CN102836175A - 人工熊胆 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种人工熊胆，该人工熊胆的配方中包括的组份及其质量百分比如下：牛磺熊去氧胆酸钠35～48，混合胆素50～63，氨基酸1～3，微量元素0.5～1；所述的混合胆素为禽胆汁中的一种或几种的混合物、和牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁、狗胆汁中的一种或几种的混合物。本发明人工熊胆粉整体药理学试验证明，镇痛、镇静、抗惊厥、抗炎、保肝利胆等方面具有与天然熊胆相似的药理作用，完全可以替代天然熊胆粉，可以实现工业化生产，而且价格较天然(引流)熊胆粉低，易被接受。另外，分子药理学实验还证实了本发明人工熊胆粉具有抑制MGc80-3肿瘤细胞生长和增殖作用。

Description

人工熊胆

技术领域

本发明涉及熊胆技术领域，特别是指一种人工熊胆。

背景技术

熊胆与牛黄、麝香并称为中药三件宝。熊胆为熊科动物黑熊(Selensrctosthibetsuns cuvier)或棕熊(vrsus actos L.)的干燥胆，始载于《唐本草》一向以贵重药材而闻名，其味苦无毒，有清肝明目，抗菌消炎，利胆排石，扩冠降脂等功效，用于惊风抽搐、目赤、咽喉肿痛、胆结石、心血管疾病、病毒感染等病症。熊胆是我国中医药临床的传统中药，用途广泛，疗效显著。传统方法是冬季捕获剖腹取胆，一熊一胆，导致现在野生熊类资源枯竭。为了保护熊类，八十年代人们发明了养熊活体引流取胆的方法，目前市场上流通的熊胆粉基本都是人工活熊引流熊胆汁干燥粉，其有效成分接近于天然熊胆粉。随着人们动物保护意识的提高，取缔养熊取胆业已成为当今热门话题，我国政府也逐步加强了对野生熊类资源的保护工作，大力支持天然熊胆的替代品研究工作，不久的将来，引流取胆的做法将被取缔，因而人工合成熊胆是一种既能满足临床用药需要，又能彻底保护熊类资源不被破坏的根本方法，即符合世界动物保护潮流，又符合国家政策、法规支持、保护的范畴。象人工牛黄、人工麝香一样，熊胆的人工制成品的开发研制乃当务之急，意义重大，前景十分广阔。

理想的人工熊胆应该是成分含量比例与天然品一致，原料来源廉价易得，制作工艺简单，成本低于天然品等。近年来涉及人工熊胆的制造思路总计有5个专利文献，按申请年限顺序排列如下：

(1)CN1357334A 2002-7-10，章贵荣等《人造熊胆粉》方法是用禽胆汁在强氧化剂和还原剂的作用下，将胆汁中的牛磺鹅去氧胆酸转化成牛磺熊去氧胆酸，然后添加胆汁色素、胆汁酸成分，加工配制成人造熊胆粉。该法的优点是改变了以往从鸡胆中提取鹅去氧胆酸，再转化成熊去氧胆酸的常规做法，而是直接由胆汁直接转化，而且不破坏结合型胆汁酸成分，思路较新颖。缺点是鸡胆中胆汁酸不仅含有牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸，同时还含有甘氨鹅去氧胆、甘氨胆酸、甘氨去氧胆酸等成分，在氧化、还原反应下，其他杂质成分也同时参与转化，杂质成分也在不断放大，最后体系成分复杂，使该人造熊胆的成份、含量及其比列很难与天然品一致。

(2)CN1465384A 2004-1-7，江崇波《人工熊胆及其制造方法》是将牛磺熊去氧胆酸钠、混合胆素、多种氨基酸、矿质元素等通过一定工艺，制成人工熊胆。该法制成的人工熊胆与天然品有着相同、相似的理化性状，各种成分的含量比例用红外和液相检测图谱显示与天然品极为相似。

