CN102861121A - 一种瓜蒌皮注射制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，本发明提供一种瓜蒌皮注射制剂及其制备方法。其中瓜蒌皮提取物制备方法为：将瓜蒌皮粉碎成粒径小于等于250μm的瓜蒌皮粉末；将粉末加入水中，在一定压力下提取，卸除压力，过滤后、浓缩，得第一浸膏；取第一浸膏通过半透膜后，收集保留液，与氯仿-正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，收集水层，浓缩，获得第二浸膏；取所述第二浸膏加入乙醇，静置，离心后取上清液，浓缩，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得。本方法工作效率高，生产成本低；由本方法获得的提取液制得的注射剂，质量稳定，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及瓜蒌皮注射制剂及其制备方法。
背景技术
瓜蒌为常用中药，是中医治疗胸痹之要药。1995年版中国药典规定瓜蒌为葫芦科(Cucurbitaceae)栝楼属植物栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim.)或双边栝楼(T.rosthornii Harms)的干燥成熟果实，同时规定两种植物果实部分的干燥种子和干燥成熟果皮分别为常用中药瓜蒌子和瓜蒌皮。瓜蒌、瓜蒌子、瓜蒌皮因要用部位不同，临床应用亦有差异。瓜蒌皮重在清化热痰、利气宽胸，用于痰热咳嗽、胸闷胁痛。
瓜蒌皮及其制剂具有抗心律失常、扩张动脉、增加冠脉流量，保护心肌缺血，提高耐氧能力，降低血清胆固醇，扩张微血管，延缓微循环障碍的发生等心血管系统的药理作用。以瓜蒌皮制成的注射剂可用于治疗冠心病、解除或改善心绞痛、改善心电图，对喘息型气管炎、肺心病哮喘具有较好的镇咳、祛痰和平喘作用。
ZL03129140.6公开了一种瓜蒌皮注射液的制备方法，该方法采用提取、上柱交换吸附洗脱的方法获得瓜蒌皮提取液，并将其调配成瓜蒌皮注射液。该方法获得的瓜蒌皮提取液的收率低，含量不稳定。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，我们进行了大量的试验探索，发现一种新的获得瓜蒌皮提取液的方法，该方法采用常温超高压的方法获得瓜蒌皮提取液，该方法得率显著提高，产品含量稳定，由其制备的瓜蒌皮制剂质量稳定，安全性好。
具体而言，本发明提供了：
一种瓜蒌皮注射制剂，包括瓜蒌皮提取物，其中瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径小于等于250μm的瓜蒌皮粉末；
(b)将(a)中的粉末加入水中，在300～400MPa条件下提取5～8min，卸除压力，过滤后收集滤液，第一次浓缩至相对密度为1.1～1.3，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在3～5℃通过半透膜后，收集保留液，与氯仿-正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，保留液与氯仿-正丁醇的混合溶液体积比为4∶1～5∶1的，收集水层，第二次浓缩至相对密度为1.1～1.3，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为80～95％的乙醇，静置20～24h，离心后取上清液，第三次浓缩至相对密度为1.1～1.3，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为1～3。
所述半透膜选用22mm半透膜。
所述第一次浓缩、第二次浓缩或第三次浓缩为在50～60℃，真空度为0.04MPa的条件浓缩。
所述混合溶液中氯仿：正丁醇的体积比为5∶1。
步骤(c)中所述保留液与所述混合溶液的体积比为1∶1。
上述所述瓜蒌皮注射液，采用下述方法制得：
(a)用注射用水稀释瓜蒌皮提取液至每1ml相当于原生药5g；
(b)对步骤(a)的溶液进行去除热源和灭菌；
(c)灌封，灭菌即得。
上述所述的瓜蒌皮粉针剂的制备方法为：
(a)用注射用水稀释瓜蒌皮提取液至每1ml相当于原生药5g；
(b)将15g甘露醇加入到步骤(a)的溶液中，搅拌溶解；
(c)对步骤(b)的溶液进行去除热源和灭菌；
(d)对步骤(c)的溶液进行冷冻干燥或真空干燥，获得瓜蒌皮冻干粉针剂。
超高压提取(ultrahigh-pressure extraction，UHPE)，也成超高冷等静压提取，是指在常温下用100-1000MPa的流体静压力作用下提取溶剂和中药的混合液上，在预定压力下保持一段时间，是植物细胞内外压力里达到平衡后迅速去掉压力。由于细胞内外渗透压忽然增大，细胞膜的结构发生变化，是的细胞内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提取液中，达到提取中药有效成分的目的。
本发明采用Sevag法脱蛋白，Sevage法是指利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与氯仿-正丁醇混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与氯仿-正丁醇交界处。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
