CN102803508B - 用于干细胞成像的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供包含以下的表达载体：与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含启动子；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含应答元件，所述应答元件随着一种或多种细胞分化或去分化而被激活或失活。亦提供用于包含表达载体的干细胞成像并监测所述干细胞的方法及试剂盒。
Description
领域
本发明总体上涉及细胞成像，并且更具体地是对用干细胞中的新型表达载体表达的报告核酸序列成像。
背景
在活体对象中对单个细胞或细胞群无侵袭性和重复性成像，是体内跟踪细胞的关键，尤其是在基于细胞的疗法领域。在很多应用中已使用不同成像模式来了解正常生理和疾病进展，所述应用包括基于细胞的疗法、细胞运输或基因疗法研究。含有报告核酸序列的表达载体在活体对象中对基因表达的无侵袭性定量成像提供可能。
为了阐释分子和细胞事件的复杂性和动力学，期需在单个或多个报告基因构建体的帮助下在单个细胞中对报告基因表达成像。成像的报告基因编码可由各种无侵袭性成像技术检测的蛋白质。可在活体对象中视报告基因类型而定用以下技术对报告基因表达成像：光学成像、正电子发射断层显像(PET)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)或磁共振成像(MRI)。
基于干细胞的疗法显示相当大的潜力，尤其是在再生医学领域。基于干细胞的疗法的障碍之一是缺乏有效的监测方法来跟踪采用的干细胞。监测干细胞的分化状态对于确定治疗功效以及可能的有害作用例如植入的干细胞的致瘤性(tumorogenicity)必不可少。可通过用含有内源启动子驱动的报告基因的转基因来评估细胞培养物中或活体对象中的内源基因表达。对植入的干细胞多能性的评估可使得能够预测将来畸胎瘤的形成。与多能性标记相关的启动子驱动的报告基因系统可帮助检测干细胞的分化状态。
为了克服每一种模式的缺点，检测多种不同报告基因表达的多模式方法可能是有用的。此外，在活动物中用无侵袭性报告基因成像技术监测干细胞活性的可靠方法是高度期需的目标。
简述
本发明总体上包括包含一个或多个报告序列的表达载体。本发明进一步包括用于通过报告核酸表达成像来监测细胞活性的方法和试剂盒。
用于监测干细胞的表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的(operably linked)第一报告核酸序列，和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含启动子。所述第二表达调控序列包含对细胞分化或去分化的一个或多个阶段应答而激活或失活的应答元件。
表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子。所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件。
用于监测干细胞的方法实例包括将包含第一报告核酸序列和第二报告核酸序列的第一表达载体递送给所述干细胞；和通过对第一或第二报告核酸序列中至少之一的表达成像来监测干细胞。所述第一报告核酸序列与包含用于一种或多种多能性标记的启动子的第一表达调控序列可操作地连接。所述第二报告核酸序列与第二表达调控序列可操作地连接，所述第二表达调控序列包含应答元件或由一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子，所述应答元件对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答。
用于监测干细胞的试剂盒的实例包含表达载体，其中所述表达载体包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含Oct4启动子，和所述第二表达调控序列包含对GATA4蛋白的结合应答的应答元件。
表达载体的实例包含：与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含受一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子。
附图
当参考附图阅读以下详述时将更好地理解本发明这些和其它特征、方面和优势，在整个附图中相同的符号代表相同的部分，其中：
图1为本发明具有组成型泛素启动子和细胞特异性Oct4启动子的构建体的实施方案的示意图。
图2A-D为显示胚胎干细胞中或分化的成体细胞系中Oct4表达的特异性的图表。
图3为在用Oct4-hRLuc瞬时转染的小鼠ES细胞中海肾(renilla)萤光素酶表达的图表。
图4A-B为稳定表达Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的小鼠ES细胞的萤光素酶表达的图表。
图5为随时间Oct4mRNA水平和β-肌动蛋白mRNA水平的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶相片。
图6A是图表，图6B为一系列小鼠的图像，显示活小鼠中包含Oct4-hRLuC表达载体的ES细胞的萤光素酶表达。图6C是图表，图6D为一系列小鼠的图像，显示活小鼠中包含Ubiq-Fluc表达载体的ES细胞的萤光素酶表达。
图7为用于通过将应答元件和最小启动子序列插入多克隆位点来制备表达载体的本发明方法实例的示意图，所述应答元件对GATA4蛋白的结合应答。图7按出现次序分别公开SEQ ID NO.5和6。
图8为本发明表达载体实施方案的示意图，其在pcDNA载体骨架中包含cDNA-编码的GATA4蛋白。
图9为编码GATA4蛋白的cDNA序列的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶相片。
图10为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件在体外对GATA4蛋白的结合应答。
图11为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对HEK 293细胞中的GATA4结合应答。
图12为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对HCT 116结肠癌细胞中的GATA4结合应答。
