CN102781478A - 用于细胞内靶向增殖和蛋白质合成的聚阴离子多价大分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用聚阴离子多价大分子对参与活化细胞的增殖和蛋白质合成的细胞内分子进行靶向的方法和组合物。具体来说，将与多元醇相连的多个硫酸盐基团特异性靶向增殖和活化细胞的细胞质和细胞核。本发明还包含新的聚阴离子大分子化合物和制剂。

Description

用于细胞内靶向增殖和蛋白质合成的聚阴离子多价大分子
发明领域
总的来说，本发明涉及使用聚阴离子多价大分子对参与活化细胞的增殖和蛋白质合成的细胞内分子进行靶向的方法和组合物。具体来说，将与多元醇相连的多个硫酸盐基团特异性靶向增殖和活化细胞的细胞质和细胞核。本发明还包含新的聚阴离子大分子化合物和制剂。发明背景和相关技术描述
在最近几十年间，在提高诊断和治疗药物的效能方面已经取得了许多进步。主要的成就是在急性病中做出的。目前，可以高效地治疗急性病例如感染性疾病、急性血栓形成或急性血压调节异常。大多数用于急性病的药物治疗对健康组织和器官没有严重影响。由于药物治疗的时间短，因此健康组织和器官能够从不想要的药物效应中充分恢复。与持续时间短的急性病药物治疗通常伴随着短时间药物暴露，与此相反，慢性病的治疗必然伴有人体长期持续地暴露于所应用的药物。然而，长期持续暴露于药物，往往对健康组织和器官有害。
在最近几十年间，为了避免对健康组织和器官的不想要的严重药物效应，采取了两种不同策略。一方面，药物研究集中在有希望进行疾病特异性的靶向机制表达的新的药物靶点。就增殖和活化细胞中信号传导机制的发现而言，已鉴定到大量新的靶点。然而，除了少数例外情况之外，对大多数新发现的药物靶点的治疗性攻击没有改进治疗结果。另一方面，已投入大量努力来提高临床确立的治疗药物的生物可利用度。为了提高生物可利用度，药物研究集中于治疗性或诊断性效应分子的化学修饰或药物制剂。
过去三十年来，靶向效应子结合物的用途已被确立。具体来说，将能够诱导诊断或治疗效应的分子与具有靶向性质的载体分子相连。由于免疫球蛋白的高结合亲和性，蛋白质抗体或抗体片段常常被用作靶向递送的载体分子。对于肿瘤疾病的治疗来说，抗体可以将毒素或化疗剂携带到肿瘤。由于抗体-效应子结合物与肿瘤的某些靶分子的强烈结合，在肿瘤环境中获得了效应子的明显更高的浓度。同时，在一系列实验和临床肿瘤中，已证明抗体-效应子结合物是有效的。靶向递送效应分子的另一个优点是降低了不想要的效应分子效应。详细来说，没有与具有靶向性质的载体相连的药物分子中的大部分没有到达疾病位点，而是仅仅被施加到人体中以便在血液中获得所需的药物浓度。因此，最大部分所施加的药物从血液循环中消除，而没有到达疾病位点。例如，可以被认作慢性病的恶性实体肿瘤在诊断和治疗时具有1至10克的大小，因此占人体的0.01至0.001%。该比率说明了通过将应用的药物导向所述疾病，可以显著优化药物治疗，因此能够减少所用的剂量。
然而，尽管在急性病治疗中取得了显著进展，但大多数治疗不能实现慢性病的治愈。与急性病相反，大多数慢性病只有在与疾病相关的信号传导和基因转录能够被选择性靶向时才可以被治疗。为了实现这个目标，治疗药物必须充分透过细胞膜并在疾病的靶细胞内积累。由于基因转录和蛋白质合成的关键靶分子的遍在性表达，未来的治疗药物必须表现出在疾病位点处的选择性摄入。未来的治疗药物的后一种特征是极为重要的，因为结合并抑制疾病过程之外的基因转录和蛋白质合成的关键调控子可能对人体有害。
来自于科学研究的结果为超过500种因子在基因转录和蛋白质合成中的作用提供了证据。然而，在不同因子中，NF-κB和AP-1是关键的，并且已被确立为治疗靶点（Letoha等，Mol.Pharmacol.69:2027,2006；Sliva等，Curr Cancer Drug Targets.4:327,2004）。这两种基因转录的调控子在细胞的活化和增殖中发挥核心作用，并且是不同的信号传导级联的下游信号。NF-κB和AP-1两者都位于细胞的细胞质和核中。对于NF-κB和AP-1的治疗性靶向来说，药物必须满足两个重要的先决条件。首先，治疗药物必须以足够的量透过细胞膜并在细胞质内积累。其次，治疗药物必须能够辨别健康器官或组织中的细胞与疾病过程中的细胞。后一方面是极为重要的，因为NF-κB和AP-1在人体的每个细胞中表达，这两种疾病靶点的抑制可能明显对敏感的人体功能有害。
NF-κB（核因子-活化B细胞的κ轻链增强子）是一种控制DNA转录的蛋白质复合物。NF-κB存在于几乎所有动物细胞类型中，并参与对刺激因素例如应激、细胞因子、自由基、紫外辐射、氧化型LDL、和细菌或病毒抗原的细胞应答。NF-κB在调控对感染的免疫应答中发挥关键作用。相反，已将NF-κB的不正确调控与癌症、炎性和自体免疫疾病、脓毒性休克、病毒感染和非正常免疫发育相关联。NF-κB还牵涉突触可塑性和记忆的过程（Baud等，Nat Drug Discov.8:33,2009）。
