CN102805198A - 一种从粗老茶中提取活性蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从粗老茶中提取活性蛋白的方法。该方法是利用超声辅助提取并辅以纤维素酶和果胶酶的处理来破坏茶叶细胞的细胞壁，使活性物质更大限度地溶出，并采用碱法提取以得到茶叶中的酸性蛋白，再用等电点沉淀的方法分离出茶蛋白；再对提取得到的茶蛋白进行酶解，从而再次提高了茶蛋白的性能。由于超声技术和复合酶处理破坏了细胞的细胞壁，对其内的活性物质的结构也有一定程度的影响，所以本方法得到的茶蛋白样品得率较高；再经酶解处理之后，蛋白的溶解性、抗氧化活性又有了明显的提高，因此本方法具有资源利用率高、节约能源、活性增强等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从粗老茶中提取活性蛋白的方法，属于天然活性成分提取技术领域，可用于保健食品和功能食品的研制开发。
背景技术
茶叶的药用价值历史悠久，据《神农本草经》中记载：久服茶叶能“安心益气，轻身耐老”。另据唐《本草拾遗》中所述：“诸药为各病之药，茶为万病之药”。大量的研究表明，茶叶中含有多种可被利用的生物活性成分和营养物质，如：茶多酚、茶多糖、茶蛋白等。但是，由于粗老茶经冲泡后大多口感苦涩，结果导致其明显滞销，而经研究发现其内的多种成分，如茶多糖、茶蛋白等具有非常明显的保健作用。
其中，茶蛋白质约占茶叶干物质总量的20％-30％，而且绝大多数是非水溶性蛋白质，只有1％-2％的蛋白质是水溶性的，非水溶性蛋白质主要是谷蛋白，约占蛋白总量的80％，其具有不溶于水，只溶于稀酸、稀碱溶液的特点，所以常利用碱法对茶叶中的蛋白质进行提取。
超声波提取技术常常用于植物有效成分的浸出提取，利用超声波的空化作用和次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等加速欲提取成分的扩散释放，并充分与溶剂混合，以提高提取的效率，目前超声提取技术已应用于茶多糖的提取。
研究表明，茶蛋白也具有茶多酚所具有的保健功能：非水溶性茶蛋白具有明显的降血脂效果，对动脉粥样硬化及冠心病可能有一定的预防作用；茶蛋白对预防放射治疗时引起的致突变效有保护作用；另外，茶蛋白还具有抗氧化、抗衰老等作用。
目前通常采用热碱浸提方法进行茶蛋白的分离提取，但其缺点是所消耗的能源较大，而且蛋白的得率及活性均不十分理想。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种得率高，且活性增强的从粗老茶中提取活性蛋白的方法。
为了达到上述目的，本发明提供的从粗老茶中提取活性蛋白的方法包括按顺序进行的下列步骤：
1)复合酶法预处理：将粗老茶加入到适量蒸馏水中至其全部浸没在蒸馏水中，用稀盐酸调节pH至4，然后加入占粗老茶总量0.5％～1.5％重量的由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶，在40℃的温度下反应1～3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
2)超声碱法提取：在上述反应液中加入碱液，所述粗老绿茶与碱液的重量比为1∶20～1∶40，碱选自氢氧化钠或氢氧化钾中的一种，碱液浓度为0.1M～0.2M，然后在超声清洗仪中搅拌提取1～2小时，之后减压过滤，收集滤液而得到含有茶蛋白的茶叶供试液；
3)等电点沉淀：向上述茶叶供试液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置24～48小时；
4)离心分离：利用离心分离机将上述沉淀液离心分离15～20分钟，收集沉淀物；
5)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白样品；
6)木瓜蛋白酶酶解：将上述冷冻干燥后的茶蛋白样品加入到pH为6～7的PBS缓冲溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白样品重量0.5～1.5％，在55～65℃的温度下反应1～3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
7)等电点重新沉淀：向上述酶解后的反应液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置24～48小时；
8)离心或过滤分离：利用离心分离机将上述沉淀液离心分离15～20分钟，收集沉淀物；
9)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到所述的茶蛋白。
所述的步骤1)中纤维素酶与果胶酶的重量比为1∶1。
所述的步骤2)中超声功率设定为24～40KHz。
所述的步骤4)和步骤8)中离心分离机的转速为3000～4000转/分。
本发明提供的从粗老茶中提取活性蛋白的方法是利用超声辅助提取并辅以纤维素酶和果胶酶的处理来破坏茶叶细胞的细胞壁，使活性物质更大限度地溶出，并采用碱法提取以得到茶叶中的酸性蛋白，再用等电点沉淀的方法分离出茶蛋白；再对提取得到的茶蛋白进行酶解，从而再次提高了茶蛋白的性能。由于超声技术和复合酶处理破坏了细胞的细胞壁，对其内的活性物质的结构也有一定程度的影响，所以本方法得到的茶蛋白样品得率较高；再经酶解处理之后，蛋白的溶解性、抗氧化活性又有了明显的提高，因此本方法具有资源利用率高、节约能源、活性增强等优点。
附图说明
图1为利用本发明提供的从粗老茶中提取活性蛋白的方法及现有的热碱浸提方法得到的茶蛋白清除DPPH自由基能力对比图。
图2为利用本发明提供的从粗老茶中提取活性蛋白的方法及现有的热碱浸提方法得到的茶蛋白总还原力对比图。
图3为利用本发明提供的从粗老茶中提取活性蛋白的方法及现有的热碱浸提方法得到的茶蛋白溶解度对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明提供的从粗老茶中提取活性蛋白的方法进行详细说明。
实施例1：