(3)CN1513480A 2004-7-21杨泽民等《人工熊胆》方法是将牛磺熊去氧胆酸钠、鸡胆膏、胆红素混合制成人工熊胆。其方法先进处是利用鸡胆中胆汁酸成分绝大多数与天然熊胆相似特性，采用鸡胆膏做基质，可以补充大量已知未知成分，而且大大降低了配方成本。缺点是鸡胆中含有大量蛋白成分，不经处理直接做人工熊胆成分添加，会导致成分中胆汁酸、氨基酸、胆色素等组分与鸡胆一致，而与熊胆差别很大，添加胆红素系来源于其它动物源，其提取纯化后成本不菲，会高于一般人工活熊引流熊胆。

(4)CN102058621A 2011-5-18陈宝香《人工熊胆》，专利方法是利用兔胆、鸡胆、鸭胆、鹅胆混合而成制成人工熊胆。缺点是牛磺熊去氧胆酸含量极低，远远达不到熊胆粉目前2010版规定的30％以上标准，还含有过量的石胆酸等有细胞毒性的有害物质，其组分与熊胆粉相似，但含量比例与天然熊胆有明显差别。

(5)CN101721428A 2010-6-9傅军《人工熊胆的合成新技术》方法是将处理过的禽胆添加牛磺熊去氧胆酸、氨基酸、微量元素等制成人工熊胆。该申请的配方工艺路线方法与以上(2)法完全一致。

发明内容

本发明提出一种人工熊胆，该人工熊胆在CN1465384A2004-1-7的基础上，根据天然熊胆胆汁酸、胆色素、氨基酸、微量元素等有效成分，采用几种天然动物胆汁相似的成分进行分离纯化筛选基质物质，进一步补充添加不足的功能成分，这样合成的人工熊胆不仅成本低廉，而且能够替代天然熊胆。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种人工熊胆，其特征在于，该人工熊胆的配方中包括的组份及其质量百分比如下：

所述的混合胆素为禽胆汁中的一种或几种的混合物、和牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁、狗胆汁中的一种或几种的混合物。

作为优选的技术方案，所述人工熊胆的配方中包括的组份及其质量百分比如下：

此配方更接近于天然熊胆。

天然熊胆的化学成分很复杂，种属、产地及捕杀季节不同，差异很大。归纳有以下几类：

①胆汁酸类牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸，及微量的牛磺去氧胆酸或甘氨去氧胆酸，还有部分以上单体分解物。

②氨基酸类赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、牛磺酸等

③胆色素类胆红素、胆绿素等

④其他类胆固醇、脂肪、磷脂、无机盐等

其中胆汁酸中，含游离型和结合型熊去氧胆酸占17％～74％，其中牛磺熊去氧胆酸含量占总胆酸的45％～70.9％。普遍认为牛磺熊去氧胆酸是解痉作用的主要成分，也是含量最多的特征成分。

禽胆汁含有多种有效成分，主要含牛磺(甘氨)鹅去氧胆酸、牛磺(甘氨)胆酸、牛磺(甘氨)去氧胆酸、别胆酸、胆绿素、粘蛋白、无机盐等。

羊胆汁主要成分有胆汁酸盐、胆色素(胆红素、胆绿素)、粘蛋白、胆甾醇等。其中胆酸为1，0％～23.4％，去氧胆酸1.4～7.6％，鹅去氧胆酸0.4％～9.6％，胆甾酸总量3.5％～32.1％。羊胆中含胆酸与去氧胆酸，含胆红素也含胆绿素。羊胆中胆酸含量比牛胆高。羊胆汁中，牛磺酸结合型胆汁酸含量比牛胆汁高。

兔胆的主要胆汁酸为去氧胆酸、胆酸二者的比例为9∶1，还含有胆绿素。兔胆和熊胆在镇静、镇咳、抗电惊厥、对心脏正性肌力作用、常压耐缺氧以及对小鼠胃肠推进等项药理作用方面相似或强于熊胆。故从药理学角度，兔胆与熊胆作用相似。

