CN1910159A - 2,4－二氨基嘧啶和它们用于诱导心肌发生的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了式I的化合物，其用于体内和体外诱导哺乳动物细胞中，特别是胚胎干细胞中的心肌发生。
Description
相关申请的交互参照
本申请要求2004年1月16日提交的美国临时专利申请号60/537,144的优先权，该申请的教导在此全部引用作为参考。
发明背景
心脏病是全世界的主要问题，包含许多不同的疾病和状况。例如，心肌病是心肌的疾病，其中心脏丧失泵血能力和，在一些情况下，心节律紊乱，导致不规则心跳或心律不齐。心肌病影响成千上万的所有年龄的美国人并且是心脏移植的主要原因。该状况是进行性的且有时很快恶化。
通过用干细胞有助于理解心肌的发育和功能。干细胞是具有自身更新和响应适当信号分化成特化细胞能力的多能细胞。参见，例如，Spradling等人，Nature，414：98-104(2001)。大部分组织具有内源性干/祖细胞，在器官受到损伤时所述内源性干/祖细胞可以在损伤部位增殖和分化。然而，成人心脏主要由有丝分裂后的和终末分化细胞组成。虽然最近鉴定了具有心脏干细胞特征的心肌细胞亚群，但是它们有限的可获得性阻碍了治疗性应用。参见，例如，Beltrami等人，Cell，114：763-776(2003)。来自其它组织，诸如骨髓的干细胞显示能修复动物模型中的心脏损伤，但是低分化效率和可能与体细胞融合限制了它们在心脏修复中的用途。参见，例如，Ferrari等人，Science，279：1528-30(1998)。
多能胚胎干(ES)细胞代表功能心肌细胞的可能的无限来源。此种心肌细胞可能有助于ES细胞在心脏病中的治疗性应用，以及提供了用于探测心肌细胞分化和心脏发育的分子机制的重要工具。然而，迄今为止，ES细胞体外分化成心肌细胞涉及没充分确定的、无效的和相对非选择性的过程。参见，例如，Boheler等人，Circ.Res.，91：189-201(2002)。
因此，本领域认识到需要用于诱导和指导ES细胞分化成心肌细胞的组合物和方法。特别需要可以诱导ES细胞体内和体外分化成心肌谱系细胞的小分子。本发明满足了这些需要和其它需要。
发明概述
本发明提供了用于诱导和指导ES细胞分化成心肌谱系细胞的新的组合物和方法。
本发明的一个实施方案提供了具有以下结构的式I的化合物：
在式I中，R1是官能团，包括但不限于氢、C1-4烷基、C3-8环烷基和C0-2烷基芳基，用0-2个R1a基取代，所述0-2个R1a基是独立选择的并且是包括但不限于卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、-OH、-N(R1b，R1b)、-SO2N(R1b，R1b)、-C(O)N(R1b，R1b)、杂环烷基和-O-芳基的官能团，或当R1a基在相邻环原子上时，它们任选一起形成包括但不限于-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-和-(CH2)3-4-的官能团，或R1任选与它连接的氮一起形成杂环，其任选用C1-4烷基、C3-8环烷基、C1-4烷基羟基和C0-2烷基芳基取代；每个R1b基是独立选择的并且是包括但不限于氢和C1-4烷基的官能团。在式I中，R2是包括但不限于C1-4烷基、C3-8环烷基和C0-2烷基芳基的官能团，其用0-2R2a基取代。R2a基是独立选择的并且是包括但不限于卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、-N(R2b，R2b)、-SO2N(R2b，R2b)、-C(O)N(R2b，R2b)和-O-芳基的官能团，或当R2a基在相邻环原子上时，它们任选一起形成包括但不限于-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-和-(CH2)3-4-的官能团；且每个R2b基是独立选择的并且是包括但不限于氢和C1-4烷基的官能团。在式I中，R3一般是氢，或R3任选与连接的R2和氮一起形成杂环，其例如，任选用C1-4烷基或C0-2烷基芳基取代。
本发明的化合物包括其所有可药用盐、异构体、溶剂化物、水合物和前体药物。
在另一实施方案中，本发明提供了诱导心肌发生(cardiomyogenesis)的方法。将哺乳动物细胞与式I或II的化合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系的细胞。接触的步骤可以是体内或体外接触。考虑到它们诱导心肌发生的能力，式I或II的化合物用于治疗心肌病症，诸如心肌病和心律不齐，和用于修复例如心脏病发作引起的心肌组织损伤。
本发明的另一实施方案提供了治疗心肌病症的方法，所述治疗心肌病症的方法通过将哺乳动物细胞与式I的化合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。哺乳动物细胞还可以与有利于心肌发生的其它化合物或蛋白质接触。如果哺乳动物细胞与式I或II的化合物体外接触，向具有可治疗的病症的个体施用分化的细胞，从而治疗该病症。在一些实施方案中，哺乳动物细胞附着在固相支持体(例如，三维基质或平面表面)上或注射到心肌的损伤部位。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞与式I或II的化合物体内接触。如果哺乳动物细胞与式I或II的化合物体内接触，接触步骤可以通过向哺乳动物经口、静脉内、皮下或腹膜内施用该化合物。
在一些实施方案中，检测了哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。在一些实施方案中，通过检测心肌发生标志基因，例如心房钠尿肽(“ANF”)的表达检测哺乳动物细胞向成心肌细胞的分化。在其它实施方案中，通过检测心肌细胞特异转录因子(例如，MEF2或Nkx2.5或同源结构域转录因子HOP)的表达检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。在其它实施方案中，通过检测心肌特异基因(例如肌球蛋白轻链2V或eHAND)的表达检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。还在其它实施方案中，通过检测心脏特异基因，诸如GATA-4的表达，或通过检测涉及心肌收缩性的基因诸如肌节肌球蛋白重链(MHC)的表达检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。在其它实施方案中，通过用本领域技术人员公知的标准技术观察心肌搏动可以检测分化。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是干细胞(例如胚胎干细胞或胚胎癌细胞)。在一些实施方案中，干细胞从小鼠(例如，鼠未分化的R1胚胎干细胞或鼠癌P19细胞)或从灵长类动物(例如，人)分离。
在以上方法的一些实施方案中，向哺乳动物细胞施用的化合物是cardiogenol A、B、C或D，或包含cardiogenol A、B、C或D的一种或多种的组合物。
本发明的其它实施方案和优点从以下的详细描述中是显而易见的。
附图简述
图1.用ANF启动子报道基因测定法对心肌发生的高通量测定。该图显示用表达萤光素酶的包含ANF启动子报道基因质粒的稳定P19克隆获得的数据。该图显示在用于P19细胞的标准心肌发生分化条件下(EB形成和用1％DMSO处理)(参见Skerjank IS，Trends Cardiovasc Med，9：139-143(1999))，几天后，来自这个P19克隆的萤光素酶信号增加了5-至7-倍。
