KR20060133552A - 2,4-디아미노피리미딘 및 심장근육발생 유도를 위한 그의용도 - Google Patents

2,4-디아미노피리미딘 및 심장근육발생 유도를 위한 그의용도 Download PDF

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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 생체 내 및 시험관 내에서 포유류 세포, 특히 배아 줄기 세포의 심장근육발생 유도에 유용한 화학식 I의 화합물을 제공한다.
심장근육발생, 배아 줄기 세포

Description

2,4-디아미노피리미딘 및 심장근육발생 유도를 위한 그의 용도 {2,4-Diaminopyrimidines and their Use for Inducing Cardiomyogenesis}
관련출원에 대한 교차참조
본 출원은 본원에 그 전체가 참고로 인용된 U.S. 특허 가출원 제60/537,144호 (2004년 1월 16일)에 대해 우선권을 주장한다.
심장병은 다른 많은 질병 및 이상을 포괄하는 세계에 걸친 주요 문제이다. 예를 들어, 심장근육병증은 심장이 혈액을 펌프하는 기능을 잃고, 일부 경우, 심장 리듬이 흐트러져 불규칙적인 심장박동 또는 부정맥을 일으키는 심장 근육의 질병이다. 심장근육병증은 모든 연령의 수만명의 미국인에게 영향을 주며, 심장 이식의 주요 원인이다. 이상은 진행성인 경향이 있으며, 때때로 상당히 빠르게 악화된다.
심장 근육의 발달 및 기능의 이해는 줄기 세포의 사용에 의해 용이해질 것이다. 줄기 세포는 적절한 신호에 대응하는 구체화된 세포로 재생 및 분화하는 능력을 갖는 다기능 세포이다. 예를 들어, 문헌 [Spradling et al., Nature, 414:98-104 (2001)] 참조. 대부분의 조직은 기관에 대한 상해시 손상된 부위에서 증식 및 분화할 수 있는 내부 줄기/원종 세포를 갖는다. 그러나, 성인 심장은 후-유사분열이며 최종적으로 분화된 세포로 주로 이루어진다. 심장 줄기 세포 특성을 갖는 심장근육 세포의 부분 모집단이 최근 확인되었으나, 이들의 제한된 이용가능성이 치 료적 적용을 방해한다. 예를 들어, 문헌 [Beltrami et al., Cell, 114:763-776 (2003)] 참조. 다른 조직, 예컨대 골수로부터 유도된 줄기 세포가 동물 모델의 심장 손상을 치료할 수 있는 것으로 나타났으나, 비효율적인 분화 및 체세포와의 융화 가능성이 이들의 심장 회복에 대한 이용을 제한한다. 예를 들어, 문헌[Ferrari et al., Science, 279:1528-30 (1998)] 참조.
다능성 배아 줄기 (ES) 세포는 기능성 심장근육세포의 가능한 비제한적인 공급원을 나타낸다. 상기 심장근육세포는 심장 질병 내의 ES 세포의 치료적 적용을 용이하게 할 뿐 아니라, 심장근육세포의 분화 및 심장 발달의 분자 메카니즘을 조사하기 위한 중요한 도구를 제공한다. 그러나, 지금까지, ES 세포의 심장근육세포로의 시험관 내 분화는 열악하게 제한되며, 불충분하며 비교적 비선택적인 공정을 수반한다. 예를 들어, 문헌 [Boheler et al., Circ. Res., 91:189-201 (2002)] 참조.
이와 같이, 당업계는 ES 세포의 심장근육세포로의 분화를 유도하며 검출하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구를 인지한다. ES 세포의 심장근육 계통의 세포로의 생체 내 및 시험관 내 분화를 유도할 수 있는 소분자에 대한 특정 요구가 존재한다. 본 발명은 이들 요구 및 기타 요구를 만족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 ES 세포의 심장근육 계통 세포로의 분화를 유도하며 검출하기 위한 신규 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시양태는 하기 구조식을 갖는 화학식 I의 화합물을 제공 한다:
Figure 112006050239740-PCT00001
식 중, R1은 수소, 0 내지 2개의 R1a기로 치환된, C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬 및 C0-2 알킬아릴을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 또는 R1은 그것이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 취하여, C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -4 알킬히드록시 및 C0 -2 알킬아릴로 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성하며; 여기서, R1a기는 독립적으로 선택되며, 할로겐, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시, -OH, -N(R1b,R1b), -SO2N(R1b,R1b), -C(O)N(R1b,R1b), 헤테로시클로알킬 및 -O-아릴을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 작용기이거나, 또는 R1a기가 인접 고리 원자 상에 있는 경우, 이들은 임의로 함께 취하여 -O-(CH2)1-2-O-, -O-C(CH3)2CH2- 및 -(CH2)3-4-를 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기를 형성하며; 각각의 R1b기는 독립적으로 선택되며, 수소 및 C1 -4 알킬을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다. R2는 0 내지 2개의 R2a기로 치환된 C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬 및 C0 -2 알킬아릴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다. R2a기는 독립적으로 선택되며, 할로겐, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시, -N(R2b,R2b), -SO2N(R2b,R2b), -C(O)N(R2b,R2b) 및 -O-아릴을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이거나, 또는 R2a기는 인접 고리 원자 상에 존재시, 임의로 함께 취하여 -O-(CH2)1-2-O-, -O-C(CH3)2CH2- 및 -(CH2)3-4-를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 작용기를 형성하며; 각각의 R2b기는 독립적으로 선택되며, 수소 및 C1 -4 알킬을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다. R3은 전형적으로 수소이거나, 또는 R3은 R2 및 이 둘이 모두 결합된 질소와 임의로 함께 취하여, 예를 들어 C1 -4 알킬 또는 C0 -2 알킬아릴로 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성한다.
본 발명의 화합물은 이들의 모든 제약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물, 수화물 및 전구약물을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 심장근육발생을 유도하는 방법을 제공한다. 포유류 세포가 화학식 I 또는 II의 화합물과 접촉한 뒤, 포유류 세포는 심장근육 계통의 세포로 분화한다. 접촉 단계는 생체 내 또는 시험관 내일 수 있다. 심장근육발생을 유도하는 이들의 능력 측면에서, 화학식 I 또는 II의 화합물은 심장근육 질환, 예컨대 심장근육병증 및 부정맥을 치료하고, 예를 들어, 심장 발작으로부 터 기인한 심장 근육 조직 손상을 회복하는 데 유용하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 포유류 세포를 화학식 I의 화합물과 접촉한 뒤, 포유류 세포가 심장근육 계통의 세포로 분화함으로써 심장 근육 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 포유류 세포는 추가로 심장근육발생에 바람직한 기타 화합물 또는 단백질과 접촉할 수 있다. 포유류 세포가 화학식 I 또는 II의 화합물과 시험관 내 접촉하는 경우, 분화된 세포는 치료가능한 질환을 갖는 개체에 투여됨으로써, 질환을 치료한다. 일부 실시양태에서, 포유류 세포는 고체 지지체 (예, 3차원 매트릭스 또는 2차원 평면)에 부착되거나, 또는 심장근육의 손상된 부위에 주입된다.
일부 실시양태에서, 포유류 세포는 화학식 I 또는 II의 화합물과 생체 내 접촉한다. 포유류 세포가 화학식 I 또는 II의 화합물과 생체 내 접촉하는 경우, 접촉 단계는 포유류에 대한 화합물의 경구적, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여에 의한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화가 검출된다. 일부 실시양태에서, 포유류 세포의 심장근육모세포로의 분화가 심장근육발생 마커 유전자, 예컨대 심방 나트륨이뇨 인자 ("ANF")의 발현을 검출함으로서 검출된다. 다른 실시양태에서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화는 심장 근육 세포 특이 전사 인자 (예, MEF2 또는 Nkx2.5 또는 유사영역 전사 인자 HOP)의 발현을 검출함으로써 검출된다. 다른 실시양태에서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화는 심장 근육 특이 유전자 (예, 미오신 경쇄 2V 또는eHAND)의 발현을 검출함으로써 검출된다. 또다른 실시양태에서, 포유류 세포의 심장근육 계통 의 세포로의 분화는 심장 특이 유전자, 예컨대 GATA-4의 발현을 검출함으로써, 또는 심장 근육 수축에 관련된 유전자, 예컨대 근절 미오신 중쇄 (MHC)의 발현에 의해 검출된다. 추가 실시양태에서, 분화는 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 심장 근육의 박동을 관찰함으로써 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 포유류 세포는 줄기 세포 (예, 배아 줄기 세포 또는 배아 암종 세포)이다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 쥐 (예, 생쥐 미분화 R1 배아 줄기 세포 또는 생쥐 암종 P19 세포), 또는 영장류 (예, 인간)로부터 분리된다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 포유류 세포에 투여된 화합물은 카디오게놀(cardiogenol) A, B, C 또는 D이거나, 또는 하나 이상의 카디오게놀 A, B, C 또는 D를 포함하는 조성물이다.
본 발명의 기타 실시양태 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1은 ANF-프로모터 리포터 분석법을 사용하는 심장근육발생에 대한 높은 원료처리량 분석법이다. 도면은 ANF 프로모터 리포터 플라즈미드 발현 발광효소를 품는 안정한 P19 클론을 사용하여 수득된 데이터를 나타낸다. 그래프는 P19 세포에 대한 표준심장근육발생 분화 조건 (EB 형성 및 1% DMSO로 처리) 하에 수일 후 P19 클론으로부터 발광효소의 5 내지 7배 증가를 나타낸다. ([Skerjank IS, Trends Cardiovasc Med, 9:139-143 (1999)] 참조).
