CN102807978A - 一种藻类rna提取剂及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种藻类RNA提取剂及使用方法，所述藻类RNA提取剂由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、柠檬酸钠组成；藻类RNA提取剂的使用方法由样品前处理、抽提、吸取、沉淀、去除DNA等步骤组成。本发明适用于提取藻类RNA，操作步骤简单，成本低、稳定性好，提取RNA产率高（RNA提取率185-240μg/100mg新鲜藻样），纯度高（OD260/280值为1.90-2.10），完全满足RT-PCR、Real Time PCR和RACE-PCR等实验的需要。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种藻类RNA提取剂及使用方法。
背景技术
分离获得高纯度、完整的RNA是进行RT-PCR、qRT-PCR、Northern杂交等分生物学实验的关键。藻类组织通常富含的多糖、酚类化合物等，可在核酸分离纯化时，与RNA相互作用。酚类化合物极易被氧化，生成物（如醌类）能与RNA稳定的结合，从而影响RNA的分离纯化。多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来，多糖可以抑制很多酶的活性，因此污染了多糖多酚的RNA无法用于进一步的分子生物学研究。RNA酶的高稳定性是造成RNA极易降解和分离纯化失败的另外一个主要原因。RNA提取过程中污染的RNA酶有两种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源性RNA酶来自RNA制备过程中使用的玻璃、塑料制品和试剂及操作人员本身等，而内源性RNA酶是组织本身所固有的，当细胞破碎后即释放出来。因此，能否有效去除多糖、酚类化合物及去除或抑制RNA酶活性是提取高质量RNA成败的关键。目前，现有的RNA提取试剂盒和提取方法主要针对提取微生物、动物和高等植物组织的RNA，而对提取藻类RNA效果不佳。
中国专利公布号CN 102191239 A，公布日2011年9月21日，名称为一种提取荔枝总RNA的方法，该申请案公开了一种提取荔枝总RNA的方法，是将采集的用液氮处理的荔枝叶片样品经研磨后用丙酮进行抽提；在抽提过的植物材料中加入RNA提取液进行提取，离心，将上清液用LiCl进行沉淀，离心后收集沉淀；用LiCl溶液洗涤沉淀，离心，弃上清；待沉淀干燥后，用DEPC灭菌溶剂溶解沉淀，在-80℃中保存备用。其不足之处在于，现有RNA提取试剂对于藻类RNA的提取效果较差。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有RNA提取试剂盒对藻类RNA提取效果较差的缺陷而提供一种高效高纯的藻类RNA提取剂。
本发明的另一目的是为了提供一种高效高纯的藻类RNA提取剂的使用方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种藻类RNA提取剂，所述藻类RNA提取剂由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、DTT、和柠檬酸钠溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2 mol/L，NaCl的终浓度为1.5-2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03-0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.05-0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25-30 mmol/L，藻类RNA提取剂的终浓度为30-80 mmol/L。
作为优选，所述DEPC水溶液的质量分数为0.1%-0.2%。
一种利用藻类RNA提取剂应用于提取藻类RNA的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
步骤a）处理样品：将新鲜或超低温冷冻的藻类，用纯净水冲洗干净，然后沥干；取沥干后的藻类0.1-0.5g，在液氮中研磨至粉末状；
步骤b）配制提取剂：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠中加入质量分数为0.1-0.2%的DEPC水溶液，然后在室温下静置过夜，在121℃灭菌15-20min，得到提取剂半成品；向提取剂半成品中加入2-4mol/L 的DTT至终浓度30-80m mol/L，得到提取剂;其中Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2 mol/L，NaCl的终浓度为1.5-2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03-0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.05-0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25-30 mmol/L；