狗胆在色泽、荧光、入水现象等方面与熊胆有着极大的相似性。狗胆汁中含牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸及牛磺石胆酸、胆红素等，狗胆汁中含有20种人体需要的氨基酸，其中16种氨基酸超过猪胆中同种氨基酸的含量，还有2种氨基酸超过熊胆中同种氨基酸的含量，其中牛磺酸含量最高(12.62％)。据有关报道显示，各种动物胆汁中胆红素，乳牛及狗含量最高，猪胆次之，牛胆汁再次之。狗胆中含有9种人体必需的微量元素，其中钙与铜含量超过熊胆与猪胆。对增加心肌收缩力，增加冠状动脉血流量有着重要意义。

作为优选的技术方案，所述的禽胆汁为鸡胆汁、鸭胆汁或鹅胆汁。

作为优选的技术方案1，所述混合胆素为鸡胆汁、鸭胆汁、牛胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶1～1.5∶0.5～0.8∶1～1.5。

作为优选的技术方案2，所述混合胆素为鸡胆汁、鹅胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶3～4∶0.5～0.7∶0.5～0.7∶1～1.2∶2～2.5。

作为优选的技术方案3，所述混合胆素为鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶0.5～0.8∶1～1.2∶0.5～0.8∶1～1.2∶2～2.5。

作为优选的技术方案4，所述混合胆素为鸡胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶0.5～0.8∶1～1.2∶0.5～0.8∶2。

上述的混合胆素，其制备方法包括：

将禽胆中的1种以上、和牛羊胆、兔胆、狗胆中的一种或几种的混合物破碎，滤布压分别滤，收集胆汁，冷藏去油脂，利用PH值的变化分离析出蛋白质、多糖、脂肪等杂质成分，加热变性物理法离心去出杂质，离心液真空浓缩成稠膏备用。

作为优选的技术方案，所述的牛磺熊去氧胆酸钠的制备方法，包括：

(1)取喹啉和二甲基甲酰胺混合，在0～5℃下不断搅拌，加入氯甲酸乙酯，搅拌均匀后，滴加到冰浴中的KOH溶液中，搅拌反应10min～20min，用二氯甲烷萃取，去水相，有机相干燥，过滤，减压浓缩，加入无水乙醇和无水乙醚，搅拌下加入三氟化硼乙醚试剂，保持温度30～40℃反应4h～5h，静置分层，收集乙醚层，减压蒸馏，收集125～130℃/15Pa馏分，得蜡状物EEDQ mp56～58℃；

(2)熊去氧胆酸和牛磺酸在碱性条件下采用步骤(1)制得的EEDQ缩合剂(N-ethoxy-carbonyl-ethoxy-1，2-dihydro-quinoline)进行缩合反应，即得磺熊去氧胆酸钠。

作为优选的技术方案，所述步骤(1)中的喹啉与二甲基甲酰胺的比例为8～12∶40～60(g/mL)；所述喹啉与氯甲酸乙酯的质量比为8～12∶7～11；所述喹啉与无水乙醇的比例为8～12∶8～12(g/mL)；所述无水乙醇与无水乙醚的体积比为8～12∶40～60；所述三氟化硼乙醚试剂与无水乙醇的体积比为0.15～0.25∶8～12。

所述步骤(2)具体如下：称取5mmol熊去氧胆酸与6.5mmolEEDQ，加入10mlDMF溶液中搅拌溶解，将6mmol牛磺酸与0.9ml三乙胺分别加入上述溶解液中，不断搅拌反应，反应物在90℃搅拌回流1h后去热源，再搅拌1h至室温，用冷乙醚结晶，冷藏过夜。过滤，沉淀物用乙醚洗涤，溶于30ml二氯甲烷中，过滤除不溶物，在0℃左右将澄清液慢慢加入120ml乙醚后过滤，沉淀用乙醚洗涤后溶于30ml 0.2mol/LNaOH甲醇溶液中，搅拌下加入100ml乙醚，产生大量白色絮状沉淀，用乙醚洗后真空干燥得白色粉末牛磺熊去氧胆酸钠。