图2.在用0.25μM cardiogenol C处理的ESC(A至E)和P19CL6细胞(F)中心肌标志的免疫染色：(A)和(E)肌球蛋白重链(绿色)；(B)GATA-4(红色)；(C)MEF2(红色)；(D)Nkx2.5(红色)；和(E)肌球蛋白重链(绿色)和MEF2(红色)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。细胞用4％的多聚甲醛(Sigma)固定20分钟。在含有0.3％Triton X-100和6％马血清的PBS(Gibco)中进行细胞染色。以以下稀释度使用一级抗体：肌球蛋白重链(MHC)小鼠单克隆抗体MF20(Developmental Studies Hybridoma Bank，1∶200)、兔多克隆抗GATA-4抗体(Santa Cruz Biotech，1∶300)、兔抗MEF2抗体(Santa CruzBiotech，1∶100)和山羊抗Nkx2.5抗体(Santa Cruz Biotech，1∶100)。二级抗体是Cy2-缀合的抗小鼠(1∶300)或Cy3缀合的抗兔或抗山羊抗体(JacksonImmunoResearch，1∶500)。细胞核用DAPI(Roche)染色。用200倍放大的Nikon Eclipes TE2000显微镜照相。用Metamorph组装(assemble)双标记或三标记图像。
图3.不用cardiogenol C处理(对照)的ESC的免疫染色。(A).MHC(绿色)和核(蓝色)。(B).GATA-4(红色)和核(蓝色)。分别与图2A和2E比较。
图4.这个图显示可以用于诱导哺乳动物细胞中心肌发生的本发明的其它化合物。
发明详述
I.引言
本发明提供了用于将哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞的化合物、组合物和方法。更特别地，本发明提供了用于将哺乳动物细胞分化为心肌谱系细胞的式I和II的化合物。在一些实施方案中，提供了包含式I或II的化合物的组合物。在其它实施方案中，提供了诱导哺乳动物细胞中心肌发生的方法。根据本发明的方法，可以体内或体外诱导肌发生。
II.定义
除非另外定义，文中所用的所有技术和科学术语一般具有本发明所属领域普通技术人员一般理解的相同含义。一般地，文中所用的术语和用于有机和分析化学的实验步骤是本领域公知的和常用的。
除非另外说明，术语“烷基”本身或作为另一取代基的部分，表示直链或支链，或环烃基，或其组合，所述烷基可以是完全饱和的、单或多不饱和的且可以包括二价和多价基，具有指定的碳原子数(即C1-C10表示1至10个碳原子)。饱和烃基的实例包括诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基的基团，其同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁间二烯基)、2，4-戊二烯、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、和高级同系物和异构体。除非另外注明，术语“烷基”也意在包括以下更详细定义为“杂烷基”的烷基衍生物。限于烃基的烷基称为“同烷基”(homoalkyl)。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的部分表示衍生自烷的二价基，通过-CH2CH2CH2CH2-举例说明，且还包括以下描述为“杂亚烷基”的基团。一般地，烷基(或亚烷基)具有1至24个碳原子，具有10个或更少碳原子的基团是本发明优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是一般具有8个或8个以下的碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫代”(或硫代烷氧基)以它们常规意义使用，且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的剩余部分连接的那些烷基。
除非另外说明，术语“杂烷基”自身或与另一术语组合表示稳定的直链或支链、或环烃基或其组合，由所陈述数目的碳原子和选自O、N、Si和S的1至3个杂原子组成，并且其中氮原子和硫原子可以任选为氧化的并且氮杂原子可以是任选季铵化的。可以将杂原子O、N和S置于杂烷基的任意内部位置。可以将杂原子Si置于杂烷基的任意位置，包括烷基与分子的剩余部分连接的位置。实例包括-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-(CH3)2、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。多达两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”自身或作为另一取代基的部分表示衍生自杂烷基的二价基，通过-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-举例说明。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据一个或两个链末端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，不隐含连接基团的方向。
除非另外说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或与其它术语组合分别代表“烷基”和“杂烷基”的环化形式。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子的剩余部分连接的位置。环烷基的实例包括环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)，1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。
除非另外说明，术语“卤”或者“卤素”自身或作为另一取代基的部分，表示氟、氯、溴或碘原子。此外，术语诸如“卤烷基”意在包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”意在包括三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
除非另外说明，术语“芳基”表示可以是稠合在一起或共价连接的单环或多环(多达三个环)的多不饱和、通常芳族的烃取代基。术语“杂芳基”是指含有0至4个杂原子的芳基(或环)，所述杂原子选自N、O和S，其中氮和硫原子任选是氧化的，且氮原子任选季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的剩余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。每个以上谈及的芳基和杂芳基环系统的取代基选自以下描述的可接受的取代基。
为了简化，当与其它术语(例如，芳氧基、芳硫氧基(arylthioxy)、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如以上定义的芳基和杂芳基。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基与烷基连接的基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，包括其中碳原子(例如，亚甲基)例如由氧原子置换的烷基(例如，苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等)。
每个以上术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意在包括所指基的取代和非取代形式。以下提供了对于每种类型基团的优选取代基。
