CN102827001B - 一种苦丁茶冬青提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具药用价值的苦丁茶冬青(Ilex？kudingcha？C.J.Tseng)叶提取物及其制备方法，该提取物的特征在于，富含咖啡酰奎尼酸类有效成分，去除了有毒成分苦丁茶氰苷和苦味质，具有抗氧化、降血脂、抗病毒等活性，可用于制造防治心脑血管疾病、高脂血症、病毒性肝炎的药品或保健品。

Description

一种苦丁茶冬青提取物

技术领域

本发明涉及药用植物提取物领域，具体为一种苦丁茶冬青提取物的化学性质、制备方法及其在制备药品、保健品中的应用。

背景技术

苦丁茶冬青(IlexkudingchaC.J.Tseng)为冬青科乔本植物，是我国南方常用的苦丁茶品种之一，古籍《本草拾遗》就有关于本品降脂的记载：“久食令人瘦，去人脂”。过去30年来，许多学者对该植物进行了研究(天然产物研究与开发，2005，17(3)：366-370；湖南中医学院学报，2001，21(2)：68-70)。药理实验证明，本品水提物具有抗氧化、扩张血管、降血压、降脂等活性，但味道极苦，许多人难以接受，而且本品也表现出一些毒性。该植物成分相当复杂，已报道的就有皂苷、三萜、甾醇、挥发油、脂肪酸、氨基酸、微量元素、维生素等多种类别，究竟哪种或哪些成分是苦丁茶冬青的主要降脂药效物质，现有公开文献尚未给出明确答案。近年来三萜和皂苷类成分比较受重视，有一些发明专利与这些成分有关，如CN101775061、CN101016328、CN1508149等。有关该植物的酚性成分结构及其药理活性则鲜见报道，关于该植物的毒性成分也不明确。

发明内容

本发明的目的之一是阐明苦丁茶冬青的调节血脂活性成分，同时揭示可能的毒性成分，为合理开发利用该植物资源提供科学依据。发明人通过大量高通量筛选和实验研究，终于确定总酚酸为降血脂和抗氧化活性部位，经色谱分离纯化并应用现代波谱技术测定分子结构，阐明了一系列咖啡酰奎尼酸类成分，其含量高达4％以上，从而首次揭示出苦丁茶冬青调节血脂的有效成分理化性质，为提取路线设计和质量控制奠定了坚实的基础。

本发明提取物中的咖啡酰奎尼酸类都具有下列结构通式(I)，其中R₁～R₃中有1～2个为咖啡酰基，其余为氢，包含六个化合物(见下式)。以往文献未涉及二咖啡酰奎尼酸的绝对构型，本发明人应用CD激子手征性方法对从苦丁茶冬青得到的3，4-、3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸的绝对构型进行了测定，其CD谱均显示裂分的(-)Cotton曲线，表明环上的两个咖啡酰基为逆时针旋转关系(附图1)，所以C-3和C-5的绝对构型均为R。具体结构式如下所示。

这些咖啡酰奎尼酸类成分均为已知天然产物，它们在植物界广泛存在，但以如此高的含量和特定比存在于苦丁茶冬青，正是本发明意外和有益的重要发现之一。附图2为本发明提取物的典型HPLC色谱图，反映了该总酚酸化学组成的基本概况。

本发明提取物中3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸是主要有效成分，二者含量因药材产地、品质、提取方法等因素而波动，含量之和一般为5％～95％(重量)。本发明提取物的化学组成并不仅限于上述咖啡酰奎尼酸，发明人发现，天然的咖啡酰奎尼酸类C-7羧基都是游离的，但在提取分离过程中因接触醇类溶剂，如乙醇、甲醇，可导致少量酯化产物形成，这类次生产物在总酚酸提取物中通常很少，生物活性与酯化前也类似。发明人还发现，酚酸中含有微量黄酮类成分，为槲皮素及其苷类，如芦丁。另外，如附图2所示，提取物中还有若干微量成分有待进一步阐明。

发明人同时发现，苦丁茶冬青水溶性部位味道极苦，毒性明显，其中含有大量已知的皂苷类成分。特别是意外地发现，水溶性部位大量含有一种氰苷类物质，其结构经鉴定为新化合物——苦丁茶氰苷(ilexkudinin)，本品为白色结晶，分子量为313.31，分子式为C₁₄H₁₉NO₇，熔点164～165℃，UVλmax259nm。经X-ray单晶衍射分析(附图3)确定结构式如下(II)：