도 2는 0.25μM 카디오게놀 C로 처리된 ESC (A 내지 E) 및 P19CL6 세포 (F) 내에서 심장 근육 마커의 면역염색을 나타낸다. (A) 및 (F) 미오신 중쇄 (녹색); (B) GATA-4 (적색); (C) MEF2 (적색); (D) Nkx2.5 (적색); 및 (E) 미오신 중쇄 (녹색) 및 MEF2 (적색). 세포 핵을 DAPI (청색)으로 염색하였다. 세포를 20분 동안 4% 파라포름알데히드 (시그마)로 고정하였다. 세포 염색을 0.3% 트리톤 X-100 및 6% 말 혈청과 함께 PBS (기브코)에서 행하였다. 1차 항체를 하기 희석도로 사용하였다: 미오신 중쇄 (MHC) 쥐 모노클로날 항체 MF20 (Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:200), 토끼 폴리클로날 항-GATA-4 항체 (Santa Cruz Biotech, 1:300), 토끼 항-MEF2 항체 (Santa Cruz Biotech, 1:100) 및 염소 항-Nkx2.5 항체 (Santa Cruz Biotech, 1:100). 2차 항체는 Cy2-접합 항-쥐 (1:300) 또는 Cy3-접합 항-토끼 또는 항-염소 항체 (Jackson ImmunoResearch, 1:500)였다. 세포 핵을 DAPI (로셰)로 염색하였다. 사진은 200배 배율로 니콘 에클립스 TE2000 현미경으로 찍었다. 이중 또는 3중 라벨링된 이미지가 변성으로 조립되었다.
도 3은 카디오게놀 C 처리하지 않은 ESC (대조구)의 면역염색을 나타낸다. (A) MHC (녹색) 및 핵 (청색). (B) GATA-4 (적색) 및 핵 (청색). 각각 도 2A 및 2E와 비교된다.
도 4는 포유류 세포의 심장근육발생을 유도하는 데 사용될 수 있는 본 발명의 추가 화합물의 목록을 나타낸다.
I. 개론
본 발명은 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화를 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화에 유용한 화학식 I 및 II의 화합물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화학식 I 또는 II의 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 또다른 실시양태에서, 포유류 세포에서 심장근육발생을 유도하는 방법이 제공된다. 근육발생은 본 발명의 방법에 따라 생체 내 또는 시험관 내 유도될 수 있다.
II. 정의
따로 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이며 과학적인 용어들은 일반적으로, 본 발명이 속하는 업계의 기술자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에 사용된 학술 용어, 및 유기 및 분석 화학을 위한 실험 절차는 당업자에게 공지되며 통상적으로 사용되는 것들이다.
용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서, 따로 지시하지 않는 한, 완전히 포화되거나, 단일 또는 다중불포화될 수 있으며, 지정된 탄소 원자의 수 (예, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함)를 갖는 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있는, 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리형 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸의 동족체 및 이성질체 등과 같은 기를 포함한다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성질체를 포함한다. 용어 "알킬"은 따로 지시하지 않는 한, 또한 하기 "헤테로알킬"에 상세히 정의된 알킬의 유도체를 포함하는 것으로 의미된다. 탄화수소기에 한정된 알킬기를 "호모알킬"이라 한다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서, 알칸으로부터 유도된 2가 리디칼, 예컨대 CH2CH2CH2CH2-를 의미하며, 또한 하기 "헤테로알킬렌"에서 정의된 기들을 포함한다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌)기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기가 본 발명에 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 더 짧은 사슬, 일반적으로 8개 이하의 탄소원자를 갖는 알킬 또는 알킬렌기이다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그들의 통상적인 의미로 사용되며, 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자 각각을 통해 분자의 나머지에 부착된 알킬기를 말한다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와의 조합으로, 따로 지시하지 않는 한, 지정된 수의 탄소 원자, 및 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자 (여기서, 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며, 질소 헤테로 원자는 임의로 4차화될 수 있음)로 구성된, 안정한 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리형 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미한다. 헤테로 원자(들) O, N 및 S는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 배치될 수 있다. 헤테로원자 Si는 알킬기가 분자의 나머지에 부착되어 있는 위치를 포함하는, 헤테로알킬기의 임의의 위치에 배치될 수 있다. 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-(CH3)2, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함한다. 예컨대 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3과 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서, 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼, 예컨대 -CH2-CH2-S-CH2CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-를 의미한다. 헤테로알킬렌기의 경우, 헤테로원자는 또한 사슬 말단의 한쪽 또는 양쪽을 차지할 수 있다 (예, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기의 경우, 연결기의 어떠한 배향도 의미하지 않는다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 따로 지시하지 않는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 고리형 형태를 나타낸다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자가 헤테로사이클이 분자의 나머지에 부착되어 있는 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함한다. 헤테로시클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함한다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 그 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서, 따로 지시하지 않는 한, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 또한, 용어 "할로알킬"은 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "아릴"은 따로 지시하지 않는 한, 함께 융합되거나 또는 공유적으로 연결된 단일 고리 또는 다중 고리 (3개 이하의 고리)일 수 있는 다중불포화, 전형적으로 방향족 탄화수소 치환체를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자 (여기서, 질소 및 황 원자는 임의로 산화되며, 질소 원자(들)은 임의로 4차화됨)를 함유하는 아릴기 (또는 고리)를 말한다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환체는 하기 기재된 허용가능한 치환체의 군으로부터 선택된다.
간결하게 하기 위해, 다른 용어와 조합으로 사용된 용어 "아릴" (예, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)은 상기 정의된 아릴 및 헤테로아릴 고리 모두를 포함한다. 이와 같이, 용어 "아릴알킬"은 아릴기가, 탄소 원자 (예, 메틸렌기)가 예를 들어, 산소 원자 (예, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)에 의해 대체된 알킬기를 포함하는 알킬기 (예, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)에 부착되어 있는 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어 (즉, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴") 각각은 지시한 라디칼의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함하는 것을 의미한다. 각각의 라디칼 형태의 바람직한 치환체는 하기에 제공된다.
(종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐)을 의미하는 기를 포함하는) 알킬 및 헤테로알킬 라디칼의 치환체는 하기로부터 0 내지 (2m'+1) 범위 (여기서, m'는 상기 라디칼의 탄소 원자의 전체 수임)의 수로 선택된 다양한 기일 수 있다: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -C02R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN 및 -N02. R', R" 및 R"'는 각각 독립적으로 수소, 비치환(C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환 아릴, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴(C1-C4)알킬기를 말한다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 조합하여 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 상기 치환체의 논의에서, 당업자는 용어 "알킬"이 할로알킬 (예, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH20CH3 등)과 같은 기를 포함하는 것을 의미함을 이해할 것이다.
유사하게, 아릴 및 헤테로아릴기에 대한 치환체는 다양하며, 하기로부터 0 내지 방향족 고리계의 개방 원자가의 전체 수의 범위의 수로 선택된다: -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -N02, -C02R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(0)2R', -NR'-C(O)NR"R"', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(0)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬 (여기서, R', R" 및 R"'는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환 아릴 및 헤테로아릴, (비치환 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택됨).
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 치환체의 2개는 화학식 -T-C(O)-(CH2)q-U- (여기서, T 및 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH2- 또는 단일 결합이며, q는 0 내지 2의 정수임)의 치환체로 임의로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 2개의 치환체는 화학식 -A-(CH2)rB- (여기서, A 및 B는 독립적으로 -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(0)2NR'- 또는 단일 결합이며, r은 1 내지 3의 정수임)의 치환체로 임의로 대체될 수 있다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합의 하나는 2중 결합으로 임의로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 2개의 치환체는 화학식 -(CH2)s-X-(CH2)t (여기서, s 및 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이며, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- 또는 -S(O)2NR'-임)의 치환체로 임의로 대체될 수 있다. -NR'- 및 -S(O)2NR'-의 치환체 R'는 수소 또는 비치환 (C1-C6)알킬로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 Cl, Br, F 또는 I 치환체를 의미한다. 용어 "할로알킬" 등은 상이한 할로 원자의 혼합물을 포함한 Cl, Br, F 또는 I 원자로 대체된 하나 이상의 수소 원자를 갖는 지방족 탄소 라디칼을 말한다. 트리할로알킬은 예를 들어 바람직한 라디칼로서 트리플루오로메틸 등을 포함한다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그 통상적인 의미로 본원에 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자에 의해 분자의 나머지에 부착된 알킬기를 말한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로원자"는 산소 (O), 질소 (N) 및 황 (S)을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "제약학적으로 허용가능한 염"은 본원에 기재된 화합물에서 발견된 특정 치환체에 따라, 비교적 비독성인 산 또는 염기로 제조된 활성 화합물의 염을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물이 비교적 산성 작용기를 함유하면, 염기성 부가 염이 상기 화합물의 중성 형태와 충분한 양의 바람직한 염기를, 순수하게 또는 적절한 비활성 용매 중에서 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 염기 부가 염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노 또는 마그네슘 염 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성 작용기를 함유하면, 산 부가 염이 상기 화합물의 중성 형태와 충분한 양의 바람직한 산을, 순수하게 또는 적절한 비활성 용매 중에서 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 산 부가 염의 예는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 모노히드로겐카르본산, 인산, 모노히드로겐인산 , 디히드로겐인산, 황산, 모노히드로겐황산, 요오드화수소산 또는 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 것, 및 비교적 비독성인 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한 알기네이트와 같은 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투노르산 등과 같은 유기산의 염이 포함된다 (예, 문헌 [Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Jounral of Pharmaceutical Science, 66:1-19 (1977)] 참조). 본 발명의 특정 화합물은, 화합물을 염기 또는 산 부가염으로 전환시키는 염기성 및 산성 작용기 모두를 함유한다.