烷基和杂烷基的取代基(包括常常称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环链烯基和杂环链烯基的基团)可以是选自：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和-NO2且数目为0至(2m’+1)的多种基团，其中m’是此种基团中碳原子的总数。R’、R”和R每个独立地指氢、未取代的(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基、用1-3个卤素取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基-(C1-C4)烷基。当R’和R”与相同的氮原子连接时，它们可以与氮原子组合形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意在包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的以上讨论，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括诸如卤烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)的基团。
相似地，芳基和杂芳基的取代基是不同的并且选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO2、-CO2R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)2R’、-NR’-C(O)NR”R、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-N3、-CH(Ph)2、全氟(C1-C4)烷氧基和全氟(C1-C4)烷基；所述取代基的数目为0至芳环系统上开放原子价的总数目；且其中R’、R”和R独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
可以任选用式-T-C(O)-(CH2)q-U-的取代基置换芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基，其中T和U独立地为-NH-、-O-、-CH2-或单键，且q是0至2的整数。备选地，可以任选用式-A-(CH2)r-B-的取代基置换芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基，其中A和B独立地为-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，且r是1至3的整数。可以任选用双键置换如此形成的新环的单键之一。备选地，可以任选用式-(CH2)s-X-(CH2)t-的取代基置换芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基，其中s和t独立地是0至3的整数，且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。-NR’-和-S(O)2NR’-中的取代基R’选自氢或未取代的(C1-C6)烷基。
文中所用的术语“卤”或者“卤素”是指Cl、Br、F或I取代基。术语“卤烷基”等等是指至少一个氢原子由Cl、Br、F或I原子，包括不同卤原子混合物置换的脂族碳基团，三卤烷基包括例如，三氟甲基等等作为优选基团。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫代”(或硫代烷氧基)以它们的常规意义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的剩余部分连接的那些烷基。
如文中所用的，术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)和硫(S)。
术语“可药用盐”意在包括活性化合物的盐，其是用相对无毒性的酸或碱制备，这取决于文中描述的化合物上发现的特定取代基。当本发明的化合物含有相对酸性官能度时，通过此类化合物的中性形式与充足量的(无论是纯的或在合适的惰性溶剂中的)所希望的碱接触，可以获得碱加成盐。可药用的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐、或相似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性官能度时，通过此类化合物的中性形式与充足量的(无论是纯的或在合适的惰性溶剂中的)所希望的酸接触，可以获得酸加成盐。可药用酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如氢氯酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等等的盐，以及衍生自相对无毒性有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等等的盐。也包括氨基酸诸如精氨酸等等的盐，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等等的盐(参见，例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts，”Journal ofPharmaceutical Science，66：1-19(1977))。本发明的某些特定化合物含有允许将该化合物转化成碱或酸加成盐的碱性和酸性官能度。
通过将盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物可以再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与多种盐形式在某些物理性质，诸如在极性溶剂中的溶解性上不同，但是对于本发明，在其它方面盐与化合物的母体形式等同。
除了盐形式外，本发明还提供了前体药物形式的化合物。文中描述的化合物的前体药物是在生理条件下容易经历化学变化以提供本发明的化合物的化合物。此外，在离体环境中，通过化学或生物化学方法，前体药物可以转化成本发明的化合物。例如，当置于有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂贮库时，前体药物可以缓慢转化成本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式，包括水合形式存在。大体上，溶剂化形式与非溶剂化形式等同并且意在包含在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶态或无定形形式存在。大体上，对于本发明预计的用途，所有物理形式都是等同并且意在包含在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映体、几何异构体和个别异构体全部意在包括在本发明的范围内。
本发明的化合物在组成此类化合物的一个或多个原子上也可以含有原子同位素的非天然部分。例如，可以用放射性同位素，例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)放射标记该化合物。本发明化合物的所有同位素变异，无论是放射性或非放射性的，都意在包含在本发明的范围内。
如文中所用的“心肌发生”是指祖细胞或前体细胞分化成心肌细胞(即心肌细胞)和心肌组织的生长。祖细胞或前体细胞可以是多能干细胞，例如，胚胎干细胞。祖细胞或前体细胞可以是预定型为心肌谱系的细胞(例如，前心肌细胞)或没有预定型的细胞(例如，多能成人干细胞)。
如文中所用的“干细胞”是指能分化成多种细胞类型的任意自我更新的多能细胞或祖细胞或前体细胞。在本发明的方法中使用的合适的干细胞包括能分化成心肌谱系的细胞，例如心肌细胞。在本发明的方法中使用的合适的干细胞包括例如，胚胎干细胞(“ESC”)和胚胎癌(“EC”)细胞。多能胚胎干细胞能分化成所有类型的组织，包括神经元细胞、肌细胞、血细胞等等。参见，例如Spradling等人(2001)。