步骤c）抽提：将步骤a）的粉末状样品倒入盛有2-4mL提取剂的离心管中，涡旋混匀2-4min，将离心管在室温下放置15-30min，期间每隔5min摇晃离心管一次；然后向离心管中加入2-4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀2-4min，然后于0-4℃，离心力10000-15000g的条件下离心15-30min；吸取上清液于另一干净离心管内，加入上清液体积20%-40%的无水乙醇，涡旋混匀2-4min；然后向加入了无水乙醇的上清液中加入2-4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀2-4min，于0-4℃，离心力10000-15000g的条件下离心15-30min；
步骤d）：吸取步骤c）抽提后的上清液于干净离心管内，加入上清液体积20%-40%的12 mol/L LiCl溶液并涡旋混匀2-4min，-50—-80℃条件下静置30-60min，得到粗样品；
步骤e）沉淀：将步骤d）静置后的粗样品于0-4℃，离心力12500-15000g的条件下，离心20-40 min；弃上清液，取出沉淀，用0.5-2mL的体积分数70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 ℃下，离心力12000g，离心10 min；
步骤f）：将步骤e）中的上清液于于0-4℃，离心力12500-15000g的条件下，离心20-40 min，取出沉淀，用0.5-2mL体积分数70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 ℃下，离心力12000g，离心10 min将该次离心得到的沉淀与步骤e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步骤g）：将步骤f）处理后的粗沉淀在10-30℃下风干，然后用20-50μL的质量分数0.1%-0.2%的DEPC水溶液溶解风干后的沉淀，用RNase-Free DNase set（50）试剂盒去除样品总RNA中DNA；
步骤h）：将步骤g）去除DNA后的样品总RNA移入干净离心管，加入与样品总RNA等体积的氯仿与异戊醇混合液进行抽提，0-4 ℃，离心力12000g的条件下离心10 -25min；取上清液，移入新离心管内，加入上清液体积10%-15%的3-5 mol/L的醋酸钠溶液，调节溶液的pH4-5，然后加入2-3倍上清液体积的无水乙醇，在-70℃冰浴沉淀45-60min；然后在0-4 ℃，离心力12,000g的条件下离心10 min，弃上清液，沉淀即为纯化的藻类RNA。
在本技术方案中，由于常用的RNA提取试剂盒对藻类RNA的提取效果不佳且提取后纯度较差，故对常用RNA提取剂做出优化，Tris-HCl作为一种常用的核酸和蛋白质的缓冲液，防止核酸被破坏；EDTA作为络合剂；CTAB用于纯化RNA，柠檬酸钠具有良好的pH调节剂及缓冲性能。步骤b）中选用DEPC水溶解Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠，是为了是提取剂里不参杂其他离子；步骤d）使用LiCl使得RNA与DNA沉淀再经过高速离心得到沉淀物；步骤g）中选用DEPC水，DEPC水可用于RNA沉淀的溶解；步骤h）是为了将去除DNA后的样品纯化得到RNA。
作为优选，所述步骤c）与步骤h）中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
作为优选，所述步骤a）中所用藻类为为红藻、绿藻或褐藻。红藻、绿藻或褐藻作为海洋内大量存在的生物，其来源广阔且数量极多。
本发明的有益效果是：本发明适用于提取藻类RNA，操作步骤简单，成本低、稳定性好，提取RNA产率高（RNA提取率185-240μg/100mg新鲜藻样），纯度高（OD260/280值为1.90-2.10），完全满足RT-PCR、Real Time PCR和RACE-PCR等实验的需要。
附图说明
图1是绿藻石莼总RNA的甲醛变性胶电泳图。
图中，泳道1：DL2000 Marker；泳道2：提取的绿藻石莼总RNA；泳道3：去除DNA的绿藻石莼总RNA。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步的解释：
本发明所用试剂均为市售。
实施例一
一种藻类RNA提取剂的使用方法，包括以下步骤：
步骤a）处理样品：将新鲜绿藻石莼，用纯净水冲洗干净，然后沥干；取沥干后的绿藻石莼0.1g，在液氮中研磨至粉末状；
步骤b）配制提取剂：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠中加入质量分数为0.1%的DEPC水溶液，然后在室温下静置过夜，在121℃、高压灭菌15min，得到提取剂半成品；向提取剂半成品中加入2 mol/L的DTT至终浓度30 mmol/L，得到提取剂;其中Tris-HCl的终浓度为0.05 mol/L，NaCl的终浓度为1.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03 mol/L，CTAB的终浓度为0.05 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25 mmol/L；
