无菌盘中,盘上表面用细钢架支成拱形,然后覆盖塑料薄膜。将经覆盖塑料薄膜的僵蛹盘分别摆放在培养室内的培养架上,无光照培养7天,直至蛹体表面出现子实体原基。
上架出草:将得到的蛹体进行增光培养,前15天每天24小时,其光照强度为1000勒克斯;之后白天采用自然光光照培养,晚上光照培养、光照强度为800~1000勒克斯,直至子实体长出子囊壳,之后及时干燥。
5. 干燥:将得到的蛹虫草,放置在波长频率为2450MHz、温度为50℃~60℃的微波隧道中干燥,至含水率为5% ~8%时完成。
6. 超微粉碎:先将经干燥的蛹虫草体粉碎至粒径为20~80目,后采用摇摆式球磨机一次粉碎至粒径为150~300目,粉碎时间为3小时,转数为600转/min,罐体温度为15℃,球体温度为20℃;摇摆式球磨机的撞击球为锆球。
7. 包装储存:将得到的蛹虫草粉在无菌室内,分装入为容量为500克的包装瓶内,置于阴凉干燥处保存。
实施例2
表1:不同制备方法获得的蛹虫草的对比试验
现有方法1:中国专利申请00130381.3记载的方法;
现有方法2:中国专利申请87106987.3记载的方法。
实施例3:蛹虫草菌粉的主要营养成份分析
1)检测项目:两种蛹虫草菌粉样品中尿苷、腺苷、腺嘌呤、虫草素、尿嘧啶的含量。
样品名称:蛹虫草菌粉A(按实施例1制备);蛹虫草菌粉B(按中国专利申请00130381.3记载的方法制备)。
样品来源:广州大光制药有限公司。
检测仪器:日本岛津CS-910双波长薄层扫描仪;
试剂:硅胶H、硅胶GF254(青岛海洋化工厂);95%的乙醇、氯仿、异丙醇(北京化工厂AR)。
对照品:尿苷、腺苷、腺嘌呤、尿嘧啶(均为西德进口分装);虫草素(日本进口)纯度为98%以上。
薄层条件:硅胶GF254 33克(加磷酸氢二钠1.8克),加0.3%CMC水溶液调匀铺板,放置过夜干燥,以氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-水(体积比=8:2:6:0.6)为展开剂(每10毫升展开剂中加氨水2滴),饱和20min,上行展开,取出,晾干,扫描。
扫描条件:反射法线性扫描:λs=260nm,λR=400nm,灵敏度2,扫描速度40 nm/min,纸速20 bn/min;
对照品溶液制备:虫草素为1 ml/mg;腺苷、尿苷、腺嘌呤、尿嘧啶均为0.2 mg/ml;
供试品溶液的制备:精密称取样品约2.0g,置100ml的鸡心瓶中,加入20%乙醇40ml,回流提取5小时,趁热抽滤;用20%乙醇洗涤3次后,合并滤液,蒸至1ml;加入硅胶H 1.5g搅拌均匀,室温干燥,上柱(1.5×30mm,硅胶H 3.5g,干法装柱),采用90%乙醇减压洗脱,收集洗脱液80ml,减压后回收乙醇,残渣用50%乙醇溶液并定容于5.0ml量瓶中摇均,即得。
测定法:精密吸取对照品溶液2μL、供试品溶液10μL,滴于同一薄层板上,展开,取出,晾干,扫描,测定斑点峰面积,计算,即得。
测定分析结果表明:蛹虫草菌粉A中,虫草素含量为0.250%,腺苷为0.040%,腺嘌呤为0.010%,尿苷为0.025%,尿嘧啶为0.007%;蛹虫草菌粉B中:虫草素含量为0.050%,腺苷为0.031%,腺嘌呤为0.002%,尿苷为0.020%,尿嘧啶为0.004%,结果见表2。
表2:营养成分检测结果
已知虫草多糖、核苷类(虫草素、腺苷、腺嘌呤、尿苷、尿嘧啶)成分与其抑制肿瘤、调节免疫功能等活性有关。
2)检测项目:蛹虫草菌粉样品中的氨基酸成分检测。
样品名称:蛹虫草菌粉A(按实施例1制备);蛹虫草菌粉B(按中国专利申请00130381.3记载的方法制备)。
样品来源:广州市大光制药有限公司。