如文中所用的“分化”是指前体细胞或祖细胞(即，干细胞)分化成特定细胞类型，例如，心肌细胞的过程。通过特定细胞类型独特的或区别性的多种特性可以鉴定分化的细胞。例如，通过它们的基因表达图式或蛋白质表达图式可以鉴定分化的细胞。一般地，心肌谱系的细胞表达例如肌节肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链2V、eHAND和ANF。参见，例如Small等人，Cell，110：725-735(2002)；Shin等人，Cell，110：725-35(2002)。心肌谱系细胞通常还表达心肌细胞特异转录因子，诸如MEF2、Nkx2.5或同源域转录因子HOP。参见，例如，Edmondson等人，Development，1251-1263(1994)；Lin等人，Science，276：1404-1407(1997)。心肌细胞分化中涉及的额外转录因子包括，例如，GATA4(参见，例如，Grepin等人，Development，124：2387-95(1997))。本领域技术人员应当认识到可以利用其它心肌特异基因监测和测定分化。
“心肌细胞标志基因”是由正发育的心肌细胞独特表达或由其它细胞型很少表达的基因，因此该标志基因用于确定细胞是否为心肌细胞。心肌细胞标志基因的实例为多肽激素ANF，所述多肽激素ANF主要在心肌细胞中合成并且是一些心肌发生转录因子的下游靶标。
如文中所用的与诱导心肌发生相关的“固相支持体”是指三维基质或平面表面，在其上面可以培养干细胞。固相支持体可以来自天然存在的物质(即，基于蛋白质的)或合成物质。例如，基于天然存在物质的基质可以由自体骨片或如例如Clokie等人，J.Craniofac.Surg.13(1)：111-21(2002)和Isaksson，Swed.Dent.J.Suppl.，84：1-46(1992)中描述的通过商业途径可获得的骨替代物组成。例如，在美国专利号5,041,138、5,512,474和6,425,222中描述了合适的合成基质。例如，可生物降解的人工聚合物，诸如聚乙醇酸、聚原酸酯或聚酐可以用于固相支持体。碳酸钙、文石和多孔陶瓷(例如，密羟基磷灰石陶瓷)也合适用于固相支持体。聚合物诸如聚丙烯、聚乙二醇和聚苯乙烯也可以在固相支持体中使用。在三维基质固相支持体上培养和分化的细胞一般在基质的所有表面，例如内部和外部生长。在平面固相支持体上培养和分化的细胞一般以单层生长。术语“固相支持体”也在制备式I化合物的上下文中使用。在这个上下文中，“固相支持体”是指聚合物支持体，诸如珠，所述聚合物支持体在合适的溶剂中部分溶解或完全不溶解，并且用于结合，例如，反应的反应物或试剂。合适的固相支持体包括但不限于PAL树脂、Wang树脂和聚苯乙烯树脂。
如文中所用的“培养”是指在细胞可以增殖、分化和避免衰老的条件下维持细胞。例如，在本发明中，培养的胚胎干细胞增殖和分化成心肌细胞谱系的细胞。可以在含有适当生长因子的生长培养基中，即含有促进或增强心肌细胞发育的蛋白质的生长因子混合物中培养细胞。
III.本发明的化合物和它们的制备方法
A.式I的化合物
一方面，本发明提供了具有以下结构的式I的化合物：
在式I中，R1是官能团，包括但不限于氢、C1-4烷基、C3-8环烷基和C0-2烷基芳基，其用0-2个R1a基取代，所述0-2个R1a基是独立选择的并且是包括但不限于卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、-OH、-N(R1b，R1b)、-SO2N(R1b，R1b)、-C(O)N(R1b，R1b)、杂环烷基和-O-芳基的官能团，或当R1a基在相邻环原子上时，它们任选一起形成包括但不限于-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-和-(CH2)3-4-的官能团，或R1任选与它连接的氮一起形成杂环，该杂环任选用C1-4烷基、C3-8环烷基、C1-4烷基羟基和C0-2烷基芳基取代；每个R1b基是独立选择的并且是包括但不限于氢和C1-4烷基的官能团。在式I中，R2是包括但不限于C1-4烷基、C3-8环烷基和C0-2烷基芳基的官能团，其用0-2个R2a基取代，所述R2a基是独立选择的并且是包括但不限于卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、-N(R2b，R2b)、-SO2N(R2b，R2b)、-C(O)N(R2b，R2b)和-O-芳基的官能团，或当R2a基在相邻环原子上时，它们任选一起形成包括但不限于-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-和-(CH2)3-4-的官能团；且每个R2b基是独立选择的并且是包括但不限于氢和C1-4烷基的官能团。在式I中，R3是氢，或R3任选与连接的R2和氮一起形成杂环，其任选用例如，C1-4烷基或C0-2烷基芳基取代。
本发明的化合物包括其所有可药用盐、异构体、溶剂化物、水合物和前体药物。
在一个实施方案中，R1是包括但不限于以下的官能团：
在优选的实施方案中，R1是
在一个实施方案中，R2是包括但不限于以下的官能团：
在特定优选的实施方案中，R3是氢。然而，在其它实施方案中，R2和R3和与它们连接的氮形成杂环。合适的杂环的实例包括但不限于以下：
在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有以下一般结构：
在以上式II中，R2为如以上对于式I的定义。在优选的实施方案中，式I和II的R2包括但不限于以下：
本发明优选的化合物包括但不限于以下(文中分别称为CardiogenolA、B、C和D)：
本发明的其它优选的化合物包括但不限于图4中示出的那些典型化合物。
用下文中特别是在实施例中给出的体外和体内筛选方法可以容易地筛选式I和II的化合物诱导心肌发生的能力。
B.化合物的制备
通过固相或溶液相合成可以制备本发明的化合物。
1.固相合成
指导式I和II的化合物固相合成的方法在文中实施例I以及Ding等人J.Am.Chem.Soc.，124(8)：1594(2002)、Ding等人，J.Am.Chem.Soc.，124(49)：14520-14521(2002)和2003年10月15日提交的美国专利申请号10/687,220、2001年10月12日提交的美国专利申请号60/328,763、2001年11月20日提交的美国专利申请号60/331,835、2002年1月7日提交的美国专利申请号60/346,480、2002年1月10日提交的美国专利申请号60/348,089和2002年10月12日提交的美国专利申请号10/270,030(具有代理人诉讼号21288-000340)中讨论，为所有目的将这些文献的教导在此全部引用作为参考。
大体上，通过还原胺化将2-乙醇胺与(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)甲基聚苯乙烯树脂(PAL-树脂)偶连。在DMF(4mL)中悬浮PAL-树脂(1g，1.1毫摩尔)，然后向该溶液中加入乙醇胺(5.5毫摩尔)、乙酸(0.65mL，1.13毫摩尔)和三乙酸基硼氢化钠(720mg，3.4毫摩尔)。将混合物在室温轻轻摇动约12小时。然后例如，用DMF(10mL，3次)、甲醇(10mL，3次)和二氯甲烷(10mL，3次)清洗所得树脂。然后将苯胺结合的树脂在1-丁醇(5mL)中与2，4-二氯嘧啶(2.2毫摩尔)和二异丙基乙胺(0.5mL，3毫摩尔)在80℃反应12小时。然后如以上描述的清洗所得树脂。
将嘧啶结合的PAL树脂(100mg，0.1毫摩尔)在1mL丁醇中与例如，不同的芳族胺(1.0毫摩尔)混合。将反应混合物在120℃加热12小时以产生需要的产物。然后如以上描述清洗所得树脂并用CH2Cl2∶TFA∶Me2S∶H2O/45∶45∶5∶5(v/v/v/v，0.5mL)室温切割大约2小时。收集溶液并在真空中干燥以提供需要的粗制品。然后用例如用制备RP-HPLC以H2O(含有0.1％TFA)和MeCN作为溶剂容易地纯化粗制品。
本领域技术人员是显而易见的是，相似的固相合成技术可以用于制备式I和II的其它化合物。
2.溶液相合成