步骤c）抽提：将步骤a）的粉末状样品倒入盛有2mL提取剂的离心管中，涡旋混匀2min，将离心管在室温下放置15min，期间每隔5min摇晃离心管一次；然后向离心管中加入2mL的氯仿与异戊醇的混合液，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，涡旋混匀2min，然后于0℃，离心力10000g的条件下离心15min；吸取上清液于另一干净离心管内，加入上清液体积20%的无水乙醇，涡旋混匀2min；然后向加入了无水乙醇的上清液中加入2mL的氯仿与异戊醇的混合液，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，涡旋混匀2min，于0℃，离心力10000g的条件下离心15min；
步骤d）：吸取步骤c）抽提后的上清液于干净离心管内，加入上清液体积20%的12 mol/L LiCl并涡旋混匀2min，-50℃条件下静置30min；
步骤e）沉淀：将步骤d）静置后的粗样品于0℃，离心力12500g的条件下，离心20min；弃上清液，取出沉淀，用0.5mL的体积分数70%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0 ℃下，离心力12000g，离心10 min；
步骤f）：将步骤e）中的上清液于于0℃，离心力12500g的条件下，离心20 min，取出沉淀，用0.5mL体积分数70%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0 ℃下，离心力12000g，离心10 min将该次离心得到的沉淀与步骤e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步骤g）：将步骤f）处理后的沉淀在10℃下风干，然后用20
μL的质量分数0.1%的DEPC水溶液溶解风干后的沉淀，用RNase-Free DNase set（50）试剂盒去除样品总RNA中DNA；RNase-Free DNase set（50）试剂盒购自德国QIAGEN公司。
步骤h）：将步骤g）去除DNA后的样品总RNA移入干净离心管，加入与样品总RNA等体积的氯仿与异戊醇混合液进行抽提，0 ℃下，12000g，离心10 min；取上清液，移入新离心管内，加入上清液体积10%的3mol/L的醋酸钠溶液，调节溶液pH4，加入2倍上清液体积的无水乙醇，在-70℃冰浴沉淀45min；然后在0 ℃下，12000g，离心10 min，弃上清液，沉淀即为纯化的绿藻石莼RNA。
实施例二
一种藻类RNA提取剂的使用方法，包括以下步骤：
步骤a）处理样品：将新鲜斑紫菜，用纯净水冲洗干净，然后沥干；取沥干后的斑紫菜0.2g，在液氮中研磨至粉末状；
步骤b）配制提取剂：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠中加入质量分数为0.2%的DEPC水溶液，然后在室温下静置过夜，在121℃灭菌20min，得到提取剂半成品；向提取剂半成品中加入3mol/L 的DTT至终浓度50m mol/L，得到提取剂;其中Tris-HCl的终浓度为0.1 mol/L，NaCl的终浓度为2 mol/L，EDTA的终浓度为0.05 mol/L，CTAB的终浓度为0.1mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为28mmol/L；
步骤c）抽提：将步骤a）的粉末状样品倒入盛有3mL提取剂的离心管中，涡旋混匀3min，将离心管在室温下放置20min，期间每隔5min摇晃离心管一次；然后向离心管中加入3mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀3min，然后于3℃，离心力12000g的条件下离心20min；吸取上清液于另一干净离心管内，加入上清液体积30%的无水乙醇，涡旋混匀3min；然后向加入了无水乙醇的上清液中加入3mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀3min，于2℃，离心力12000g的条件下离心20min；
步骤d）：吸取步骤c）抽提后的上清液于干净离心管内，加入上清液体积30%的12 mol/L LiCl溶液并涡旋混匀3min，-70℃条件下静置45min，得到粗样品；
步骤e）沉淀：将步骤d）静置后的粗样品于2℃，离心力14000g的条件下，离心30 min；弃上清液，取出沉淀，用1mL的体积分数72%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于2℃下，离心力12000g，离心10 min；