화합물의 중성 형태는 염과, 염기 또는 산을 접촉시키고, 통상적인 방법으로 모 화합물을 분리함으로써 재생될 수 있다. 화합물의 모 형태는 특정 물리적 특성, 예컨대 극성 용매 중의 용해도와 상이하나, 염은 본 발명의 목적을 위한 화합물의 모 형태에 상응한다.
염 형태 외에, 본 발명은 전구약물 형태인 화합물을 제공한다. 본원에 기재된 화합물의 전구약물은 본 발명의 화합물을 제공하는 생리적 조건 하에 화학적 변화를 쉽게 행하는 화합물이다. 또한, 전구약물은 생체 밖 환경에서, 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 전구약물은 적절한 효소 또는 화학제를 갖는 경피 패치 저장소 내에 배치되는 경우, 본 발명의 화합물로 서서히 전환될 수 있다.
본 발명의 특정 화합물은 비용매화 형태 뿐만 아니라 수화된 형태를 포함한 용매화 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화 형태는 비용매화 형태에 상응하며, 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 특정 화합물은 다중 결정성 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태가 본 발명에 의해 의도된 용도에 대해 상응하며, 본 발명의 범주 내로 의도된다.
본 발명의 특정 화합물은 비대칭 탄소 원자 (광학 중심) 또는 이중 결합을 포함하며; 라세미체, 부분입체이성질체, 기하학적 이성질체 및 개별 이성질체가 모두 본 발명의 범주 내에 포괄되는 것으로 의도된다.
본 발명의 화합물은 또한 상기 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 원자 동위체의 비자연 비율을 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위체, 예컨대 트리튬(3H), 요오드-125(125I) 또는 탄소-14(14C)로 방사선라벨링될 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변형은, 방사선활성이건 아니건, 본 발명의 범주 내에 포괄되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "심장근육발생"은 원종 또는 전구체 세포의 심장 근육 세포 (즉, 심장근육세포)로의 분화 및 심장 근육 조직의 성장을 말한다. 원종 또는 전구체 세포는 다능성 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포일 수 있다. 원종 또는 전구체 세포는 심장근육 계통으로 예비수탁된 세포 (예, 예비 심장근육 세포) 또는 예비수탁되지 않은 세포 (예, 다기능 성인 줄기 세포)일 수 있다.
본원에 사용된 "줄기 세포"는 임의의 자가 재생적 다능성 세포 또는 다기능 세포, 또는 다중 세포 형태로 분화할 수 있는 원종 세포 또는 전구체 세포를 말한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 줄기 세포는 심장근육 계통의 세포, 예컨대 심장근육세포로 분화할 수 있는 것들을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 줄기 세포는 예를 들어, 배아 줄기 세포 ("ESC") 및 배아 암종 ("EC") 세포를 포함한다. 다능성 배아 줄기 세포는 신경 세포, 근육 세포, 혈액 세포 등을 포함한 모든 종류의 조직으로 분화할 수 있다. 예컨대 [Spradling et al. (2001)] 참조.
본원에 사용된 "분화하다" 또는 "분화"는 전구체 또는 원종 세포 (예, 줄기 세포)가 특정 세포 형태, 예컨대 심장근육세포로 분화하는 공정을 말한다. 분화된 세포는 이러한 특정 세포 형태에 관해 독특하며 차별적인 특징의 수에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 분화된 세포는 유전자 발현 및 단백질 발현의 패턴에 의해 확인될 수 있다. 전형적으로, 심장근육 계통의 세포는 유전자, 예컨대 근절 미오신 중쇄, 미오신 경쇄 2V, eHAND 및 ANF를 발현한다. 예를 들어, 문헌 [Small et al., Cell, 110:725-735 (2002); Shin et al., Cell, 110:725-35 (2002)] 참조. 심장 근육 세포 특이 전사 인자, 예컨대 MEF2, Nkx2.5 또는 유사영역 전사 인자 HOP가 또한 심장근육 계통의 세포에 의해 전형적으로 발현된다. 예를 들어, 문헌 [Edmondson et al., Development, 1251-1263 (1994); Lin et al., Science, 276:1404-1407 (1997)] 참조. 심장근육세포 분화에 관련된 추가 전사 인자는 예를 들어, GATA4 (예컨대, 문헌 [Grepin et al., Development, 124:2387-95 (1997)] 참조)를 포함한다. 당업자는 기타 심장 근육 특이 유전자가 분화를 모니터링하고 측정하는 데 이용될 수 있음을 인지할 것이다.
"심장근육세포 마커 유전자"는, 마커 유전자가 세포가 심장근육세포인지 아닌지를 결정하는 데 유용할 수 있는 정도로, 심장근육세포 또는 드물게는 기타 세포 형태를 발달시킴으로써 독특하게 발현된 유전자이다. 심장근육세포 마커 유전자의 예는 ANF, 심장근육세포에서 주로 합성되며, 몇몇 심장근육발생 전사 인자의 하류 표적인 폴리펩티드 호르몬이다.
심장근육발생 유도와 관련되어 본원에서 사용된 "고체 지지체"는 줄기 세포가 배양될 수 있는 3차원 매트릭스 또는 2차원 평면을 말한다. 고체 지지체는 천연 발생 물질 (예, 단백질 기재) 또는 합성 물질로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 천연 발생 물질 기재의 매트릭스는 자가이식성 뼈 절편 또는 시판되는 뼈 대체물, 예컨대 문헌 [Clokie et al., J. Craniofac. Surg. 13(1): 111-21 (2002)] 및 [Isaksson, Swed. Dent. J. Suppl., 84: 1-46 (1992)]에 기재된 것으로 구성될 수 있다. 적절한 합성 매트릭스는 예컨대 U.S. 특허 제5,041,138호, 제5,512,474호 및 제6,425,222호에 기재되어 있다. 예를 들어, 생물분해성 인공 중합체, 예컨대 폴리글리콜산, 폴리오르소에스테르 또는 폴리안하이드리드가 고체 지지체에 사용될 수 있다. 탄산칼슘, 선석 및 다공성 세라믹 (예컨대, 조밀한 수산화인회석 세라믹)이 또한 고체 지지체에 사용하기에 적절하다. 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리스티렌과 같은 중합체가 또한 고체 지지체에 사용될 수 있다. 3차원 매트릭스인 고체 지지체 상에서 배양 및 분화된 세포는 전형적으로, 매트릭스의 모든 표면, 예컨대 내부 및 외부에서 생장한다. 평면인 고체 지지체 상에서 배양 및 분화된 세포는 전형적으로 단일층으로 생장한다. 용어 "고체 지지체"는 또한 화학식 I의 화합물의 제조에 사용될 수 있다. 문맥상, "고체 지지체"는 적절한 용매에 부분적으로 용해되거나 완전히 불용성일 수 있으며, 예를 들어 반응물 또는 반응 시약을 결합하는 데 사용되는 중합체성 지지체, 예컨대 비드를 말한다. 적절한 고체 지지체는 PAL 수지, 왕 수지 및 폴리스티렌 수지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "배양"은 증식, 분화하며 노쇠를 피할 수 있는 조건 하에 세포를 유지하는 것을 말한다. 예를 들어, 본 발명에서, 배양된 배아 줄기 세포는 심장근육 세포 계통의 세포로 증식 및 분화한다. 세포는 적절한 생장 인자, 예컨대 심장근육세포의 발달을 용이하게 하거나 강화하는 단백질 함유 생장 인자 혼합물을 함유하는 생장 배지에서 배양될 수 있다.
III. 본 발명의 화합물 및 그의 제조 방법
A. 화학식 I의 화합물
하나의 양태에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 화학식 I의 화합물을 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112006050239740-PCT00002
식 중, R1은 수소, 0 내지 2개의 R1a기로 치환된, C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬 및 C0 -2 알킬아릴을 포함하나 그에 한정되지 않는 작용기이며, 또는 R1은 그것이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 취하여, C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -4 알킬히드록시 및 C0-2 알킬아릴로 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성하며; 여기서, R1a기는 독립적으로 선택되며, 할로겐, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시, -OH, -N(R1b,R1b), -SO2N(R1b,R1b), -C(O)N(R1b,R1b), 헤테로시클로알킬 및 -O-아릴을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 작용기이거나, 또는 R1a기가 인접 고리 원자 상에 있는 경우, 이들은 임의로 함께 취하여 -O-(CH2)1-2-O-, -O-C(CH3)2CH2- 및 -(CH2)3-4-를 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기를 형성하며, 각각의 R1b기는 독립적으로 선택되며 수소 및 C1 -4 알킬을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다. R2는 0 내지 2개의 R2a기로 치환된 C1-4 알킬, C3 -8 시클로알킬 및 C0 -2 알킬아릴을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이며, 여기서, R2a는 독립적으로 선택되며, 할로겐, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시, -N(R2b,R2b), -SO2N(R2b,R2b), -C(O)N(R2b,R2b) 및 -O-아릴을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이거나, 또는 R2a기는 인접 고리 원자 상에 존재시, 임의로 함께 취하여 -O-(CH2)1-2-O-, -O-C(CH3)2CH2- 및 -(CH2)3-4-를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 작용기를 형성하며; 각각의 R2b기는 독립적으로 선택되며, 수소 및 C1 -4 알킬을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다. R3은 전형적으로 수소이거나, 또는 R3은 R2 및 이 둘이 부착된 질소와 임의로 함께 취하여, 예를 들어 C1 -4 알킬 또는 C0 -2 알킬아릴로 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성한다.