上述方案将EEDQ试剂自行合成，较好的解决了价格昂贵问题，反应条件温和可控。

作为优选的技术方案，所述的牛磺熊去氧胆酸钠的另一种制备方法，包括：

(1)以熊去氧胆酸为原料，经过乙酰化、酰氯化反应得到混合酸酐溶液；

(2)将牛磺酸溶于碳酸钠溶液中，得到牛磺酸的碳酸钠溶液；将所述牛磺酸的碳酸钠溶液滴加到步骤(1)中的混合酸酐溶液中，搅拌，滤除沉淀得滤液；

(3)将步骤(2)中的滤液的pH调整为6～7，浓缩干燥得牛磺熊去氧胆酸粗品干燥物；

(4)将步骤(3)中的浓缩干燥物脱盐纯化和重结晶，即得牛磺熊去氧胆酸。

作为优选的技术方案，所述步骤(1)中的乙酰化、酰氯化的具体过程如下：

在反应釜中加入质量比为8～10∶1的丙酮和熊去氧胆酸，分散均匀，冷却至-5～-10℃，得到冷却后的混合液；向冷却后的混合液中滴加用丙酮稀释后的三乙胺溶液，滴加完毕后再滴加氯甲酸乙酯，继续在-5～-10℃搅拌，过滤，过滤后的滤液即为混合酸酐溶液；其中三乙胺与熊去氧胆酸的质量比为2～3∶10；三乙胺与用于稀释的丙酮的体积比为3∶2；所述步骤(3)使用盐酸调节pH；

所述步骤(3)中的浓缩干燥为：将调节pH后的滤液蒸干，然后在70℃～90℃下减压抽干；所述脱盐纯化的具体过程如下，向步骤(3)中的牛磺熊去氧胆酸粗品干燥物中加入无水乙醇，70～90℃回流处理，待盐松散后过滤，除盐和未反应的牛磺酸，在滤液搅拌下加入乙酸乙酯-丙酮混合溶液中，剧烈搅拌，产生白色沉淀，室温下静置12h～24h，吸取上层液，过滤收集滤饼；其中牛磺熊去氧胆酸粗品干燥物与无水乙醇的质量体积比1∶4～5g/L；所述重结晶的具体过程如下：将所述滤饼用水溶解，再加入丙酮溶液中搅拌，2℃～5℃冷藏8～12h，过滤得白色浆状物，70～90℃真空干燥，粉碎；其中水与丙酮溶液的体积比为1∶5～10。

进一步的，所述步骤(2)中的碳酸钠溶液为1mol/L；所述牛磺酸与碳酸钠溶液的质量体积比为18～23∶100g/mL。

进一步的，所述氨基酸为天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸的混合物。

进一步的，所述矿质元素为含钾、镁、锰、锌、铜、铁、铬、钙的食用药用级盐类化合物。

一种人工熊胆粉，将上述原料，在60℃～90℃水平薄膜干燥，即得。

本发明的人工熊胆是在CN1465384A 2004-1-7，江崇波《人工熊胆及其制造方法》的研究基础上，模拟天然熊胆的化学成分和特征成分，设计筛选可食用动物胆汁、胆色素、氨基酸、微量元素等成分为人工熊胆基质，根据各种活性成分的含量及比例相似原理，确定一个较稳定的配方，体现了人工熊胆成分的多样性和协同性。

本发明通过十多年的研究改进，主要是通过筛选与熊胆主要成分相似的动物胆汁加以生化分离，最大限度保留原胆汁中全价的胆汁酸、氨基酸、胆色素、微量元素等生物活性成分，添加牛磺熊去氧胆酸钠原料药、添加补充部分氨基酸、微量元素等使人工熊胆的配方更趋于合理，成份更趋于天然，本发明优于现有人工熊胆，不仅产品价格低廉，而且无论在外观性状、理化鉴别还是内在质量上、药理药效等方面都与天然熊胆相似，产品质量符合升级后的2010年版国家标准，是理想的熊胆人工替代品。

本发明的产品在物理性状、鉴别特征、颜色气味、理化性质、主要成分含量及比例等方面均符合熊胆粉国家现行标准各项规定。

本发明人工熊胆粉整体药理学试验证明，镇痛、镇静、抗惊厥、抗炎、保肝利胆等方面具有与天然熊胆相似的药理作用，完全可以替代天然熊胆粉，可以实现工业化生产，而且价格较天然(引流)熊胆粉低，易被接受。另外，分子药理学实验还证实了本发明人工熊胆粉具有抑制MGc80-3(肿瘤细胞)生长和增殖作用。