NF-κB被真核细胞广泛用作控制细胞增殖和细胞存活的基因的调控子。因此，许多不同类型的人类肿瘤具有错误调控的NF-κB：也就是说，NF-κB具有组成型活性。活性NF-κB启动保持细胞增殖并使细胞免于原本将通过凋亡导致其死亡的状态的基因进行表达。NF-κB的缺陷引起对凋亡的易感性增加，导致细胞死亡增加。因为NF-κB控制参与炎症的许多基因，因此在许多炎性疾病例如炎症性肠病、关节炎、败血症、胃炎、哮喘等中发现NF-κB具有长期活性，并不令人吃惊。许多被宣传具有抗癌和抗炎活性的天然产物（包括抗氧化剂），也已被显示抑制NF-κB（Kaur等，Curr Cancer Drug Targets 7:355,2007）。
活化蛋白1（AP-1）是一种转录因子，其是异源二聚体蛋白，由属于c-Fos、c-Jun、ATF和JDP家族的蛋白质构成。它对各种刺激因素包括细胞因子、生长因子、应激以及细菌和病毒感染作出响应而调控基因表达。AP-1进而控制许多细胞过程，包括分化、增殖和凋亡（Vesely等，Mutat Res.682:7,2009）。
NF-κB和AP-1的活化引起参与肿瘤生长、凋亡、炎症、自体免疫疾病和纤维化的大量信号传导分子的编码基因的转录。细胞因子例如白介素-1、白介素-6、TNF-α或生长因子如TGF-β，代表了NF-κB和AP-1活化的最重要的下游信号。具体来说，转化生长因子β（TGF-β）是高度多效性的细胞因子，其控制细胞功能的许多方面，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡、粘附、血管发生、免疫监视、和存活，因此代表了治疗药物的重要靶点（Jakowlew,Cancer Metastasis Rev 2006;25:435-57）。TGF-β由许多细胞类型产生，总是存在于血浆中（以其潜伏形式）并渗透所有器官，与基质组分结合并产生这种免疫抑制分子的储库。无论如何，它在许多病理条件下过量产生。这包括肺纤维化、肾小球硬化症、肾间质纤维化、肝硬化、克罗恩病、心肌症、硬皮病和慢性移植物抗宿主疾病（Prud'homme等，Lab Invest 2007;87:1077-91）。在肿瘤疾病中，TGF-β抑制早期病变的发展，但是这种效应后来丧失并且癌细胞产生TGF-β，这种TGF-β然后促进肿瘤转移。该细胞因子也有助于肿瘤基质的形成、血管发生和免疫抑制（Jakowlew,Cancer Metastasis Rev 2006;25:435-57）。有鉴于此，正在对抑制TGF-β活性的几种方法进行研究，包括中和抗体、可溶性受体、受体激酶拮抗剂药物和反义试剂。靶向TGF-β的新疗法的益处正在热切研究中（Prud'homme,Lab Invest 2007;87:1077-91）。
对于治疗性干预来说，考虑到了其中病理过程以免疫系统的细胞与非细胞组分的缺陷和不受调控的相互作用为特征的所有自体免疫疾病，例如乳糜泻、1型糖尿病（IDDM）、系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（syndrome）、Churg-Strauss综合征、多发性硬化症（MS）、桥本氏（hashimoto's）甲状腺炎、格雷夫氏（Graves'）病、特发性血小板减少性紫癜、阿狄森氏(Addisons)病、贫血症、关节强直性脊椎炎、骨关节炎、白塞氏(Behcets)综合征、口腔溃疡、慢性疲劳、慢性阻塞性肺病（COPD）、克罗恩(Crohns)病、库兴氏(Cushins)病、疱疹样皮炎、皮肌炎、湿疹、纤维肌痛、脱发、肝炎、甲状腺机能减退、扁平苔癣、美尼尔氏(Meniere's)病、肌无力、莱特尔氏(Reiters)综合征、肉样瘤病、硬皮病、败血症、干燥综合征、太阳中毒、SIRS（系统性炎性反应综合征）和眼色素层炎（Masters等，Annu Rev Immunol2009;27:621-68）。
在人类癌症中，TGF-β通过NF-κB或AP1的活化而产生，并通过在早期肿瘤发生期间降低TGF-β信号传导和在晚期进展性疾病中增加TGF-β信号传导两方面来促进肿瘤发生。有证据表明，TGF-β调控肿瘤细胞的细胞周期活性，引起对肿瘤细胞增殖的控制。尽管正常细胞和已分化肿瘤细胞的生长被TGF-β阻断，但未分化肿瘤细胞的生长受到刺激。TGF-β在未分化肿瘤细胞中的刺激作用是由突变的信号传导途径造成的。尽管TGF-β对原发肿瘤细胞的生长有影响，但通过刺激肿瘤细胞外渗，TGF-β是肿瘤转移的最有力调控子之一。对肿瘤血管发生的影响是TGF-β刺激肿瘤生长和转移的另一种机制（Tian等Future Oncol 2009;5:259-71）。已发现在许多肿瘤中TGF-β的水平升高，例如急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌（非黑素瘤）、胆管癌、膀胱癌、骨癌、纤维组织细胞瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏（Burkitt）淋巴瘤、类癌瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性障碍、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、胚胎性瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、生殖细胞瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞（肝）癌、霍奇金氏（Hodgkin）淋巴瘤、胰岛细胞瘤、肾（肾细胞）癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合征、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、前列腺癌、良性前列腺增生、直肠癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、阴道癌（Jones等，Expert Opin Ther Targets 2009;13:227-34）。