分析仪器:835-50氨基酸自动分析仪,进样量为50μL;
分析条件:分析柱φ2.6×150mm,缓冲液流速:0.225ml/min;
结果表明,本发明的蛹虫草菌粉中的18种氨基酸(包括牛磺酸)的总含量为49.7026%,远高于已有的蛹虫草菌粉33.801%,结果见表3。
表3:蛹虫草菌粉氨基酸含量检验表
实施例4:蛹虫草菌粉的抗疲劳、抗乏氧试验
对本发明的蛹虫草菌粉的药理活性强度进行检测,采用已有的蛹虫草菌粉作为对照样品进行抗疲劳、抗乏氧的试验研究。通过实验结果表明,本发明的蛹虫草菌粉抗疲劳、抗乏氧的作用明显高于已有的蛹虫草菌粉。
实验材料:蛹虫草菌粉A(按实施例1制备)和蛹虫草菌粉B(按中国专利申请00130381.3记载的方法制备),均由广州市大光制药有限公司提供。
(1)蛹虫草菌粉的抗疲劳试验
选体重为18~22g的健康小鼠40只,雌雄各半,随机分为4组,分组情况及给药剂量详见表4,连续给药10天,末次给药40min后将动物投入水温为28±2℃、水深为35cm的游泳槽内进行游泳试验,记录每只动物的游泳时间。
表4:两种蛹虫草菌粉样品的抗疲劳实验结果
给药组别 |
剂量(g/kg) |
动物个数(n) |
游泳时间(min) |
蛹虫草菌粉A |
4.0 |
10 |
105.65±9.97 |
蛹虫草菌粉A |
2.0 |
10 |
105.20±21.88 |
蛹虫草菌粉B |
4.0 |
10 |
98.76±12.73 |
蛹虫草菌粉B |
2.0 |
10 |
93.42±19.92 |
表4说明,各给药组连续给药10天后,本发明的蛹虫草菌粉4.0g/kg剂量组和2.0g/kg剂量组均比已有的蛹虫草菌粉对照组有显著延长的抗疲劳作用。
(2)蛹虫草菌粉的抗乏氧试验
选体重为18~22g的健康小鼠40只,雌雄各半,随机分为4组,分组情况及给药剂量详见表5,连续给药10天,末次给药40min后将小鼠装入250ml的密闭广口瓶内,瓶内装5g钠石灰,瓶口涂凡士林封闭,观察并记录小鼠的死亡时间。
表5:两种蛹虫草菌粉样品的抗乏氧实验结果
给药组别 |
剂量(g/kg) |
动物个数(n) |
存活时间(min) |
蛹虫草菌粉A |
4.0 |
10 |
32.74±4.96 |
蛹虫草菌粉A |
2.0 |
10 |
32.03±13.40 |
蛹虫草菌粉B |
4.0 |
10 |
29.97±13.76 |
蛹虫草菌粉B |
2.0 |
10 |
28.58±11.46 |
表5说明,各给药组连续给药10天后,本发明的蛹虫草菌粉组4.0g/kg剂量组和2.0g/kg剂量组均比已有的蛹虫草菌粉对照组有显著延长的抗乏氧作用,有延长小鼠生存时间的趋势。
通过上述抗疲劳及抗乏氧实验结果,我们可以看出本发明的蛹虫草菌粉呈现出较显著促进作用。
实施例5:本发明的蛹虫草菌粉的分散性试验
分散性是指固体粒子的絮凝团或液滴在水或其他均匀液体介质中,能分散为细小粒子悬浮于分散介质中而不沉淀的性能。分散性与物质的比表面积有关,比表面积大则分散性好。
取蛹虫草菌粉A(按实施例1制备,粒径300目)和蛹虫草菌粉B(按中国专利申请00130381.3记载的方法制备,粒径100目)各2克,加纯净水100毫升,充分搅拌分散均匀,静置 15-20分钟后观察。蛹虫草粉A的结果见附图2;蛹虫草菌粉B的结果见附图3。
由照片可以看出,实施例1制备的经超微粉碎的蛹虫草菌粉大部分溶于水中,溶液颜色呈深褐色,在水中无分层现象和沉淀发生;而按中国专利申请00130381.3记载的方法制备的经普通粉碎的蛹虫草菌粉仅部分溶于水中,颜色浅黄色,有沉淀产生,分层明显。
本项试验说明了本发明的蛹虫草菌粉有更好的分散性、溶解性、比表面积更大,优于已有的蛹虫草菌粉。