步骤f）：将步骤e）中的上清液于于1℃，离心力13000g的条件下，离心30 min，取出沉淀，用1mL体积分数72%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于3℃下，离心力12000g，离心10 min将该次离心得到的沉淀与步骤e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步骤g）：将步骤f）处理后的粗沉淀在20℃下风干，然后用40μL的质量分数0.2%的DEPC水溶液溶解风干后的沉淀，用RNase-Free DNase set（50）试剂盒去除样品总RNA中DNA；
步骤h）：将步骤g）去除DNA后的样品总RNA移入干净离心管，加入与样品总RNA等体积的氯仿与异戊醇混合液进行抽提，0-4 ℃，离心力12000g的条件下离心15min；取上清液，移入新离心管内，加入上清液体积12%的4 mol/L的醋酸钠溶液，调节溶液的pH4.5，然后加入3倍上清液体积的无水乙醇，在-70℃冰浴沉淀50min；然后在3℃，离心力12,000g的条件下离心10 min，弃上清液，沉淀即为纯化的斑紫菜RNA。
实施例三
一种藻类RNA提取剂的使用方法，包括以下步骤：
步骤a）处理样品：将超低温冷冻的羊栖菜，用纯净水冲洗干净，然后沥干；取沥干后的羊栖菜0.5g，在液氮中研磨至粉末状；
步骤b）配制提取剂：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠中加入质量分数为0.2%的DEPC水溶液，然后在室温下静置过夜，在121℃灭菌20min，得到提取剂半成品；向提取剂半成品中加入4mol/L 的DTT至终浓度80m mol/L，得到提取剂;其中Tris-HCl的终浓度为0.2 mol/L，NaCl的终浓度为2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为30 mmol/L；
步骤c）抽提：将步骤a）的粉末状样品倒入盛有4mL提取剂的离心管中，涡旋混匀4min，将离心管在室温下放置30min，期间每隔5min摇晃离心管一次；然后向离心管中加入4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀4min，然后于4℃，离心力15000g的条件下离心30min；吸取上清液于另一干净离心管内，加入上清液体积40%的无水乙醇，涡旋混匀4min；然后向加入了无水乙醇的上清液中加入4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀4min，于4℃，离心力15000g的条件下离心30min；
步骤d）：吸取步骤c）抽提后的上清液于干净离心管内，加入上清液体积40%的12 mol/L LiCl溶液并涡旋混匀4min， -80℃条件下静置60min，得到粗样品；
步骤e）沉淀：将步骤d）静置后的粗样品于4℃，离心力15000g的条件下，离心40 min；弃上清液，取出沉淀，用2mL的体积分数75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于4 ℃下，离心力12000g，离心10 min；
步骤f）：将步骤e）中的上清液于于0-4℃，离心力15000g的条件下，离心40 min，取出沉淀，用2mL体积分数75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于4 ℃下，离心力12000g，离心10 min将该次离心得到的沉淀与步骤e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步骤g）：将步骤f）处理后的粗沉淀在30℃下风干，然后用50μL的质量分数0.2%的DEPC水溶液溶解风干后的沉淀，用RNase-Free DNase set（50）试剂盒去除样品总RNA中DNA；
步骤h）：将步骤g）去除DNA后的样品总RNA移入干净离心管，加入与样品总RNA等体积的氯仿与异戊醇混合液进行抽提， 4 ℃，离心力12000g的条件下离心25min；取上清液，移入新离心管内，加入上清液体积15%的5 mol/L的醋酸钠溶液，调节溶液的pH5，然后加入3倍上清液体积的无水乙醇，在-70℃冰浴沉淀60min；然后在4 ℃，离心力12,000g的条件下离心10 min，弃上清液，沉淀即为纯化的羊栖菜RNA。
表1 RNA提取率及OD260/280值
由表中可知，RNA提取率在200μg/100mg以上，OD260/280值则都大于2。OD260/280值是指核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共轭双键，在260nm波长处有最大吸收峰，蛋白在280nm波长处有最大吸收峰，故OD260/280值大于2则较好。
Claims (5)