TGF-β的关键性作用在心血管系统的疾病中也得到确证。与肿瘤中TGF-β诱导的机制非常类似，在心血管疾病中TGF-β合成的主要刺激因素也是NF-κB的活化（Frangogiannis,Pharmacol Res 2008;58:88）。TGF-β已牵涉许多心血管病，例如中风再灌注、局部缺血、心脏病发作、心肌炎、心内膜炎、心肌机能不全（Goumans等，Trends Cardiovasc2008;18:293-8）。TGF-β在新生内膜的发生和与血管成形术相关的收缩性重塑中具有重要作用。在动脉粥样硬化中，它的作用尚未完全阐明，但是它控制免疫系统的能力对病变发生具有深远影响，特别是通过影响所产生的病变的类型。TGF-β也能诱导动脉发生并显著影响血管发生过程，具有促血管发生和抗血管发生两种效应（Galinka等，AnnuRev Immunol 2009;27:165-97）。它也是各种心血管纤维化病、包括脉管系统、心脏和肾脏中的心血管纤维化病的发生的主要贡献者。也已显示，TGF-β在纤维化的发生和发展中发挥重要作用。纤维化是在器官或组织中作为补救性或反应性过程而形成或发生过量的纤维状结缔组织，与作为器官或组织正常组分的纤维组织的形成相反。其实例是胰脏和肺脏的囊性纤维化、可作为肌肉注射的并发症出现的注射纤维化、心内膜心肌纤维化、肺脏的特发性肺纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、煤工尘肺的并发症、肾源性系统纤维化（Pohlers等，Biochim Biophys Acta,2009,1792,746-756）。
目前可用的抗TGF-β治疗药物具有几种缺点。现有的用于治疗自体免疫疾病的药物的显著缺点是它们的治疗窗小。重复施用常常引起不良药物作用和严重器官损伤。心毒性、肾毒性和肝炎是用于治疗自体免疫疾病的临床可用药物的常见副作用（Cohen,International Journalof Clinical Practice 2007;1922-1930）。在临床背景中，大多数现有药物被间断施用，以避免不可逆的毒性。然而，间断性治疗计划增加了疾病发展的风险。由于这些原因，对用于TGF-β相关疾病治疗的更有效和耐受良好的药物，存在着显著需求。
已知可以通过几种引起受体信号传导抑制的方法来抑制TGF-β。然而，这些方法受到体内效能有限和缺少耐受性的限制。阻断TGF-β的反义寡核苷酸的合成已有描述（Flanders,Clinical Medicine &Research 2003,1,13-20）。反义寡核苷酸能够减少TGF-β蛋白的合成。然而，这种方法常常引起TGF-β合成的不完全抑制。反义寡核苷酸的另一个缺点是积累在疾病位点处的药物量少。TGF-β受体的小分子抑制剂（SMI）也是已知的（Hjelmeland等，Mol Cancer Ther 2004;3:737-745）。这些分子经常可口服利用，但是缺少足够的耐受性和安全性。TGF-β受体的已知SMI的毒副作用是由于缺少特异性。已知的化合物不仅抑制TGF-β受体的信号传导，而且抑制具有结构相似性的许多其他受体。结合TGF-β或阻断TGF-β与其受体结合的抗体也是已知的。这些分子显示出在疾病位点处充分积累，并长时间阻断信号传导（Saunier等，Curr Cancer Drug Targets 2006;6:565-78）。然而，抗体具有几个缺点，这限制了它们的治疗性应用。首先，干扰TGF-β的抗体，由于免疫系统被带有免疫系统组分结合位点的该抗体中的部分所激活，可能行使不想要的副作用。这种免疫系统的激活可能引起治疗的毒性。另一个缺点可能是中和抗体的产生。中和抗体的出现经常在多次施用后被观察到。在中和抗体的情况下，治疗的效能降低。
由于已知疗法的局限，因此需要与活化的NF-κB和AP-1和TGF-β合成升高相关的疾病的新治疗方法。新治疗方法的终极目标是高效能和良好的耐受性。因此，本发明的目的是提供化合物和化合物类别，其易于合成并适用于治疗与活化的NF-κB或AP-1和细胞因子例如TGF-β的合成升高相关的疾病。根据本发明，意外发现聚阴离子多价大分子代表一类新的治疗分子，其将效应分子选择性递送到增殖和活化细胞的细胞质和细胞核中。
本发明提出了基于大量硫酸盐基团在树枝状支化大分子载体上的多价组装的聚阴离子大分子在诊断或治疗性效应分子的细胞内递送中的用途。更具体来说，本发明包含使用共价连接诊断或治疗性效应分子的具有超支化结构的硫酸化多元醇作为药物，来治疗与活化的NF-κB或AP-1和TGF-β合成升高相关的疾病。
发明概述
本发明的主题是：
一种药物组合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子。