본 발명의 화합물은 그의 모든 제약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물, 수화물 및 전구약물을 포함한다.
하나의 실시양태에서, R1은 하기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다:
Figure 112006050239740-PCT00003
바람직한 실시양태에서, R1은
Figure 112006050239740-PCT00004
이다.
하나의 실시양태에서, R2는 하기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 작용기이다:
Figure 112006050239740-PCT00005
특정 바람직한 실시양태에서, R3은 수소이다. 그러나, 다른 실시양태에서, R2 및 R3 및 이들이 부착된 질소는 헤테로사이클을 형성한다. 적절한 헤테로사이클의 예는 하기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112006050239740-PCT00006
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 일반 구조식을 갖는다:
Figure 112006050239740-PCT00007
상기 화학식 II에서, R2는 화학식 I에 관해 상기 정의된 바와 같다. 바람직한 실시양태에서, 화학식 I 및 II의 R2는 하기를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112006050239740-PCT00008
본 발명의 바람직한 화합물은 (카디오게놀 A, B, C 및 D로서 각각 본원에 언 급된) 하기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112006050239740-PCT00009
본 발명의 다른 바람직한 화합물은 도 4에 설명된 예시적 화합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I 및 II의 화합물은 하기에, 특히 실시예에 설명된 시험관 내 및 생체 내 스크리닝 방법을 사용하여 심장근육발생을 유도하는 그 능력에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있다.
B. 화합물의 제조
본 발명의 화합물은 고체상 또는 용액상 합성에 의해 제조될 수 있다.
1. 고체상 합성
화학식 I 및 II의 화합물의 고체상 합성에 관한 방법은 본원의 실시예 1, 및 그 모든 교시가 본원에 참고로 인용된 문헌 [Ding et al., J. Am. Chem. Soc., 124(8):1594 (2002)], [Ding et al., J. Am. Chem. Soc., 124(49):14520-14521 (2002)] 및 U.S. 특허 출원 제10/687,220호 (2003년 10월 15일 출원), U.S. 특허 출원 제60/328,763호 (2001년 10월 12일 출원), U.S. 특허 출원 제60/331,835호 (2001년 11월 20일 출원), U.S. 특허 출원 제60/346,480호 (2002년 1월 7일 출원), U.S. 특허 출원 제60/348,089호 (2002년 1월 10일 출원), 및 U.S. 특허 출원 제10/270,030호 (2002년 10월 12일 출원 (변리사 서류 번호 21288-000340))에 논의된다.
일반적으로, 2-에탄올아민이 환원성 아민화에 의해 (4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)메틸 폴리스티렌 수지 (PAL-수지)에 커플링된다. PAL-수지 (1g, 1.1mmole)을 DMF (4mL) 및 에탄올아민 (5.5mmole)에 현탁한 다음, 아세트산 (0.65mL, 1.13mmole) 및 나트륨 트리아세톡시보로히드리드 (720mg, 3.4mmole)이 용액에 첨가된다. 혼합물을 실온에서 약 12시간 동안 부드럽게 진탕한다. 생성된 수지를 예를 들어, DMF (10mL, 3회), 메탄올 (10mL, 3회) 및 디클로로메탄 (10mL, 3회)으로 세척한다. 이어서, 아닐린 결합된 수지를 80℃에서 12시간 동안 1-부탄올 (5mL) 중 2,4-디클로로피리미딘 (2.2mmole) 및 디이소프로필에틸아민 (0.5mL, 3mmole)과 반응한다. 생성된 수지를 상기 기재된 바와 같이 세척한다.
피리미딘 결합된 PAL 수지 (100mg, 0.1mmole)을 예를 들어, 1mL 부탄올 중 상이한 방향족 아민 (1.0mmole)과 혼합한다. 반응 혼합물을 약 12시간 동안 120℃에서 가열하여 목적 생성물을 수득한다. 이어서, 생성된 수지를 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 실온에서 대략 2시간 동안 CH2Cl2:TFA:Me2S:H20/45:45:5:5 (v/v/v/v, 0.5mL)로 분해한다. 용액을 회수하고, 진공 하 건조하여 목적 조 생성물을 수득한다. 이어서, 조 생성물은 예를 들어, 용매로서 H20 (0.1% TFA 함유) 및 MeCN을 사용하는 예비 RP-HPLC를 사용하여 쉽게 정제한다.
유사한 고체상 합성 기술이 화학식 I 및 II의 기타 화합물의 제조에 사용될 수 있음이 당업자들에게 쉽게 이해될 것이다.
2. 용액상 합성
본 발명의 화합물은 실시예 1에 설명된 바와 같은 용액상 합성에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 화학식 I의 화합물의 용액상 합성은 당업자에게 공지된 적절한 반응 조건 하에, 우선 2,4-디할로헤테로아릴 (예컨대 2,4-디클로로푸린)을 적절한 치환체 (예컨대 히드록시에틸아미노기)로 치환하는 것을 포함한다. 이어서, 당업자에게 공지된 적절한 반응 조건 하에, 제2 적절한 치환체 (예컨대 적절하게 치환된 아닐린 (예, (4-페닐아미노)아닐린, 4-페녹시아닐린, 4-메톡시아닐린, 4-아미노-트랜스-스틸넨 등)으로 치환한다. 본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 표준 방법 (예컨대 예비 RP-HPLC)을 사용하여 정제될 수 있다.
IV. 심장근육발생 유도를 위한 화합물/조성물의 사용
본 발명의 조성물은 포유류 세포의 심장근육발생을 유도하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 말해서, 포유류 세포가 화학식 I의 화합물과 접촉한 뒤, 포유류 세포는 심장근육 계통의 세포로 분화한다. 포유류 세포는 생체 내 또는 시험관 내에서 화학식 I의 화합물 (또는 그의 조성물)과 접촉한다. 예를 들어, 카디오게놀 C는 손상되거나 또는 기능부전인 심장 근육에 정맥내로 직접적으로 투여되거나, 또는 외과 수술 동안 직접적 투여에 의해 투여될 수 있다.
A. 심장근육발생의 생체 내 유도
화학식 I의 화합물, 및 그의 조성물은 생체 내 심장근육발생의 유도에 편리하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 조성물은 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화를 유도하는 데 효과적인 양으로, 개체, 예컨대 인간과 같은 포유류에 투여된다. 심장근육발생을 유도하는 그들의 능력 측면에서, 화학식 I의 화합물은 심장근육병증과 같은 질환의 치료 및 급성 심장 질환에서 손상된 심근의 회복에 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 심장 근육 조직의 발달을 연구하는 목적으로 심장근육세포를 발생시키기 위해 사용된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 손상되거나 약화된 심장 근육 조직의 회복 또는 증가가 필요한 피검자의 치료 동안 사용된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 손상되거나 약화되지 않은 심장 근육 조직의 증가 및 강화를 원하는 피검자를 치료하는 데 사용된다. 상기 피검자는, 예를 들어 심장 질환 또는 이상의 위험이 있는 대상들을 포함할 수 있다.
당업자는 본 발명의 조성물이 단독으로 또는 다른 화합물 및 치료적 섭생과 조합하여 사용되어 심장근육발생을 유도할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물은 심장 근육 조직의 발달을 강화하는, 정제 또는 합성된 생장 인자 및 기타 제제, 또는 이들의 조합과 연합하여 투여될 수 있다.
조성물의 유효량은 존재, 특성 및 조성물의 투여를 동반하는 임의의 역효과의 정도; 조성물의 LD50; 및 다양한 농도에서 조성물의 부효과에 의해 측정될 것이다. 전형적으로, 투여된 조성물의 양은 체중 1kg당 약 0.01 내지 약 20mg, 더욱 전형적으로, 체중 1kg당 약 0.05 내지 약 15mg, 더욱 전형적으로, 체중 1kg당 약 0.1 내지 약 10mg일 것이다.
조성물은 예를 들어, 정맥내 주입, 경구, 복강내 또는 피하 주입에 의해 투여될 수 있다. 경구 투여가 바람직한 투여 방법이다. 화합물의 제형은 단일 투여 또는 다중 투여 밀봉된 용기, 예컨대 앰플 및 바이알로 제시될 수 있다.
본 발명의 조성물은 전형적으로, 개체 또는 피검자에게 투여하기 전에 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로, 투여되는 특정 조성물 (예, 카디오게놀 C)에 의해서 뿐만 아니라, 조성물 투여에 사용된 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물의 광범위한 적절한 제형이 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).