通过如实施例1中陈述的溶液相合成可以制备本发明的化合物。通常，式I化合物的溶液相合成涉及在本领域技术人员已知的适当反应条件下首先用合适的取代基(诸如羟乙基氨基)取代2，4-二卤杂芳基(诸如2，4-二氯嘌呤)。接着在本领域技术人员已知的反应条件下用第二种合适的取代基(诸如合适取代的苯胺(例如，(4-苯基氨基)苯胺、4-苯氧基苯胺、4-甲氧基苯胺、4-氨基-反式-茋等等)取代。用本领域技术人员已知的标准方法(诸如制备RP-HPLC)可以纯化本发明的化合物。
IV.用化合物/组合物诱导心肌发生
可以用本发明的组合物诱导哺乳动物细胞中的心肌发生。一般而言，将哺乳动物细胞与式I的化合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。哺乳动物细胞可以与式I的化合物(或其组合物)体内或体外接触。例如，cardiogenol C可以静脉内直接施用到损伤或机能不良的心肌或在手术期间直接施用。
A.心肌发生的体内诱导
可以方便地用式I的化合物以及其组合物体内诱导心肌发生。本发明的化合物和组合物以有效诱导哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞的量施用于个体，例如哺乳动物，如人。考虑到它们诱导心肌发生的能力，式I的化合物可用于修复急性心脏病中损伤的心肌和用于治疗病症，诸如心肌病。在优选的实施方案中，为了研究心肌组织的发育，用本发明的化合物和组合物产生心肌细胞。在另一优选的实施方案中，在治疗需要修复或加强损伤或衰弱的心肌组织的受试者期间使用本发明的化合物和组合物。在另一实施方案中，用本发明的组合物治疗希望加强或增强没有损伤或衰弱的心肌组织的受试者。此类受试者可以包括，例如处于心脏病或病症危险的受试者。
本领域技术人员应当理解本发明的组合物可以单独使用或与其它化合物和治疗方案组合以诱导心肌发生。例如，式I的化合物可以与纯化的或合成的生长因子和其它活性剂，或它们的组合联合施用，所述生长因子和其它活性剂或其组合物增强心肌组织发育。
通过伴随组合物施用的副作用的存在、性质和程度；组合物的LD50；和不同浓度下组合物的副作用确定该组合物的有效量。典型地，施用的组合物的量为每千克体重约0.01至约20mg，更典型地每千克体重约0.05至约15mg，甚至更典型地每千克体重约0.1至约10mg。
例如可以通过静脉内输注、经口、腹膜内或皮下施用组合物。经口施用是优选的施用方法。化合物的剂型可以以单位剂量或多剂量密封容器，诸如安瓿和瓶存在。
在向个体或受试者施用前，本发明的组合物一般用可药用载体配制。可药用载体部分通过施用的具体组合物(例如，cardiogenol C)以及通过施用组合物的特定方法确定。因此，有本发明药物组合物的多种合适剂型(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，1989)。
合适用于经口施用的剂型的组成可以为(a)液体溶液，诸如在稀释剂，诸如水、盐水或PEG 400中悬浮的有效量的式I的化合物；(b)胶囊剂、囊剂或者片剂，每种含有预定量的作为液体、固体、颗粒或明胶的活性成分；(c)在适当液体中的混悬液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包括一种或多种以下物质：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学相容的载体。糖锭形式可以在调味剂，例如，蔗糖中包含活性成分，以及锭剂在惰性基质，诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶等等中包含活性成分，它除了活性成分外，还含有本领域已知的载体。
本发明的组合物可以是合适用于其它施用途径，例如，静脉内输注、腹膜内或皮下施用的剂型。该剂型包括，例如，含水和不含水的、等渗的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂，和使剂型与计划的受者的血液等渗的溶质，和含水和不含水的无菌混悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可以从无菌粉剂、粒剂和片剂制备注射溶液和混悬液。
在本发明的上下文中，向患者施用的剂量应当随时间足够实现患者中的有益的治疗反应。例如，如果施用本发明的组合物来治疗或预防心肌病，向患者施用的剂量应当足够预防、延缓或逆转心肌有节律收缩的能力的降低。通过利用的特定组合物的效力和患者的状况，以及待治疗患者的体重或表面积确定剂量。通过在特定患者中施用特定组合物伴随的任何不利副作用的存在、性质和程度确定剂量的大小。
B.心肌发生的体外诱导
可以方便地用本发明的组合物体外诱导心肌发生。将哺乳动物细胞与组合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。
1.合适的细胞
待分化成心肌谱系细胞的细胞可以来自任意合适的哺乳动物。例如细胞可以获得自啮齿类动物，例如，小鼠、大鼠、豚鼠和兔；非啮齿类哺乳动物，例如，犬、猫、猪、绵羊、马、奶牛和山羊；灵长类动物，例如，猩猩和人。待分化的细胞可以是原代细胞或可以是在培养中维持的细胞。如果细胞在培养中维持，它们一般在培养的第12代和第15代之间与本发明的化合物/组合物接触。用于本发明的方法中的建立细胞原代培养物所使用的技术和方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Humason，ANIMALTISSUE TECHNIQUES，4th ed.，W.H.Freeman and Company(1979)，和Ricciardelli等人，In Vitro Cell Dev.Biol.，25：1016(1989))。
通过从骨髓中的其它细胞或其它间充质干细胞(MSC)源分离多能间充质干细胞可以获得人间充质干细胞。骨髓细胞可以获得自髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其它髓腔。人间充质干细胞的其它来源包括胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年皮肤、血液、脂肪组织和肌肉卫星细胞。一般地，在含有生长因子的生长培养基中培养来自含有间充质干细胞的组织样品的细胞，所述生长因子(1)刺激无分化的间充质干细胞生长，和(2)允许仅仅使间充质干细胞选择性粘附在基质表面。将细胞培养合适的时间后，从基质表面除去不粘附物质，从而提供了间充质干细胞的扩大群体。因此，通过阳性选择粘附骨髓或骨膜细胞获得了同质MSC群体，所述骨髓或骨膜细胞没有与造血细胞或分化的间充质细胞相关的标志。
优选地，与本发明的化合物接触的哺乳动物细胞是干细胞，特别是胚胎干细胞(ESC)。用于分离人和动物ESC的方法是本领域公知的。参见，例如，Brook FA，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，94：5709-12(1997)；Grounds等人，J.Histochem.and Cytochem.，50：589-610(2002)；Reubinoff，Nat.Biotech.，18：399-404(2000)。哺乳动物胚胎干细胞包括，例如，鼠R1细胞和人胚胎干细胞。
2.一般培养方法
哺乳动物细胞(例如，ESC)可以与式I的化合物单独接触，与单一混合物中的式I的其它化合物一起或顺序组合接触，或在存在其它生长因子时接触。本领域技术人员应当理解可以调节化合物的量，例如cardiogenol A、B、C或D任一种和生长因子的量以有助于诱导特定细胞类型中的分化。例如，与细胞接触的cardiogenol的量通常是大约0.01μM(52ng/ml)至大约10μM(2.6μg/ml)，更通常为大约0.02μM至大约5μM，甚至更通常为大约0.05μM至大约1μM，还更通常为大约0.075μM至大约0.5μM，最通常为约1μM。
本发明的这个方面取决于细胞培养领域中的常规技术。本领域技术人员用已知的方法可以确定合适的细胞培养方法和条件(参见，例如，Freshney等人，CULTURE OF ANIMAL CELLS(3rd ed.1994))。大体上，细胞培养环境包括考虑诸如用于细胞生长的基质、细胞密度和细胞收缩、气相、培养基和温度的因素。
