JP4825978B2 - インスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途 - Google Patents
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Description
b)前記a)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン産生細胞においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド
からなるプロモーターに関する。
(b)(a)で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する工程、
(c)レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、および
(d)抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法に関する。
ヒトインスリンプロモーターの転写開始部位(+1)の上流−1から−363番目までの5′フランキング領域(配列番号1)を、ヒト正常肺線維芽細胞株(NHLF)より精製したヒトゲノム100ngを鋳型とし、反応条件(94℃、15秒、62.5℃、30秒、68℃、1分)×35サイクルで、PCR産物1(以下、XhoI/−363/−1/HindIIIとも言う)として得た。プライマーとしては、5′側にXhoI切断部位を組み込んだフォワードプライマー1(配列番号3)と、3′側にHindIII切断部位を組み込んだリバースプライマー1(配列番号4)をヒトインスリンプロモーターの−363/−1領域の両端に設定した。PCR反応液の組成を表1に示す。
フォアワードプライマー1:
5′−TATCTCGAGACAGCAGCGCAAAGAGCCCCGCCCTGCAG−3′(配列番号3)
リバースプライマー1:
5′−ATAAAGCTTTGAGGGCTGCTGGGCCCCCGCTGGCTTTATA−3′(配列番号4)
前記(A)で得られたPCR産物1(XhoI/−363/−1/HindIII)の全量を制限酵素XhoIおよびHindIII各10Uにて37℃で16時間処理した。ルシフェラーゼ発現プラスミドであるpGL3 ベーシック ベクター(プロメガ社製)5μgを同じ2種の制限酵素各15Uにて37℃で3時間処理し、クイックライゲーションキット(Quick ligation kit)(M2200S:ニューイングランドバイオラボ(New England Biolab)社製)を用いてライゲーションを行なった(図4)。ライゲーションは、50ngのベクターDNAに対しモル比で3倍量のインサートDNAを混和し、核酸不含水で希釈し10μlとしたのち、キットに付属の2×クイックライゲーション緩衝液と1μlのクイックT4DNAリガーゼを加えて、室温で5分間インキュベートして行なった。得られたライゲーション産物のうち1μlを、溶解後30分間氷上においた100μlのコンピテントセル(DH5a、東洋紡績株式会社製)に添加し、37℃で45秒処理したのち、2分間氷上に静置し、ついでLB培地を900μl添加し、37℃で1時間振とう培養後、100μg/mlアンピシリン含有LB寒天培地に播種した。37℃で14時間培養し、多数のコロニーを得た。複数のコロニーをピックアップし、同様の培地で小スケール培養を行なった後、ミニプレップキット(miniprep kit)(キアゲン(Qiagen)社製)を用いて、そのプロトコールにしたがってプラスミドを精製した。得られたプラスミドをXhoIおよびHindIIIで処理し、目的配列がインサートとして切り出されることをエチジウムブロマイド含有1%アガロースゲルにて電気泳動後確認し(図5、レーン2)、目的のプラスミド1(以下、phINS−363/−1・Lucとも言う。)を得た。
(B)で得られたプラスミド:phINS−363/−1・Luc50ngを鋳型とし、ヒトインスリンプロモーター領域−363/−32を(1)制限酵素SmaI切断部位を付加したフォアワードプライマー2(配列番号5)およびXhoI切断部位を付加したリバースプライマー2(配列番号6)、(2)制限酵素NheI切断部位を付加したフォアワードプライマー3(配列番号7)およびSmaI切断部位を付加したリバースプライマー3(配列番号8)、(3)制限酵素MluI切断部位を付加したフォアワードプライマー4(配列番号9)およびNheI切断部位を付加したリバースプライマー4(配列番号10)、(4)制限酵素KpnI切断部位を付加したフォアワードプライマー5(配列番号11)およびMluI切断部位を付加したリバースプライマー5(配列番号12)を使用し、(A)と同様の方法でPCRによる増幅を行ない、制限酵素切断部位を有する−363/−32領域をPCR産物2〜5として4種類(以下、それぞれ、SmaI/−363/−32/XhoI、NheI/−363/−32/SmaI、MluI/−363/−32/NheIおよびKpnI/−363/−32/MluIともいう。)得た。
フォアワードプライマー2:
5′−TATCCCGGGACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−3′(配列番号5)
リバースプライマー2:
5′−ATACTCGAGTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTG−3′(配列番号6)
フォアワードプライマー3:
5′−ATAGCTAGCACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−3′(配列番号7)
リバースプライマー3:
5′−ATACCCGGGTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTGTCAACCC−3′(配列番号8)
フォアワードプライマー4:
5′−TATACGCGTACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−3′(配列番号9)
リバースプライマー4:
5′−ATAGCTAGCTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTGTCAAC−3′(配列番号10)
フォアワードプライマー5:
5′−TATGGTACCACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−3′(配列番号11)
リバースプライマー5:
5′−ATAACGCGTTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTGTC−3′(配列番号12)
(B)で得られたプラスミド1:phINS−363/−1・Lucと、(C)で得られたPCR産物2:SmaI/−363/−32/XhoIとを、制限酵素SmaIおよびXhoIにて処理したのち、以下(B)と同様の方法にて、ライゲーションを施行し、phINS−363/−1・LucのSmaIおよびXhoI部位に−363/−32領域が1つ組み込まれた目的のプラスミド2(phINS(−363/−32)×1・Lucとも言う。)を得た。この方法を繰り返し、phINS−363/−1・LucのNheIおよびSmaI部位、MluIおよびNheI部位、KpnIおよびMluI部位に、(C)で得られたPCR産物3〜5を組み込み、それぞれ、プラスミド3〜5(phINS−363/−1+(hINS−363/−32)×2〜4・Lucとも言う。)を作製した。
各プラスミド:phINS−363/−1+(hINS−363/−32)×1〜4・Lucをそれぞれの長さの挿入断片を一度に切り出せる制限酵素:HindIIIおよびKpnIにて処理。目的配列がインサートとして切り出されることをエチジウムブロマイド含有1%アガロースゲルにて電気泳動により確認した(図5、レーン3〜6)。
各プロモーターの活性を評価するために、レポーターアッセイを以下の通り実施した。
(A)各細胞へのプラスミドの導入
表3の各プラスミド1〜6(6μg)と、内部標準としてサイトメガロウイルスプロモーターの下流にβ−ガラクトシダーゼを連結したプラスミド:pCMVβ−gal(6μg)との計12μgを、それぞれ1.5mlキャップ付き小チューブ(エッペンドルフ社製)内で混合し、これにリポフェクション専用培養液Opti-men(ギブコ(Gibco)BRL社製)を添加し、総量を300μlとした。陰性対照としては、pCMVβ−gal(6μg)とpGL3ベーシックベクター(6μg)とを混合したものを使用した。一方で14mlクリアチューブ(ファルコン(Falcon)社製)内にリポフェクション試薬:リポフェクチン(Lipofectin)(インビトロゲン(Invitrogen)社製)を21μl入れ、これにOpti-menを加え総量を300μlとした。45分静置したのち、小チューブ内の各プラスミドを培地ごとクリアチューブに加え、リポフェクション試薬と混和し、さらに15分静置した。血清含培養液(2mMまたは16mMのL−グルコース添加ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))を2.4ml添加して総量を3.0mlとし、よく混和してリポフェクション用調製液を作成した。
リポフェクション工程終了から36時間後、各ウェルの培養液を除き、これにレポーター細胞融解緩衝液(プロメガ社製)を400μlずつ添加し5分間静置したのちスクレーパーを用いて、完全に細胞を剥がした。各ウェルより内容物をエッペンドルフ社製キャップ付き1.5mlチューブに移し、軽く遠心して不溶解物を底に落とした。この上清100μlとBright-Glo ルシフェラーゼアッセイ基質(プロメガ社製)100μlを混和し、ルミノメーターを用いて発光量(RLU)を測定した。
配列番号4:ヒトインスリンプロモーターの−363/−1領域の3′側にHindIII制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号5:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の5′側にSmaI制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号6:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の3′側にXhoI制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号7:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の5′側にNheI制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号8:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の3′側にSmaI制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号9:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の5′側にMluI制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号10:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の3′側にNheI制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号11:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の5′側にKpnI制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号12:ヒトインスリンプロモーターの−363/−32領域の3′側にMluI制限部位を組み込んだリバースプライマー
Claims (4)
- 配列番号1で表わされる塩基配列の5′側に配列番号2で表わされる塩基配列を1〜4個含有するポリヌクレオチドからなるプロモーター。
- 請求項1記載のプロモーターを含むベクター。
- 請求項1記載のプロモーターの3′側にレポーター遺伝子および/または抗生剤耐性遺伝子が連結されている請求項2記載のベクター。
- (a)請求項1記載のプロモーターの3′側にレポーター遺伝子および抗生剤耐性遺伝子が連結されているベクターを、未分化細胞に導入する工程、
(b)(a)で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する工程、
(c)レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、および
(d)抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法。
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