CN102860512A - 一种乌鸡肽铁螯合物生物补铁剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乌鸡肽铁螯合物，包括在乌鸡肽溶液中加入抗坏血酸，并且在pH3-6的条件下，将乌鸡肽溶液与亚铁盐恒温下螯合。通过傅里叶红外光谱对螯合物进行结构鉴定，乌鸡肽铁螯合物中亚铁离子与多肽中NH²⁺以及-COO^-形成配位键，说明乌鸡肽铁螯合物是一种新型肽铁螯合物。本发明制备原料安全无毒，制备过程无有害物质产生，并且工艺简便、成本低廉，可应用于补铁剂等功能性食品和保健品的制备。

Description

一种乌鸡肽铁螯合物生物补铁剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种乌鸡肽铁螯合物生物补铁剂的制备方法，属于现代食品加工生物技术领域。

背景技术

铁是人体必需的化学元素之一，人体缺铁或铁利用不良时会影响血红蛋白的合成，引起缺铁性贫血(iron deficiency anemia，IDA)。缺铁性贫血对人体有很大的危害，缺铁会显著降低小儿的智力和生长发育，使人的免疫功能、体力、耐力下降；流行病学调查显示母亲贫血与低体重儿、早产儿和产期婴儿的死亡率相关。全世界约有10％～30％的人群有不同程度的缺铁，其中多为妇女、儿童和老人，而在发展中国家这个比例会更高。目前利用补铁剂强化食品是防治IDA的主要手段。硫酸亚铁等非血红素铁价格低廉，但易与食物中植酸、多酚等成分形成难溶性化合物，吸收率较低，并易产生内源性自由基导致细胞膜脂质过氧化。血红素铁比非血红素铁的利用率高，但最高也只达25％左右并具有异味。我国目前大部分补铁剂吸收利用率较低，有一定毒副作用，寻求一种口感好、高吸收、安全无毒副作用的补铁剂非常必要。

活性肽铁是以蛋白质水解产生的分子活性肽为原料，与铁离子络合形成的螯合物。与氨基酸相比，肽的吸收效率更高且不易饱和。以活性肽为原料开发吸收利用率更高、生理作用更强的新型补铁剂，正成为目前国内外研究的一个热点。目前国内此类专利申请，如乳蛋白酶解液与亚铁盐螯合(200810240344.4)、酪蛋白肽螯合铁(201010040074.X)、椰子球蛋白亚铁络合物制备补铁剂(201010203183.9)、卵铁离子传递蛋白补铁剂(200610012762.9)等，然而，这些物质多属于蛋白酶解物与铁的螯合，组成成分的分子量不清，而一般蛋白酶解物的分子量常高于5000Da，在人体吸收利用率和生理活性方面差强人意。此外，目前专利在铁螯合物的制备上常忽视对亚铁离子易氧化成为三价铁离子的防护，而三价铁离子螯合物与二价铁离子相比具有吸收利用率低、易产生氧化损伤的劣势。

乌鸡是我国家禽品种基因库中具有特殊经济价值的珍禽，具有特殊的营养滋补与药用价值。《本草经疏》记载：“乌骨鸡补血益阴，则虚劳赢弱可除；阴回热去，则津液自生，渴白止矣；阴平阳秘，表里固密，邪恶之气不得入，心腹和而痛自止。益阴，则冲、任、带三脉俱旺，故能除崩中带下一切虏损诸疾也。”说明乌鸡有补血益阴、除虑退热之功效。可见，乌鸡为补血益阴之上品。乌鸡主要化学成分为蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、镁、维生素B1、B2等。乌鸡鲜肉中含17种氨基酸，其中13种氨基酸含量较高，是获取生物活性肽的宝贵资源。传统中医理论表明，乌鸡具有补血、益气、滋阴等功效，近期研究还证实具有抗氧化、延缓衰老、增强抗诱变能力以及提高免疫的作用。

乌鸡肽，又称乌鸡低聚肽，是以乌鸡蛋白为原料，酶解后获得的低分子量肽产物。低聚肽吸收速度快、耗能低、易于被人体消化、吸收和利用，具有降血压、抗氧化、抗疲劳、免疫调节等重要的生理活性。