1)复合酶法预处理：将30g粗老茶加入到适量蒸馏水中至其全部浸没在蒸馏水中，用稀盐酸调节pH至4，然后加入0.45g由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶与果胶酶的重量比为1∶1)，在40℃的温度下反应1小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
2)超声碱法提取：在上述反应液中加入1200g浓度为0.2M的氢氧化钠液，然后在超声清洗仪中搅拌提取1小时，超声功率设定为24KHz，之后减压过滤，收集滤液而得到含有茶蛋白的茶叶供试液；
3)等电点沉淀：向上述茶叶供试液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置48小时；
4)离心分离：利用离心分离机在3000转/分的转速下将上述沉淀液离心分离20分钟，收集沉淀物；
5)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白样品；
6)木瓜蛋白酶酶解：将上述冷冻干燥后的茶蛋白样品加入到pH为7的PBS缓冲溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白样品重量1.5％，在65℃的温度下反应1小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
7)等电点重新沉淀：向上述酶解后的反应液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置48小时；
8)离心或过滤分离：利用离心分离机在3000转/分的转速下将上述沉淀液离心分离20分钟，收集沉淀物；
9)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率为88.04％。
实施例2：
1)复合酶法预处理：将30g粗老茶加入到适量蒸馏水中至其全部浸没在蒸馏水中，用稀盐酸调节pH至4，然后加入0.15g由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶与果胶酶的重量比为1∶1)，在40℃的温度下反应3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
2)超声碱法提取：在上述反应液中加入600g浓度为0.1M的氢氧化钠液，然后在超声清洗仪中搅拌提取1小时，超声功率设定为40KHz，之后减压过滤，收集滤液而得到含有茶蛋白的茶叶供试液；
3)等电点沉淀：向上述茶叶供试液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置24小时；
4)离心分离：利用离心分离机在4000转/分的转速下将上述沉淀液离心分离15分钟，收集沉淀物；
5)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白样品；
6)木瓜蛋白酶酶解：将上述冷冻干燥后的茶蛋白样品加入到pH为6的PBS缓冲溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白样品重量0.5％，在55℃的温度下反应3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
7)等电点重新沉淀：向上述酶解后的反应液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置24小时；
8)离心或过滤分离：利用离心分离机在4000转/分的转速下将上述沉淀液离心分离15分钟，收集沉淀物；
9)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率为88.10％。
实施例3：
1)复合酶法预处理：将30g粗老茶加入到适量蒸馏水中至其全部浸没在蒸馏水中，用稀盐酸调节pH至4，然后加入0.3g由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶与果胶酶的重量比为1∶1)，在40℃的温度下反应2小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
2)超声碱法提取：在上述反应液中加入900g浓度为0.15M的氢氧化钾液，然后在超声清洗仪中搅拌提取2小时，超声功率设定为32KHz，之后减压过滤，收集滤液而得到含有茶蛋白的茶叶供试液；
3)等电点沉淀：向上述茶叶供试液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置36小时；
4)离心分离：利用离心分离机在3500转/分的转速下将上述沉淀液离心分离15分钟，收集沉淀物；
5)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白样品；
6)木瓜蛋白酶酶解：将上述冷冻干燥后的茶蛋白样品加入到pH为6的PBS缓冲溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白样品重量1.0％，在60℃的温度下反应2小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
7)等电点重新沉淀：向上述酶解后的反应液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置36小时；
8)离心或过滤分离：利用离心分离机在3500转/分的转速下将上述沉淀液离心分离15分钟，收集沉淀物；
9)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率为88.08％。
实施例4：
1)复合酶法预处理：将30g粗老茶加入到适量蒸馏水中至其全部浸没在蒸馏水中，用稀盐酸调节pH至4，然后加入0.45g由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶与果胶酶的重量比为1∶1)，在40℃的温度下反应3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