경구 투여에 적절한 제형은 (a) 액체 용액, 예컨대 희석제, 예컨대 물, 식염수 또는 PEG 400에 현탁된 화학식 I의 화합물의 유효량; (b) 각각 액체, 고체, 과립 또는 젤라틴으로서 활성 성분의 소정량을 함유하는 캡슐, 사셰(sachet) 또는 정 제; (c) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적절한 에멀션으로 구성될 수 있다. 정제 형태는 하나 이상의 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미소결정성 셀룰로스, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 및 기타 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 향료제, 염료, 붕해제 및 제약학적으로 상용성인 담체를 포함할 수 있다. 로젠지 형태가 향료 중의 활성 성분, 예컨대 수크로스를 포함할 수 있으며, 향정은 활성 성분 외에 공지된 담체를 함유하는 비활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 에멀션, 겔 등 내에 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 조성물은 투여의 기타 경로, 예컨대 정맥내 주입, 복강내 또는 피하 투여에 적절한 제형 형태일 수 있다. 제형은 예를 들어, 산화방지제, 완충제, 세균발육 억제제, 및 제형을 의도하는 수용체의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점화제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 문맥상, 환자에게 투여된 투여량은 시간의 경과에 따라 환자의 유리한 치료적 반응을 달성하기에 충분해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 심장근육병증을 치료 또는 예방하기 위해 투여되는 경우, 환자에게 투여된 투여량은 리드미컬하게 수축하기 위해 심장 근육의 감소된 용량을 방지, 지연 또는 역전하기에 충분해야 한다. 투여량은 사용된 특정 조성물의 효능, 및 환자의 상태, 뿐 만 아니라 치료될 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 투여량의 크기는 또한 존재, 특성, 특정 환자 중 특정 조성물의 투여에 동반하는 역효과의 정도에 의해 결정될 것이다.
B. 심장근육발생의 시험관 내 유도
본 발명의 조성물은 심장근육발생의 시험관 내 유도에 편리하게 사용될 수 있다. 포유류 세포가 조성물과 접촉한 뒤, 포유류 세포는 심장근육 계통의 세포로 분화한다.
1. 적절한 세포
심장근육 계통의 세포로 분화될 세포는 임의의 적절한 포유류로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 세포는 설치류, 예컨대 쥐, 래트, 기니아 피그 및 토끼; 비설치류 포유류, 예컨대 개, 고양이, 돼지, 양, 말, 소 및 염소; 영장류, 예컨대 침팬지 및 인간으로부터 수득될 수 있다. 분화될 세포는 1차 세포일 수 있거나, 또는 배양 중 유지된 세포일 수 있다. 세포가 배양 중 유지되면, 이들은 전형적으로 배양 중 12번째 및 15번째 사이에 본 발명의 화합물/조성물과 접촉한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 세포의 초기 배양을 생성하는 기술 및 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Humason, ANIMAL TISSUE TECHNIQUES, 4ed., W.H. Freeman and Company (1979)] 및 문헌 [Ricciardelli et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 25:1016 (1989)] 참조).
인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 골수 또는 기타 MSC 공급원의 다른 세포로부터 다능성 중간엽 줄기 세포를 분리함으로써 수득될 수 있다. 골수 세포는 엉덩뼈 능선, 대퇴뼈, 정강뼈, 척추, 갈비뼈 또는 기타 골수공간으로부터 수득될 수 있다. 인간 중간엽 줄기 세포의 기타 공급원은 배아 난황낭, 태반, 탯줄, 태아 및 청소년 피부, 혈액, 지방조직 및 근육 위성 세포를 포함한다. 전형적으로, 중간엽 줄기 세포를 함유하는 조직 시험편으로부터의 세포는 (1) 분화 없이 중간엽 줄기 세포 생장을 촉진하며, (2) 중간엽 줄기 세포만의 기판 표면에 대한 선택적 접착을 허용하는 생장 인자를 함유하는 생장 배지에서 배양된다. 적절한 시간 동안 세포의 배양 후, 비접착 물질은 기판 표면으로부터 제거되어, 중간엽 줄기 세포의 확장된 모집단을 제공한다. 이와 같이, 균질한 MSC 모집단은, 조혈 세포 또는 분화된 중간엽 세포와 결부된 마커가 없는, 접착 골수 또는 골막 세포의 양성적인 선택에 의해 수득된다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물에 의해 접촉된 포유류 세포는 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포 (ESC)이다. 인간 및 동물 ESC의 분리를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Brook FA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5709-12 (1997); Grounds et al., J. Histochem. and Cytochem., 50:589-610 (2002); Reubinoff, Nat. Biotech., 18:399-404 (2000)] 참조. 포유류 배아 줄기 세포는 예를 들어, 생쥐 R1 세포 및 인간 배아 줄기 세포를 포함한다.
2. 일반 배양 방법
포유류 세포 (예, ESC)는 단일 혼합물로 또는 연속적으로, 또는 기타 생장 인자의 존재 하에, 화학식 I의 기타 화합물과 조합하여, 또는 화학식 I의 화합물 단독과 접촉될 수 있다. 당업자는 화합물의 양, 예컨대 임의의 카디오게놀 A, B, C 또는 D의 양, 및 생장 인자가 특정 세포 형태의 분화의 유도를 용이하게 하도록 조정될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 세포와 접촉된 카디오게놀의 양은 전형적으로 약 0.01μM (52ng/ml) 내지 약 10μM (2.6㎍/ml), 더욱 전형적으로 약 0.02μM 내지 약 5μM, 더욱 전형적으로 약 0.05μM 내지 약 1μM, 더욱 전형적으로 약 0.075μM 내지 약 0.5μM, 가장 전형적으로 약 1μM이다.
본 발명의 상기 양태는 세포 배양 분야의 통상적인 기술에 의존한다. 적절한 세포 배양 방법 및 조건은 공지된 방법학을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Freshney et al., CULTURE OF ANIMAL CELLS (3rd ed. 1994)] 참조). 일반적으로, 세포 배양 환경은 세포 생장, 세포 밀도 및 세포 수축을 위한 기질로서 상기 인자, 기체상, 배지 및 온도의 고려를 포함한다.
세포의 배양은 일반적으로 세포 생장에 최적으로 공지된 조건 하에 행해진다. 상기 조건은 예를 들어, 대략 37℃의 온도, 및 대략 5% CO2를 함유하는 습한 대기를 포함할 수 있다. 배양 기간은 목적 결과에 따라 매우 광범위할 수 있다. 일반적으로, 배양은 바람직하게는, 세포가 적절하게 발현할 때까지 지속된다. 증식은 편의상 3H 티미딘 혼입 또는 BrdU 라벨링을 사용하여 결정된다.
플라스틱 접시, 플라스크 또는 롤러 병이 본 발명의 방법에 따라 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다. 적절한 배양 용기는 예를 들어, 다중 웰 플레이트, 페트리디쉬, 조직 배양 튜브, 플라스크, 롤러 병 등을 포함한다.
세포는 세포 종류를 기준으로 실험적으로 결정된 최적 밀도에서 생장한다. 세포는 전형적으로 12 내지 15회 통과하며, 15회 통과후 폐기된다.
배양된 세포는 적절한 온도, 예컨대 세포가 수득되는 동물의 체온을 제공하여 지역적 온도 변동이 되는 배양기 내에서 통상적으로 생장한다. 일반적으로, 37℃가 세포 배양에 바람직한 온도이다. 대부분의 배양기는 대략 대기 조건으로 가습된다.
기체상의 중요한 구성성분은 산소 및 이산화탄소이다. 전형적으로, 대기 산소 압력이 세포 배양에 사용된다. 배양 용기는 기체 투과성 캡을 사용하거나, 또는 배양 용기의 밀봉을 방해함으로써, 통상적으로 배양기 대기로 환기되어 기체 교환을 허용한다. 이산화탄소는 세포 배지 중의 완충제와 함께 pH 안정화의 역할을 하며, 전형적으로 배양기 중에 1 내지 10%의 농도로 존재한다. 바람직한 CO2 농도는 전형적으로 5%이다.
한정된 세포 배지가 포장, 예비혼합된 분말 또는 예비멸균된 용액으로서 이용가능하다. 통상적으로 사용된 배지의 예는 MEM-α, DME, RPMI 1640, DMEM, 이스코브(Iscove) 완전 배지, 또는 맥코이(McCoy) 배지 (예를 들어, 기브코 BRL/생명 과학 카탈로그 및 참고 가이드; 시그마 카탈로그 참조)를 포함한다. 전형적으로, MEM-α 또는 DMEM이 본 발명의 방법에 사용된다. 한정된 세포 배양 배지는 종종 5 내지 20% 혈청, 전형적으로 가열 비활성화된 혈청, 예컨대 인간, 말, 송아지 및 소 태아 혈청으로 보충된다. 전형적으로 10% 소 태아 혈청이 본 발명의 방법에 사용된다. 배양 배지는 바람직하게는 약 7.2 내지 약 7.4의 pH로 세포를 유지하도록, 통상적으로 완충된다. 배지에 대한 기타 보충물은 예를 들어, 항생제, 아미노산 및 설탕, 및 생장 인자를 포함한다.
C. 심장근육발생의 검출
본 발명의 조성물의 생체 내 및 시험관 내 투여 후, 심장근육발생의 유도가 하기를 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 상이한 방법에 의해 검출될 수 있다: 심장근육세포-특이 단백질의 발현의 검출, 심장 근육 세포-특이 전사 인자의 발현의 검출, 심장 근육 기능에 필수적인 단백질 발현의 검출, 및 심장 근육 세포의 박동의 검출. 심장근육세포-특이 단백질 및 심장 근육 세포-특이 전사 인자의 구체적인 예가 본원에 기재된다.