苦丁茶氰苷的制备方法：取苦丁茶冬青叶1kg，用95％酒精回流提取三次，合并提取液，减压浓缩，浸膏加入5倍量水搅拌溶解，滤过，清液加5％盐酸酸化至pH2，滤过，滤液用5％Na₂CO₃中和，减压浓缩，上大孔树脂柱吸附，先用水洗，然后用30％酒精洗，收集30％酒精洗脱部分，减压浓缩，再用高压制备型C₁₈柱(10μm，40×250mm)分离，检测波长254nm，流速80ml/min，洗脱剂为超纯水，根据出峰情况收集流出液，将同一单峰流分合并，减压浓缩，放置过夜，得白色结晶1.3g，即为苦丁茶氰苷。

采用改良寇氏法对小鼠灌胃苦丁茶氰苷的急性LD₅₀进行了测定，方法：取小鼠50只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为5组，10只/组。按等比级数增减，设置5个剂量组，相邻两剂量比值1∶0.846。分别灌服不同剂量的苦丁茶氰苷(300.0、253.8、214.7、181.6、153.6mg/kg)。每天观察临床症状和死亡情况，连续1周，结果表明，苦丁茶氰苷对小鼠口服的LD₅₀为185.2mg/kg。苦丁茶氰苷中毒后，肝脏和肾脏指数升高，主要病理变化为肝脏和肾脏明显肿大，肾小管上皮细胞肿胀变性，部分肾小管上皮细胞破裂。该实验结果表明，小鼠口服苦丁茶氰苷中毒后，肝脏和肾脏受到一定程度的损害。

已知，氰苷类是植物界常见的有毒成分类型，该类成分经动物口服进入消化道后，会分解产生剧毒的氢氰酸，氰离子进入血液后可迅速与氧化型细胞色素氧化酶的辅基Fe³⁺离子结合，使其丧失传递氢原子电子和激活分子氧的作用，造成组织缺氧和窒息。中毒常呈急性发作，快者在半小时内死亡，症状一般由兴奋、呼吸困难并立即转入脉搏徐缓，瞳孔扩大，眼球震颤，肌肉痉挛和惊厥而死亡。50mg氢氰酸即可致人死亡。因此，氰苷可能是苦丁茶冬青中迄今所知的主要有毒成分。该氰苷的发现为限量检测有害物质提供了明确的指标成分，对保障苦丁茶冬青提取物的安全性具有十分重要的意义。本发明总酚酸提取物中苦丁茶氰苷的实际含量均≤0.2％(重量)，该残留量不会对人体健康造成危害。对比苦丁茶冬青叶粗提物和总酚酸提取物的HPLC色谱图(附图5)可以看出，前者苦丁茶氰苷的峰面积仅次于3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸，是三个主峰之一，而后者基本不显苦丁茶氰苷色谱峰。

本发明的目的之二是提供一种苦丁茶冬青总酚酸有效部位的制备方法。发明人基于对该植物化学成分的全面认识，利用咖啡酰奎尼酸类与皂苷、氰苷、糖类、色素、三萜等其它成分的理化性质差异，摸索出一条独特的制备路线，如附图4所示，简单易行，适于工业生产，其特征在于部分或全部含有以下顺序操作步骤：

a.取苦丁茶冬青叶，用水、酒精或甲醇回流提取，滤过，浓缩，得浸膏；

b.取浸膏，加水溶解，用碱水调pH6.5～8.5，滤过，滤液再加酸水酸化至pH1～4，过滤，沉淀用水洗净酸水，抽干，得沉淀部分；

c.滤液中溶解的酚性成分通过聚酰胺柱进行吸附，先用水洗除杂质，再用20％～95％(重量)浓度的酒精将酚性成分洗下，回收溶剂，浓缩物并入沉淀部分；

d.沉淀干燥后用烷烃类有机溶剂脱脂；

e.沉淀用有机溶剂提取，滤过，浓缩，得精膏(游离总酚酸)；

f.精膏用碱水溶解，滤过，浓缩，干燥，得总酚酸钠盐。

步骤a所用溶剂，优选浓度为20％～95％(重量)的酒精；步骤b和f所用碱水为无机碱的水溶液，优选含钠离子的碱，如氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液；所用酸水为无机酸水溶液，如硫酸或盐酸的水溶液；脱脂所用烷烃类溶剂为石油醚、汽油、己烷、环己烷之一或混合物，优选石油醚。步骤e所用有机溶剂为醋酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醇之一种或其混合溶剂，优选丙酮和醋酸乙酯，再优选丙酮。