一般在已知最适于细胞生长的条件下进行细胞的孵育。此类条件可以包括，例如大约37℃的温度和含有大约5％CO2的潮湿空气。孵育的持续时间取决于希望的结果可以有很大程度的变化。大体上，孵育优选持续到细胞表达合适的物质时。用3H胸苷掺入或BrdU标记方便地测定增殖。
根据本发明的方法，可以用塑料平皿、瓶或滚瓶培养细胞。合适的培养容器包括，例如，多孔平板、培养皿、组织培养管、烧瓶、滚瓶等等。
以基于细胞类型通过经验确定的最佳密度生长细胞。通常将细胞传代12-15次并在15代后弃去。
考虑到温度的地区差异，在提供合适温度，例如从其获得细胞的动物的体温的温度下在培养箱中常规生长培养的细胞。大体上，37℃是用于细胞培养的优选的温度。大部分培养箱加湿到大约大气条件。
气相的重要组分是氧气和二氧化碳。一般地，大气氧张力用于细胞培养。通过用气体可透过的盖子或通过防止培养容器密封一般将培养容器与培养箱空气换气以允许气体交换。二氧化碳以及细胞培养基中的缓冲剂在pH稳定性中起作用，且在培养箱中二氧化碳一般以1-10％的浓度存在。优选的CO2浓度通常是5％。
可获得作为包装的、预混合的粉末或预灭菌的溶液的确定的细胞培养基。通常使用的培养基的实例包括MEM-α、DME、RPMI 1640、DMEM、Iscove’s完全培养基或McCoy’s培养基(参见，例如，GibcoBRL/LifeTechnologies Catalogue and Reference Guide；Sigma Catalogue)。一般地，本发明的方法中使用MEM-α或DMEM。确定的细胞培养基常常补充5-20％血清，一般是热灭活的血清，例如，人、马、牛和胎牛血清。一般地，本发明的方法中使用10％的胎牛血清。培养基一般是缓冲的以在优选大约7.2至大约7.4的pH维持细胞。向培养基中的其它补充物一般包括，例如抗生素、氨基酸和糖，和生长因子。
C.心肌发生的检测
体内或体外施用本发明的组合物后，通过许多不同的方法可以检测心肌发生的诱导，所述许多方法包括但不限于：检测心肌细胞特异蛋白质的表达、检测心肌细胞特异转录因子的表达、检测用于心肌功能必需的蛋白质的表达，和检测心肌细胞的搏动。文中描述了心肌细胞特异蛋白质和心肌细胞特异转录因子的特定实例。
1.心肌细胞特异蛋白质的检测
通过测定心肌细胞特异蛋白质或mRNA的水平可以检测心肌细胞分化的表达。用免疫测定法，诸如免疫组织化学染色、蛋白质印迹、ELISA等等用选择性结合特定心肌细胞特异蛋白质或其片段的抗体可以方便地测量特定心肌细胞特异蛋白质的水平。免疫测定法中用蛋白质特异抗体检测蛋白质是本领域技术人员已知的(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)，Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2d ed.1986)；和Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)。对于测定mRNA，优选例如，PCR、LCR扩增或杂交测定法，例如RNA印迹杂交、RNA酶保护、斑点印迹。用直接或间接标记的检测活性剂，例如荧光或放射性标记的核酸、放射性或酶标记的抗体检测蛋白质或mRNA的水平。这些测定法是本领域技术人员已知的并且在例如Ausubel，等人，ed.CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(2001)中描述。
通常，用心肌细胞蛋白质ANF的表达检测分化的心肌细胞。ANF是多肽激素，所述多肽激素主要在心肌细胞合成并且是许多心肌发生转录因子的下游靶标；认为它是特异的心肌细胞“标志”基因(Boer，Exp.Cell Res.，207：421-29(1993)。例如，通过将ANF启动子区插入到容易检测的蛋白质或活性容易检测的酶，诸如萤光素酶的报道基因质粒上游，可以测定ANF基因的活化。这些情况下报道基因的表达水平升高表明心肌细胞发生分化。
a)免疫组织化学检测
对于直接免疫组织化学染色细胞以检测，例如，心肌细胞特异基因，将细胞以合适的密度接种在96孔测定板中并用适当量的式I的化合物(例如，cardiogenol A)单独处理或与其它生长因子一起处理适当时间。然后将细胞在10％的福尔马林溶液中固定。将固定的细胞再次清洗并用本领域技术人员已知的方法(参见，例如，Harlow & Lane，1988，同上；Coligan，1991，同上；Goding，1986，同上；和Kohler & Milstein，1975，同上)用对目的蛋白质特异的试剂(例如，对蛋白质特异的抗体或，如果使用酶报道基因，存在报道基因酶时辨别率(例如通过荧光方法)改变的试剂)染色。对细胞照相并从图像上手工计数表达心肌细胞特异基因的阳性细胞。
2.心肌细胞特异转录因子的检测
用报道基因测定法可以检测心肌细胞特异转录因子的表达。多种报道基因测定法是本领域技术人员公知的。参见，例如，New等人，Phytother.Res.，17：439-48(2003)；Schenborn等人，Mol.Biotechnol.，13：29-44(1999)。报道基因测定法中可以使用例如，氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶、细菌萤光素酶或β-半乳糖苷酶的报道基因。一般将报道基因构建体瞬时或稳定转染到细胞中。一般通过PCR适当引物扩增相关基因的启动子区。将得到的PCR产物插入到合适的克隆载体中，扩增并测序。用适当的限制性酶消化得到的质粒并将得到的片段插入到包含报道基因的载体中。
a)瞬时转染的细胞
对于使用瞬时转染细胞的报道基因测定法，一般将细胞以大约30,000个细胞/孔的密度接种到6孔板中2mL生长培养基中并孵育过夜或孵育合适的时间。用合适的转染试剂将质粒DNA转染到细胞中。8小时后，将转染的细胞接种到96孔测定板(例如，Corning)中并用适当量的式I的化合物(例如，cardiogenol A)处理。将细胞孵育4天，然后用本领域技术人员已知的方法测定细胞中报道基因的活性。
b)稳定转染的细胞
对于使用稳定转染细胞的报道基因测定法，一般将细胞以大约30,000个细胞/孔的密度接种到6孔板中2mL生长培养基中并孵育过夜或孵育合适的时间。用合适的转染试剂将适当量的报道基因质粒和包含选择标记(例如，抗生素抗性基因)的载体共转染到细胞中。适当的孵育时间后，将细胞接种到10cm培养皿中并向培养基中加入适当量的抗生素。以适当的间隔加入新鲜抗生素。将抗生素抗性集落混合以产生稳定转染的细胞。将转染的细胞接种到96孔测定板(例如，Corning)并用适当量的式I的化合物(例如，cardiogenol A)处理。将细胞孵育4天，然后用本领域技术人员已知的方法测定细胞中报道基因的活性。
3.分化的心肌细胞的施用
通过本领域技术人员已知的任意方法可以向受试者施用分化的心肌细胞。在本发明的一个实施方案中，例如，通过外科手术植入可以向受试者施用完整固相支持体(例如，三维基质或平面表面)上的分化的心肌细胞。备选地，向受试者施用，例如，静脉内、皮下或腹膜内施用前，可以例如通过蛋白酶处理从基质脱离分化的心肌细胞。
在本发明的一些实施方案中，提取胚胎干细胞并随后与基质接触用于增殖和分化成心肌谱系细胞。可以从待治疗的受试者，即自体(因此避免了植入物的基于免疫的排斥反应)，或可以从第二个受试者，即异体提取细胞。在每种情况下，细胞的施用可以与适当的免疫抑制处理相结合。
根据本发明的方法分化的心肌细胞可以通过本领域已知的任意方法向受试者施用。施用的合适方法包括，例如，静脉内、皮下、腹膜内和外科手术植入。例如，在心脏手术期间，将心肌细胞可以直接注射到心肌或局部应用。
细胞可以在适于施用的剂型中，所述剂型为例如，含水的和不含水的、等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使剂型与计划的受者血液等渗的溶质，和含水的和不含水的无菌混悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射溶液和混悬液可以从无菌粉剂、粒剂和片剂制备。