1. 심장근육세포-특이 단백질의 검출
심장 근육 세포 분화의 발현이 심장 근육 세포-특이 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정함으로써 검출될 수 있다. 특정 심장 근육 세포-특이 단백질의 수준은 면역분석법, 예컨대 면역조직화학염색, 웨스턴 블로팅, 엘리사(ELISA) 등을 특정 심장근육세포-특이 단백질 또는 그의 절편에 선택적으로 결합하는 항체와 함께 사용하여 편리하게 측정될 수 있다. 면역분석법에서 단백질-특이 항체를 사용하는 단백질의 검출은 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986); and Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)] 참조). mRNA의 측정의 경우, 증폭, 예컨대 PCR, LCR, 또는 혼성화 분석법, 예컨대 노던 혼성화, RNA아제 보호, 도트 블로팅이 바람직하다. 단백질 또는 mRNA의 수준은, 예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로 라벨링된 검출 제제, 예컨대 형광적으로 또는 방사선활성적으로 라벨링된 핵산, 방사선활성적으로 또는 효소활성적으로 라벨링된 항체를 사용하여 검출된다. 이들 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 문헌 [Ausubel, et al. ed. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (2001)]에 기재되어 있다.
전형적으로, 심장 근육 세포 단백질 ANF의 발현이 분화된 심장근육세포의 검출에 사용된다. ANF는 심장 근육세포에서 주로 합성되며, 몇몇 심장근육발생 전사 인자의 하류 표적인 폴리펩티드 호르몬이며; 특이 심장근육세포 "마커" 유전자로 고려된다 (Boer, Exp. Cell Res., 207:421-29 (1993)). ANF 유전자의 활성화는 예를 들어, 쉽게 검출가능한 단백질, 또는 그 활성이 쉽게 검출가능한 효소, 예컨대 발광효소의 리포터 플라즈미드 상류에 ANF 프로모터 영역을 삽입함으로써 측정될 수 있다. 이들 환경에서 리포터 유전자의 발현 수준의 증가는 심장근육세포 분화의 지표이다.
a) 면역조직화학적 검출
검출을 위한 세포, 예컨대 심장근육세포-특이 유전자의 직접적인 면역조직화학적 염색을 위해, 세포를 적절한 밀도로 96웰 분석 플레이트에 시딩하고, 적절한 양의 화학식 I의 화합물 (예, 카디오게놀 A)을, 단독으로 또는 다른 생장 인자와 조합하여 적절한 시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 10% 포르말린 용액으로 고정하였다. 고정된 세포를 다시 세척하고, 당업자에게 공지된 방법 (예컨대 문헌 [Harlow & Lane, 1988, supra; Coligan, 1991, supra; Goding, 1986, supra; and Kohler & Milstein, 1975, supra)] 참조)을 사용하여, 목적 단백질에 대해 특이적인 시약 (예, 단백질에 대해 특이적인 항체, 또는 효소적 리포터 유전자가 사용된 경우, 예컨대 형광분석 방법에 의한 그 검출성이 리포터 유전자 효소의 존재 하에 변하는 시약)으로 염색하였다. 세포의 사진을 찍고, 심장근육세포-특이 유전자를 발현하는 양성 세포를 사진으로부터 수동으로 계수하였다.
2. 심장 근육 세포-특이 전사 인자의 검출
심장 근육 세포-특이 전사 인자의 발현을 리포터 유전자 분석법을 사용하여 검출할 수 있다. 다양한 리포터 유전자 분석법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [New et al., Phytother. Res., 17:439-48 (2003); Schenborn et al, Mol. Biotechnol., 13:29-44 (1999)] 참조. 리포터 유전자, 예컨대 클로람페니콜 아실트랜스퍼라제, 개똥벌레 발광효소, 세균 발광효소, 또는 β-갈락토시다제를 리포터 유전자 분석법에 사용할 수 있다. 리포터 구성은 전형적으로 세포에 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션된다. 관련 유전자의 프로모터 영역이 PCR 적절한 프라이머에 의해 전형적으로 증폭된다. 생성된 PCR 생성물은 적절한 클로닝 벡터에 삽입되고, 증폭되며, 서열화된다. 생성된 플라즈미드는 적절한 제한 효소로 분해되며, 생성 절편은 리포터 유전자를 포함하는 벡터에 삽입된다.
a) 일시적으로 트랜스펙션된 세포
일시적으로 트랜스펙션된 세포를 갖는 리포터 유전자 분석을 위해, 세포를 전형적으로, 생장 배지 2mL 중 대략 30,000세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 시딩 하고, 적절한 시간 동안 밤새 배양한다. 플라즈미드 DNA를 적절한 트랜스펙션 시약을 사용하여 세포에 트랜스펙션한다. 8시간 후, 트랜스펙션된 세포를 96-웰 분석 플레이트 (예, 코닝)에 평판배양하고, 적절한 양의 화학식 I의 화합물 (예, 카디오게놀 A)로 처리한다. 세포를 4일 동안 배양한 다음, 세포 내 리포터 유전자 활성을 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 분석한다.
b) 안정적으로 트랜스펙션된 세포
안정적으로 트랜스펙션된 세포를 갖는 리포터 유전자의 분석을 위해, 세포를 전형적으로, 생장 배지 2mL 중 대략 30,000세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 시딩하고, 적절한 시간 동안 또는 밤새 배양한다. 리포터 플라즈미드 및 선택적 마커를 포함하는 벡터 (예, 항체 내성 유전자)의 적절한 양을 적절한 트랜스펙션 시약을 사용하여 세포에 동시 트랜스펙션한다. 적절한 배양 시간 후, 세포를 10cm 배양 접시에 시딩하고, 항체의 적절량을 배양 배지에 첨가한다. 새로운 항체를 적절한 간격으로 첨가한다. 항체 내성 콜로니를 회수하여, 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 수득한다. 트랜스펙션된 세포는 96웰 분석 플레이트 (예, 코닝)에 평판배양하고, 적절한 양의 화학식 I의 화합물 (예, 카디오게놀 A)로 처리한다. 세포를 4일 동안 배양한 다음, 세포 내 리포터 유전자 활성을 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 분석한다.
3. 분화된 심장근육세포의 투여
분화된 심장근육세포는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 피검자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 무손상 고체 지지체 (예, 3차원 매트릭스 또는 2차원 평면) 상의 분화된 심장근육세포를 예컨대 외과수술적 이식에 의해, 피검자에게 투여할 수 있다. 대안적으로, 분화된 심장근육세포는 피검자에게 예컨대 정맥내, 피하 또는 복강내 투여하기 전에, 프로테아제로 처리함으로써 매트릭스로부터 탈착될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 배아 줄기 세포는 추출되어, 계속해서 증식 및 심장근육 계통의 세포로의 분화를 위해, 매트릭스와 접촉한다. 세포는 처리될 피검자로부터 예컨대 자가이식적으로 추출될 수 있거나 (이에 의해, 이식의 면역 기재 거부를 피함), 또는 제2 피검자로부터 예컨대 비상동적으로 추출될 수 있다. 어느 경우건, 세포의 투여는 적절한 면역억제 처리와 조합될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 분화된 심장근육세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 피검자에게 투여될 수 있다. 적절한 투여 수단은, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내 및 외과적 이식을 포함한다. 심장근육세포는 심장 근육에 직접적으로 주입되거나, 또는 예를 들어, 심장에 대한 외과수술 동안 국소적으로 적용될 수 있다.
세포는 투여에 적절한 제형, 예를 들어, 산화방지제, 완충제, 세균발육 억제제, 및 제형을 의도하는 수용체의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점화제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액일 수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
외과적 이식의 경우, 분화된 세포는 전형적으로 무손상 지지체, 예컨대 3차 원 매트릭스 또는 2차원 평면 상에 잔류한다. 매트릭스 또는 2차원 평면은 피검자의 적절한 부위에 외과적으로 이식된다. 예를 들어, 심장 근육 조직의 일부의 대체를 필요로 하는 환자는 외과적으로 이식된 무손상 고체 지지체 상에 분화된 세포를 가질 수 있다.
감소되거나 기능부전인 심장 근육 세포로 인한 상태의 예방 또는 치료에 투여될 세포의 효과적인 양의 결정시, 의사는 세포 독성, 이식 반응, 질병의 진행 및 항 세포 항체의 생성을 평가한다. 투여를 위해, 본 발명의 방법에 따라 분화된 심장근육세포는 환자의 질량 및 전체 건강에 적용된 바에 따라 다양한 농도에서 심장근육세포의 부작용을 고려하여, 피검자에게 심장 근육 세포를 제공하기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할된 투여량에 의해 달성될 수 있다.
하기 실시예는 청구된 발명을 예시하나, 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 카디오게놀 A, B, C 및 D의 합성 및 특성화
합성에 사용된 모든 화학제는 알드리히로부터 구입하였다. 2,4-디클로로피리미딘 (200mg, 1.34mmole)을 에탄올 5mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 282㎕ (1.62mmole) 및 에탄올아민 90mg (1.47mmole)을 이 용액에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 50℃에서 12시간 동안 가열하여, 2-클로로-4-(1-히드록시에틸아미노)-피리미딘 (80% 수율)을 수득하였다. 2-클로로-4-(1-히드록시에틸아미노)-피리미딘 20mg (0.12mmol)을 1-부탄올 (1mL)에 용해하고, 4-(페닐아미노)아닐린 42.4mg (0.23mmole)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 전자파 반응기 중에서 200℃에서 15분 동안 가열하여, 카디오게놀 A를 수득하였다 (85% 수율). 유사하게, 4-페녹시아닐린 42.7mg (0.23mmole), 4-메톡시아닐린 28.4mg (0.23mmole) 또는 4-아미노-트랜스-스틸벤 45.0mg (0.23mmole)을 사용하여, 카디오게놀 B (80% 수율), C (90% 수율) 또는 D (75% 수율)를 각각 수득하였다. 화합물을 10분 동안 5% 내지 90% MeCN 선형 구배로, 용매로서 MeCN 및 H2O (0.1% TFA 함유)를 사용하여 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 목적 피크를 회수하고, 동결 건조하여 최종 생성물을 수득하였다.