图13为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对用5-氮杂胞苷(5-azacytidine)处理HCT116结肠癌细胞后的GATA4结合应答。
图14为本发明构建体实施方案的示意图，所述构建体包含组成型启动子(泛素)、细胞特异性启动子(Oct4)和应答元件(对GATA4应答)。
详述
为了更清晰简明地阐述和指出本发明要求保护的主题，对在以下说明及所附权利要求书中使用的特定术语提供以下定义。在整个说明书中，应该将特定术语例证理解为非限制性实例。
本文所用术语″表达载体″或″表达构建体″，指可用于将特定基因或特定核酸序列或表达序列标签引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，就可通过细胞转录和翻译装置来产生由核酸序列编码的蛋白质。表达载体可包含调节核酸序列或表达调控序列、转录起始序列、目的核酸序列(例如报告核酸序列)、转录终止序列或其组合。表达调控序列可包含充当用于有效转录编码目的蛋白的核酸序列或表达序列标签的增强子和/或启动子的序列。
本文所用术语″报告核酸序列″或″报告基因″，指编码具有报告活性的蛋白或肽的核酸序列。报告核酸序列可编码可被独立检测的蛋白或肽。常用报告核酸序列编码固有地具有肉眼可识别特性的蛋白或肽(例如荧光蛋白，例如GFP)，或可产生肉眼可识别特性的蛋白或肽(例如生物发光蛋白，例如萤光素酶)。由于将报告核酸序列表达作为标记使用，因此报告核酸序列可用这样的方式来选择，以使得其在研究中的细胞或生物体中非天然表达。报告核酸序列的非限制性实例包括编码绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤光素酶、β-内酰胺酶和β-半乳糖苷酶的核酸序列。
本文所用术语″可操作地连接的″，意即当两个核酸分子序列彼此连接时，其连接方式为允许两种序列均转录到同一RNA转录物上，或允许在一个序列中开始的RNA转录物延伸到第二序列中。因此，若在启动子序列开始转录将产生可操作地连接的第二序列的RNA转录物，那么两个序列例如启动子序列(第一序列)和任何其它第二DNA序列为可操作地连接的。例如，编码报告蛋白的报告核酸序列和表达调控序列可以可操作地连接，以这样的方式连接以便允许通过激活表达调控序列中存在的启动子或增强子来使报告核酸序列表达。成为″可操作地连接的″，两个序列不必彼此紧密相邻。
本文所用术语″表达调控序列″，指位于报告核酸序列上游的核酸序列。这些表达调控序列尤其限定RNA聚合酶特异性结合启动子序列以起始转录的位点。表达调控序列可包含启动子、增强子、基因应答元件或核酸应答元件或转录起始序列。表达调控序列可经工程改造以改进下游报告核酸序列的转录和/或翻译效率。
本文所用术语″应答元件″，指当位于接近启动子或在启动子内时能够调控转录活性的核酸序列。例如，可将GATA4蛋白-结合序列用作位于接近最小启动子的应答元件。GATA4蛋白的结合可调控最小启动子的启动子活性。应答元件的非限制性实例包括激素应答元件、cAMP应答元件和GATA4蛋白-结合核酸序列。
本文所用术语″组成型启动子″，指允许连续转录其同族基因的非调节启动子。组成型启动子在其整个发育期间持续指导活体对象各部分的基因表达。组成型启动子的非限制性实例包括泛素启动子、CT2启动子(编码ATP硫化酶)和与CaMV 35S转录物或农杆菌属(Agrobacterium)Ti质粒胭脂氨酸合成酶基因相关的启动子。
本文所用术语″监测″，指在体外或体内观察或记录活性。例如，其可为常规收集关于细胞、组织或器官中的生物过程进展或发展的信息的过程。例如可通过对细胞中产生的或引入到细胞中的可成像蛋白或肽成像，来实现在细胞、组织或器官中监测特定活性。例如，可成像蛋白或肽可为生物发光或荧光。可实施监测，例如以确定细胞或组织的存在与否、浓度、定位或分化状态。可监测可成像蛋白或肽的技术的非限制性实例包括光学成像(荧光和生物发光)、PET、MRI或SPECT。
本文所用术语″分化″指较少特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。在多细胞生物体发育期间随着生物体从单受精卵到组织和细胞类型的复杂系统的变化，发生无数次分化。在组织修复期间和正常细胞更新(cell turnover)期间，成体干细胞分裂并形成完全分化的子细胞。分化显著改变细胞大小、形状、膜电位、代谢活性和对信号的应答。这些变化主要是由于基因表达的高度受控的修饰。例如，能够分化为很多细胞类型的细胞被称为多能细胞。
本文所用术语″去分化″，指其中部分分化或终末分化的细胞通常作为再生过程的部分回复到较早发育阶段的细胞过程。非限制性实例包括诱导的多能干细胞(iPS)。去分化的细胞能够再分化为特化的细胞类型。例如，特化的细胞类型例如脂肪细胞可去分化为多能干细胞。
本文所用术语″多能性标记″指多能性细胞特异性标记蛋白。本文所用″多能细胞″指可分化全部三个胚层(例如内胚层、中胚层和外胚层)的细胞群。多能细胞表达多种多能性细胞-特异性标记。标记具有某些未分化细胞的典型细胞形态，例如致密集落、胞核与胞质比率高或突出的核仁。仅当细胞处于未分化的多能状态或处于去分化的多能状态时才激活多能性标记。多能性标记的非限制性实例包括Oct4、Sox2、Klf和Nanog。
本发明表达载体的一个或多个实施方案包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。第一表达调控序列可包含启动子。在一个实施方案中，第一表达调控序列可包含用于一个或多个多能性标记的启动子，例如Oct4启动子。第二表达调控序列可包含对一种或多种应答元件特异性蛋白例如GATA4蛋白的结合应答的应答元件。表达载体可进一步包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。第三表达调控序列可包含组成型启动子。在一个实施方案中，组成型启动子为泛素启动子。在表达载体中，第一、第二或第三报告核酸序列可分别与第一、第二或第三表达调控序列符合读框的可操作地连接。在某些实施方案中，表达调控序列可包含当细胞分化或去分化时被激活或失活的任何启动子，或对任何蛋白的结合应答的任何应答元件。所述调控序列可包括但不限于Oct4启动子或对GATA-4蛋白结合应答的应答元件。
在表达载体中，所述第一、第二或第三表达调控序列调控所述第一、第二或第三报告核酸序列的转录，或修饰所述报告核酸编码的蛋白的翻译。为有效转录报告蛋白，可工程改造表达调控序列和报告核酸序列之间的距离。表达载体可进一步包含一种或多种序列，其在体内或体外或活系统中可用于标记(例如荧光蛋白标签)报告蛋白。