1、本方法获得的提取液中总氨基酸以精氨酸计大于等于20mg/ml；
2、本方法在常温下使用超高压可以快速、高效地获取瓜蒌皮提取液，相对于传统方法减少工序，超短了生产时间，降低生产成本低；
3、使用本发明所述的超高压提取方法，使瓜蒌皮提取液的得率高达7％以上；
4、使用本发明所述的超高压能耗低，提取过程在封闭系统下进行，降低污染发生率；
5、由本方法获得的提取液制得的注射剂，质量稳定，安全性高。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中的超高压提取采用DL700超高压等静压机(上海大隆机器厂)进行。
制备例
实施例1
瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径250μm的瓜蒌皮粉末；
(b)取(a)中的粉末100g加入500ml水在300MPa的条件下提取8min，卸除压力，过滤后收集滤液，滤液在50℃，真空度为0.08MPa第一次浓缩至相对密度为1.1，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在5℃用22mm半透膜透析后，收集保留液，与体积比为4∶1的氯仿-正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，收集水层，滤液在50℃，真空度为0.08MPa第二次浓缩至相对密度为1.1，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为95％的乙醇，静置20h，离心后取上清液，滤液在50℃，真空度为0.08MPa第三次浓缩至相对密度为1.1，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为1。
实施例2
瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径200μm的瓜蒌皮粉末；
(b)取(a)中的粉末100g加入600ml水在350MPa的条件下提取7min，卸除压力，过滤后收集滤液，滤液在55℃，真空度为0.08MPa，第一次浓缩至相对密度为1.13，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在4.5℃用22mm半透膜透析后，收集保留液，与体积比为4∶1的氯仿和正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，收集水层，滤液在55℃，真空度为0.08MPa第二次浓缩至相对密度为1.13，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为90％的乙醇，静置21h，离心后取上清液，滤液在55℃，真空度为0.08MPa第三次浓缩至相对密度为1.13，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为1.5。
实施例3
瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径150μm的瓜蒌皮粉末；
(b)取(a)中的粉末100g加入700ml水在350MPa的条件下提取6min，卸除压力，过滤后收集滤液，滤液在50℃，真空度为0.08MPa第一次浓缩至相对密度为1.2，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在3℃用22mm半透膜透析后，收集保留液，与体积比为5∶1的氯仿和正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，收集水层，滤液在50℃，真空度为0.08MPa第二次浓缩至相对密度为1.2，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为85％的乙醇，静置22h，离心后取上清液，滤液在50℃，真空度为0.08MPa第三次浓缩至相对密度为1.2，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为2。
实施例4
瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径100μm的瓜蒌皮粉末；
(b)取(a)中的粉末100g加入800ml水在400MPa的条件下提取5min，卸除压力，过滤后收集滤液，滤液在60℃，真空度为0.08MPa第一次浓缩至相对密度为1.25，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在3℃用22mm半透膜透析后，收集保留液，与体积比为5∶1的氯仿-正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，收集水层，滤液在60℃，真空度为0.08MPa第二次浓缩至相对密度为1.25，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为80％的乙醇，静置23h，离心后取上清液，滤液在60℃，真空度为0.08MPa第三次浓缩至相对密度为1.25，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为2.5。