上述步骤b～f可选择性重复操作，以达到进一步精制纯化的目的。步骤c所述之聚酰胺柱吸附，可重复用于总酚酸的纯化，特别是富集二咖啡酰奎尼酸类。非酚性成分和单咖啡酰奎尼酸类通常用水或浓度在10％以下的稀酒精可先洗脱下来，而二咖啡酰奎尼酸被聚酰胺吸附得更牢，一般使用浓度在20％以上的酒精洗脱。所得酚酸不含溶血性的皂苷和有毒氰苷，二咖啡酰奎尼酸含量高，3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸含量之和可达40％～90％(重量)，质量易于控制，安全性好，适于作为注射剂原料药。

本发明目的之三是提供上述提取物的医药用途。在确定总酚酸是苦丁茶冬青的降血脂有效部位后，发明人尝试对其进行了更多的药效试验，惊奇地发现，该提取物对缺血性心脑血管疾病显示出优异的治疗效果，具有高效低毒的明显特征，并且在治疗病毒性肝炎和清除自由基、抗氧化方面也有不凡表现。下面提供本发明提取物的部分药理实验结果。

1.对局灶性脑缺血的影响

大鼠静脉输注提取物(总酚酸盐)，观察本品对三氯化铁所致脑缺血大鼠的行为及梗塞面积的影响，结果显示，大鼠输注提取物2、4、8mg/kg后，动物行为变化及梗塞范围与生理盐水对照组比较有明显改善，24h后行为评分分别降低了46.2％(p＜0.01)、60.1％(p＜0.001)、50.8％(p＜0.001)；脑梗塞面积平均缩小了20.2％(p＞0.05)、50.5％(p＜0.001)、41.4％(p＜0.01)。

2.对微循环障碍大鼠软脑膜局部血流量的影响

静脉输注提取物(总酚酸盐)，观察本品对高分子右旋糖苷所致大鼠微循环障碍的影响。结果表明，假手术大鼠软脑膜局部流量60min内无明显改变；静脉推注高分子右旋糖苷后大鼠脑软膜局部流量明显减少，60min内最大下降23.5±6.2PU；静注提取物2、4、8mg/kg组于给药后10min，大鼠脑软膜流量降低值即明显少于溶剂对照组，作用持续60min以上，60min内最大下降分别为18.1±7.5、18.1±5.5、13.4±5.5PU，与溶剂对照组最大下降值比较，p分别＞0.05、＜0.05、＜0.001，说明给予提取物可缓解静注高分子右旋糖苷导致微循环流量的减少。

3.对微循环障碍大鼠血粘度的影响

前一实验结束后，从大鼠腹主动脉取血，按体积1∶9比例将3.8％枸橼酸钠加入全血中抗凝，用锥板型血液粘度计在不同切速下(7.5～150s^-1)测定大鼠全血粘度。结果表明，与假手术组比较，造型组大鼠在静脉推注高分子右旋糖苷后在不同切速下血粘度均明显高于正常大鼠。给予提取物(总酚酸盐)2mg/kg后在各切速下大鼠血粘度与模型对照组无明显差别；给予4mg/kg后在低切速(7.5s^-1)时血粘度明显低于模型对照组(p＜0.05)；给予8mg/kg后在各切速下大鼠血粘度均明显低于模型对照组。

4.对大鼠实验性动脉血栓形成的影响

取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只。对照组大鼠静脉注射生理盐水；给药组静注提取物(总酚酸盐)2、4、8mg/kg，给药体积均为0.1ml/100g。实验时腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉，仰卧位固定，分离颈总动脉，将实验性体内血栓形成仪的刺激电极和温度探头挂于颈总动脉上，给药后10min开始刺激，刺激强度为2mA，刺激5min后关闭刺激开关，取下电极，3min后调节温控表至零位，记录动脉血栓形成时间。结果表明，大鼠静注提取物2、4、8mg/kg后，与对照组比较，动脉血栓形成时间分别推迟9％(p＞0.05)、63％(p＜0.001)、108％(p＜0.001)，表明提取物中、高剂量能明显推迟大鼠实验性动脉血栓形成时间。