表达载体可用于组成型(始终如一表达)或细胞特异性(仅在某些细胞谱系类型中表达)表达报告核酸序列。例如，泛素启动子在任何活细胞中都具有组成型表达。包含与报告核酸序列可操作地连接的泛素启动子的表达载体，可用于持续表达报告核酸序列。可将与组成型启动子(例如泛素)可操作地连接的报告核酸序列用于对细胞存活和增殖成像。可通过采用对特定细胞类型应答的启动子来获得细胞特异性表达。细胞特异性启动子可为特异性针对多能细胞的启动子，其被称为多能性标记特异性启动子。例如，当表达载体存在于干细胞中时，在本发明表达载体中使用的Oct4启动子被激活。
第二表达调控序列还可包含最小启动子。最小启动子是对于转录因子结合及随后的与所述启动子可操作地连接的基因转录所需的最小基础核酸序列。最小启动子可与应答元件可操作地连接。最小启动子可被应答元件激活。应答元件在特定细胞谱系中对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答。例如，应答元件可对GATA4蛋白的结合应答。可通过GATA4蛋白与应答元件的结合来诱导最小启动子。在心肌细胞中GATA4蛋白的表达增加。因此，仅当细胞经历分化到心脏特异性细胞谱系例如心肌细胞时，才诱导与GATA4的应答元件可操作地连接的最小启动子。在一个实施方案中，最小启动子可选自CMV启动子、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子或TATA框启动子。在特定实施方案中，最小启动子为CMV启动子。
在一个实施方案中，第一表达调控序列包含Oct4细胞特异性启动子，第二表达调控序列包含与应答元件(其对GATA4蛋白的结合应答)可操作地连接的最小启动子(例如CMV最小启动子)。表达调控序列可在生物体生长期间调控核酸序列表达。某些可调控表达调控序列可在宿主细胞生长期间关闭，然后可在有利表达大量所需蛋白的所需时间点再次打开。
第一报告核酸序列与多能性标记的启动子可操作地连接，所述多能性标记在当细胞为多能干细胞或为受诱导的多能干细胞时表达。例如，当细胞处于多能阶段时Oct4启动子活性增加，而当细胞分化为特定细胞谱系时Oct4启动子活性降低。因此，在细胞分化状态，报告基因表达下调。因此，当细胞处于多能状态时，与可操作地连接Oct4启动子的报告核酸序列成像相关的信号为″开″，当细胞已分化时所述信号为″关”。
第二报告核酸序列与应答元件可操作地连接，而所述应答元件与最小启动子可操作地连接。可通过应答元件特异性蛋白例如GATA4蛋白与应答元件的结合来激活最小启动子。在某些实施方案中，应答元件包含GATA4结合序列的至少四个重复。当干细胞分化为心脏特异性细胞例如心肌细胞时，GATA4蛋白的表达增加。因此，当细胞处于分化状态(分化为心脏特异性细胞)时，与连接GATA4的报告核酸序列相关的信号为″开″，当细胞为多能或处于去分化的状态时，所述信号为“关”。例如，当干细胞分化为心脏特异性细胞谱系时，GATA4蛋白的表达增加。然而，当心脏特异性细胞去分化为受诱导的多能干(iPS)细胞时，GATA4蛋白的表达降低。
在某些实施方案中，可通过细胞特异性蛋白与应答元件的结合，来激活与最小启动子可操作地连接的第二报告核酸序列。举一个例子，当干细胞分化为内皮细胞时，胎儿肝激酶-1(FLK-1)可被激活，其可与第二表达调控序列中存在的应答元件结合，并激活与应答元件相关的最小启动子。细胞特异性标记的非限制性实例列于表1中。在某些实施方案中，第二表达调控序列可包含分化的细胞-特异性启动子。分化的细胞特异性启动子包括但不限于FLK-1、BM88或HLA-Dra。在某些实施方案中，细胞特异性标记(表1中列举的非限制性实例)可为与应答元件结合的应答元件特异性蛋白，或为与分化细胞中的启动子结合的细胞特异性蛋白。
表1：细胞特异性标记
当细胞为活的时，与组成型启动子例如泛素可操作地连接的第三报告核酸序列表达。泛素启动子通过甲基化来抵抗基因沉默，并在细胞分化活性期间不受调节。因此，当细胞活着时，与连接泛素的报告核酸序列表达有关的信号为″开″，不管是在分化、去分化、多能性阶段还是细胞重编程的阶段，若细胞在任何时间点死亡时所述信号为“关”。
一种或多种报告核酸序列可编码多肽，所述多肽本身可成像或可在与底物或探针或靶标反应时成像。所述多肽可通过光学成像、MRI、PET、SPECT或其组合来成像。PET具有适用于所有活体对象的优点。然而，PET需要相对短寿命的放射性示综物。所述多肽可为生物发光或为荧光。可通过光学成像对生物发光或荧光多肽成像。本文所用术语″生物发光多肽″或″生物发光蛋白″是在与底物反应时产生生物发光的多肽或蛋白质。生物发光相对难以用于单细胞成像，而荧光对单细胞成像高度敏感。荧光报告蛋白本身可成像，而生物发光报告蛋白在与底物反应时可成像。可通过用探针或靶标对PET可成像报告蛋白成像。
在一个实例中，第一、第二和第三报告核酸序列中每一种都编码生物发光多肽，而在另一实例中，第一、第二和第三报告核酸序列每一种都可编码荧光多肽。编码生物发光多肽的报告核酸序列可选自萤火虫萤光素酶(FL)、海肾萤光素酶(RL)或gaussi萤光素酶(GL)。适用于本发明的荧光多肽实例包括但不限于红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)。可通过基于荧光的细胞分选用荧光激活细胞分选术(FACS)来测量编码荧光多肽的报告核酸序列的表达。第一、第二或第三报告核酸序列中的每一种都可编码为MR可成像蛋白的蛋白，例如铁蛋白。在某些实施方案中，第一、第二或第三报告核酸序列编码HSV1-sr39胸苷激酶，其为PET可成像蛋白。
在一个实施方案中，第一报告核酸序列编码生物发光蛋白，而第二报告核酸序列编码荧光蛋白，或反之亦然。例如，第一报告核酸序列可编码RL，其中第二报告核酸序列可编码GFP，或反之亦然。在其它实施方案中，第一和第二报告核酸序列二者都可编码生物发光蛋白，其中所述蛋白不同，并可独立在两种不同波长下成像。举一个例子，第一报告核酸序列可编码RL，其中第二报告核酸序列可编码FL，或反之亦然。FL在550-570nm范围内产生光，而RL在480nm下产生蓝光。由于其在底物需求和光输出方面有差异，可将这些酶用于双-报告测定。在另一实施方案中，第一和第二报告核酸序列二者都可编码荧光蛋白，其中所述蛋白不同，并可在两个不同波长下独立成像。举一个例子，第一报告核酸序列可编码GFP，其中第二报告核酸序列可编码RFP，或反之亦然。