《乌鸡低聚肽体外抗氧化活性研究》(《食品与发酵工业》，2010年第36卷第10期，2010/10，P19-22，刘文颖等)中对乌鸡低聚肽的理化成分、分子量分布、氨基酸组成、自由基清除作用、还原能力等进行了深入报道。研究表明，乌鸡肽中小分子蛋白质含量较高、分子量大多1000Da以下，含量最高的是140-500Da小肽，富含抗氧化性氨基酸，具有较强的清除自由基能力和还原能力。

中国专利申请201110131377.7“一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法”，公开了一种乌鸡低聚肽的制备方法，包括前处理、酶解、分离提纯、干燥制得的粉末状产品，相对分子质量低于1000Da的活性肽比例占90％以上，具有抗氧化、降血压等生物活性。

发明内容

本发明的目的在于利用小分子的乌鸡低聚肽与亚铁盐进行螯合，提供一种新型乌鸡肽铁螯合物的制备方法。本发明补铁剂生物吸收利用率高，由于小分子乌鸡肽的络合和促进吸收作用，具有补铁率高的优势，还具有抗氧化、免疫调节的功能。

本发明是通过将乌鸡肽溶液与亚铁盐恒温下螯合来实现的。因此，本发明制备方法的技术方案包括：在乌鸡肽溶液中加入抗坏血酸，并且在pH3-6的条件下，将乌鸡肽溶液与亚铁盐恒温下螯合。

本发明方法中，关键是乌鸡肽与亚铁离子的螯合步骤中，添加抗坏血酸，并且螯合过程在pH3-6下恒温进行，以便防止亚铁离子被氧化为三价铁离子。

具体说，本发明提供一种乌鸡肽铁螯合物的制备方法，包括如下步骤：

1)配制：配制乌鸡肽溶液；

2)螯合：加入抗坏血酸，加入亚铁盐，调节pH值至3-6，恒温下螯合；

3)沉淀：将螯合液用无水乙醇进行沉淀，得到乌鸡肽铁螯合物。

其中，乌鸡肽与亚铁离子的螯合需要在溶液中进行，可以直接使用乌鸡肽溶液来实施本发明方法。通常，乌鸡肽产品是以乌鸡肽干粉的形式存在，因此需要进行乌鸡肽溶液的配制。溶液的配置可以按照常规方法配制，例如，称取一定量的乌鸡肽置于反应容器中，加入定量水，搅拌使其充分溶解。

乌鸡肽的浓度可以是任意的，只要是肽螯合铁技术中的常用的肽溶液浓度即可。

在一个特别优选的实施方案中，将乌鸡肽与水按照2∶100-6∶100比例进行配制，制得浓度为2％-6％(单位为g/mL)的乌鸡肽溶液，更有利于乌鸡肽与亚铁离子的充分有效螯合。首选，乌鸡肽的浓度为3％-5％。

螯合亚铁离子的步骤中，首先加入一定质量的抗坏血酸，溶解于乌鸡肽溶液中，防止后面加入的亚铁离子在溶液中被氧化为三价铁离子，抗坏血酸是很好的抗氧化剂。抗坏血酸的浓度是本领域技术人员任意选择的，只要达到能够防止亚铁离子在溶液中被氧化为三价铁离子的浓度即可。

在一个特别优选的实施方案中，加入抗坏血酸于乌鸡肽溶液中溶解，使其在溶液中的浓度达到0.5％-1.5％(重量百分比)，浓度过高容易影响乌鸡肽与亚铁离子的螯合效果，浓度过低不能充分防止亚铁离子的氧化，首选，抗坏血酸在乌鸡肽溶液的浓度是0.8％-1.2％。

然后，加入亚铁盐，搅拌使其充分溶解，调整pH值为3-6，恒温进行螯合反应。

乌鸡肽与亚铁盐的比例可以是任意的，只要是肽螯合铁技术中的常用比例即可。在一个特别优选的实施方案中，乌鸡肽与亚铁盐的质量比为3∶1-1∶1。

螯合反应在恒温下进行是必需的，如果需要的话，反应过程中可以保持密闭环境，以避免亚铁离子被氧化。螯合反应的温度和时间是本领域技术人员可以确定的，可以在肽螯合铁技术中的常用条件范围内选择，能够达到肽与亚铁离子的螯合即可。