카디오게놀 A: 1H NMR (400MHz, DMSO): δ(ppm) 3.44 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 6.20 (d, 1H, J=7.2), 6.83 (t, 1H, J=7.2), 7.08 (m, 5H), 7.23 (t, 2H, J=8.3), 7.34 (d, 2H, J=7.7), 7.67 (d, 1H, J=6.6), 8.25 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 10.18 (s, 1H). 고성능 질량 분광분석법 (MALDI-FTMS): 계산된 [MH+](C18H20N5O) 322.1662, 실측치 322.1660.
카디오게놀 B: 1H NMR (400MHz, DMSO): δ(ppm) 3.45 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 6.24 (d, 1H, J=7.2), 7.03 (m, 5H), 7.14 (t, 1H, J=7.4), 7.40 (t, 2H, J=7.5), 7.55 (d, 2H, J=8.6), 7.73 (d, 1H, J=7.0), 8.97 (s, 1H), 10.30 (s, 1H). 고성능 질량 분광분석법 (MALDI-FTMS): 계산된 [MH+] (C18H19N402) 323.1502, 실측치 323.1498.
카디오게놀 C: 1H NMR (400MHz, DMSO): δ(ppm) 3.42 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 6.21 (d, 1H, J=7.2), 6.97 (d, 2H, J=8.9), 7.41 (d, 2H, J=8.4), 7.66 (d, 1H, J=7.1), 8.93 (s, 1H), 10.07 (s, 1H). 고성능 질량 분광분석법 (MALDI-FTMS): 계산된 [MH+] (C13H17N402) 261.1346, 실측치 261.1342.
카디오게놀 D: 1H NMR (400MHz, DMSO): δ(ppm) 3.48 (m, 2H), 3.62 (m, 2H), 6.26 (d, 1H, J=7.2), 7.27 (m, 3H), 7.38 (t, 2H, J=7.5), 7.61 (m, 6H), 7.77 (d, 1H, J=7.0), 9.00 (s, 1H), 10.35 (s, 1H). 고성능 질량 분광분석법 (MALDI-FTMS): 계산된 [MH+] (C20H21N4O) 333.1710, 실측치 333.1711.
상기 용액상 합성 방법 외에, 본 발명의 화합물은 또한 다음과 같이 고체상 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다:
일반적으로, 2-에탄올아민을 환원성 아민화에 의해 (4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)메틸 폴리스티렌 수지 (PAL-수지)에 커플링하였다. PAL-수지 (1g, 1.1mmole)을 DMF (4mL) 및 에탄올아민 (5.5mmole)에 현탁한 다음, 아세트산 (0.65mL, 1.13mmole) 및 나트륨 트리아세톡시보로히드리드 (720mg, 3.4mmole)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 약 12시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 생성된 수지를 DMF (10mL, 3회), 메탄올 (10mL, 3회) 및 디클로로메탄 (10mL, 3회)으로 세척하였다. 이어서, 아닐린 결합된 수지를 80℃에서 12시간 동안 1-부탄올 (5mL) 중 2,4-디클로로피리미딘 (2.2mmole) 및 디이소프로필에틸아민 (0.5mL, 3mmole)과 반응하였다. 생성된 수지를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다.
피리미딘 결합된 PAL 수지 (100mg, 0.1mmole)을 1mL 부탄올 중 상이한 방향족 아민 (1.0mmole)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 12시간 동안 120℃에서 가열하여 목적 생성물을 수득하였다. 이어서, 생성된 수지를 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 실온에서 2시간 동안 CH2Cl2:TFA:Me2S:H20/45:45:5:5 (v/v/v/v, 0.5mL)로 분해했다. 용액을 회수하고, 진공 하 건조하여 목적 조 생성물을 수득하였다. 이어서, 조 생성물은 용매로서 H20 (0.1% TFA 함유) 및 MeCN을 사용하는 예비 RP-HPLC를 사용하여 정제할 수 있다.
실시예 2: 심장근육발생 유도 분자에 대한 세포 배양 및 높은 원료처리량 스 크리닝
P19 배아 암종 (EC) 세포 (ATCC)를 5% CO2 중 37℃에서 7.5% 새로 태어난 송아지 혈청 및 2.5% FBS (기브코)를 갖는 MEM-α에서 배양하였다. P19CL6 세포 (Dr. Michael Schneider and Dr. Nakamura Teruya 증여)를 5% CO2 중 37℃에서 10% FBS (기브코)를 갖는 MEM-α에서 배양하였다. ANF 프로모터 영역을 함유하는 절편 (약 700bps)을 PCR 프라이머 (5'-ccgacgcgtgaaacatcacattggttgcctt 및 5'-ccgctcgagcactctctggtttctctctc)를 사용하여 증폭한 다음, Mlul 및 Xhol 제한 부위를 사용하여 PGL3-BV 발광효소 리포터 플라즈미드에 서브클로닝하였다. 안정한 P19 클론 포함 리포터 플라즈미드는 P19 세포에 대한 표준 심장근육발생 분화 조건시 (EB 형성 및 1% DMSO로 처리 ([Skerjank IS, Trends Cardiovasc Med, 9:139-143 (1999)] 참조)), 발광효소 신호에서 5 내지 7배 증가를 나타냈다 (도 1). 이 세포주를 하기 방법에 따라 단층 형식으로 100,000개 화합물 헤테로사이클 자료를 스크리닝하는 데 사용하였다. 103 세포를 100㎕ 유도 배지 (5% FBS를 갖는 MEM-α)를 갖는 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 평판배양하고, 1mM 화합물 용액 500nL을 각 웰에 첨가하였다. 3일 동안 화합물 처리한 후, 어떠한 첨가된 부가 화합물로도 배지가 변화되지 않았다. 발광효소 활성은 브라이트-글로(Bright-Glo) 발광효소 분석 키트 (프로메가)를 사용하여 화합물 처리 7일 후 측정하였다. 대략 80개 화합물이 EB의 부재 하에 4배 이상 상향 제어된 발광효소 활성을 확인하였다.
MHC는 심장 근육 수축에 대해 책임이 있는 필수 모터 단백질이며, 분화에 대한 2차 분석법으로서 사용되었다. 상기 기재된 스크리닝 분석법에서 확인된 80개 화합물의 35개가 P19CL6 세포 중에서 근절 미오신 중쇄 (MHC) 발현을 유도하였다. P19CL6 세포주는 심장근육발생에 대한 높은 효력을 갖는 P19 EC 세포의 서브클론이다. [Habara-Ohkubo, Cell Struct. Funct., 21:101-110 (1996)] 참조. MHC 발현을 항-MHC 항체 (MF20)로 세포를 면역염색함으로써 P19CL6 세포 중에서 측정하였다 (도 2F).
실시예 3: 심장근육발생 유도 활성을 갖는 화합물로서 카디오게놀 A, B, C 및 D의 확인
상기 실시예에서 확인된 35개 화합물 중, 카디오게놀 A 내지 D (표 1)가 MHC 발현을 유도하는 데 가장 효과적이었다.
Figure 112006050239740-PCT00010
표 1의 카디오게놀의 최적 활성은 일련의 "+" 부호로, 다음과 같이 지정된다: ++: 10 내지 25% 세포가 7일 후 MHC에 대해 양성임; +++: 25 내지 40% 세포가 7일 후 MHC에 대해 양성임; ++++: 40 내지 55% 세포가 7일 후 MHC에 대해 양성임.
이들 화합물이 일반적인 심장근육발생 유도제임을 확인하기 위해, 미분화된 R1 쥐 ESC에 대한 이들의 효과를 분석하였다. R1 쥐 ESC는 배양 배지 중 백혈병 억제 인자 (LIF)의 첨가로 다능성 상태로 유지될 수 있다. 배아 줄기 세포주 R1을 15% ES 혈청 대체물, 1mM L-글루타민 (기브코), 1% 비필수 아미노산 스톡, 1% 뉴클레오시드 스톡, 0.1mM 베타-메르캅토메탄올 (스페셜티 미디어) 및 백혈병 억제 인자 (LIF, 케미콘) 1000단위/mL을 갖는 넉아웃 DMEM을 갖는 젤라틴 코팅된 조직 배양 디쉬에서 배양하였다.
분화를 위해, R1 세포를 10% FBS을 갖는 DMEM 100㎕ 및 화합물 0.25μM를 갖는 젤라틴 코팅된 384웰 또는 96웰 플레이트 중에 단일층 (10000세포/웰)으로 평판배양하였다. LIF는 분화 동안 존재하지 않았다. 배양 7일 후 (화합물로 3일, 이어서 첨가된 추가 화합물 없이 배지 교환 후 또다른 4일), 박동하는 심장 근육의 존재를 현미경으로 가시화하였다. MHC의 발현 외에 (도 2A), 심장 특이 유전자 GATA-4가 항-GATA4 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 검출되었다 (도 2B). GATA-4는 P19 세포 중 심장근육발생을 강화하는 과발현 및 심장의 발달을 제한하는 전사 인자이다. (Grepin et al., Development, 124:2387-95 (1997); Chadron et al., Cell and Dev. Biol., 10:85-91 (1999); Gag et al., Nature, 424:443-447 (2003)). 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, MHC 또는 GATA-4 어느 것도 미분화된 R1 쥐 ESC에서 발현되지 않는다. 또한, 화합물 처리가 어떠한 유의적인 세포 사멸 없이 세포 증식을 늦춤이 관찰되며, 이는 이러한 공정이 다른 계통의 세포의 사멸과 함께 심장 전구체 세포에 대한 선택이 단순히 아님을 나타낸다.