在一个方面，第一报告核酸序列可编码PET报告蛋白，例如单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)，其中第二报告核酸序列可编码生物发光蛋白例如RL，或反之亦然。在另一方面，第一报告核酸序列可编码PET报告蛋白，例如HSV1-TK，其中第二报告核酸序列可编码荧光蛋白，例如RFP，或反之亦然。在其它方面，第一报告核酸序列可编码PET报告蛋白，例如HSV1-TK，其中第二报告核酸序列可编码MRI可成像蛋白，例如铁蛋白，或反之亦然。在又一方面，第一和第二报告核酸序列二者都可编码PET报告蛋白，其中所述蛋白不同，并可在两个不同时间点成像。在一个实施方案中，第一报告核酸序列可编码生物发光蛋白例如FL，其中第二报告核酸序列可编码MRI可成像蛋白，例如铁蛋白，或反之亦然。在其它实施方案中，第一报告核酸序列可编码荧光蛋白，例如GFP，其中第二报告核酸序列可编码MRI可成像蛋白，例如铁蛋白，或反之亦然。在另一实施方案中，第一和第二报告核酸序列二者都可编码MRI可成像蛋白，其中两种蛋白因其不同的共振信号而不同。
表达载体可进一步包含第三报告核酸序列，其中第一、第二和第三报告核酸序列中每一种都可编码生物发光蛋白或荧光蛋白，其中这三种蛋白不同，并可在不同波长下成像。举一个例子，第一报告核酸序列可编码RL，第二报告核酸序列可编码FL，而第三报告核酸序列可编码gaussi萤光素酶(GL)。在一方面，第一和第二报告核酸序列二者都可编码生物发光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码PET可成像蛋白，或反之亦然。在其它方面，第一和第二报告核酸序列二者都可编码生物发光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码MR可成像蛋白，或反之亦然。在另一方面，第一和第二报告核酸序列二者都可编码荧光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码PET可成像蛋白，或反之亦然。在再一方面，第一和第二报告核酸序列二者都可编码荧光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码MR可成像蛋白，或反之亦然。第一报告核酸序列可编码生物发光蛋白，第二报告核酸序列可编码荧光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码PET可成像蛋白或MR可成像蛋白。在另一方面，第一报告核酸序列可编码荧光蛋白，第二报告核酸序列可编码生物发光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码PET可成像蛋白或MR可成像蛋白。
第一报告核酸序列可编码PET可成像蛋白，第二报告核酸序列可编码荧光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码MR可成像蛋白。第一报告核酸序列可编码PET可成像蛋白，第二报告核酸序列可编码MR可成像蛋白，其中第三报告核酸序列可编码荧光蛋白。在一方面，第一报告核酸序列可编码MR可成像蛋白，第二报告核酸序列可编码荧光蛋白，其中第三报告核酸序列可编码PET可成像蛋白或生物发光蛋白。
用于监测干细胞的方法的一个或多个实施方案包括将第一表达载体递送给干细胞，其中所述第一表达载体包含第一报告核酸序列和第二报告核酸序列。所述方法进一步包括通过对于第一或第二报告核酸序列至少之一的表达成像来监测干细胞。所述第一报告核酸序列与第一表达调控序列可操作地连接，所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子，例如Oct4启动子。所述第二报告核酸序列与第二表达调控序列可操作地连接，所述第二表达调控序列包含应答元件，所述应答元件对一种或多种应答元件特异性蛋白例如GATA4蛋白的结合应答。第二表达调控系统进一步包含最小启动子。表达载体可进一步包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列，其中所述第三表达调控序列包含组成型启动子，例如泛素。
在某些实施方案中，所述方法包括将第一和第二表达载体相继或同时递送给干细胞，接着监测所述细胞。所述第一表达载体包含：与包含Oct4启动子的第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含对GATA4结合应答的应答元件。所述第二表达载体包含与表达调控序列可操作地连接的报告核酸序列，所述表达调控序列包含组成型启动子，例如泛素。
在某些其它实施方案中，所述方法可包括将第一、第二或第三表达载体序贯或同时递送给干细胞，接着监测所述细胞。所述第一表达载体可包含与包含Oct4的表达调控序列可操作地连接的报告核酸序列。所述第二表达载体包含与表达调控序列可操作地连接的报告核酸序列，所述表达调控序列包含对GATA4结合应答的应答元件和与所述应答元件可操作地连接的最小启动子。所述第三表达载体可包含与包含泛素的表达调控序列可操作地连接的报告核酸序列。
可将表达载体经由转染、转导、核转染(nucleofection)或其组合递送给干细胞。可通过电穿孔递送表达载体，所述电穿孔的有效性为化学转染的大约10倍。该程序对于将外源基因引入到细胞尤其是哺乳动物细胞亦高度有效。例如，可将电穿孔用于产生敲除小鼠的过程中，以及用于肿瘤治疗、基因疗法和基于细胞的疗法中。
在一个实施方案中，可将表达载体通过转染递送给细胞，其中将外源DNA引入真核细胞。在一个实例中，可通过核转染将表达载体递送给细胞。核转染提供转染甚至是不分裂细胞的能力，所述不分裂细胞例如神经元和静息血细胞。在其它实施方案中，亦可通过DNA纳米粒技术实施表达载体的递送。可用实时荧光光谱法，通过在纳米粒渗透细胞并在细胞核中释放其DNA的同时追踪纳米粒来监测DNA纳米粒转移。
用于本发明干细胞的有用递送系统可包括仙台病毒脂质体递送系统、阳离子脂质体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、慢病毒表达载体或其组合。脂质体作为递送溶媒的用途是一种引人关注的特别的方法。脂质体可与靶位点的细胞融合以将其内容物递送到细胞内。