优选，螯合在30-60℃下恒温反应20-40min。

本发明螯合步骤中所用的亚铁盐可以是本领域常用的任何亚铁盐，优选选自硫酸亚铁或氯化亚铁。

沉淀步骤包括将螯合液用无水乙醇进行沉淀，沉淀的目的是用无水乙醇对螯合物进行沉淀洗涤，以便除去未反应的游离亚铁离子。

无水乙醇的添加量可以是任意的，只要能够达到去除游离亚铁离子的效果即可。在一个优选方案中，用螯合液2-4倍体积的无水乙醇进行沉淀，沉淀过程可以是静置沉淀1-2h，得到乌鸡肽铁螯合物沉淀物，

在本发明的一个优选方法中，在螯合步骤2)和沉淀步骤3)之间包括浓缩步骤，即螯合之后将螯合液浓缩，然后再进行沉淀处理。

具体说，浓缩步骤包括将螯合液冷却，在45-55℃下将螯合液浓缩，以便更有利于进行沉淀处理。

为使产品易于销售或保存，优选，将获得的螯合物进行干燥，得到乌鸡肽铁螯合物干粉。

本发明中获得的乌鸡肽铁螯合物中铁离子含量经检测为95.9-124.55mg/g，溶解性实验表明，乌鸡肽铁螯合物在中性水溶液中溶解度较小，在弱碱条件下溶解度增加。溶液澄清透明，呈淡黄褐色。

经红外光谱鉴定分析表明，本发明中获得的乌鸡肽铁螯合物中亚铁离子与乌鸡肽中NH²⁺以及-COO^-形成配位键，是一种新型肽铁螯合物。

因此，本发明还提供一种通过本发明方法或任一种优选方法制备而成的乌鸡肽铁螯合物。

本发明的乌鸡肽铁螯合物相比现有技术中的蛋白酶解物与铁的螯合物，具有补铁效果好和生物吸收快的有益效果。研究表明，人体摄入的蛋白主要是以多肽形式从肠道直接吸收。与整蛋白和氨基酸相比，小分子短肽的吸收效率更高且不易饱和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一组成的氨基酸。小肠粘膜上短肽载体的发现以直接证据证实了二肽和三肽能被完整吸收的观点。研究认为，动物体内对蛋白酶解产物的氨基酸吸收强度比相应游离氨基酸高70-80％。短肽载体的吸收能力可能高于各种氨基酸载体吸收能力的总和。现有技术中的蛋白酶解物与铁的螯合物，其中的蛋白酶解物分子量常高于5000Da，而乌鸡肽中小分子蛋白质分子量大多1000Da以下，因此，在人体吸收利用率和生理活性方面，现有技术的蛋白酶解物与铁的螯合物，远低于分子量小于1000Da的乌鸡肽与铁的螯合。

本发明的乌鸡肽铁螯合物可以按照常规技术制备成口服液、片剂、胶囊、口服颗粒剂等剂型。

本发明的乌鸡肽铁螯合物中，乌鸡活性肽能够显著提高小鼠红细胞和血红蛋白水平，并且提高速度明显高于阿胶处理，具有明显的补血作用。因此，本发明的乌鸡肽铁螯合物用于制备口服液、片剂、胶囊、颗粒剂，以小分子乌鸡肽作为新型补铁剂的原料，能够利用乌鸡的补血功效，并充分结合小分子活性肽的吸收利用率优势，以及乌鸡肽本身的生物活性，是具有增强生物吸收和补铁效果的新型补铁剂。

附图说明

图1是本发明方法制备的乌鸡肽铁螯合物的乌鸡肽螯合亚铁离子前后的红外光谱的谱图对比，横坐标是红外波长，纵坐标是透光率。

具体实施方式

下面将通过具体的实施例对本发明作进一步的详细描述，但不限制本发明的范围。

实施例1

乌鸡肽溶液的配制：称取10.0g的乌鸡肽置于反应容器中，加入250mL蒸馏水，搅拌溶解得到浓度为4％的乌鸡肽溶液。

螯合亚铁离子：称取2.5g的抗坏血酸，溶解于乌鸡肽溶液中使其浓度达到1.0％，防止亚铁离子氧化，加入10g氯化亚铁，使混合溶液中乌鸡肽与氯化亚铁的质量比为1∶1。搅拌使其充分溶解反应，调节保持溶液pH值为5，将液体置于30℃反应罐中反应40min，反应保持密闭环境避免亚铁离子被氧化。