실시예 4: 카디오게놀 C는 배아 줄기 세포의 심장근육발생의 효과적인 유도제이다 .
카디오게놀 C는 피리미딘 C2 위치에서 치환하는 p-메토님 아닐린을 가지며, ESC로부터 MHC 양성 심장근육세포의 분화를 유도하기 위한 0.1μM의 EC50으로 매우 효과적이다. 카디오게놀 C는 25μM보다 큰 농도에서만 유의적인 세포 독성을 나타냈으며, 3일 동안 R1 세포를 0.25μM 화합물로 처리하고, 4일 동안 화합물 없이 배지에서 배양한 후, 50% 초과의 세포가 MHC에 대해 양성 염색되었으며, 90% 초과의 세포가 GATA-4에 대해 양성이며, GATA가 MHC보다 일찍 발현된다는 이전의 관찰과 일치한다. 예컨대 문헌 [Boheler et al., Circ. Res., 91:189-201 (2002)] 참조. 또한, 카디오게놀 C로 처리된 R1 세포가 많은 박동 영역이 있었으며, 이는 이들 MHC 양성 세포가 기능성 심장 근육을 형성할 수 있음을 증명한다. 이들 결과는 세포 모집단의 대다수가 카디오게놀 C에 의해 유도되어, (집합 및 EB 형성 부재 하에) 심장 계통으로 분화되었음을 가리킨다. 이는 세포 모집단의 5%만이 심장근육세포를 형성하는, 집합 및 EB의 형성에 의해 심장근육발생을 유도하는 현행 표준 방법과 대조된다. 상기 문헌 [Boheler et al., (2002)] 참조.
실시예 5: 카디오게놀 C를 사용하여 분화된 ESC 중 심장 근육 세포-특이 전사 인자의 검출
카디오게놀 C의 활성을 추가로 특성화하기 위해, 심장 근육 세포 특이 전사 인자 MEF2 및 Nkx2.5의 발현을 조사하였다 (도 2C 및 D). MEF2 계열의 구성원들이 근육 발달에 필수적이다. 예컨대, 문헌 [Edmondson, et al., Development, 1251-1263 (1994); Lin et al., Science, 276:1404-1407 (1997)] 참조. GATA-4와 함께 Nkx2.5는 다중 심장 근육 특이 유전자 (예, 미오신 경쇄 2V, 심방 나트륨이뇨 인자, eHAND 및 유사영역 전사 인자 HOP)의 발현을 제어한다. 예컨대, 문헌 [Small et al., Cell, 110:725-735 (2002); Shin et al., Cell, 110:725-35 (2002)] 참조. 또한, Nkx2.5 유전자의 표적화 장애물은 배아 치사유전자증이며, 심장 발달을 막는다. 예컨대, 문헌[Lyons et al., Genes Dev., 9:1654-66 (1995)] 참조. 대략 90%의 카디오게놀 C 처리된 세포가 MEF2 및 Nkx2.5에 대해 양성으로 염색되며, ESC가 카디오게놀 C에 의해 심장 근육으로 분화됨이 추가로 확인된다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허 출원은 각 개별 공보 또는 특허 출원이 참고로 인용되도록 구체적이며 개별적으로 지시된 것처럼, 참고로 본원에 인용된다.
상기 발명이 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었으나, 첨부된 청구의 범위의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고, 특정 변형 및 수정이 이루어질 수 있음이 본 발명의 교시 측면에서 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

Claims (51)

  1. 하기 구조식을 갖는 화학식 I의 화합물:
    <화학식 I>
    Figure 112006050239740-PCT00011
    식 중, R1은 수소, 0 내지 2개의 R1a기로 치환된, C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬 및 C0-2 알킬아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이거나, 또는 R1은 그것이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 취하여, C1-4 알킬, C3 -8 시클로알킬, C1 -4 알킬히드록시 및 C0 -2 알킬아릴로 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성하며; R1a기는 할로겐, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시, -OH, -N(R1b,R1b), -SO2N(R1b,R1b), -C(O)N(R1b,R1b), 헤테로시클로알킬 및 -O-아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R1a기가 인접 고리 원자 상에 있는 경우, 이들은 임의로 함께 취하여 -O-(CH2)1-2-O-, -O-C(CH3)2CH2- 및 -(CH2)3-4-로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 형성하며;
    각각의 R1b기는 수소 및 C1 -4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되 며;
    R2는 0 내지 2개의 R2a기로 치환된 C1 -4 알킬, C3 -8 시클로알킬 및 C0 -2 알킬아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 기이며, R2a는 할로겐, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시, -N(R2b,R2b), -SO2N(R2b,R2b), -C(O)N(R2b,R2b) 및 -O-아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R2a기는 인접 고리 원자 상에 존재시, 임의로 함께 취하여 -O-(CH2)1-2-O-, -O-C(CH3)2CH2- 및 -(CH2)3-4-로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 형성하며;
    각각의 R2b기는 수소 및 C1 -4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기이며;
    R3은 수소이거나, 또는 R3은 R2 및 이 둘이 부착된 질소와 임의로 함께 취하여, C1-4 알킬 또는 C0 -2 알킬아릴로 임의로 치환된 헤테로사이클을 형성한다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물:
    Figure 112006050239740-PCT00012
  3. 제2항에 있어서, R1이
    Figure 112006050239740-PCT00013
    인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R2가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물:
    Figure 112006050239740-PCT00014
  5. 제1항에 있어서, R3이 수소인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R2 및 R3 및 그 둘이 부착된 질소가 헤테로사이클을 형성하는 것인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 헤테로사이클이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물:
    Figure 112006050239740-PCT00015
  8. 제1항에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물:
    <화학식 II>
    Figure 112006050239740-PCT00016
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, R2가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물:
    Figure 112006050239740-PCT00017
  10. 제1항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물:
    Figure 112006050239740-PCT00018
  11. 제1항 또는 제10항의 화합물, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  12. 포유류 세포를 제1항의 화합물과 접촉함으로써, 포유류 세포가 심장근육 계통의 세포로 분화하는 것을 포함하는, 심근발생 유도 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1항의 화합물이 제약학적으로 허용가능한 담체 내에 존재하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 포유류 중에 존재하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 경구 투여에 의한 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 정맥내 투여에 의한 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 피하 투여에 의한 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 복강내 투여에 의한 것인 방법.
  19. 제12항에 있어서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화가 심장근육세포 마커 유전자의 발현을 검출함으로써 검출되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 심장근육세포 마커 유전자가 심방 나트륨이뇨 인자를 암호화하는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화가 심장 근육 세포-특이 전사 인자의 발현을 검출함으로써 검출되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 심장 근육 특이 전사 인자가 MEF2 및 Nkx2.5로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화가 심장 근육 수축에 관련된 모터 단백질의 발현을 검출함으로써 검출되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 모터 단백질이 근절 미오신 중쇄 모터 단백질인 방법.
  26. 제19항에 있어서, 포유류 세포의 심장근육 계통의 세포로의 분화가 심장 특이 유전자의 발현을 검출함으로써 검출되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 심장 특이 유전자가 GATA-4인 방법.
  28. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 배아 줄기 세포가 쥐로부터 분리된 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 배아 줄기 세포가 R1 배아 줄기 세포인 방법.
  31. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 배아 암종 세포인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 암종 세포가 쥐로부터 분리된 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 쥐 암종 세포가 P19 배아 암종 세포인 방법.
  34. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 영장류 배아 줄기 세포인 방법.
  35. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
  36. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 심장근육발생 강화 단백질과 추가로 접촉하 는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 심장근육발생 강화 단백질이 심장근육발생과 관련된 생장 인자인 방법.
  38. 제12항에 있어서, 포유류 세포가 고체 지지체에 부착된 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 고체 지지체가 3차원 매트릭스인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 고체 지지체가 2차원 평면인 방법.
  41. 포유류 세포를 제1항의 화합물과 접촉함으로써, 포유류 세포가 심장근육 계통의 세포로 분화하는 것을 포함하는, 심장근육발생 유도 방법.
  42. 제41항에 있어서, 포유류 세포가 포유류 내에 존재하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 경구 투여에 의한 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 정맥내 투여에 의한 것인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 피하 투여에 의한 것인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 접촉 단계가 화합물의 포유류에 대한 복강내 투여에 의한 것인 방법.
  47. 포유류 세포를 제1항의 화합물과 접촉함으로써, 포유류 세포가 심장근육 계통의 세포로 분화하는 것을 포함하는, 심장 근육 질환의 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, 심장 근육 질환이 손상된 심장근육과 관련된 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 심장 근육 질환이 심장근육병증인 방법.
  50. 제47항에 있어서, 심장근육 계통의 세포를 질환이 있는 개체에 투여함으로써 질환을 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 투여가 외과적 이식에 의한 것인 방법.
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