在优选实施方案中，药物组合物具有式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，m是1-100的数目。
在更优选的实施方案中，药物组合物通过将所述硫酸化聚甘油和治疗性或诊断性效应分子细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病。
一种结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子。
在优选实施方案中，结合物具有式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，m是1-100的数目。
在更优选实施方案中，结合物具有式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，n是大于10的数目。
在更加优选的实施方案中，其中效应分子占结合物的小于50重量%，并且结合物在水中的溶解度在100mg/mL以上。
在更加优选的实施方案中，结合物包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病。
在更加优选的实施方案中，结合物包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子，用于治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
在更加优选的实施方案中，结合物包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子，其通过所述硫酸化聚甘油和治疗性或诊断性效应分子细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病，其中以每次给药1mg/kg至1000mg/kg的剂量执行多次治疗。
在更加优选的实施方案中，结合物包含：
a）聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有1至1,000个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有0至67%的支化度和500至1,000,000g/mol的平均分子量，
b）所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-OSO3 -M+取代，其中-OSO3H或-OSO3 -M+基团的优选数目大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，
c）所述硫酸化聚甘油由此产生的平均分子量为1,000至5,000,000g/mol，
d）带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，其中所述官能团能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合，其中X是硫酸化度，
e）诊断性和/或治疗性效应分子，其共价连接于一个直至最大可能数量的所述官能团，所述诊断性效应分子选自荧光染料或用于放射活性或顺磁性金属的螯合剂，所述治疗性效应分子选自细胞抑制剂、抗血管生成药物、光敏化剂、siRNA。
在更加优选的实施方案中，结合物具有式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3 -、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C。
一种具有通式P(OSO3 -M+)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G 选自-OH、-OSO3H、-OSO3 -、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C。
在更优选的实施方案中，硫酸化聚甘油通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
在更加优选的实施方案中，硫酸化聚甘油通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病，其中以每次给药1mg/kg至1000mg/kg的剂量执行多次治疗。
硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途，所述硫酸化聚甘油按照以下形式：
包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子的结合物
和
在优选实施方案中，式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m的结合物，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，m是1-100的数目
和
在更优选的实施方案中，式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m的结合物，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，n是大于10的数目。
硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途，，所述硫酸化聚甘油按照以下形式：
通式P(OSO3 -M+)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3 -、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C
和
在更优选的实施方案中，通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病的硫酸化聚甘油。
在更加优选的实施方案中，涉及硫酸化聚甘油的用途，其中所述治疗性或诊断性效应分子被共价连接到所述硫酸化聚甘油。
硫酸化聚甘油的无水制剂，其按照如下形式：
包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子的结合物。
硫酸化聚甘油的无水制剂，其按照如下形式：
通式P(OSO3 -M+)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3 -、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C。
在更加优选的实施方案中，无水制剂通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病。
在更加优选的实施方案中，无水制剂用于治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
在更加优选的实施方案中，无水制剂以每次给药1mg/kg至1000mg/kg的剂量执行多次治疗。
在更加优选的实施方案中，无水制剂包含含有缓冲盐和/或选自蔗糖、甘露糖、海藻糖的至少一种低温防护剂的冷冻干燥物。
附图简述
图1是具有树枝状聚甘油骨架的大分子聚阴离子聚硫酸的示例性化学结构的示意图。起始分子是TMP。该式显示了树枝状、超支化、硫酸化聚甘油的主要结构实体。各种衍生物的合成描述在实施例1和2中。
图2是具有聚(酰胺基胺)树枝状化合物骨架（Bioconjug.Chem.20:693,2009）的大分子聚阴离子聚硫酸的示例性化学结构的示意图。树枝状化合物的硫酸化与聚甘油同样地执行。该式显示了具有90%平均硫酸化的化合物。
图3是具有Boltorn聚酯树枝状化合物骨架（Bioconjug.Chem.14:817,2003）的大分子聚阴离子聚硫酸的示例性化学结构的示意图。树枝状化合物的硫酸化与聚甘油同样地执行。该式显示了具有83%平均硫酸化的化合物。
图4显示了具有实施例2的连接物的硫酸化聚甘油。所述实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架（球泡）的示意图。
图5显示了硫酸化聚甘油与实施例3的属于花青染料类型的诊断性效应分子的结合物。所述实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物和效应分子的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架（球泡）的示意图。
图6显示了硫酸化聚甘油与实施例4的属于螯合剂类型的用于放射标记的诊断性效应分子（放射诊断和放射疗法）的结合物、以及与实施例5的用于MRI的金属络合物的结合物。实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物和效应分子的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架（球泡）的示意图。
图7显示了硫酸化聚甘油与实施例6的属于光敏化剂、细胞抑制剂（苯丁酸氮芥和紫杉醇）和siRNA类型的治疗性效应分子的结合物。所述实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物和效应分子的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架（球泡）的示意图。
图8显示了在细胞化学染色（使用DAPI的核染色）中，体外温育1小时的A549人类肺癌细胞对不同分子量的荧光三甘油或聚甘油结合物（ICC染料）的细胞摄取（实施例7）。
图9显示了在细胞化学染色（使用DAPI的核染色）中，体外温育4小时的A549人类肺癌细胞对ICC-三甘油结合物和硫酸化大分子肝素和硫酸化聚甘油（实施例3c）的细胞摄取。只有硫酸化聚甘油（SPG）集中在细胞内（实施例8）。
图10通过流式细胞测量分析（FACS）显示出单核细胞能够以非常高的量摄入硫酸化聚甘油（实施例3c的化合物），而淋巴细胞仅显示出少量摄取（实施例9）。
图11证实了硫酸化聚甘油诱导TGF-β-1从CASKI细胞释放的统计学显著的抑制。将细胞处理48小时，并通过ELISA检测培养上清液中的TGF-β-1（实施例10）。