浓缩：反应液静置冷却，置于真空浓缩设备中，利用真空浓缩设备在45℃下将反应液体积缩小。

沉淀及干燥：在浓缩液中按照1∶4的体积比加入无水乙醇，单位为mL/mL，放置在室温中沉淀2h，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到乌鸡肽铁螯合物干粉。

在上述条件下所得的补铁剂原粉为青灰色粉末，铁离子含量为124.55mg/g，产品无异味，弱碱性条件下溶于水呈淡黄褐色透明溶液。

实施例2

乌鸡肽溶液的配制：称取5kg乌鸡肽置于反应罐中，加入100L蒸馏水，搅拌溶解制备成5％的乌鸡肽溶液。

螯合亚铁离子：称取0.8kg的抗坏血酸，溶解于乌鸡肽溶液中使其浓度达到0.8％，防止亚铁离子氧化，称取2.5kg硫酸亚铁加入混合溶液中，使混合溶液中乌鸡肽与硫酸亚铁的质量比为2∶1，搅拌使其溶解。调节pH值使其保持在6左右，搅拌使其在40℃下充分反应30min。反应过程中保持密闭环境防止亚铁离子接触空气氧化。

浓缩：反应液静置冷却，转置于真空浓缩设备中，利用真空浓缩设备在50℃下将反应液体积缩小。

沉淀及干燥：在浓缩液中按照1∶2的比例加入无水乙醇，单位为L/L，放置在室温中沉淀1h，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到乌鸡肽铁螯合物原粉。

在上述条件下所得的补铁剂原粉为青灰色粉末，铁离子含量为95.90mg/g，产品无异味，弱碱性条件下溶于水呈淡黄褐色透明溶液。

可以将该乌鸡肽铁螯合物原粉按照常规方法制成口服液补铁剂。

实施例3

乌鸡肽溶液的配制：称取3.0kg的乌鸡肽置于反应容器中，加入100L蒸馏水，搅拌溶解得到浓度为3％的乌鸡肽溶液。

螯合亚铁离子：称取1.2kg的抗坏血酸，溶解于乌鸡肽溶液中使其浓度达到1.2％，防止亚铁离子氧化，加入1.0kg氯化亚铁，使混合溶液中乌鸡肽与氯化亚铁的质量比为3∶1。搅拌使其充分溶解反应，调节保持溶液pH值为3，将液体置于60℃反应罐中反应20min，反应保持密闭环境避免亚铁离子被氧化。

沉淀及干燥：在螯合液中按照1∶3的体积比加入无水乙醇，单位为L/L，放置在室温中沉淀2h，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到乌鸡肽铁螯合物干粉。

在上述条件下所得的补铁剂原粉为青灰色粉末，铁离子含量为99.40mg/g，产品无异味，弱碱性条件下溶于水呈淡黄褐色透明溶液。

可以将该乌鸡肽铁螯合物原粉按照常规方法制成胶囊补铁剂。

实施例4

乌鸡肽溶液的配制：称取2g乌鸡肽置于反应罐中，加入100mL纯净水，搅拌溶解制备成2％的乌鸡肽溶液。

螯合亚铁离子：称取0.5g的抗坏血酸，溶解于乌鸡肽溶液中使其浓度达到0.5％，防止亚铁离子氧化，称取2g氯化亚铁加入混合溶液中，使混合溶液中乌鸡肽与硫酸亚铁的质量比为1∶1，搅拌使其溶解。调节pH值使其保持在6左右，搅拌使其在35℃下充分反应30min。反应过程中保持密闭环境防止亚铁离子接触空气氧化。

浓缩：反应液静置冷却，转置于真空浓缩设备中，利用真空浓缩设备在55℃下将反应液体积缩小。

沉淀及干燥：在浓缩液中按照1∶3的比例加入无水乙醇，单位为mL/mL，放置在室温中沉淀1h，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到乌鸡肽铁螯合物原粉。