可将包含本发明表达载体的干细胞移植到各种生物系统。干细胞样品可采集自患者或供体动物，通过插入本发明表达载体将其离体改造，并重新植入给患者，或移植给另一受体。在一个实例中，干细胞采集自患者，接着在培养物中扩大细胞数目，然后诱导分化为特定细胞，例如心脏细胞(cardiac cell)。在该方法期间的任何时间，可将包含报告核酸序列的表达载体引入到所述细胞中。可将干细胞移植给患者，或植入一个或多个相同物种或不同物种的不同受体。然后可监测细胞，以测定干细胞的不同细胞阶段。
可通过监测报告蛋白的表达来观察表达载体或载体至细胞的递送。所述细胞可为干细胞，其中所述干细胞选自单能干细胞、多能(pluripotent)干细胞、多潜能(multipotent)干细胞、全能干细胞或诱导的多能干细胞。在某些实施方案中，培养细胞或培养细胞的子代可包含含有两种或多种报告核酸序列的表达载体。
在体内实施用于监测干细胞分化状态的方法。可在各种组织中监测干细胞的分化状态，所述组织包括但不限于肌肉组织、结缔组织、神经组织、心脏组织或脂肪组织。干细胞监测可确定干细胞存在与否、浓度、定位或分化状态。可视发光或荧光报告蛋白产生的光强度来测定干细胞的浓度。通过监测并追踪成像的细胞，可测定在特定组织或器官中于特定时间点的干细胞定位。可视不同报告蛋白的颜色变化来确定分化或多能性阶段。
用包含第一、第二和第三报告核酸序列的表达载体转染干细胞。第一报告核酸序列与Oct4启动子可操作地连接，所述Oct4启动子为仅当细胞为干细胞时被激活的细胞特异性启动子。因此，当细胞为多能干细胞时编码报告蛋白的第一报告核酸表达。然而，当干细胞处于分化状态时报告蛋白不表达。第二报告核酸序列与GATA4蛋白结合的应答元件可操作地连接。GATA4蛋白为仅当细胞为心脏细胞时被激活的细胞特异性蛋白。因此，当细胞为心脏细胞时编码报告蛋白的第二报告核酸表达。然而，当心脏细胞去分化为干细胞时，报告蛋白不表达。
用于监测干细胞的本发明试剂盒实施方案包括表达载体。所述表达载体可包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含Oct4启动子，所述第二表达调控序列包含对GATA4蛋白结合应答的应答元件和最小启动子。
试剂盒可进一步包括另外的表达载体，其中所述另外的表达载体可包含可操作地连接包含组成型启动子例如泛素的表达调控序列的报告核酸序列。试剂盒亦可包含细胞(例如在冷冻条件下)和/或用于培养细胞的培养基。试剂盒可进一步包括用于处理一种或多种表达载体和/或细胞、将表达载体递送给细胞或培养细胞的方案。试剂盒可与阐述使用试剂盒方法的手册一起包装。在特定实施方案中，试剂盒可包括含有表达载体的干细胞或干细胞子代，其中所述表达载体可包含可操作地连接Oct4启动子的第一报告核酸序列；和可操作地连接应答元件(用于结合GATA4蛋白)和最小启动子的第二报告核酸序列。
对于使用ES细胞作为治疗应用来源，植入的ES细胞的免疫排斥和致瘤性是其挑战。所述与植入的ES细胞的免疫排斥相关的问题可通过用患者特异性的多能干细胞来消除，所述多能干细胞通过对采自所述患者的体细胞的重编程来产生。体外和体内评估ES细胞的多能性可在检测致瘤性及在开发预防致瘤性的策略中有帮助。
实施例1
用无血清培养基培养未分化的胚胎干细胞
自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得鼠ES-D3细胞系(CRL-1934)。通过与1000IU/mL白血病抑制因子在37℃(LIF；Chemicon，ESGRO，ESG1107)于含5％CO2/空气的增湿培养箱中孵育，将ES细胞保持在未分化多能状态。在0.1％明胶包被的塑料皿上用ES培养基来培养ES细胞，其中所述培养基为Knockout Dulbecco改良的Eagle培养基。Eagle培养基补充有15％Knockout血清替代品、0.1mmol/L的β-巯基乙醇和2mmol/L谷氨酰胺。每天更换ES培养基，每2-3天传代ES细胞。
实施例2
胚胎干细胞的体外分化
通过取出LIF并加入高浓度的胎牛血清，体外实施ES细胞分化。在0.1％明胶包被塑料皿上于含有Iscove’s Dulbecco改良的Eagle培养基的分化培养基中培养ES细胞，所述培养基补充有15％胎牛血清、0.5mmol/L硫代甘油和2mmol/L glutamax。在用coelentrazine或D-萤光素对细胞光学成像后每天更换ES培养基。
实施例3
干细胞特异性的组成型启动子驱动的光学报告基因系统的构建
通过用HindIII和NotI限制性酶限制性消化，使干细胞特异性的Oct4启动子的基因片段从质粒释放。在pRL-CMV载体(Promega)的CMV启动子区域产生NotI限制性酶位点，然后用HindIII和NotI限制酶消化。让Oct4启动子的粘性末端片段在海肾萤光素酶基因的上游区与pRL-CMV载体连接，以制备Oct4启动子驱动的海肾萤光素酶构建体(Oct4-hRLuc)。用HindIII和BglII限制性酶自Oct4-hRLuc释放Oct4启动子基因片段，并连接到多克隆位点pGL4.10载体(Promega)中，以制备Oct4启动子驱动的人源化萤火虫萤光素酶构建体(Oct4-FLuc2)。为了用Oct4-hRLuc制备ES细胞，用BglII和XbaI限制性酶自Oct4-hRLuc释放Oct4启动子驱动的hRLuc区段，并连接到用相同限制性酶消化的pcDNA 3.1puro中(puro Oct4-hRLuc)。制备了包含泛素启动子驱动的萤火虫萤光素酶增强的绿色荧光蛋白的融合蛋白的慢病毒载体(Ubiq-FLuc-eGFP)。
为了产生编码与eGFP融合的萤火虫萤光素酶(FLuc)的双功能报告基因系统，从含有FLuc-eGFP和截短的单纯疱疹胸苷激酶的三部分融合报告基因构建体经PCR扩增FLuc-eGFP(FG)。用以下引物产生eGFP的终止密码子并分别在5′端和3′端产生克隆位点BamHI和KpnI：5′-gcggatccGCCACCATGGAAGACGCCAA-3′(SEQ ID NO：1)和5′-gcggtaccctaCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′(SEQ ID NO：2)。然后将该片段克隆到pHRG(含有海肾萤光素酶基因的无启动子报告质粒(promoter less reporter plasmid))中以制备pHRFG。用以下引物从pFUG经PCR扩增泛素启动子，在5′端产生Clal位点：5′-ggggatcgatAACCCGTGTCGGCTCCAGAT-3′(SEQ ID NO：3)和5′-GGCGTCTTCCATGGATCCTC-3′(SEQ ID NO：4)。然后将该片段连接到pHRFG的Clal和BamH1位点来制备pHRUFG。最后，制备了含有两个不同基因Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的两个表达调控序列的载体(图1)。图1显示具有组成型泛素启动子和细胞特异性Oct4启动子的本发明构建体。