图12显示出通过SPR/Biacore测量到硫酸化聚甘油（SPG）、带有连接物的硫酸化聚甘油（SPGL）和带有效应分子的结合物以高亲和性与细胞内转录因子NF-κB结合。结合亲和性随硫酸化程度和分子量的增加而增加，其由IC50值的降低所显示。连接物和效应分子不妨碍结合亲和性（实施例11）。
图13强调了硫酸化聚甘油诱导肺A549肿瘤细胞生长（图13A）和代谢活性（图13B）的统计学显著和生物学相关的抑制。将A549细胞与硫酸化聚甘油一起培养7天，并检测细胞数量和代谢活性。显示了培养7天后肿瘤细胞数量（A）和MTT试验（B）的结果（MW±SD）（实施例12）。
图14显示了用硫酸化聚甘油或PBS（对照）治疗的裸鼠（A549肺癌模型）的肿瘤体积的时间过程。在治疗45天后，日剂量为30mg/kg体重的硫酸化聚甘油（化合物P3）抑制肿瘤生长，显示出强治疗效果（实施例13）。
图15证实了用硫酸化聚甘油每日皮下治疗患有胶原蛋白诱导的关节炎的大鼠和健康对照的效果。在用硫酸化聚甘油以30mg/kg的日剂量治疗后，临床评分值、滑膜中的肥大细胞数量和炎性浸润受到影响，表明了显著的治疗结果（实施例14）。
图16显示了患有胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎的麻醉大鼠的荧光图像，其中硫酸化聚甘油与花青染料的结合物（化合物P26/E2，实施例3b）快速和大量摄取，并且患关节炎的关节中的荧光对比度（10分钟）随着疾病活性而增加（从低至高，评分值为1至3）。箭头指示具有高荧光对比度的患关节炎的关节（实施例17）。
图17显示了在皮肤炎症（接触性超敏反应）的小鼠模型中，硫酸化聚甘油与用64Cu放射性标记的DOTA的结合物（化合物P17/E13，实施例4a）的PET图像。麻醉小鼠的图像在发炎的耳组织中显示出高对比度。箭头指示发炎区域（实施例18）。
图18证实了硫酸化聚甘油与紫杉醇（泰素）的结合物（实施例6b的化合物）与没有结合的紫杉醇（泰素）相比，增加了肺肿瘤细胞A549的细胞生长和代谢活性的抑制。显示了在培养48小时后的肿瘤细胞数量（图18A）和MTT试验（图18B）的结果（MW±SD，n=4）（实施例19）。
图19显示了在与结合有VEGF-siRNA的硫酸化聚甘油（SPG）（实施例6e）或单独的VEGF-siRNA温育后，A549肺癌细胞系中的VEGF生产。在48h条件细胞培养基中通过ELISA测量VEGF蛋白。每个柱是来自于三次独立实验的三个测量值的平均值±SEM（实施例20）。
图20显示了本发明的ICG（图20a）、ICG类似物（图20b）的化学结构，以及用作诊断效应分子的优选衍生物的结构（图20c-d）。
图21显示了在0.9%NaCl中，硫酸化聚甘油与花青染料的结合物（化合物P17/E1，实施例3c）的荧光由于聚集而降低。
发明详述
本发明的目的是提供用于治疗肿瘤疾病、炎症、自体免疫疾病和纤维化的药物，所述药物的特征在于治疗有效性高和耐受性良好。本发明的聚阴离子多价大分子特别是由于其令人吃惊的高效能和即使在施用高剂量后的良好耐受性，适用于将效应分子递送到增殖和活化细胞的细胞质和细胞核中，以诊断和治疗肿瘤疾病、炎症、自体免疫疾病和纤维化。
一条系统研究过的细胞途径是具有高分子量的大分子的胞吞作用。胞吞作用是细胞通过将分子（例如大分子）与它们的细胞膜一起吞入，借以从细胞外部吸收所述分子的过程。它是被身体的所有细胞利用的通用机制，因为对细胞重要的大多数物质和底物是大的极性分子，不能通过疏水的质膜或细胞膜。胞吞作用过程在健康细胞和参与疾病过程的细胞两者中都存在（Liu等，PLOS Biology 2009;7:1000204）。
特别是当大分子结构的大分子或基于粒子的实体（有机或无机纳米粒子）到达细胞膜时，涉及到胞吞作用机制。因此，通过使用大分子载体分子，已实现了靶向性质提高的药物的设计。具体来说，已经合成了品种广泛的聚合实体或树枝状化合物（ori等，Adv Drug DelivRev.57:609,2005；Haag等，Angew.Chem.Int.Ed.45:1198,2006）。对于分子的靶向性质来说，大分子的化学修饰已被广泛接受。大量证据表明，置于大分子上的阳离子结构能够使大分子通过胞吞作用跨过细胞膜。就此而言，阳离子大分子被用于诊断和治疗效应子的细胞内递送（Paleos等，Curr Top Med Chem.8:1204,2008）。然而，由于人类生物体中每个细胞运用胞吞作用机制的普遍能力，阳离子大分子被每个细胞摄入。因此，药物递送涉及具有阳离子元件的组分和结构（例如WO2009142893）。这引起药物治疗的许多不想要的效应和毒性，以及药物在不希望的身体区室中的沉积。阳离子肽穿膜肽（Penetratin）被鉴定为NF-κB的细胞内抑制剂（Letoha等，Mol.Pharmacol.69:2027,2006）。
已知由于完整细胞的细胞膜的负电荷引起排斥并阻止细胞膜渗透，因此大多数阴离子结构不被细胞摄取。已经描述了品种广泛的具有聚阴离子状态的大分子实体。其中包括天然存在的化合物例如蛋白聚糖、脂质双层表面、微管和多核苷酸例如DNA或RNA。它们在基因转录和蛋白质合成中发挥中心作用。其他化合物是人造的聚合大分子或树枝状化合物例如聚氨基酸、聚羧酸盐和合成的寡核苷酸。由于完整细胞的细胞膜的负电荷，因此可以预期聚阴离子大分子与细胞膜的静电相互作用可能引起排斥并阻止细胞膜渗透。因此，不知道聚阴离子大分子是否可用于将效应分子递送到增殖和活化细胞的细胞质和细胞核中。事实上，由于单独作为药物效应子给药的RNA或siRNA不能充分集中在细胞中，因此已经做出大量努力以借助阳离子性或特殊载体分子将RNA或siRNA递送至细胞内区室（Jeong等，Bioconjug.Chem.20:5,2009）。
