CN104961779B - 一种含咖啡酰基的鞣质衍生物及其制备工艺和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于林业加工剩余物的次生代谢活性成分制备及利用领域，具体涉及从胡桃科胡桃属漾濞核桃树树叶中制备一种含咖啡酰基的鞣质衍生物1，3‑二‑O‑没食子酰基‑6‑O‑咖啡酰基‑β‑D‑吡喃葡萄糖的工艺及该衍生物在制备抗氧化产品中的应用。本发明所采用的提取及分离制备工艺规范、得率高、成本低、操作简便的特点。

Description

一种含咖啡酰基的鞣质衍生物及其制备工艺和应用

技术领域

本发明属于林业加工剩余物的次生代谢活性成分及其利用技术领域，具体涉及一种新的含咖啡酰基的鞣质衍生物1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖(1，3-di-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucoside)及其制备工艺和用途。

背景技术

漾濞核桃(Juglans sigillata Doda)为胡桃科(Juglandanceae)胡桃属(Juglans)落叶乔木，主要分布在我国西南部的云南、西藏、四川及贵州的山坡和山谷地区(Wu&Raven，Flora of China，Vol.4，Science Press，Beijing，1999，283～284)。漾濞核桃树树高可达30米以上，其果核表面褶皱明显，极不平滑，内褶壁发达，取仁较难。漾濞核桃根深，主根发达。漾濞核桃喜光，耐湿热，不耐干冷(周成贵，林业科技开发，2004，18(3)，42～44)。漾濞核桃仁因膳食营养价值极高而一直备受推崇，其种子外壳一直被用作民间药物治疗食道癌、胃癌、心脏癌和肺癌(Si et al，Chemistry ofNatural Compounds，2011，47(3)，442～445)。最新研究表明漾濞核桃种子外壳具有优异的酪氨酸酶抑制活性(Si CL，et al，Bioresources，2014，9(2)，2226～2236)。到目前为止，对漾濞核桃树化学成分的研究主要集中在其核桃仁、核桃仁壳、果实青皮、树干皮等部位，而且从以上诸部位中提取分离的化合物主要是水解单宁类、缩合单宁类、α-四氢萘酮类，然而对漾濞核桃树叶次生代谢化学成分的研究却甚少(Liu et al，Helvetica Chimica Acta，2010，93(2)，265～271；Si et al，Chemistry ofNatural Compounds，2011，47(3)，442～445；Si et al，BiochemicalSystematics andEcology，2011，39(3)，225～227)。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的含咖啡酰基的鞣质衍生物1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖(英文名为1，3-di-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucoside)。

本发明的另一个目的是提供从胡桃科胡桃属中的漾濞核桃树树叶中制备1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的工艺。

本发明的第三个目的是提供1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的抗氧化活性功效用途。

本发明的技术方案概述如下：

下述结构式的化合物：

从漾濞核桃树中制备1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的工艺，包括如下步骤：

(1)取粉碎的漾濞核桃树叶，按质量比为1∶3～1∶10加入体积百分浓度为40％～95％的丙酮水溶液，常温提取或加热提取或微波辅助提取或超声波辅助提取1～6次，每次1～96小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的1％～10％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量1～5倍的水，搅拌，加入粗提物质量1～5倍的正己烷萃取1～5次，分离出正己烷层，将正己烷层减压浓缩得正己烷萃取相；

(3)正己烷萃取相经硅胶柱层析和凝胶柱层析之至少一种制备得到1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖。

在上述1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的制备工艺步骤中，所述漾濞核桃树叶原料包括漾濞核桃树的新鲜叶、落叶、干叶中的一种或几种。

1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖在制备抗氧化产品中的应用。

本实验证明本发明的化合物分子式为C₂₉H₂₆O₁₇，化学名为1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖，即1，3-di-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucoside。该化合物为淡黄色，其熔点为193～195℃，旋光度为其UV(λ_maxnm，MeOH)：245、300、332；IR(KBr)v_max cm^-13395、1676、1612；正性FAB-MS m/z[M+H]⁺为647，而m/z[M+Na]⁺为669。

本发明的制备工艺具有操作方法简单规范、得率高、制备成本低等特点。

实验证实1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖对DPPH自由基有优异的清除效果(IC₅₀值为6.28μM)，其清除能力强于正对比组中的人工合成抗氧化剂BHT(IC₅₀值为6.86μM)和天然抗氧化剂α-tocopherol(IC₅₀值为6.70μM)。这表明本发明制备的1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的抗氧化活性显著，可作为抗氧化剂应用于保健品、药品、食品以及化妆品等行业。

具体实施方式

参考下列实施例将更全面、更容易地理解本发明，给出实施例是为了更清楚地阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1：

1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的制备

(1)取粉碎的漾濞核桃树叶，按质量比为1∶4加入体积百分浓度为60％的丙酮水溶液，常温提取3次，每次72小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的4％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量3倍的水，搅拌，加入粗提物质量2倍的正己烷萃取4次，分离出正己烷层，将正己烷层减压浓缩得正己烷萃取相；