实施例4
瞬时转染并用萤火虫和海肾萤光素酶测定来评估Oct4-hRLuc和Oct4-FLuc2的干细胞特异性
用基于脂质体的方法用Oct4-hRLuc和Poct4-Fluc2瞬时转染小鼠ES细胞、大鼠成肌细胞(H9C2)细胞和人肾癌细胞(HEK-293T)。用200ng/孔DNA和LipofectamineTM 2000来转染。除非另外指出，否则在所有瞬时转染研究中，将5ng/孔的其它光学报告物(reporter)例如CMV启动子驱动的FLuc2(CMV-FLuc2)或CMV启动子驱动的hRLuc(CMV-hRLuc))用于转染标准化。用CMV-hRLuc和CMV-Fluc2作为对照瞬时转染小鼠ES细胞、H9C2和HEK-293T。在瞬时转染后48小时进行萤火虫和海肾萤光素酶测定。如下所述实施用于萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶活性的发光计测定。简言之，在Promega提供的200ml冰冷的1X被动裂解缓冲液中裂解转染过的细胞，并在冰上振摇15分钟。让细胞裂解液以1.3×104g在4℃离心5分钟，以除去细胞碎片。为测定海肾萤光素酶活性，通过加入0.5mg的coelenterazine到100ml磷酸缓冲盐水pH7.0(PBS)中来测定20ml上清液，接着在发光计(T型20/20；Turner Designs，Sunnyvale，CA)中计数光子达10秒。如就海肾萤光素酶活性所述的来测定萤火虫萤光素酶活性，但用100ml来自Promega的萤光素酶测定试剂II(LARII)底物代替coelenterazine。通过Bradford测定试剂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)来测定细胞裂解液中的蛋白浓度。用萤火虫萤光素酶活性，对海肾萤光素酶活性进行就蛋白含量及转染效率而言的标准化，并将所述海肾萤光素酶活性表示为每微克蛋白每分钟计数的相对光单位(RLU)。也用海肾萤光素酶活性将萤火虫萤光素酶活性进行就蛋白含量及转染效率而言的标准化。
对于Oct4-hRLuc和CMV-hRLuc转染，小鼠ES细胞显示更高的Oct4启动子活性，但显示与H9C2和HEK-293T细胞相似或更低的CMV启动子活性。与H9C2和HEK-293细胞比较，小鼠ES细胞中的Oct4启动子活性(由CMV启动子活性标准化)分别为其43和647倍(T-检验，p＝0.002)。对于Oct4-FLuc2和CMV-FLuc2转染，小鼠ES细胞显示更高的Oct4启动子活性，但显示比HEK-293T细胞更低的CMV启动子活性。与HEK-293细胞比较，小鼠ES细胞中由CMV启动子活性标准化的Oct4启动子活性为其401倍(T-检验，p＝0.001)。图2A-2D为表示与分化的成体细胞系相比胚胎干细胞的Oct4表达特异性的图表。图2A显示与H9C2和HEK-293T细胞相比更高的小鼠ES细胞的Oct4-hRLuc活性，但与H9C2和HEK-293T细胞相比显示相似或更低的CMV启动子活性。图2B显示由CMV-hRLuc活性标准化的Oct4-hRLuc活性，其中Oct4-hRLuc活性显著高于H9C2和HEK-293细胞中的活性。图2C显示与HEK-293T细胞比较，小鼠ES细胞的Oct4-FLuc2活性更高，但CMV启动子活性比HEK-293T细胞中的低。图2D显示由CMV-FLuc2活性标准化的Oct4-FLuc2活性，其中Oct4-FLuc2活性显著高于HEK-293细胞中的活性。
实施例5
瞬时ES细胞转染和Oct4-hRLuc活性随时间的变化
用基于脂质体的方法用Oct4-hRLuc和CMV-FLuc2瞬时转染小鼠ES细胞，并在分化培养基中培养。在转染后1-6天期间用发光计测定实施萤火虫和海肾萤光素酶测定。为评估每一细胞的Oct4启动子活性，由CMV-FLuc2活性标准化Oct4-hRLuc活性。
在小鼠ES细胞中测量了由CMV启动子活性标准化的Oct4启动子活性。用含Oct4-hRLuc和CMV-FLuc2的脂质体瞬时-转染小鼠ES细胞。转染后2天Oct4活性最高，然后经4天活性逐渐降低。图3阐明转染的小鼠ES细胞在转染2天时显示最高的经标准化的RLuc活性，此后标准化的RLuc活性随时间逐渐降低。
实施例6
用Oct4-hRLuc和Ubiq-Fluc-eGFP制备稳定的ES细胞
通过基于脂质体的转染用puro Oct4-hRLuc和Ubiq-Fluc-eGFP来转染小鼠ES细胞，并用嘌呤霉素(500ng/ml浓度)选择。在获得稳定表达Oct4-hRLuc的小鼠ES细胞后，让细胞重悬在含8ug/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene)(Sigma)的OptiMEM中。在细胞培养孵育箱中于37℃和5％CO2中在3小时内以5的感染复数来转导细胞。3小时后将新鲜生长培养基加入到细胞中。然后孵育细胞48-72小时，随后通过流式细胞术分选和分析，以及进行生物发光成像。病毒的转染效率为71％，分选具有最高eGFP表达的细胞用于进一步实验。
实施例7
用分化培养基培养细胞中的Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP活性变化
用无血清ES细胞维持培养基将稳定表达Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP二者的小鼠ES细胞在6孔板上铺板(105/孔)。24小时后，将细胞转移到分化培养基中。通过用冷却的电荷耦合器件(CCD)相机(Xenogen I VIS；Xenogen Corp.Alameda，CA)用D-萤光素和coelenterazine的生物发光成像测定海肾萤光素酶和萤火虫萤光素酶活性。
用分化培养基在细胞培养物中稳定表达Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的小鼠ES细胞随时间的hRLuc和Fluc2活性。Ubiq-FLuc活性随细胞数量的增加而增加，而Oct4-hRLuc活性(图4A)在分化培养基中尽管细胞数量增加却降低。用Ubiq-Fluc活性来标准化Oct4-hRLuc活性，其中两种活性都随时间降低(图4B)。图4A-B为阐明在分化培养基中稳定表达Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的小鼠ES细胞的随时间的萤光素酶活性的图表。PCR分析显示Oct4mRNA水平随时间降低。图5表示PCR扩增的随时间降低的Oct4的mRNA水平。