原则上，已知有许多大分子化合物已被用作药物递送载体。这些大分子可以在它们的聚合或树枝状骨架的化学结构类型、阴离子头部电荷的附着、分子量和从完全线性至超支化结构范围内的支化程度方面有差异。聚合骨架的化学性质可以源自于聚合反应以引起多分散分子量分布、或被适度合成以提供具有限定的结构和分子量的树枝状化合物。经过充分研究的实例是聚酰胺基胺（PAMAM）、聚赖氨酸（PL）、聚乙烯亚胺（PEI），它们都被合成为直链或支链结构的多分散聚合物、或限定化学结构的树枝状化合物。对于本技术领域的专业人员来说，已知大分子实体例如PAMAM、PEI、PL等的细胞摄取的普遍潜在机制是基于如上讨论的胞吞途径。关于大分子药物递送的其他信息可以在下列文献中发现：Saovapakhiran等，Bioconjug.Chem.20:693,2009；Seib等，J.Contr.Release 117:291,2007；Nori等，Adv Drug Deliv Rev.57:609,2005；Haag等，Angew.Chem.Int.Ed.45:1198,2006。
令人吃惊的是，已发现硫酸化多元醇化合物类型的树枝状聚阴离子大分子通过特异性机制集中于细胞内。相同分子量但是不具有硫酸盐基团的多元醇不能集中在人类A549肺癌细胞中。具体来说，将具有5kDa至208kDa范围内的分子量不同但不具有硫酸盐基团、因此仅具有多元醇骨架上的游离羟基的超支化树枝状聚甘油用荧光羰花青染料（ICC）标记，以比较性测量在人类A549肺癌细胞中的细胞内摄入。本发明人惊讶地发现，如果不带有多个硫酸盐基团，只有分子量为120kDa及以上的大分子才能通过胞吞作用被人类A549肺癌细胞摄入。此外，分子量最高20kDa并且不具有硫酸盐基团的超支化树枝状聚甘油不能通过胞吞作用跨过细胞膜（实施例7，图2），而分子量最高20kDa的硫酸化聚甘油被集中在细胞内。由于硫酸化的树枝状聚甘油被摄入到细胞内，这清楚地显示出硫酸化的树枝状聚甘油与非硫酸化的树枝状聚甘油相比的优势。
还已发现，当装配在大分子载体上的硫酸盐基团的数量低于某个值时，低聚硫酸盐不显示出细胞内集中，并且对NF-κB不具有适度的结合亲和性。与花青染料结合的基于甘油的支化硫酸化树枝状化合物（第一代具有4个硫酸盐，第二代具有8个硫酸盐，第三代具有16个硫酸盐），在所有情况下都显示出对NF-κB的结合亲和性为IC50>1000（本发明的实施例11）。可以得出结论，大量硫酸盐基团在聚合或树枝状载体骨架上的多价装配，是导致令人吃惊地鉴定到的细胞内集中以及转录因子NF-κB各AP-1的结合的性质的关键允许因素，并且对硫酸盐基团的最少数量有要求。因此，优选的是表现出数量超过10个硫酸盐基团、更优选超过15个硫酸盐基团、更加优选超过20个硫酸盐基团、最优选超过25个硫酸盐基团的硫酸化聚甘油和硫酸化聚甘油结合物。
因此，新的创造性性质是当阴离子电荷以多个装配在大分子中时，阴离子电荷能够起到进入细胞内部的特异性载体和效应子的功能，用于增殖和蛋白质合成的细胞内靶向。更具体来说，将阴离子性硫酸根基团共价连接到大分子载体分子上，引起上述令人吃惊地鉴定到的细胞内集中以及转录因子NF-κB和AP-1的结合以及TGF-β合成的抑制的性质。根据本发明，令人吃惊地发现，分子大小低于通过胞吞作用过程集中于细胞内部的大分子性质（正如对不具有硫酸盐基团的聚甘油所显示的，其需要高得多的分子量才能集中于细胞中；参见上文）的硫酸化聚甘油，通过不涉及胞吞作用的特异性机制被特异性运输到细胞内。详细来说，关于使用分子量低于20kDa的硫酸化聚甘油的运输机制的研究，为目前尚不了解的用于有机阴离子大分子的内流泵提供了证据。所述内流泵特异性存在于增殖和活化细胞中。
在生理pH范围内利用聚阴离子特征的聚合物或树枝状化合物可以是磺酸盐、硫酸盐、膦酸盐、磷酸盐、羧酸盐。向大分子中以合成导入这些基团是多种多样的；一种合理的方式是将多元醇的羟基转变成硫酸盐以提供聚硫酸盐。反应条件决定转化程度（详情参见下文）。硫酸化聚甘油首先由Türk等作为一类新的聚阴离子大分子描述（Bioconjugate Chemistry 15,2004,162-167）。WO 2008/015015描述了发现抑制凝血的不同物质。从该现有技术公布中，没有关于细胞内集中和选择性结合于NF-κB和AP-1以及抑制TGF-β释放的提示。
基于与二磺酸化萘偶联的聚酰胺基胺（PAMAM）或聚赖氨酸骨架的聚阴离子树枝状化合物，已知作为杀微生物药物候选物用于预防HIV（McCarthy等，Molecular Pharmaceutics 2005,2,312-318；Witvrouw等，Molecular Pharmacol.2000,58,1100-1108）。所述化合物靶向病毒粒子细胞膜上的受体。从这些数据不能推导出能够在人类细胞系中实现细胞内靶向。在高于ED50浓度2500倍的浓度下，观察到细胞渗透，其表明细胞渗入的非特异性机制。