(3)正己烷萃取相经硅胶柱层析制备得到1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖。

该化合物的结构鉴定：

由正性快原子轰击质谱图谱(Positive FAB-MS)可知该化合物的m/z[M+Na]⁺为669，而m/z[M+H]⁺为647，结合¹H和¹³C NMR图谱得出其分子式为C₂₉H₂₆O₁₇。以1％的三氯化铁乙醇溶液(质量百分比)喷雾显色反应时呈深绿色，表明该化合物分子中含有酚羟基团(Imakura et al，Phytochemistry，1985，24(1)，139～146)。¹H NMR谱图数据(表1)中，特征质子峰[δ7.09(2H，s，H-2′&6′)、δ7.12(2H，s，H-2″&6″)]表明该化合物中含两个没食子酰基(Tanaka et al，Phytochemistry，2005，66，675～681)。而ABX型的质子共振峰[δ7.18(1H，d，J＝1.8Hz，H-2″′)、δ6.80(1H，d，J＝8.2Hz，H-5″′)，δ6.97(1H，d，J＝1.8&8.2Hz，H-6″′)]及AB类型的质子共振峰[δ7.58(1H，d，J＝16.1Hz，H-7″′)、δ6.30(1H，d，J＝16.1Hz，H-8″′)]揭示该化合物中含有一个反式咖啡酰基(trans-caffeoyl)(Abbasi et al，Chemistry ofNatural Compounds，2014，50(5)，836～841)。在¹³C NMR图谱上(数据见表1)，与1，3，6-三-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖(1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucoside)的¹³C NMR数据相比，差别之处在于该化合物中一个反式咖啡酰基取代了1，3，6-三-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖中的一个没食子酰基。此外，该化合物的HMBC图谱中显示该化合物葡萄糖基C6号位相连的质子[δ4.31(1H，dd，J＝6.2&12.0Hz)、δ4.53(1H，dd，J＝12.0&2.1Hz)，H-6_a和6_b]与反式咖啡酰基上的9号位碳信号(δ168.4，C-9″′)存在远程相关，因而确定此反式咖啡酰基与葡萄糖基的C6位相连。综合以上信息，该化合物的化学结构式被确定为1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖(英文名：1，3-di-O-galloyl-6-O-caffeoyl-β-D-glucoside)。经检索，该化合物为新的含咖啡酰基的鞣质衍生物。该化合物在紫外灯254nm波长下有紫外吸收。在薄层色谱试验中，用冰乙酸-水体积比6∶94的溶剂系统展开时该化合物的R_f值约为0.57，用叔丁醇-冰乙酸-水体积比3∶1∶1的溶剂系统展开时该化合物的R_f值约为0.38。

表1. 1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的¹H(400MHz)及¹³CNMR(100MHz)谱数据(MeOH-d₄)

实施例2：

(1)取粉碎的漾濞核桃树叶，按质量比为1∶5加入体积百分浓度为70％的丙酮水溶液，微波辅助提取4次，每次1.5小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的5％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量2倍的水，搅拌，加入粗提物质量3倍的正己烷萃取3次，分离出正己烷层，将正己烷层减压浓缩得正己烷萃取相；

(3)正己烷萃取相经凝胶柱层析制备得到1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖。

实施例3：

(1)取粉碎的漾濞核桃树叶，按质量比为1∶6加入体积百分浓度为80％的丙酮水溶液，超声波辅助提取2次，每次2小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的8％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量1.5倍的水，搅拌，加入粗提物质量2倍的正己烷萃取2次，分离出正己烷层，将正己烷层减压浓缩得正己烷萃取相；

(3)正己烷萃取相经硅胶柱层析和凝胶柱层析制备得到1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖。

实施例4：

1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的抗氧化活性评价

1.待评价样品：上述制备的1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖经HPLC测定后纯度为99.9％；本实验中，选用人工合成的BHT和天然的α-tocopherol为正对照组。

2.实验方法：待评价样品的抗氧化活性能力评价选用广泛应用的清除DPPH自由基法，具体操作严格以文献(Si CL，et al，Wood Science and Technology，2011，45：5～13)中规定步骤进行。各组实验均独立平行进行三次，然后取其平均值计算。

评价实验结果如表2。结果表明，1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖对DPPH自由基的清除能力IC₅₀值为6.28μM，而正对照组α-tocopherol和BHT清除DPPH自由基能力IC₅₀值分别为6.70和6.86μM。试验结果充分表明1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖对DPPH自由基的清除效果优于正对照组BHT和α-tocopherol。因此，本发明制备的1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的抗氧化能力显著，可作为抗氧化剂应用于药品、食品、保健品以及化妆品等行业。

表2. 1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖、α-tocopherol及BHT清除DPPH自由基能力(IC₅₀值，μM)

Claims (1)

1.一种含咖啡酰基的鞣质衍生物1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖的制备工艺，其特征是包括如下步骤：

(1)取粉碎的漾濞核桃树叶，按质量比为1∶3～1∶10加入体积百分浓度为40％～95％的丙酮水溶液，常温提取或加热提取或微波辅助提取或超声波辅助提取1～6次，每次1～96小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的1％～10％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量1～5倍的水，搅拌，加入粗提物质量1～5倍的正己烷萃取1～5次，分离出正己烷层，将正己烷层减压浓缩得正己烷萃取相；

(3)正己烷萃取相经硅胶柱层析和凝胶柱层析之至少一种制备得到1，3-二-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖。