JP6106436B2 - 幹細胞をイメージングするための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
マウスES−D3細胞株(CRL−1934)をAmerican Type Culture Collection(ATCC、マナサス、米国ヴァージニア州)から入手した。空気中5%CO2を有する給湿インキュベーター内において1000IU/mLの白血病阻害因子(LIF、Chemicon社、ESGRO、ESG1107)と共に37℃でインキュベートすることで、ES細胞を未分化の多能性状態に維持した。0.1%ゼラチン被覆プラスチック皿上において、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地であるES培地を用いてES細胞を培養した。イーグル培地には、15%のノックアウト血清リプレースメント、0.1mmol/Lのβ−メルカプトエタノール及び2mmol/Lのグルタミンを補充した。ES培地は毎日交換し、ES細胞は2〜3日毎に継代した。
LIFを除去して高濃度のウシ胎児血清を添加することで、ES細胞のインビトロ分化を実施した。0.1%ゼラチン被覆プラスチック皿上において、15%のウシ胎児血清、0.5mmol/Lのモノチオグリセロール及び2mmol/Lのグルタマックスを補充したIscoveのダルベッコ改変イーグル培地を含む分化培地中でES細胞を培養した。ES用の培地は、コエレンテラジン又はD−ルシフェリンで細胞の光学イメージングを行った後に毎日交換した。
幹細胞特異的Oct4プロモーターの遺伝子フラグメントを、HindIII及びNotI制限酵素での制限消化によってプラスミドから遊離させた。pRL−CMVベクター(Promega社)のCMVプロモーター領域中にNotI制限酵素部位を生成し、次いでHindIII及びNotI制限酵素で消化した。Oct4プロモーターの付着末端フラグメントをレニラルシフェラーゼ遺伝子の上流領域でpRL−CMVベクター中に連結することで、Oct4プロモーター駆動レニラルシフェラーゼ構築物(Oct4−hRLuc)を作製した。HindIII及びBglII制限酵素でOct4−hRLucからOct4プロモーターの遺伝子フラグメントを遊離させ、多重クローニング部位のpGL4.10ベクター(Promega社)中に連結することで、Oct4プロモーター駆動ヒト化ホタルルシフェラーゼ構築物(Oct4−FLuc2)を作製した。Oct4−hRLucを有するES細胞を作製するため、Oct4プロモーター駆動hRLucセグメントをBglII及びXbaI制限酵素でOct4−hRLucから遊離させ、同じ制限酵素で消化したpcDNA 3.1ピューロ中に連結した(ピューロOct4−hRLuc)。ユビキチンプロモーター駆動ホタルルシフェラーゼ−エンハンスト緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質を含むレントウイルスベクター(Ubiq−FLuc−eGFP)を作製した。
マウスES細胞、ラット筋芽細胞(H9C2)及びヒト腎臓癌細胞(HEK−293T)に、リポソームに基づく方法でOct4−hRLuc及びPoct4−FLuc2を一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションのためには200ng/ウェルのDNA及びLipofectamine(商標)2000を使用した。特記しない限り、すべての一時的トランスフェクション試験において、5ng/ウェルの他の光学レポーター(例えば、CMVプロモーター駆動FLuc2(CMV−FLuc2)又はCMVプロモーター駆動hRLuc(CMV−hRLuc))をトランスフェクション基準化のために使用した。マウスES細胞、H9C2及びHEK−293Tに、対照としてCMV−hRLuc及びCMV−FLuc2を一時的にトランスフェクトした。一時的トランスフェクションから48時間後にホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイを実施した。ホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ活性に関するルミノメーターアッセイを下記のようにして実施した。簡単に述べれば、Promega社から供給された氷冷1×受動溶解緩衝液200ml中でトランスフェクト細胞を溶解し、氷上で15分間振盪した。細胞溶解物を4℃で1.3×104gで5分間遠心して細胞破片を除去した。レニラルシフェラーゼ活性を測定するため、20mlの上澄み液にpH7.0のリン酸緩衝食塩水(PBS)100mlに溶解した0.5mgのコエレンテラジンを添加し、次いでルミノメーター(モデルT 20/20、Turner Designs社、サニーベール、米国カリフォルニア州)で10秒間光子計数することで分析した。ホタルルシフェラーゼ活性は、Promega社からのルシフェラーゼアッセイ試薬II(LARII)基質をコエレンテラジンの代わりに使用した点を除き、レニラルシフェラーゼ活性に関して記載されたようにして測定した。細胞溶解物中のタンパク質濃度は、Bradfordアッセイ試薬(Bio−Rad Laboratories社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州)によって測定した。レニラルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性を用いてタンパク質含有量及びトランスフェクション効率について基準化し、相対光単位(RLU)/マイクログラム(タンパク質)/分(計数時間)として表した。ホタルルシフェラーゼ活性もまた、レニラルシフェラーゼ活性を用いてタンパク質含有量及びトランスフェクション効率について基準化した。