本发明不仅工艺简单，适于工业化大生产，溶剂采取廉价、常用、易得品，可以精馏回收套用，利用率达60％，大大降低生产成本，凸显经济效益。

本发明采用仿生学原理，将天然熊胆中牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、胆红素、胆绿素、多种氨基酸、胆固醇、脂肪、无机盐等含量及其比例作为基质物主要化学成分指标标准，筛选组配，形成复合胆素浸膏。

本发明生产工艺参仿熊胆汁干燥工艺，60℃～90℃水平薄膜干燥，具有和天然熊胆一样的性状，气腥味极苦微回甜，棕褐色玻璃样光泽，水试在水面旋转避尘，下沉黄线不扩散；火试起泡无烟和羽毛气味；其它理化指标与熊胆粉保持一致。

复合胆素是以禽胆包括鸡、鸭、鹅胆为基础，利用禽胆汁中主要胆汁酸成分与熊胆主要成分相同或相似；牛羊胆、兔胆、狗胆等动物的胆富含胆色素、胆汁酸等有效成分可以弥补单纯禽胆作为人工熊胆基质成分的不足。

各种动物胆汁中胆红素，乳牛及狗含量最高，猪胆次之，牛胆汁再次之。本方法不用单独添加胆红素及部分氨基酸组分，尽量减少有机化学合成品添加，尽量采取天然胆汁的有效成分，不仅大大降低产品成本，而且产品安全性明显提高。

有益效果

(1)配方更安全

采用几种天然可食用动物胆汁作为人工熊胆基本组分添加物，不仅可以补充、调整、替代天然熊胆胆汁酸成分，而且具有毒性低、副作用少，容易被吸收等特点，更安全可靠。

(2)本配方尽量减少或不加胆色素、微量元素无机盐等人为添加物，按仿生学原理组方，使配方中有效物质含量及其比列更接近天然熊胆，在红外光谱、液相色谱等分析结果表明与天然熊胆相似或相同。

(3)本配方采用几种常见动物胆汁为配方，胆源易采、易得、易加工，而且具有显著临床功效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例5中人工熊胆粉与天然熊胆粉、TUDCA的红外吸收光谱；其中a-天然熊胆粉，b-TUDCA，c-人工熊胆粉；

图2为本发明的牛磺熊去氧胆酸钠的一种反应式；

图3为本发明的牛磺熊去氧胆酸钠的另外一种反应式。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

人工熊胆配方：

其中氨基酸是指天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸的等比混合物。

微量元素是指钾、镁、锰、锌、铜、铁、铬、钙等8种金属的食用药用级盐类化合物的混合物。

混合胆素为鸡胆汁、鸭胆汁、牛胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6∶1∶0.5∶1。

鸡胆汁的制备：将鸡胆破碎，滤布压分别滤，收集胆汁，冷藏去油脂，利用pH值的变化分离析出蛋白质、多糖、脂肪等杂质成分，加热变性物理法离心去除杂质，离心液真空浓缩成稠膏备用。

鸭胆汁、牛胆汁和狗胆汁的制备方法如鸡胆汁的制备方法。

具体制造工艺：取20L去离子水加热至80℃，加入牛磺熊去氧胆酸4公斤搅拌下令其熔融，在加入300g氨基酸混合物、100g微量元素混合物，充分搅拌溶解，将混合胆素5.6公斤干膏粉加入，不断搅拌使其全部溶解，再搅拌1小时，铺于烘盘上80℃以下烘干8～10小时，取出粗粉即得。

实施例2

此实施例与实施例1不同的是混合胆素不同，其余与实施例1相同。

此实施例中使用的混合胆素为：

鸡胆汁、鸭胆汁、牛胆汁和狗胆汁的混合物，它们的胆汁的质量比6∶1∶0.5∶1。

实施例3

此实施例与实施例1不同的是混合胆素不同，其余与实施例1相同。

此实施例中使用的混合胆素为：

鸡胆汁、鹅胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的胆汁的质量比为6∶3∶0.5∶0.5∶1∶2。