5.抗血小板聚集作用

取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只。对照组大鼠静注生理盐水，给药组分别静注提取物(总酚酸盐)2、4、8mg/kg，给药体积均为0.1ml/100g。实验时腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉，仰卧位固定，腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠与全血按1∶9混合抗凝，1000rpm离心7min制备富血小板血浆，3000rpm离心10min制备贫血小板血浆，应用PPP自动平衡血小板聚集仪，将各诱导剂诱导的生理盐水组血小板聚集百分数调至60％左右，诱导剂ADP、花生四烯酸(AA)、胶原终浓度分别为4μmol/L、2mmol/L、20mg/ml。观察对给药组大鼠血小板聚集作用的影响。结果见表1。

表1本发明提取物对大鼠血小板聚集功能的影响(n＝10)

注：与对照组比较，^*p＜0.05；^**p＜0.01

6.急性毒性试验

取体重18～22g昆明种小鼠雌、雄各50只，按性别、体重分别随机分成各5组，每组10只，静脉推注提取物(总酚酸盐)2070、1863、1677、1509、1358mg/kg，相邻两剂量组剂距为0.9，静注体积均为0.1ml/10g体重，观察给药后一周内小鼠的毒性反应、死亡分布和死亡动物数，并按Bliss法计算LD₅₀及其95％可信限。结果表明，高剂量静脉注射提取物后小鼠1min左右出现自主活动减少，静卧，呼吸急促，继而出现行为失调，惊厥，5～20min左右死亡。未死动物在30min后呼吸逐渐恢复正常，1h后行为等均恢复正常，以后6日内均不再出现死亡。死亡小鼠肉眼尸检心、肺、肝等主要脏器未见异常。雌性小鼠LD₅₀为1666.65(1556.12～1785.33)mg/kg；雄性小鼠LD₅₀为1740.76(1614.34～1862.56)mg/kg，雌雄动物LD₅₀近似，无明显差异。

7.对犬心肌缺血的治疗作用及血流动力学影响

静脉输注提取物(总酚酸盐)2、4mg/kg，明显改善结扎犬冠状动脉前降支所致实验性急性心肌缺血程度，缩小心肌梗塞范围。麻醉开胸犬心脏血流动力学试验结果表明，输注组合物1、2mg/kg对血流动力学各指标无明显影响；4mg/kg可降低血压、左室内压最大变化速率、左室做功及冠脉阻力，对心率、左室舒张末期压、总外周阻力、心脏泵血功能等其它血流动力学参数无影响，表明提取物通过减轻心脏后负荷，扩张冠脉及外周血管，减少回心血量及心脏做功发挥抗心肌缺血作用。

8.对高脂血症大鼠血清脂质水平的影响

选用SD大鼠(180～200g)80只，雌雄各半，喂养基础饲料5d，测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)正常值，然后随机分成五组，即高脂血症模型组，氯贝丁酯组(阳性对照组)和提取物高、中、低剂量组，给予高脂饲料喂养。高脂饲料配方：79％基础饲料，1％胆固醇，10％蛋黄粉，10％猪油。连续高脂饲料喂养10d，取血测定TC值，证明均已形成高脂血症，各组选择10只继续高脂饲料喂养，并分别给予相应药物(NS混悬液，10ml/kg)，模型组给予等容积NS，均灌胃给予。每日1次，于14d及28d分别从眼眶静脉丛取血，按酶试剂终点法测TC、TG，所得实验数据用POMS-05(随机方差分析)软件统计处理，用x±s表示。结果见表2。

表2.本发明提取物对高血脂大鼠TC和TG的影响(n＝10)

注：与高血脂模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

数据表明，提取物高、中、低剂量均可明显降低高血脂大鼠血清TC及TG水平，呈量效关系，且在中、高剂量条件下，作用明显强于阳性药对照组。

9.腹腔注射及口服给药在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果

实验采用一日龄北京鸭，经腿胫静脉注射鸭乙型肝炎病毒，7天后开始给鸭腹腔注射及口服提取物3个剂量组，腹腔注射为10、20、30mg/kg，口服给药为30、60、120mg/kg，1天2次，给药10天，观察药物对鸭的毒性和鸭血清鸭乙型肝炎病毒DNA的影响，并与阿昔洛韦比较。实验表明：口服大剂量组120mg/kg，1天2次10天，无毒性。腹腔注射给药30mg/kg组，按配对统计，给药后第10天和停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降和显著下降(P＜0.01-0.05)；按成组统计与各自对照组比较，给药后第10天和停药后3天，能非常显著和显著地降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平(P＜0.01-0.05)。口服给药60mg/kg，按配对统计，停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著效果(P＜0.05)；成组统计，给药后第10天和停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著下降(P＜0.05)。口服120mg/kg给药后第5天、第10天和停药后3天按配对统计，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著和非常显著下降(P＜0.05-0.01)；成组统计处理，给药后第5天、第10天和停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著和显著下降(P＜0.01-0.05)。阿昔洛韦对照有显著效果，说明实验可信。结论：提取物腹腔注射给药30mg/kg；口服给药60-120mg/kg对鸭乙型肝炎病毒感染有效。

10.对大鼠血清MDA含量和SOD活性的影响

取雄性20月龄Wistar大鼠40只，体重400～500g，随机分成四组：对照组(喂基础饲料)，提取物大、中、小剂量组(喂基础饲料加提取物60、40、20mg·kg^-1·d^-1)。连续喂养4w，于实验第29天，禁食12h，股动脉采血测血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)值。用SPSS10.0软件分析，组间比较用t检验，结果见表3。

表3.本发明提取物对大鼠血清MDA含量和SOD活性的影响(n＝10)

组别	MDA(nmol/ml)	SOD(NU/ml)
			对照组	8.92±0.56	181.45±7.15
提取物(大)	3.44±0.40*	194.58±8.55*
			提取物(中)	4.26±0.24*	190.36±8.82*

提取物(小)

4.63±0.48*

187.76±9.04**

与对照组比较：^*p＜0.01；^**qp＜0.05.

结果表明，本发明提取物能降低老龄大鼠血清MDA含量，升高老龄大鼠血清SOD活性，与对照组比较有显著差异。

11.抗氧化活性测定

采用DPPH·氧化法，向3ml25ug/mL的1，1-二苯-2-苦味酰基(DPPH·)溶液中加入150ul试样(空白对照用等量甲醇代替)，总体积3.15ml，混匀，于37℃放置30分钟后，用E-722型可见分光光度计在520nm处测其吸光值。提取物试样为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml和8mg/ml甲醇溶液，以2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)为阳性对照。样品对DPPH·的清除率＝[ODblank-ODsample/ODblank]×100％。式中，ODblank：DPPH·与溶剂混合液的吸光度，ODsample：DPPH·与样品反应后的吸光度。结果显示，提取物试样对DPPH·有极强的清除能力，其IC₅₀为2.3mg/ml，比BHT(IC₅₀4.2mg/ml)活性更强。

本发明目的之四是提供苦丁茶冬青提取物在制备药物、保健品中的应用，包括单独或与其它药用许可的活性成分组合，配以适当的药用辅料或药学上许可的载体，应用当前公知的制剂工艺方法，制成各种口服或非肠道给药剂型，如片剂、硬胶囊、滴丸、口服液、颗粒剂、注射液、冻干粉针等。

附图说明

图13，4-、3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸的CD图谱

图2本发明提取物的典型HPLC色谱图，色谱条件：色谱柱VP-ODS，150L×4.6mm；流动相MeOH-0.1％TFA梯度洗脱(时间：0min→40min；MeOH：20％→60％，0.1％TFA：80％→40％)；波长328nm；流速1ml/min。

图3苦丁茶氰苷的X-ray单晶衍射结构图

图4本发明提取物的制备方法流程图

图5本发明提取物、粗提物及苦丁茶氰苷的HPLC比较，色谱条件：色谱柱VP-ODS，150L×4.6mm；流动相MeOH-0.1％TFA梯度洗脱(时间：0min→40min；MeOH：20％→60％，0.1％TFA：80％→40％)；波长259nm；流速1ml/min。