マウスES細胞に、リポソームに基づく方法でOct4−hRLuc及びCMV−FLuc2を一時的にトランスフェクトし、分化培地中で培養した。トランスフェクションから1〜6日後の期間において、ルミノメーターアッセイを用いてホタル及びレニラルシフェラーゼアッセイを実施した。細胞当たりのOct4プロモーター活性を評価するため、Oct4−hRLuc活性をCMV−FLuc2活性によって基準化した。
マウスES細胞に、リポソームに基づくトランスフェクションによってピューロOct4−hRLuc及びUbiq−Fluc−eGFPをトランスフェクトし、ピューロマイシン(濃度500ng/ml)で選択した。Oct4−hRLucを安定に発現するマウスES細胞を得た後、かかる細胞を8μg/mlのPolybrene(Sigma社)を含むOptiMEM中に再懸濁した。37℃及び5%CO2の細胞培養インキュベーター内において、5の感染多重度で細胞に3時間形質導入した。3時間後、新鮮な増殖培地を細胞に添加した。細胞を48〜72時間インキュベートした後、フローサイトメトリー及びバイオルミネセンスイメージングによって選別し分析した。ウイルスのトランスフェクト効率は71%であり、最高のeGFP発現を示す細胞を選別してさらなる実験に供した。
Oct4−hRLuc及びUbiq−FLuc−eGFPの両方を安定に発現するマウスES細胞を、無血清ES細胞維持培地を用いて6ウェルプレート上にプレーティングした(105/ウェル)。24時間後、細胞を分化培地に移した。冷却電荷結合素子(CCD)カメラ(Xenogen IVIS、Xenogen Corp.、アラメダ、米国カリフォルニア州)を用いたバイオルミネセンスイメージングにより、D−ルシフェリン及びコエレンテラジンを用いてレニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
動物の取扱いは、スタンフォード大学動物研究委員会のガイドラインに従って行った。すべての注射及びイメージング処置中には、マウスをイソフルオラン(100%酸素中2%イソフルラン、1L/分)を用いてガス麻酔した。冷却電荷結合素子(CCD)カメラ(Xenogen IVIS29、Xenogen Corp.)を用いてマウスのイメージングを行った。マウスES細胞(1×106)に、Oct4−hRLuc及びUbiq−FLuc−eGFPを安定にコトランスフェクトした。次いで、細胞を7週齢の雌マウス(nu/nu、Charles River社)に移植した。生きているマウスにおける移植ES細胞中のOct4プロモーター活性を測定するため、5%エタノールと95%PBSとの混合物に溶解した20μgのコエレンテラジン(最終容量200μL)を尾静脈から注射し、1分の取得時間を有するIVUSシステムを用いてマウスを直ちにイメージングした。動物を光密チャンバー内に入れ、低レベル照明の下でグレースケールの参照画像を得た。画像は、移植細胞から放出される光子を集めた後、Living Image Software(Zenogen Corp.)及びIgor Image Analysis Software(Wavemetrics社)を用いて得た。測定された光を定量化するため、移植細胞の領域にわたって平均及び最大光子数/秒/平方センチメートル/ステラジアンを求めた。
内胚葉及び心臓分化にとって決定的に重要なGATA4結合タンパク質の発現を測定するため、転写因子応答性レポーター遺伝子イメージング技法を開発した。GATA4結合配列の4つのコピーを、ヒト化ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する(PG5lucベクターからの)最小レポーターと連結することで、GATA4結合タンパク質応答要素レポーター遺伝子系(GRERG)を構築した。(Promega社からの)PGL4.10を骨格として使用した。4つのGATA結合配列及びアデノウイルスの主後期プロモーター配列をpGL4.10の多重クローニング部位に順次に挿入した。GATA応答要素を挿入するためにはXhoI及びHindIII制限酵素部位を使用した(図7)。図7に示すように、4つのGATA結合配列及びアデノウイルスの主後期プロモーター配列をpGL4.10の多重クローニング部位に順次に挿入した。
GATA4結合タンパク質に対するcDNAを有するプラスミドをOpenbiosystem社から購入した。cDNA配列をPCRで増幅した。NheI及びXhoIの制限酵素部位をPCR増幅DNAの各端に導入した。興味ある遺伝子を、pcDNA 3.1ベクター(図8)を発現する哺乳動物細胞中にクローニングした。ベクターをHEK 293細胞中にトランスフェクトし、GATA4結合タンパク質の発現を評価した。ベクターをトランスフェクトした細胞は、GATA4結合タンパク質mRNAのより高い発現を示した(図9)。図9は、GATA4タンパク質をエンコードするcDNA配列のPCR増幅を示す画像である。