实施例4

此实施例与实施例1不同的是混合胆素不同，其余与实施例1相同。

此实施例中使用的混合胆素为：

鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的胆汁的质量比为6∶0.5∶1∶0.5∶1∶2。

实施例5

此实施例的与实施例1不同的是混合胆素不同，其余与实施例1相同。

此实施例中使用的混合胆素为：

鸡胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的胆汁的质量比为6∶0.5∶1∶0.5∶2。

取人工熊胆与天然熊胆及TUDCA的红外吸收光谱图(如图1所示)在4000～1800cm^～1，1333～800cm^～1，700～400cm^～1谱图基本一致，1554cm^～1峰为TUDCA的IR特征峰，从人工熊胆和天然熊胆谱图中二者峰高及比值，可以推测人工熊胆TUDCA的量高于天然品。

实施例1～5中的配方可以在这个范围内调整：

该人工熊胆的配方中包括的组份及其质量百分比如下：

或者在下述的范围内调整；

此范围内的配方更接近天然天然熊胆。

实施例6

上述实施例1中的牛磺熊去氧胆酸钠可以通过下述方法制得，具体如下：

(1)取10g喹啉和45ml二甲基甲酰胺放入三口烧瓶中，在0～5℃下不断搅拌，加入9g氯甲酸乙酯，搅拌均匀后，滴加到冰浴中的100ml 7％KOH溶液中，搅拌反应10min，用二氯甲烷萃取，去水相，有机相用无水硫酸钠干燥12h～24h，过滤，减压浓缩，加入10ml无水乙醇和45ml无水乙醚，搅拌下加入0.2ml三氟化硼乙醚试剂，保持温度30～40℃反应4h，静置分层，乙醚层用碳酸氢钠饱和溶液处理，用无水硫酸钠干燥12～24h，过滤，滤液常压蒸除溶剂后，减压蒸馏，收集125～130℃/15Pa馏分，得蜡状物EEDQ(5.3g，25％)mp56～58℃；

(2)称取5mmol熊去氧胆酸与6.5mmolEEDQ，加入10mlDMF溶液中搅拌溶解，将6mmol牛磺酸与0.9ml三乙胺分别加入上述溶解液中，不断搅拌反应，反应物在90℃搅拌回流1h后去热源，再搅拌1h至室温，用冷乙醚结晶，冷藏过夜。过滤，沉淀物用乙醚洗涤，溶于30ml二氯甲烷中，过滤除不溶物，在0℃左右将澄清液慢慢加入120ml乙醚后过滤，沉淀用乙醚洗涤后溶于30ml0.2mol/LNaOH甲醇溶液中，搅拌下加入100ml乙醚，产生大量白色絮状沉淀，用乙醚洗后真空干燥得白色粉末牛磺熊去氧胆酸钠(4.25mmol，产品得率85％)。

实施例7

上述实施例1中的牛磺熊去氧胆酸钠可以通过下述方法制得，具体如下：

(1)10g熊去氧胆酸原料(25.5mmol)，2.7g三乙胺(26.5mmol)溶于丙酮100ml溶液中，冷却至-5～-10℃，向溶液中滴加2.9g氯甲酸乙酯(25.97mmol)，滴加完毕后继续在-5～-10℃搅拌20min，过滤除去三乙胺盐，滤液备用；

(2)牛磺酸缩合反应

将牛磺酸4g(31.875mmol)溶于22ml 1mol/L碳酸钠溶液中，滴加到前项所得混合酸酐溶液中，在20～30℃下30min内均速添加完毕，快速搅拌3h～4h，滤除沉淀，滤液备用；

(3)调酸与浓缩干燥

上述滤液用2mol/LHCL溶液调pH6～7，回收蒸干溶液，80℃下继续减压抽干，得牛磺熊去氧胆酸干燥物；所述的减压抽干可以选取的温度范围为70℃～90℃，本实施例中选取80℃；