实施例8
在活小鼠中小鼠ES细胞异种移植物的Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP活性的变化
按照斯坦福大学动物研究委员会指南实施动物处理。在所有注射和成像程序期间，用异氟烷(100％氧气中2％异氟烷，1L/分钟)将小鼠气体麻醉。用冷却的电荷耦合器件(CCD)相机(Xenogen IVIS29；Xenogen Corp.)对小鼠成像。用Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP来稳定共转染小鼠ES细胞(1×106)。然后将细胞植入7周龄的雌性小鼠(nu/nu，Charles River)中。为测定活小鼠中植入的ES细胞的Oct4启动子活性，经由尾静脉注射5％乙醇和95％PBS混合物中的20μg的coelenterazine(终体积200μl)，用IVUS系统以1分钟获取时间立即对小鼠成像。将动物置于不透光的室内，在低水平光照下获得灰度参考图像。在收集自植入的细胞发射的光子后用Living Image软件(Xenogen Corp.)和Igor图像分析软件(Wavemetrics)来获得图像。为了定量所测量的光，在植入细胞的区域内测定每球面度每平方厘米每秒的平均及最大光子。
为测定活小鼠中植入的ES细胞的泛素启动子活性，经由尾静脉注射3mg的D-萤光素/PBS(终体积200μl)，5分钟后用IVUS系统以1分钟获取时间对小鼠成像，直到光输出达到最大点。如上述coelenterazine成像一样进行数据分析。监测稳定表达Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的小鼠ES细胞，以测定萤光素酶活性。异种移植物的Oct4-hRLuc活性迅速降低。24小时后成像，而Oct4-hRLuc活性为植入小鼠ES细胞后5分钟测量的活性的约1.7％。Ubiq-FLuc活性亦降低，其为植入后24小时获取图像的起始活性的19％，但此后活性逐渐增加。图6A-D表示活小鼠异种移植物中Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP活性的变化。图6A和6B阐明异种移植物的Oct4-hRLuc活性迅速降低，并且在24小时后为植入细胞后5分钟时测量的活性的1.7％。图6C和6D阐明Ubiq-FLuc活性逐渐降低，并且24小时后为植入细胞后5分钟时测量的活性的19％，但此后逐渐增加。图6A-B显示通过对异种移植物的Oct4-hRLuc活性成像的细胞分化状态的图像，其显示植入后24小时内信号快速降低。图6C显示植入后通过对Ubiq-FLuc活性成像以追踪细胞存活的图表，图6D显示植入后通过对Ubiq-FLuc活性成像以追踪细胞存活的一系列小鼠图像，图表显示初始降低接着72小时后逐渐增加。
实施例9
制备GATA-4应答元件报告基因(GRERG)系统
开发了转录因子应答报告基因成像技术，以测定对内胚层和心脏分化很关键的GATA4结合蛋白的表达。通过将4拷贝的GATA结合序列与最小启动子(来自PG51uc载体)驱动的人源化萤火虫萤光素酶基因连接，来构建GATA4结合蛋白应答元件报告基因系统(GRERG)。用PGL4.10(来自Promega)作为骨架。将四个GATA结合序列和腺病毒的主要晚期启动子序列序贯插入到pGL4.10的多克隆位点。使用XhoI和HindIII限制性酶位点来插入GATA应答元件(图7)。将四个GATA结合序列和腺病毒的主要晚期启动子序列序贯插入到pGL4.10的多克隆位点，其如图7所示。
实施例10
制备产生GATA4结合蛋白的载体
含GATA4结合蛋白的cDNA的质粒购自Openbiosystem。用PCR扩增cDNA序列。将NheI和XhoI的限制性酶位点引入到PCR扩增的DNA的每一端。将目的基因克隆到表达pcDNA3.1载体的哺乳动物细胞(图8)中。将载体转染到HEK 293细胞中，并评估GATA4结合蛋白的表达。用载体转染的细胞显示GATA4结合蛋白mRNA的表达更高(图9)。图9为编码GATA4蛋白的cDNA序列的PCR扩增图像。
实施例11
报告基因表达：发光计测定(体外)和生物发光成像(体内)
将构建的表达载体共转染到HEK 293细胞中，以测定GATA4结合蛋白应答元件驱动的报告基因系统(GRERG)的表达。用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)进行转染。应用几种不同浓度的GATA4结合蛋白表达载体，以优化合适的载体剂量。通过发光计测定来测量GRERG的萤光素酶活性，其中通过共转染GATA4结合蛋白表达载体来增加GRERG活性，其如图10所示。测量(发光计)来自用固定浓度的GRE-萤光素酶转染和用渐增浓度的表达GATA结合蛋白的质粒载体共转染的HEK 293T细胞的萤光素酶活性。增加GATA4蛋白表达通过与GATA4-应答元件结合来激活萤光素酶的表达。
GRERG-活性的增加率与GATA4结合蛋白表达载体浓度成比例(约6倍)。通过生物发光成像(BLI)测定(用IVUS)来测量HEK 293细胞中的GRERG的萤光素酶活性。通过在HEK 293细胞中共转染GATA4结合蛋白表达载体，亦增加GRERG的BLI活性(图11)。当用1μg GATA4结合蛋白表达载体共转染的细胞与单独GRERG(无GATA4结合蛋白表达载体)比较，GRERG活性增加约6倍。图11为自用固定浓度GRE-萤光素酶转染和用渐增浓度的表达GATA结合蛋白的质粒载体共转染的HEK 293T细胞中测量的萤光素酶活性(CCD相机成像)的柱状图。增加GATA4蛋白表达通过与GATA4-应答元件结合来激活萤光素酶的表达。