1. 一种藻类RNA提取剂，其特征在于，所述藻类RNA提取剂由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、DTT、和柠檬酸钠溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2 mol/L，NaCl的终浓度为1.5-2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03-0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.05-0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25-30 mmol/L，藻类RNA提取剂的终浓度为30-80 mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种藻类RNA提取剂，其特征在于，所述DEPC水溶液的质量分数为0.1%-0.2%。
3.一种权利要求1所述的藻类RNA提取剂应用于提取藻类RNA的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
步骤a）处理样品：将新鲜或超低温冷冻的藻类，用纯净水冲洗干净，然后沥干；取沥干后的藻类0.1-0.5g，在液氮中研磨至粉末状；
步骤b）配制提取剂：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB与柠檬酸钠中加入质量分数为0.1-0.2%的DEPC水溶液，然后在室温下静置过夜，在121℃灭菌15-20min，得到提取剂半成品；向提取剂半成品中加入2-4mol/L 的DTT至终浓度30-80m mol/L，得到提取剂;其中Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2 mol/L，NaCl的终浓度为1.5-2.5 mol/L，EDTA的终浓度为0.03-0.06 mol/L，CTAB的终浓度为0.05-0.15 mmol/L，柠檬酸钠的终浓度为25-30 mmol/L；
步骤c）抽提：将步骤a）的粉末状样品倒入盛有2-4mL提取剂的离心管中，涡旋混匀2-4min，将离心管在室温下放置15-30min，期间每隔5min摇晃离心管一次；然后向离心管中加入2-4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀2-4min，然后于0-4℃，离心力10000-15000g的条件下离心15-30min；吸取上清液于另一干净离心管内，加入上清液体积20%-40%的无水乙醇，涡旋混匀2-4min；然后向加入了无水乙醇的上清液中加入2-4mL的氯仿与异戊醇的混合液，涡旋混匀2-4min，于0-4℃，离心力10000-15000g的条件下离心15-30min；
步骤d）：吸取步骤c）抽提后的上清液于干净离心管内，加入上清液体积20%-40%的12 mol/L LiCl溶液并涡旋混匀2-4min，-50—-80℃条件下静置30-60min，得到粗样品；
步骤e）沉淀：将步骤d）静置后的粗样品于0-4℃，离心力12500-15000g的条件下，离心20-40 min；弃上清液，取出沉淀，用0.5-2mL的体积分数70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 ℃下，离心力12000g，离心10 min；
步骤f）：将步骤e）中的上清液于于0-4℃，离心力12500-15000g的条件下，离心20-40 min，取出沉淀，用0.5-2mL体积分数70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 ℃下，离心力12000g，离心10 min将该次离心得到的沉淀与步骤e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步骤g）：将步骤f）处理后的粗沉淀在10-30℃下风干，然后用20-50μL的质量分数0.1%-0.2%的DEPC水溶液溶解风干后的沉淀，用RNase-Free DNase set（50）试剂盒去除样品总RNA中DNA；
步骤h）：将步骤g）去除DNA后的样品总RNA移入干净离心管，加入与样品总RNA等体积的氯仿与异戊醇混合液进行抽提，0-4 ℃，离心力12000g的条件下离心10 -25min；取上清液，移入新离心管内，加入上清液体积10%-15%的3-5 mol/L的醋酸钠溶液，调节溶液的pH4-5，然后加入2-3倍上清液体积的无水乙醇，在-70℃冰浴沉淀45-60min；然后在0-4 ℃，离心力12,000g的条件下离心10 min，弃上清液，沉淀即为纯化的藻类RNA。
4.根据权利要求3所述的一种藻类RNA应用于藻类RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步骤c）与步骤h）中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
5.根据权利要求3或4所述的一种藻类RNA应用于藻类RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步骤a）中所用藻类为红藻、绿藻或褐藻。
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