(4)脱盐纯化

向上述干燥物中添加40ml无水乙醇80℃左右进行回流处理1h，待盐松散后过滤除盐和未反应的牛磺酸，将滤液搅拌下加入1000ml乙酸乙酯-丙酮(50∶50v/v)混合溶液中，剧烈搅拌，产生大量白色沉淀，室温下静置一夜，吸取上层液，过滤收集滤饼，待进一步纯化；所述的回流处理的温度可以选取70℃～90℃，本实施例中选取80℃，回流处理的时间根据具体情况可以为1h～2h；

(5)精制重结晶

上述滤饼用100ml水溶解，加入900ml丙酮溶液中搅拌，2℃～5℃冷藏12h，过滤得白色浆状物，80℃真空干燥，粉碎得牛磺熊去氧胆酸。所述的真空干燥的温度可以选取70℃～90℃，本实施例中选取80℃。产品得率为76％。

本发明人工熊胆临床前预实验研究

1整体药理学实验

1.1对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

结果：与对照组比较，天然熊胆粉组和人工熊胆粉4g/kg和2g/kg组均能明显减少小鼠扭体次数。

1.2对二甲苯所致小鼠耳壳肿胀的影响

结果：与对照组比较，天然熊胆粉4g/kg组、人工熊胆粉4g/kg和2g/kg组均能明显抑制二甲苯所致小鼠耳壳肿胀作用。

1.3对士的宁诱发小鼠惊厥潜伏期的影响。

结果：与对照组比较，天然熊胆粉、人工熊胆粉4g/kg组均有拮抗士的宁诱发小鼠惊厥的作用。

1.4对小鼠自主活动的影响

结果：与对照组比较，天然熊胆粉和人工熊胆粉4g/kg组均能明显抑制小鼠自主活动次数。

1.5对2，4～二硝基酚所致大鼠发热体温的影响

表5天然与人工熊胆粉降低体温作用

与对照组比较：^*P＜O.05；^**P＜O.01

结果：与对照组比较，天然熊胆粉6g/kg组肛温变化有显著差异(表5)。

1.6对大鼠胆汁分泌的影响

结果：与对照组比较，天然熊胆粉6g/kg组给药后30、60、90min，天然熊胆粉3g/kg组给药后30、60min，人工熊胆粉6g/kg组给药后30、60min和3g/kg组给药后60min均能明显增加胆汁分泌量。

2离体药理实验

2.1抑菌实验

天然熊胆粉10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml对大肠杆菌有高度敏感抑制作用，其中5mg/ml抑菌作用最明显。20mg/ml无抑菌作用。人工熊胆粉10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml对大肠杆菌有高度敏感抑制作用，其中5mg/ml抑菌作用最明显。

(2)金黄色葡萄糖球菌

天然熊胆粉10mg/ml、5mg/ml对大肠杆菌有高度敏感抑制作用1mg/ml对大肠杆菌有中度敏感抑制作用20mg/ml无抑菌作用。人工熊胆粉5mg/ml对大肠杆菌有高度敏感抑制作用1mg/ml对大肠杆菌有中度敏感抑制作用20mg/ml无抑菌作用。

2.2细胞毒实验

相同浓度下天然熊胆粉细胞毒性比人工熊胆粉毒性小：两种熊胆粉对人的细胞毒性比对小鼠细胞毒性小；当熊胆粉浓度达500ug/ml时对人体细胞无毒性。

2.3抗病毒实验

根据红细胞凝集程度确定血凝抑制滴度，以完全抑制红细胞凝集的最小血清浓度为终点，以稀释倍数表示其滴度，结果如下表

当实验组血凝效价/空白对照组血凝效价＞32倍时，药物有明显的抗病毒作用，人工(天然)熊胆粉5ug/ml、10ug/ml时抗病毒作用明显，且人工熊胆粉略优于天然品。

3分子药理学实验

3.1人工熊胆粉对MGc80-3生长的影响

用不同浓度的人工熊胆处理MGc80-3细胞。3d后计数各组的活细胞数，人工熊胆在5～40mg；浓度范围内均对MGc80-3细胞的增殖活动有抑制作用，而且这种抑制作用具有剂量依赖性，5mg/L的浓度有轻微抑制生长的作用，其抑制率为4.6％；40mg/L的浓度对生长产生强烈的抑制作用，其抑制率为88.9％。