具体实施方式

下面以更具体的实施例对本发明提取物制备方法及其在制备各类制剂中的应用加以说明，但本发明内容不局限于此。

实施例1：苦丁茶冬青总酚酸的制备

取苦丁茶冬青叶1kg，粉碎成粗粉，加入95％酒精回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，得醇浸膏280g。浸膏用1.5L纯化水搅拌溶解，滴加稀氢氧化钠调pH值7左右，离心，滤过，滤液用5％盐酸酸化至pH2，静置2小时，过滤，沉淀用水洗至流出液pH5左右，抽干，得沉淀约128g。将滤液加至聚酰胺(30～60目)吸附柱内，先用水洗脱，至流出液颜色变浅且酸性降至pH5左右时，改用80％酒精洗脱，收集酒精洗脱液，减压浓缩，得膏状物约12g，并入沉淀部分。沉淀干燥后用石油醚回流脱脂3次，过滤，挥干，再用丙酮回流提取4次，合并提取液，回收溶剂，得总酚酸82g。其3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸含量之和为39％(重量)，基本不含苦丁茶氰苷，味淡不苦，可作为各种口服和外用制剂的原料。

实施例2：苦丁茶冬青总酚酸的制备

取苦丁茶冬青叶1kg，粉碎成粗粉，加水煎煮3次，合并提取液，减压浓缩，得浸膏220g。浸膏用1.5L水搅拌溶解，加5％碳酸钠调pH值7左右，离心，滤过，滤液用5％硫酸酸化至pH2，静置2小时，过滤，沉淀用水洗至流出液pH5左右，抽干，得沉淀约100g。将滤液加至聚酰胺(30～60目)吸附柱内，先用水洗脱，至流出液颜色变浅且酸性降至pH5左右时，改用60％酒精洗脱，收集酒精洗脱液，减压浓缩，得膏状物约10g，并入沉淀部分。沉淀干燥后用己烷回流脱脂3次，过滤，挥干，再用醋酸乙酯回流提取4次，合并提取液，回收溶剂，得总酚酸85g。其3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸含量之和约为42％，基本不含苦丁茶氰苷，味淡不苦，可作为各种口服和外用制剂的原料。

实施例3：苦丁茶冬青总酚酸盐的制备

取实施例1或2所得总酚酸20g，缓慢分次加入5％氢氧化钠适量，搅拌下使充分溶解，控制溶液pH7～8，滤过，喷雾干燥，得总酚酸盐19g。本品水溶性好，可作为各种固体和液体制剂的原料。

实施例4：注射用苦丁茶冬青总酚酸盐的制备

取实施例1或2所得总酚酸30g，加入100ml95％酒精使溶解，拌入适量聚酰胺，晾干，加至聚酰胺柱内，先用水洗，然后用5％酒精洗，再用80％酒精洗，收集80％酒精洗脱液，减压浓缩，得膏状物18g；继续用丙酮回流提取4次，合并提取液，回收溶剂，所得膏状物用适量5％碳酸钠溶解，控制溶液pH7～8，超滤，减压浓缩，喷雾干燥，得棕黄色粉末14g。其3，5-和4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸含量之和约为80％(重量)，不含皂苷和苦丁茶氰苷，水溶性好，可作为注射剂原料。

实施例5：片剂制备

取本发明总酚酸提取物20g，与淀粉100g、糊精5g混匀，加入10％淀粉浆制软材，用14目尼龙筛网制粒，60～70℃通风干燥，16目筛整粒，加硬脂酸镁1.5g、羧甲基纤维素钠5g，混匀，压制成1000片，包衣，即得，每片含提取物20mg。给药剂量和次数根据临床有效性而定。

实施例6：胶囊制备

取本发明总酚酸提取物20g，与淀粉120g、硬脂酸镁2g混匀，直接用全自动胶囊填充机填充成1000粒，抛光，即得，每粒含提取物20mg。给药剂量和次数根据临床有效性而定。

实施例7：滴丸制备

取本发明总酚酸提取物12g，投入32g加热熔融的聚乙二醇6000中，搅拌至溶解，转移至贮液瓶中，密闭并保温在80～90℃，调节滴丸机液滴定量阀门，由上往下滴入10～15℃的液状石蜡中，共制1000粒，将形成的滴丸沥干并擦除液状石蜡，干燥即得，每粒含提取物12mg。给药剂量和次数根据临床有效性而定。