2)超声碱法提取：在上述反应液中加入1200g浓度为0.2M的氢氧化钾液，然后在超声清洗仪中搅拌提取2小时，超声功率设定为40KHz，之后减压过滤，收集滤液而得到含有茶蛋白的茶叶供试液；
3)等电点沉淀：向上述茶叶供试液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置48小时；
4)离心分离：利用离心分离机在4000转/分的转速下将上述沉淀液离心分离20分钟，收集沉淀物；
5)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白样品；
6)木瓜蛋白酶酶解：将上述冷冻干燥后的茶蛋白样品加入到pH为6的PBS缓冲溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白样品重量1.5％，在60℃的温度下反应3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
7)等电点重新沉淀：向上述酶解后的反应液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置48小时；
8)离心或过滤分离：利用离心分离机在4000转/分的转速下将上述沉淀液离心分离20分钟，收集沉淀物；
9)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白，茶蛋白提取率为88.03％。
本发明人将上述利用本发明提供的方法及现有的热碱浸提方法获得的蛋白提取率和蛋白含量进行了对比，结果见表1。
表1本发明方法与现有的热碱浸提方法的茶蛋白提取结果对比
由表中内容可见，本发明方法获得的蛋白提取率和蛋白含量均高于现有的热碱浸提方法。
自由基是具有高度化学活性的物质，是生命活动中多种生化反应的中间产物，人的生命活动离不开自由基，但人体内自由基过多或清除过慢，自由基则会攻击并损坏大分子，对细胞膜、核酸及机体蛋白质等造成损伤，是引起人体衰老、致病、致癌的重要因素之一。为此，本发明人对利用上述实施例得到的茶蛋白清除DPPH自由基能力进行了实验，并与现有的热碱浸提方法进行了对比，实验结果见图1。
由图1可以看出，与现有的热碱浸提方法相比，利用本发明方法所获得的茶蛋白对DPPH自由基的清除能力得到增强，且经数据分析，两种茶蛋白具有明显的显著性差异(p＜0.05)。
同时，本发明人还对利用上述实施例得到的茶蛋白总还原力进行了实验，并与现有的热碱浸提方法进行了对比，实验结果见图2。
由图2可以看出，与现有的热碱浸提方法相比，本发明方法所获得的茶蛋白的还原能力有了大幅度提高，且经数据分析，两种茶蛋白具有非常明显的显著性差异(p＜0.01)。
最后，本发明人还对利用上述实施例得到的茶蛋白溶解度进行了测定，并与现有的热碱浸提方法进行了对比，实验结果见图3。
由图3可以看出，与现有的热碱浸提方法相比，本发明方法所获得的茶蛋白的溶解度有了大幅度提高，且经数据分析，两种茶蛋白具有非常明显的显著性差异(p＜0.01)。
Claims (4)
1.一种从粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的从粗老茶中提取活性蛋白的方法包括按顺序进行的下列步骤：
1)复合酶法预处理：将粗老茶加入到适量蒸馏水中至其全部浸没在蒸馏水中，用稀盐酸调节pH至4，然后加入占粗老茶总量0.5％～1.5％重量的由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶，在40℃的温度下反应1～3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
2)超声碱法提取：在上述反应液中加入碱液，所述粗老绿茶与碱液的重量比为1∶20～1∶40，碱选自氢氧化钠或氢氧化钾中的一种，碱液浓度为0.1M～0.2M，然后在超声清洗仪中搅拌提取1～2小时，之后减压过滤，收集滤液而得到含有茶蛋白的茶叶供试液；
3)等电点沉淀：向上述茶叶供试液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置24～48小时；
4)离心分离：利用离心分离机将上述沉淀液离心分离15～20分钟，收集沉淀物；
5)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到茶蛋白样品；
6)木瓜蛋白酶酶解：将上述冷冻干燥后的茶蛋白样品加入到pH为6～7的PBS缓冲溶液中，之后加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的用量占茶蛋白样品重量0.5～1.5％，在55～65℃的温度下反应1～3小时，反应结束后在100℃的温度下灭活5min；
7)等电点重新沉淀：向上述酶解后的反应液中加入浓盐酸，以将溶液pH调至4.5，然后在4℃的温度下静置24～48小时；
8)离心或过滤分离：利用离心分离机将上述沉淀液离心分离15～20分钟，收集沉淀物；
9)冷冻干燥：将上述沉淀物重新溶解于蒸馏水中，然后置于-18℃的温度下进行冷冻，冻实之后置于-50℃的真空冷冻干燥机中进行干燥而得到所述的茶蛋白。
2.根据权利要求1所述的从粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤1)中纤维素酶与果胶酶的重量比为1∶1。
3.根据权利要求1所述的从粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤2)中超声功率设定为24～40KHz。
4.根据权利要求1所述的从粗老茶中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤4)和步骤8)中离心分离机的转速为3000～4000转/分。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121205 |