人工熊胆对MGc80-3细胞的生长抑制效应随培养时间的变化过程.在5、10及15mg/L三种浓度下，人工熊胆的生长抑制作用均随培养时间的延长而不断加强.在处理68h后其抑制率分别为28.5％，57.6％及90.7％，平均群体倍增时间也分别比对照组延长3.5，15.2及44.2h。

对10mg/L人工熊胆处理组细胞进行了分裂指数测定，结果处理组细胞在各时期的分裂指数都明显下降，其分裂指数高峰值(37.54‰)比对照组(49.02‰)降低了11.48‰，高峰值也比对照组提前，这进一步证实了人工熊胆对MGc80-3细胞的生长抑制效应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人工熊胆，其特征在于，该人工熊胆的配方中包括的组份及其质量百分比如下：

所述的混合胆素为禽胆汁中的一种或几种的混合物，和牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁、狗胆汁中的一种或几种的混合物。

2.根据权利要求1所述的一种牛磺熊去氧胆酸钠的制备方法，其特征在于，所述人工熊胆的配方中包括的组份及其质量百分比如下：

3.根据权利要求1或2所述的一种牛磺熊去氧胆酸钠的制备方法，其特征在于，所述的禽胆汁为鸡胆汁、鸭胆汁或鹅胆汁。

4.根据权利要求3所述的一种人工熊胆，其特征在于，所述混合胆素为鸡胆汁、鸭胆汁、牛胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶1～1.5∶0.5～0.8∶1～1.5。

5.根据权利要求3所述的一种人工熊胆，其特征在于，所述混合胆素为鸡胆汁、鹅胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶3～4∶0.5～0.7∶0.5～0.7∶1～1.2∶2～2.5。

6.根据权利要求3所述的一种人工熊胆，其特征在于，所述混合胆素为鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶0.5～0.8∶1～1.2∶0.5～0.8∶1～1.2∶2～2.5；或所述混合胆素为鸡胆汁、牛胆汁、羊胆汁、兔胆汁和狗胆汁的混合物，它们的质量比为6～8∶0.5～0.8∶1～1.2∶0.5～0.8∶2。

7.根据权利要求1或2所述的一种人工熊胆，其特征在于，所述的牛磺熊去氧胆酸钠的制备方法，包括：

(1)取喹啉和二甲基甲酰胺混合，在0～5℃下不断搅拌，加入氯甲酸乙酯，搅拌均匀后，滴加到冰浴中的KOH溶液中，搅拌反应10min～20min，用二氯甲烷萃取，去水相，有机相干燥，过滤，减压浓缩，加入无水乙醇和无水乙醚，搅拌下加入三氟化硼乙醚试剂，保持温度30～40℃反应4h～5h，静置分层，收集乙醚层，减压蒸馏，收集125～130℃/15Pa馏分，得蜡状物EEDQ mp56～58℃；

(2)熊去氧胆酸和牛磺酸在碱性条件下采用步骤(1)制得的EEDQ缩合剂进行缩合反应，即得牛磺熊去氧胆酸钠。

8.根据权利要求7所述的一种人工熊胆，其特征在于，所述步骤(1)中的喹啉与二甲基甲酰胺的比例为8～12∶40～60g/mL；所述喹啉与氯甲酸乙酯的质量比为8～12∶7～11；所述喹啉与无水乙醇的比例为8～12∶8～12g/mL；所述无水乙醇与无水乙醚的体积比为8～12∶40～60；所述三氟化硼乙醚试剂与无水乙醇的体积比为0.15～0.25∶8～12。

9.根据权利要求1或2所述的一种人工熊胆，其特征在于，所述矿质元素为含钾、镁、锰、锌、铜、铁、铬、钙的食用药用级盐类化合物。

10.一种人工熊胆粉，其特征在于，将权利要求1或2所述的人工熊胆，在60℃～90℃水平薄膜干燥，即得。

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