構築された発現ベクターをHEK 293細胞にコントランスフェクトすることで、GATA4結合タンパク質応答要素駆動レポーター遺伝子系(GRERG)の発現を判定した。トランスフェクションはLipofectamine(商標)2000(Invitrogen社)を用いて行った。適当なベクター用量を最適化するため、数種の濃度のGATA4結合タンパク質発現ベクターを適用した。GRERGのルシフェラーゼ活性は、図10に示すようにGATA4結合タンパク質発現ベクターのコトランスフェクションでGRERGの活性を高めるルミノメーターアッセイによって測定した。一定濃度のGRE−ルシフェラーゼをトランスフェクトすると共に、GATA結合タンパク質を発現するプラスミドベクターを増加する濃度でコトランスフェクトしたHEK 293T細胞からのルシフェラーゼ活性を測定した(ルミノメーター)。GATA4タンパク質の発現の増加は、GATA4応答要素と結合することによってルシフェラーゼの発現を活性化する。
幹細胞特異的Oct4プロモーターの遺伝子フラグメントを、HindIII及びNotI制限酵素での制限消化によってプラスミドから遊離させた。Oct4プロモーターの付着末端フラグメントをレニラルシフェラーゼ遺伝子の上流領域でpRL−CMVベクター中に連結することで、Oct4プロモーター駆動レニラルシフェラーゼ構築物(Oct4−hRLuc)を作製した。Oct4−hRLucを有するES細胞を作製するため、Oct4プロモーター駆動hRLucセグメントをBglII及びXbaI制限酵素でOct4−hRLucから遊離させ、同じ制限酵素で消化したpcDNA 3.1ピューロ中に連結した(ピューロOct4−hRLuc)。
Claims (14)
- Oct4プロモーターを含む第1の発現制御配列と機能的に連結された第1のレポーター核酸配列、及び
GATA4タンパク質の結合に応答する応答要素であってGATA4タンパク質結合配列の4回以上の反復を含む応答要素を含む第2の発現制御配列と機能的に連結された第2のレポーター核酸配列
を含んでなる発現ベクターであって、幹細胞の様々な分化のステージをモニタリングするように構成された発現ベクター。 - 第2の発現制御配列がさらに、応答要素と機能的に連結された最小プロモーターを含む、請求項1記載の発現ベクター。
- さらに、第3の発現制御配列と機能的に連結された第3のレポーター核酸配列を含む、請求項1記載の発現ベクター。
- 第3の発現制御配列が構成的プロモーターを含む、請求項3記載の発現ベクター。
- 第1、第2及び第3のレポーター核酸配列の少なくとも1つが、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピューター断層撮影又はこれらの組合せによってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項3記載の発現ベクター。
- 第1及び第2のレポーター核酸配列の少なくとも一方が、陽電子放出断層撮影によってイメージング可能なポリペプチドをエンコードする、請求項1記載の発現ベクター。
- 第1又は第2のレポーター核酸配列或いはその両方がそれ自体で蛍光を発するポリペプチドをエンコードする、請求項1記載の発現ベクター。
- 請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の発現ベクターを含む培養細胞。
- 幹細胞をインビトロでモニタリングするための方法であって、当該方法が、
第1のレポーター核酸配列及び第2のレポーター核酸配列を含む第1の発現ベクターを幹細胞に送達する段階、並びに
第1及び第2のレポーター核酸配列の少なくとも一方の発現をイメージングすることで幹細胞をモニタリングする段階
を含んでなり、第1のレポーター核酸配列がOct4プロモーターを含む第1の発現制御配列と機能的に連結されており、第2のレポーター核酸配列がGATA4タンパク質の結合に応答する応答要素であってGATA4タンパク質結合配列の4回以上の反復を含む応答要素を含む第2の発現制御配列と機能的に連結されている、方法。 - 発現ベクターがさらに、第3の発現制御配列と機能的に連結された第3のレポーター核酸配列を含む、請求項9記載の方法。
- 幹細胞が、単能性幹細胞、多分化能性幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、誘導多能性幹細胞及びこれらの組合せから選択される、請求項10記載の方法。
- さらに、モニタリング段階に先立って第2の発現ベクターを幹細胞に送達する段階を含み、第2の発現ベクターは構成的プロモーターを含む第3の発現制御配列と機能的に連結された第3のレポーター核酸配列を含む、請求項9記載の方法。
- 幹細胞をモニタリングするためのキットであって、
第1の発現制御配列と機能的に連結された第1のレポーター核酸配列、及び
第2の発現制御配列と機能的に連結された第2のレポーター核酸配列
を含む発現ベクターを含んでなり、第1の発現制御配列がOct4プロモーターを含んでおり、第2の発現制御配列がGATA4タンパク質の結合に応答する応答要素であってGATA4タンパク質結合配列の4回以上の反復を含む応答要素を含んでいる、キット。 - さらに追加の発現ベクターを含んでおり、追加の発現ベクターが、構成的プロモーターを含む第3の発現制御配列と機能的に連結された第3のレポーター核酸配列を含んでいる、請求項13記載のキット。
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