实施例8：口服液制备

取本发明总酚酸盐提取物20g，与蜂蜜400g、蔗糖100g、苯甲酸钠6g及蒸馏水2000ml混合，加热至85～90℃，搅拌使溶解，保温30min，滤过，滤液加水稀释至10000ml，搅匀，灌封(每支10ml)，灭菌，即得。

实施例9：颗粒剂制备

取本发明总酚酸提取物4g、糊精16g、蔗糖粉230g及乙醇适量，混匀，过10目筛制成颗粒，子60～70℃干燥，整粒，分装，即得，每包重2.5g。

实施例10：注射液制备

取本发明总酚酸盐50g，加注射用水适量使溶解，加配制量的0.02％活性炭搅拌5～10分钟，滤过，滤液稀释至10L左右，加氯化钠调节渗透压至等渗，调pH7.5～8.0，滤过，灌封成1000支(10ml/支)，灭菌，即得。可供静脉注射给药。给药剂量和次数根据临床有效性而定。

实施例11：冻干粉针制备

无菌条件下取本发明总酚酸盐50g，置于无菌容器内，加注射用水约900ml，搅拌使溶解，调节pH值至7.0～7.5，加注射用水至1000ml，然后加配制量的0.02％活性炭搅拌5～10min，用无菌抽滤漏斗过滤，超滤，滤液检验合格后分装于安瓿中，低温冷冻干燥，无菌熔封即得，每支50mg，临用前加注射用水适量使溶解，用氯化钠输液250～500ml稀释后缓慢静脉滴注。给药剂量和次数根据临床有效性而定。

实施例12：复方胶囊制备

取本发明总酚酸提取物20g，与三七皂苷20g、淀粉150g及适量乙醇混匀，过10目筛，干燥，整粒，加入硬脂酸镁2g，混匀，用全自动胶囊填充机填充成1000粒，抛光，即得。每粒含提取物及三七皂苷各20mg。可口服用于各种缺血性心脑血管疾病的防治。给药剂量和次数根据临床有效性而定。

Claims (11)

1.一种具有药用价值的苦丁茶冬青(IlexkudingchaC.J.Tseng)叶提取物的制备方法，所述的具有药用价值的苦丁茶冬青(IlexkudingchaC.J.Tseng)叶提取物含有由结构通式I表示的咖啡酰奎尼酸类或其钠盐为主的酚酸类成分，式I中：R₁～R₃中任一或二个取代基是咖啡酰基，其余为氢；C-3和C-5的绝对构型均为R，

该制备方法包括以下步骤：

a.取苦丁茶冬青叶，用水、酒精或甲醇回流提取，滤过，浓缩，得浸膏；

b.取浸膏，加水溶解，用碱水调pH为6.5～8.5，滤过，滤液再加酸水酸化至pH为1～4，过滤，沉淀用水洗净酸水，抽干，得沉淀部分；

c.滤液中溶解的酚性成分通过聚酰胺柱进行吸附，先用水洗除杂质，再用20％～95％重量浓度的酒精将酚性成分洗下，回收溶剂，浓缩物并入沉淀部分；

d.沉淀干燥后用烷烃类有机溶剂脱脂；

e.沉淀用有机溶剂提取，滤过，浓缩，得总酚酸精膏；

f.精膏用碱水溶解，滤过，浓缩，干燥，得总酚酸钠盐。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b所述的碱水为氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤f所述的碱水为氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液；。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b所述的酸水为盐酸或硫酸水溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d所述的烷烃类有机溶剂为石油醚、己烷、环己烷、汽油之一种或两种以上的混合液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e所述的有机溶剂为丙酮、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇之一种或两种以上的混合液。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e所述的有机溶剂为丙酮和/或醋酸乙酯。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所得产物中含有由结构通式I表示的咖啡酰奎尼酸类或其钠盐为主的酚酸类成分，

式I中：R₁～R₃中任一或二个取代基是咖啡酰基，其余为氢；C-3和C-5的绝对构型均为R。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所得产物中3,5-二-O-咖啡酰奎尼酸和4,5-二-O-咖啡酰奎尼酸的含量之和为5％～95％(重量)。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所得产物中3,5-二-O-咖啡酰奎尼酸和4,5-二-O-咖啡酰奎尼酸的含量之和为40％～90％(重量)。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所得产物中具有以下式II所示结构的苦丁茶氰苷的含量≤0.2％(重量)，