对于外科手术植入，分化的细胞一般留在完整的固相支持体，例如三维基质或平面表面上。将基质或平面表面通过外科手术植入到受试者中的适当位置。例如，需要更换一部分心肌组织的受试者可以通过外科手术植入完整固相支持体上的分化细胞。
为确定在治疗或预防由于心肌细胞减少或功能不良引起的疾病中待施用细胞的有效量，医生评估细胞毒性、移植反应、疾病的发展和抗细胞抗体的产生。对于施用，考虑到不同浓度的心肌细胞对患者的整体和总体健康的副作用，根据本发明的方法分化的心肌细胞可以以有效提供心肌细胞的量向受试者施用。施用可以通过单次剂量或分份剂量完成。
实施例
以下实施例以阐述的方式提供，但不限制要求专利保护的本发明。
1.实施例1：Cardiogenol A、B、C和D的合成和表征
用于合成使用的所有化学试剂均购自Aldrich。在5mL乙醇中溶解2，4-二氯嘧啶(200mg，1.34毫摩尔)并向溶液中加入282μL(1.62毫摩尔)二异丙基乙胺(DIEA)和90mg(1.47毫摩尔)的乙醇胺。然后将反应混合物50℃加热12小时以提供2-氯-4-(1-羟基乙基氨基)-嘧啶(80％产率)。在1-丁醇(1mL)中溶解20mg(0.12毫摩尔)2-氯-4-(1-羟基乙基氨基)-嘧啶并加入42.4mg(0.23毫摩尔)4-(苯基氨基)苯胺。在微波反应器中将反应混合物以200℃加热15分钟以提供cardiogenol A(85％产率)。类似地，用42.7mg(0.23毫摩尔)4-苯氧基苯胺、28.4mg(0.23毫摩尔)4-甲氧基苯胺或45.0mg(0.23毫摩尔)4-氨基-反式-茋分别得到cardiogenol B(80％产率)、C(90％产率)或D(75％产率)。通过制备HPLC用H2O(含有0.1％TFA)和MeCN作为溶剂，以10分钟内5％至90％MeCN的线性梯度纯化所述化合物。收集所希望的峰并冷冻干燥以得到最终产物。
Cardiogenol A：1H NMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)3.44(m，2H)，3.57(m，2H)，6.20(d，1H，J＝7.2)，6.83(t，1H，J＝7.2)，7.08(m，5H)，7.23(t，2H，J＝8.3)，7.34(d，2H，J＝7.7)，7.67(d，1H，J＝6.6)，8.25(s，1H)，8.95(s，1H)，10.18(s，1H)。高分辨率质谱分析法(MALDI-FTMS)：理论值[MH+](C18H20N5O)322.1662，实验值322.1660。
Cardiogenol B：1H NMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)3.45(m，2H)，3.56(m，2H)，6.24(d，1H，J＝7.2)，7.03(m，5H)，7.14(t，1H，J＝7.4)，7.40(t，2H，J＝7.5)，7.55(d，2H，J＝8.6)，7.73(d，1H，J＝7.0)，8.97(s，1H)，10.30(s，1H)。高分辨率质谱分析法(MALDI-FTMS)：理论值[MH+](C18H19N4O2)323.1502，实验值323.1498。
Cardiogenol C：1H NMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)3.42(m，2H)，3.55(m，2H)，3.72(s，3H)，6.21(d，1H，J＝7.2)，6.97(d，2H，J＝8.9)，7.41(d，2H，J＝8.4)，7.66(d，1H，J＝7.1)，8.93(s，1H)，10.07(s，1H)。高分辨率质谱分析法(MALDI-FTMS)：理论值[MH+](C13H17N4O2)261.1346，实验值261.1342。
Cardiogenol D：1H NMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)3.48(m，2H)，3.62(m，2H)，6.26(d，1H，J＝7.2)，7.27(m，3H)，7.38(t，2H，J＝7.5)，7.61(m，6H)，7.77(d，1H，J＝7.0)，9.00(s，1H)，10.35(s，1H)。高分辨率质谱分析法(MALDI-FTMS)：理论值[MH+](C20H21N4O)333.1710，实验值333.1711。
除了前述溶液相合成方法外，也可以用如下的固相合成方法制备本发明的化合物：
大体上，通过还原胺化将2-乙醇胺与(4-甲酰-3，5-二甲氧基苯氧基)甲基聚苯乙烯树脂(PAL-树脂)偶连。在DMF(4mL)中悬浮PAL-树脂(1g，1.1毫摩尔)，然后向溶液中加入乙醇胺(5.5毫摩尔)、乙酸(0.65mL，1.13毫摩尔)和三乙酸基硼氢化钠(720mg，3.4毫摩尔)。将混合物在室温轻轻摇动12小时。然后用DMF(10mL，3次)、甲醇(10mL，3次)和二氯甲烷(10mL，3次)清洗所得树脂。然后在1-丁醇(5mL)中将苯胺结合的树脂与2，4-二氯嘧啶(2.2毫摩尔)和二异丙基乙胺(0.5mL，3毫摩尔)在80℃反应12小时。然后如以上描述清洗所得树脂。
在1mL丁醇中将嘧啶结合的PAL树脂(100mg，0.1毫摩尔)与不同的芳族胺(1.0毫摩尔)混合。将反应混合物在120℃加热12小时以产生需要的产物。然后如以上描述清洗所得树脂并用
CH2Cl2∶TFA∶Me2S∶H2O/45∶45∶5∶5(v/v/v/v，0.5mL)室温切割2小时。收集溶液并在真空中干燥以提供需要的粗制品。然后用制备RP-HPLC以H2O(含有0.1％TFA)和MeCN作为溶剂纯化粗制品。
2.实施例2：细胞培养和用于心肌发生诱导分子的高通量筛选
在37℃下5％CO2中，在含有7.5％的新生牛血清和2.5％的FBS(Gibco)的MEM-α中培养P19胚胎癌(EC)细胞(来自ATCC)。在37℃下5％CO2培养箱中，在含有10％FBS(来自Gibco)的MEM-α中培养P19CL6细胞(Michael Schneider博士和Nakamura Teruya博士赠送)。用PCR引物(5’-ccgacgcgtgaaacatcacattggttgcctt和5’-ccgctcgagcactctctggtttctctctc)扩增含有大鼠ANF启动子区的片段(～700bp)，然后用MluI和XhoI限制性位点将该片段亚克隆到PGL3-BV萤光素酶报道基因质粒中。在P19细胞的标准心肌发生分化条件(EB形成和用1％DMSO处理)(参见Skerjank IS，Trends Cardiovasc Med，9：139-143(1999))时，包含报道基因质粒的稳定P19克隆的萤光素酶信号增加5-至7-倍(图1)。根据以下方法，用这个细胞系以单层形式筛选100,000种化合物杂环文库。在每孔含有100μL诱导培养基(含有5％FBS的MEM-α)的384-孔板的每个孔中接种103个细胞；然后向每孔中加入500nL 1mM的化合物溶液。化合物处理3天后，更换为不加化合物的培养基。化合物处理7天后用Bright-Glo萤光素酶测定试剂盒(Promega)测定萤光素酶活性。鉴定了不含EB时上调萤光素酶活性＞4-倍的大约80种化合物。
MHC是负责心肌收缩能力的一种必需动力蛋白并且用作分化的第二种测定。在以上描述的筛选测定中鉴定的80种化合物中的35种也诱导P19CL6细胞中肌节肌球蛋白重链(MHC)的表达。P19CL6细胞系是P19EC细胞的亚克隆，其具有较高潜力的心肌发生。参见Habara-Ohkubo，CellStruct.Funct.，21：101-110(1996)。通过用抗MHC抗体(MF20)免疫染色细胞确定了P19CL6细胞中的MHC表达(图2F)。
3.实施例3：鉴定Cardiogenols A、B、C和D为具有心肌发生诱导活性
的化合物
在以上实施例中鉴定的35种化合物中，4种二氨基嘧啶cardiogenolA-D(表1)在诱导MHC表达中有最强效。
表1.