实施例5
瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径220μm的瓜蒌皮粉末；
(b)取(a)中的粉末100g加入1000ml水在400MPa的条件下提取5min，卸除压力，过滤后收集滤液，滤液在60℃，真空度为0.08MPa第一次浓缩至相对密度为1.3，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在5℃用22mm半透膜透析后，收集保留液，与体积比为5∶1的氯仿和正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，收集水层，滤液在60℃，真空度为0.08MPa第二次浓缩至相对密度为1.3，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为80～95％的乙醇，静置24h，离心后取上清液，滤液在60℃，真空度为0.08MPa第三次浓缩至相对密度为1.3，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为3。
实施例6
取实施例1所得瓜蒌皮提取液，加入注射用水稀释至每1ml相当于原生药5g；去除热源和灭菌；灌封，灭菌即得。
实施例7
取实施例2所得瓜蒌皮提取液，加入注射用水稀释至每1ml相当于原生药5g；去除热源和灭菌；灌封，灭菌即得。
实施例8
取实施例3所得瓜蒌皮提取液，加入注射用水稀释至每1ml相当于原生药5g；去除热源和灭菌；灌封，灭菌即得。
实施例9
取实施例4所得瓜蒌皮提取液，加入注射用水稀释至每1ml相当于原生药5g；去除热源和灭菌；灌封，灭菌即得。
实施例10
取实施例5所得瓜蒌皮提取液，加入注射用水稀释至每1ml相当于原生药5g；去除热源和灭菌；灌封，灭菌即得。
试验例
一、含量测定
对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的精氨酸对照品250mg，置50ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备精密量取供试品1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法精密量取对照品溶液1ml、3ml，分别置50ml量瓶中，加水稀释至刻度。分别精密量取上述对照品溶液、供试品溶液各1ml，置25ml量瓶中，另以水作为空白溶液，分别加磷酸缓冲溶液(pH8.0，量取1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液95ml和1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液5ml，混匀)0.5ml，2％茚三酮溶液(称取水合茚三酮2g，加水50ml和氯化亚锡80mg，搅拌均匀。分次加少量水溶解，放于暗处静置24小时，滤过并加水至100ml)0.5ml，摇匀，置沸水浴中煮沸15分钟，取出，迅速冷却，加水稀释至刻度。照比色法(中国药典2010年版一部附录V B)，在570nm波长处分别测定吸收度，按外标两点法计算，即得。
表1含量测定结果
| 总氨基酸含量以精氨酸计(mg/ml) | |
| 实施例6 | 21.3 |
| 实施例7 | 20.4 |
| 实施例8 | 22.3 |
| 实施例9 | 23.2 |
| 实施例10 | 21.7 |
| ZL03129140 | 12.1 |
由上表可知，采用本发明所述方法提取的到瓜蒌皮提取液制得的注射液中总氨基酸的含量均在20mg/ml以上，且明显高于ZL03129140方法所得的注射液中总氨基酸的含量。
二、提取率比较试验
对比例：采用ZL03129140所述方法获得瓜蒌皮提取液，提取率1.51％。
本发明方法，如下
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径250μm的瓜蒌皮粉末；
(b)取(a)中的粉末100g加入800ml水在下述的条件下超高压提取一段时间，过滤后收集滤液，滤液在60℃，真空度为0.08MPa浓缩至相对密度为1.25，获得第一浸膏，测定第一浸膏中总氨基酸的提取率，结果如下：
表2不同压力下总感氨基酸提取率(温度25℃，提取时间5min)
| 序号 | 压力(MPa) | 提取率(％) |
| 1 | 200 | 2.81 |
| 2 | 250 | 3.25 |
| 3 | 300 | 7.36 |
| 4 | 350 | 7.42 |
| 5 | 400 | 7.48 |
| 6 | 450 | 5.22 |
| 7 | 500 | 5.17 |
| ZL03129140 | - | 1.51 |
由上表可知，当温度和提取时间保持不变时，在压力达到300MPa是提取率显著增加，在300-400MPa范围内提取保持稳定，当压力超过400MPa提取率下降。
表3不同提取时间下总感氨基酸提取率(温度25℃，压力350MPa，)
| 序号 | 提取时间(min) | 提取率(％) |
| 1 | 3 | 4.32 |
| 2 | 5 | 7.42 |
| 3 | 6 | 7.44 |
| 4 | 7 | 7.46 |
| 5 | 8 | 7.47 |