将构建的表达载体共转染到HCT 116细胞中，以测定GATA4结合蛋白应答元件报告基因(GRERG)系统的表达。用LipofectamineTM2000(Invitrogen)进行转染。应用几种不同浓度的GATA4结合蛋白表达载体，以优化载体剂量。通过在HCT 116结肠癌细胞中共转染GATA4结合蛋白表达载体，亦增加通过BLI(用IVUS)测定测量的GRERG的萤光素酶活性。当用1.5μg GATA4结合蛋白表达载体共转染的细胞与单独GRERG(无GATA4结合蛋白表达载体)比较时，GRERG活性增加约16倍，其如图12所示。通过生物发光成像自用固定浓度的GRE-Flue报告物转染和用不同剂量的GATA结合蛋白共转染的HCT 116结肠癌细胞中测量萤光素酶的表达(图12)。在HCT116结肠癌细胞中用5-氮杂胞苷处理，亦增加由BLI(用IVUS)测定测量的GRERG萤光素酶活性，其如图13所示。在用GRE-FLUC转染的HCT 116结肠癌细胞中，用5-氮杂胞苷处理后萤光素酶的表达随时间(1-3小时)增加。5-氮杂胞苷通常激活内源性GATA表达。
实施例12
干细胞特异性的组成型及诱导型启动子驱动的光学报告基因系统的构建
通过用HindIII和NotI限制性酶的限制性消化，使干细胞特异性的Oct4启动子的基因片段从质粒释放。将Oct4启动子的粘性末端片段在海肾萤光素酶基因的上游区与pRL-CMV载体连接，以制备Oct4启动子驱动的海肾萤光素酶构建体(Oct4-hRLuc)。为制备含Oct4-hRLuc的ES细胞，用BglII和XbaI限制性酶自Oct4-hRLuc释放Oct4启动子驱动的hRLuc区段，并连接到用相同限制性酶消化的pcDNA 3.1puro中(puro Oct4-hRLuc)。
从含有FLuc-eGFP和截短的单纯疱疹胸苷激酶的三部分融合报告基因构建体，通过PCR扩增编码与eGFP、FLuc-eGFP(FG)融合的萤火虫萤光素酶(FLuc)的双功能报告基因系统。然后将该片段克隆到pHRG(含有海肾萤光素酶基因的无启动子报告质粒)中以制备pHRFG。用以下引物从pFUG PCR扩增泛素启动子，在5′端产生Clal位点：5′-ggggatcgatAACCCGTGTCGGCTCCAGAT-3′(SEQ ID NO：3)和5′-GGCGTCTTCC ATGGATCCTC-3′(SEQ ID NO：4)。然后将该片段连接到pHRFG的Clal和BamHI位点来制备pHRUFG。将泛素的表达调控序列进一步克隆到含有Oct4-hRLuc的pcDNA 3.1中，形成具有Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的构建体。用PCR扩增GATA4结合蛋白的cDNA序列。将NheI和Xhol的限制性酶位点引入到PCR扩增的DNA的每一端。将目的基因克隆到表达pcDNA 3.1载体的哺乳动物细胞中。最后，将GRERG序列引入含有Oct4-hRLuc和Oct4-hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的pcDNA 3.1中，以形成具三个表达调控序列的载体(图14)。
尽管本文仅阐明及阐述本发明的某些特征，但对本领域技术人员而言将进行很多修改和改变。因此，应该理解，所附权利要求旨在涵盖落在本发明范围内的所有这类修改和改变。
Claims (14)
1.用于瞬时转染的表达载体，所述表达载体包含：
与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含至少一个Oct4启动子；和
与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件，其中所述应答元件包含GATA-4蛋白-结合序列的至少四个重复。
2.权利要求1的表达载体，其中所述第二表达调控序列还包含与所述应答元件可操作地连接的最小启动子。
3.权利要求1的表达载体，其还包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
4.权利要求3的表达载体，其中所述第三表达调控序列包含组成型启动子。
5.权利要求3的表达载体，其中所述第一、第二或第三报告核酸序列中的至少一种编码多肽，所述多肽可通过光学成像、磁共振成像、正电子发射断层显像、单光子发射计算机断层显像或其组合来成像。
6.权利要求1的表达载体，其中所述第一或第二报告核酸序列中的至少一种编码可由正电子发射断层显像成像的多肽。
7.权利要求1的表达载体，其中所述第一或第二或二种报告核酸序列都编码本身产生荧光的多肽。
8.包含权利要求1的表达载体的培养细胞。
9.用于瞬时转染的表达载体在制备用于监测干细胞的试剂盒中的用途，包括：
将包含第一报告核酸序列和第二报告核酸序列的第一表达载体递送给所述干细胞；和
通过对所述第一或第二报告核酸序列表达的至少一种成像来监测所述干细胞，
其中所述第一报告核酸序列与第一表达调控序列可操作地连接，所述第一表达调控序列包含至少一个Oct4启动子，并且所述第二报告核酸序列与第二表达调控序列可操作地连接，所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件，其中所述应答元件包含GATA-4蛋白-结合序列的至少四个重复。
10.权利要求9的用途，其中所述表达载体还包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
11.权利要求10的用途，其中所述干细胞选自单能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、全能干细胞、诱导的多能干细胞或其组合。
12.权利要求9的用途，还包括：
将第二表达载体递送给所述干细胞，然后进行所述监测步骤，其中所述第二表达载体包含与包含组成型启动子的第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
13.用于监测干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于瞬时转染的表达载体，其中所述表达载体包含：
与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和
与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，
其中所述第一表达调控序列包含至少一个Oct4启动子，并且所述第二表达调控序列包含对GATA4蛋白的结合应答的应答元件，其中所述应答元件包含GATA-4蛋白-结合序列的至少四个重复。
14.权利要求13的试剂盒，所述试剂盒还包括另外的表达载体，其中所述另外的表达载体包含与包含组成型启动子的第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
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