在上述条件下所得的补铁剂原粉为青灰色粉末，铁离子含量为120.50mg/g，产品无异味，弱碱性条件下溶于水呈淡黄褐色透明溶液。

可以将该乌鸡肽铁螯合物原粉按照常规方法制成颗粒补铁剂。

实施例5

乌鸡肽溶液的配制：称取6kg乌鸡肽置于反应罐中，加入100L纯净水，搅拌溶解制备成6％的乌鸡肽溶液。

螯合亚铁离子：称取1.5kg的抗坏血酸，溶解于乌鸡肽溶液中使其浓度达到1.5％，防止亚铁离子氧化，称取2kg硫酸亚铁加入混合溶液中，使混合溶液中乌鸡肽与硫酸亚铁的质量比为3∶1，搅拌使其溶解。调节pH值使其保持在6左右，搅拌使其在35℃下充分反应30min。反应过程中保持密闭环境防止亚铁离子接触空气氧化。

沉淀及干燥：在螯合液中按照1∶4的比例加入无水乙醇，单位为L/L，放置在室温中沉淀1h，并用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到乌鸡肽铁螯合物原粉。

试验表明，在上述条件下所得的补铁剂原粉为青灰色粉末，铁离子含量为113.65mg/g，产品无异味，弱碱性条件下溶于水呈淡黄褐色透明溶液。

可以将该乌鸡肽铁螯合物原粉按照常规方法制成片剂补铁剂。

实施例6

将实施例1制备所得的乌鸡肽铁螯合物原粉与乌鸡肽原粉分别制备固体压片，通过傅里叶红外光谱仪，扫描得红外光谱图(图1)。

图1的红外光谱分析表明：

乌鸡肽铁螯合物是一种新型肽铁螯合物。乌鸡肽与其亚铁螯合物吸收峰相比，在强弱和位置上有明显的变化。乌鸡肽铁螯合物在3030cm^-1的铵峰消失，而在1046cm^-1处出现了吸收峰，说明Fe²⁺与氨基有较强结合。在乌鸡肽IR图谱中3385cm^-1处有宽吸收峰(OH与NH伸缩振动频率重叠)，同时处在924cm^-1处有吸收峰，说明含有-COOH。乌鸡肽螯合铁IR图谱中3385cm^-1处的宽吸收峰变窄，且955-915cm^-1没有吸收峰，说明乌鸡肽螯合铁图谱中没有-COOH结构，推测羧基也以共价键的方式与铁离子结合。综上所述，乌鸡肽铁螯合物中亚铁离子与乌鸡肽中NH²⁺以及-COO^-形成配位键，是一种新型的肽铁螯合物。

Claims (9)

1.一种乌鸡肽铁螯合物的制备方法，其特征在于该方法包括在乌鸡肽溶液中加入抗坏血酸，并且在pH3-6的条件下，将乌鸡肽溶液与亚铁盐恒温下螯合。

2.根据权利要求1的制备方法，包括如下步骤：

1)配制：制得乌鸡肽溶液；

2)螯合：加入抗坏血酸，加入亚铁盐，调节pH值至3-6，恒温下螯合；

3)沉淀：将螯合液用无水乙醇进行沉淀，得到乌鸡肽铁螯合物。

3.根据权利要求1或2的制备方法，其中配制步骤中，乌鸡肽溶液浓度为2％-6％(g/mL)，优选乌鸡肽的浓度为3％-5％。

4.根据权利要求1或2的制备方法，其中螯合步骤包括：加入抗坏血酸使其浓度达到0.5％-1.5％，优选0.8％-1.2％；乌鸡肽与亚铁盐质量比为3∶1-1∶1，螯合反应在30-60℃下恒温反应20-40min。

5.根据权利要求1或2的制备方法，其中沉淀步骤包括：用浓缩液2-4倍体积的无水乙醇进行沉淀。

6.根据前述任一项权利要求的制备方法，其中在步骤2)之后包括浓缩步骤，将螯合液浓缩后再进行沉淀处理。

7.根据前述任一项权利要求的制备方法，其中将得到乌鸡肽铁螯合物沉淀物干燥成乌鸡肽铁螯合物干粉。

8.一种乌鸡肽铁螯合物，其特征在于是按照权利要求1-7中任一项所述的乌鸡肽铁螯合物的制备方法制备。

9.权利要求8的乌鸡肽铁螯合物在制备口服液、片剂、胶囊、颗粒剂补铁剂型中的用途。

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