| 6 | 9 | 7.36 |
由上表可知，当温度和压力保持不变时，提取时间越长提取率越高，但当提取时间超过8分钟时，提取率降低，且有关物质增加。
3、稳定性试验
实施例6，实施例8与ZL03129140方法制得的样品分别于影响因素试验条件高温60℃、光照(5000lx)条件下放置10天，分别于5、10天后取样测定。检测性状、pH值、不溶性微粒、含量、有关物质，与0天样品比较。
表4稳定性评价结果(0天)
表5稳定性评价结果(5天)
表6稳定性评价结果(10天)
由上可知，经高温、光照后本发明产品稳定性优于ZL03129140所得产品。
三、药理实验
1、瓜蒌皮注射液对豚鼠离体心脏的作用
取实验用雄性豚鼠10只，体重400～500g，按Langendroff氏法进行离体心脏灌流。实施例6瓜蒌皮注射液用台氏溶液稀释，配成每毫升含生药2.5mg和5mg两种浓度，置灌流管内；对照液采用台氏溶液，置另一灌流管内。剥离豚鼠心脏，接上装置，待心搏与流量恒定后，分别以对照液和药液轮流灌入心脏，每两分钟收集流量一次，各灌流10min。结果如下。
表7瓜蒌皮注射液对豚鼠离体心脏冠脉流量的影响
综上，瓜蒌皮注射液使豚鼠离体心脏冠脉流量明显增加。
2、瓜蒌皮注射液对大鼠急性心肌缺血的保护作用
取体重140～200g的雄性大鼠，用30～50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后，仰卧固定，连接仪器，记录正常胸导联心电图，标准电压1毫伏等10mm，记录速度为50mm/s，选心电图正常者进行实验，实验分给药组和对照组，每组10只，按体重自尾静脉注射瓜蒌皮注射液62.5mg/kg，注射后3min自尾静脉注射脑垂体后叶素0.5单位/kg(在10s内注射完毕)，观察不同时间的心电图变化。
对照组，自尾静脉注射生理盐水62.5mg/kg，注射后3min自尾静脉注射脑垂体后叶素0.5单位/kg(在10s内注射完毕)，观察不同时间的心电图变化。
急性心肌缺血判断标准：于静脉注射脑垂体后叶素后，30s内S-T段升高1mm以上，或2分钟内S-T段下降0.5mm以上，或T波由直立变平坦、倒置，或出现严重心律失常(频发室性早搏，室性心动过速，各种传导阻滞)。
以不出现心肌缺血的动物只数与大鼠总只数之比，表示心肌缺血阴性率。
表8瓜蒌皮注射液对大鼠急性心肌缺血的影响
综上，对照组10只大鼠，其中3只出现S-T段升高3～5mm(在注射后叶素后15s至20s时出现)，6只在2分钟内T波由直立变平坦，1只33s及40s出现早搏，阴性率为0/7。用药组10只大鼠的心电图均未见心肌缺血表现，阴性率为10/10。从实验可知，瓜蒌皮注射液对脑垂体后叶素所致的心肌缺血有明显的保护作用。
Claims (8)
1.一种瓜蒌皮注射制剂，包括瓜蒌皮提取物，其特征在于瓜蒌皮提取物的制备方法为：
(a)将瓜蒌皮粉碎成粒径小于等于250μm的瓜蒌皮粉末；
(b)将(a)中的粉末加入水中，在300～400MPa条件下提取5～8min，卸除压力，过滤后收集滤液，第一次浓缩至相对密度为1.1～1.3，获得第一浸膏；
(c)取所述第一浸膏在3～5℃通过半透膜后，收集保留液，与氯仿-正丁醇的混合溶液反应脱蛋白，保留液与氯仿-正丁醇的混合溶液体积比为4∶1～5∶1的，收集水层，第二次浓缩至相对密度为1.1～1.3，获得第二浸膏；
(d)取所述第二浸膏加入浓度为80～95％的乙醇，静置20～24h，离心后取上清液，第三次浓缩至相对密度为1.1～1.3，获得第三浸膏，过滤后收集滤液，即得；以g/ml计，所述第二浸膏与乙醇的质量体积比为1～3。
2.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其特征是，步骤(b)中，以g/ml计，所述瓜蒌皮粉末与水的质量体积比为1∶5～10。
3.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其特征是，所述半透膜选用22mm半透膜。
4.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其特征是，所述第一次浓缩、第二次浓缩或第三次浓缩为在50～60℃，真空度为0.04MPa的条件浓缩。
5.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其特征是，所述混合溶液中氯仿：正丁醇的体积比为5∶1。
6.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其特征是，步骤(c)中所述保留液与所述混合溶液的体积比为1∶1。
7.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其中注射液的制备方法为：
(a)用注射用水稀释瓜蒌皮提取液至每1ml相当于原生药5g；
(b)对步骤(a)的溶液进行去除热源和灭菌；
(c)灌封，灭菌即得。
8.根据权利要求1所述的一种瓜蒌皮注射制剂，其中粉针剂的制备方法为：
(a)用注射用水稀释瓜蒌皮提取液至每1ml相当于原生药5g；
(b)将15g甘露醇加入到步骤(a)的溶液中，搅拌溶解；
(c)对步骤(b)的溶液进行去除热源和灭菌；
(d)对步骤(c)的溶液进行冷冻干燥或真空干燥，获得瓜蒌皮冻干粉针剂。
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