在表1中cardiogenols的最佳活性用一系列的“+”符号表示，如下：++：7天后10-25％的细胞为MHC阳性；+++：7天后25-40％的细胞为MHC阳性；++++：7天后40-55％的细胞为MHC阳性。
为证实这些化合物是一般的心肌发生诱导剂，分析了它们对未分化的R1小鼠ESC的作用。在培养基中加入白血病抑制因子(LIF)时，R1小鼠ESC可以维持在多能状态。在含有15％ES血清替代物、1mM L-谷氨酰胺(来自Gibco)、1％非必需氨基酸储存液、1％核苷储存液、0.1mMβ-巯基甲醇(来自Specialty Media)和1000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF，来自Chemicon)的Knockout MEM的明胶包被的组织培养皿上培养胚胎干细胞系R1。
为了分化，将R1细胞以单层(10000个细胞/孔)接种在含有100μLDMEM与10％FBS和0.25μM化合物的明胶包被的384孔或96孔板上。在分化期间不存在LIF。培养7天后(存在化合物时培养3天和然后更换为不加额外化合物的培养基，继续培养4天)，在显微镜下看到存在搏动的心肌细胞。除了表达MHC外(图2A)，用抗GATA4抗体通过免疫荧光染色，检测到心脏特异基因GATA-4(图2B)。GATA-4是限制与正发育心脏的转录因子并且它的过表达增强P19细胞中的心肌发生(Grepin等人，Development，124：2387-95(1997)；Chadron等人，Cell and Dev.Biol.，10：85-91(1999)；Gag等人，Nature，424：443-447(2003)。如图3中显示的，在未分化的R1小鼠ESC中，既不表达MHC也不表达GATA-4。也观察到化合物处理减慢了细胞增殖，没有显著的细胞死亡，表明这个过程不仅仅是选择心脏前体细胞而引起其它谱系的细胞死亡。
4.实施例4：Cardiogenol C是胚胎干细胞中心肌发生的强效诱导剂
Cardiogenol C在嘧啶C2位置用p-metonym苯胺取代且非常有效，诱导从ESC分化成MHC阳性心肌细胞的EC50为0.1μM。仅仅在浓度大于25μM时，Cardiogenol C显示显著的细胞毒性，在用0.25μM的该化合物处理R1细胞3天并且在不含该化合物的培养基中再培养4天后，50％以上的细胞对MHC阳性染色并且90％以上的细胞对GATA-4阳性，与以前观察到的GATA-4早于MHC表达相一致。参见Boheler等人，Circ.Res.，91：189-201(2002)。此外，在用cardiogenol C处理的R1细胞中有许多搏动区域，表明这些MHC阳性细胞可以形成功能性心肌。这些结果表明大部分细胞群体是通过cardiogenol C诱导分化成心肌谱系的(不存在聚集和EB形成)。这与当前的通过聚集和EB形成诱导ESC心肌发生的标准方法不同，所述当前的标准方法中仅仅5％的细胞群体形成心肌细胞。参见Boheler等人，(2002)。
5.实施例5：在用Cardiogenol C分化的ESC中检测心肌细胞特异转录
因子
为了进一步表征Cardiogenol C的活性，检查了心肌细胞特异转录因子MEF2和Nkx2.5的表达(图2C和D)。MEF2家族成员对肌肉发育是必需的。参见，例如，Edmondson，等人，Development，1251-1263(1994)；Lin等人，Science，276：1404-1407(1997)。Nkx2.5与GATA-4一起调节多种心肌特异基因(例如，肌球蛋白轻链2V、心房钠尿肽、eHAND和同源域转录因子HOP)的表达。参见，例如，Small等人，Cell，110：725-735(2002)；Shin等人，Cell，110：725-35(2002)。此外，Nkx2.5基因的靶定中断是胚胎致死性的并且导致心脏发育抑制。参见，例如，Lyons等人，Genes Dev.，9：1654-66(1995)。大约90％的cardiogenol C处理的细胞对于MEF2和Nkx2.5阳性染色，进一步证实ESC通过cardiogenol C分化成心肌。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请在此引入作为参考，就好像每个单独的出版物或专利申请特别且单独地完整引入作为参考一样。
虽然为了清楚理解，上述发明以阐述和举例说明的方式详细描述，根据本发明的教导，本领域技术人员是显而易见的是可以对本发明进行某些变化和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。
Claims (51)
1.具有以下结构的式I的化合物：
其中：
R1是选自氢、C1-4烷基、C3-8环烷基和C0-2烷基芳基的成员，其用0-2个R1a基取代，所述0-2个R1a基独立地选自卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、-OH、-N(R1b，R1b)、-SO2N(R1b，R1b)、-C(O)N(R1b，R1b)、杂环烷基和-O-芳基，或当所述R1a基在相邻环原子上时，它们任选一起形成选自-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-和-(CH2)3-4-的成员，或R1任选与它连接的氮一起形成杂环，该杂环任选用C1-4烷基、C3-8环烷基、C1-4烷基羟基和C0-2烷基芳基取代；
每个R1b基是独立地选自氢和C1-4烷基的成员；
R2是选自C1-4烷基、C3-8环烷基和C0-2烷基芳基的成员，其用0-2个R2a基取代，所述R2a基独立地选自卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、-N(R2b，R2b)、-SO2N(R2b，R2b)、-C(O)N(R2b，R2b)和-O-芳基，或当所述R2a基在相邻环原子上时，它们任选一起形成选自-O-(CH2)1-2-O-、-O-C(CH3)2CH2-和-(CH2)3-4-的成员；
每个R2b基是独立地选自氢和C1-4烷基的成员；并且
R3是氢，或R2任选与它连接的R3和氮一起形成杂环，该杂环任选用C1-4烷基或C0-2烷基芳基取代。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1是选自下面组的成员：
3.根据权利要求2的化合物，其中R1是
4.根据权利要求1的化合物，其中R2是选自下面组的成员：
5.根据权利要求1的化合物，其中R3是氢。
6.根据权利要求1的化合物，其中R2和R3和它们连接的氮形成杂环。
7.根据权利要求6的化合物，其中所述杂环是选自下面组的成员：
8.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
9.根据权利要求1或权利要求8的化合物，其中R2是选自下面组的成员：
10.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物是选自下面组的成员：
11.药物组合物，其包含权利要求1或权利要求10的化合物和可药用载体。
12.诱导心肌发生的方法，该方法包括：
将哺乳动物细胞与权利要求1的化合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述权利要求1的化合物在可药用载体中。
14.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞在哺乳动物中。
15.权利要求14的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物经口施用所述化合物。
16.权利要求14的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物静脉内施用所述化合物。
17.权利要求14的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物皮下施用所述化合物。
18.权利要求14的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物腹膜内施用所述化合物。
19.权利要求12的方法，其还包括检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。
20.权利要求19的方法，其中通过检测心肌细胞标志基因来检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。
21.权利要求20的方法，其中心肌细胞标志基因编码心房钠尿肽。
22.权利要求19的方法，其中通过检测心肌细胞特异转录因子的表达来检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。
23.权利要求22的方法，其中心肌特异转录因子选自MEF2和Nkx2.5。
24.权利要求19的方法，其中通过检测涉及心肌收缩的动力蛋白的表达检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。
25.权利要求24的方法，其中动力蛋白是肌节肌球蛋白重链动力蛋白。
26.权利要求19的方法，其中通过检测心脏特异基因的表达来检测哺乳动物细胞向心肌谱系细胞的分化。
27.权利要求26的方法，其中心脏特异基因是GATA-4。
28.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞是胚胎干细胞。
29.权利要求28的方法，其中胚胎干细胞从小鼠分离。
30.权利要求29的方法，其中胚胎干细胞是R1胚胎干细胞。
31.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞是胚胎癌细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述癌细胞从小鼠分离。
33.权利要求32的方法，其中所述小鼠癌细胞是P19胚胎癌细胞。
34.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞是灵长类动物胚胎干细胞。
35.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞是人胚胎干细胞。
36.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞还与心肌发生增强蛋白接触。
37.权利要求36的方法，其中心肌发生增强蛋白是涉及心肌发生的生长因子。
38.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞附着在固相支持体上。
39.权利要求38的方法，其中固相支持体是三维基质。
40.权利要求38的方法，其中固相支持体是平面表面。
41.诱导心肌发生的方法，该方法包括：
将哺乳动物细胞与权利要求1的化合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。
42.权利要求41的方法，其中哺乳动物细胞在哺乳动物中。
43.权利要求41的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物经口施用所述化合物。
44.权利要求41的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物静脉内施用所述化合物。
45.权利要求41的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物皮下施用所述化合物。
46.权利要求41的方法，其中接触步骤是通过向所述哺乳动物腹膜内施用所述化合物。
47.治疗心肌病症的方法，该方法包括：
将哺乳动物细胞与权利要求1的化合物接触，从而哺乳动物细胞分化成心肌谱系细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述心肌病症与损伤的心肌有关。
49.权利要求48的方法，其中所述心肌病症是心肌病。
50.权利要求47的方法，其还包括向具有所述病症的个体施用心肌谱系细胞，从而治疗该病症。
51.权利要求50的方法，其中施用是通过外科手术植入进行的。
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