此外，意外地发现聚阴离子多元醇适合于将诊断和治疗性效应分子递送到靶细胞中，因此可用作治疗药物的载体。WO93018793描述了用于递送到内皮细胞的聚阴离子药物结合物的制备。在WO93018793中概述的实施例涉及用于内皮细胞靶向递送的肝素药物结合物的制备。提供了肝素药物结合物结合到内皮细胞膜上的证据。没有提供关于肝素药物结合物适合于将药物递送到内皮细胞的细胞质的信息。与WO93018793一致，本发明人发现，肝素不能以适宜的浓度跨过细胞膜，并且不能将诊断效应子递送到细胞内。肝素的分子量在7kDa至30kDa范围内，低于胞吞性细胞内摄取所需的大小。此外，本发明的实验结果由此证实了肝素不能集中于细胞内（本发明的实施例8）。
更具体来说，对于本发明来说，治疗性效应子是能够直接或间接诱导针对靶细胞的抑制或毒性效应的分子。与增殖和活化不可缺少的某个细胞内靶点结合的治疗性效应子代表直接效应子。本发明人惊讶地发现，属于硫酸化聚甘油类型的聚阴离子多元醇，由于与NF-κB和AP-1强烈结合而表现出强且持续时间长的细胞内积累（实施例8）。相反，不具有硫酸盐基团的多元醇在温育停止后快速从细胞的细胞质中消除（实施例7）。概括来说，本发明人惊讶地发现，聚阴离子多元醇以高亲和性结合于细胞内靶分子，由此防止快速消除。这种意外发现的性质证实了与基于多元醇的载体骨架相连的多个硫酸盐基团表现出直接治疗效应，因此根据本发明，硫酸盐基团是直接效应子。本发明人证实这些针对NF-κB的效应子非常有效地抑制TGF-β的合成（实施例10）。由于TGF-β是自体免疫疾病、败血症、SIRS、纤维化、癌症和心血管疾病中的主要介导物，因此能够观察到最终的治疗效果。
基于上面鉴定和描述的性质，发现硫酸化多元醇最适合用于将其他诊断和治疗性效应分子递送到细胞内。这些对本发明来说的间接治疗效应子是能够不依赖于NF-κB和AP-1的活性抑制而诱导对靶细胞的其他抑制或毒性效应的分子。因此，聚阴离子多元醇的特别性质是将治疗和诊断性效应子递送到细胞内，其显示出与单独的相应治疗和诊断性分子相比，在细胞内的积累和摄入持续时间更长。治疗和诊断性分子与属于聚甘油类型的硫酸化多元醇共价结合，由此在硫酸化聚甘油与治疗和诊断性效应子之间产生结合物。
因此，有鉴于上面概述的发现，本发明包含使用聚阴离子大分子来靶向参与活化细胞的增殖和蛋白质合成的细胞内分子。在具体情况中，与多元醇相连的多个硫酸盐基团被特异性靶向增殖和活化细胞的细胞质和细胞核。已发现，所述靶向与胞吞作用的已知细胞摄取机制和已知发生在每种细胞类型中的大分子摄取具有本质上的不同。本发明证实了聚阴离子大分子在低于胞吞作用途径的分子量下是有效的，并且对于活化和增殖细胞是选择性的（实施例8和实施例9）。
专业技术人员理解，活化细胞是代谢活性提高的细胞。活化细胞可以通过MTT测定法来鉴定。此外，细胞活化可以通过在不同细胞类型例如分离的外周血单核细胞或造血细胞系的上清液中检测不同的炎性细胞因子来证实。因此，根据本发明，活化细胞包括免疫系统的细胞或肿瘤细胞。免疫系统的细胞可以是例如单核细胞、巨噬细胞或淋巴细胞。
在上述发现的基础上，本发明包括具有下列通式的化合物的用途：
P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的大分子，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间连接的反应性基团，m=0-100。
在优选实施方案中，本发明包括通式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m的化合物的用途，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的多元醇，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=0-100。
在更优选的实施方案中，本发明包括通式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m的化合物的用途，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的聚甘油，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=0-100。
共价连接了治疗性或诊断性效应分子的聚阴离子多元醇是新的，并且以前未被描述过。因此，本发明包括具有下列通式的化合物：
P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的多元醇，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=1-100。
具有共价连接的连接物单元以与治疗性或诊断性效应分子共价结合的聚阴离子多元醇是新的，并且以前未被描述过。因此，本发明包括具有下列通式的化合物：
P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的多元醇，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L-＝P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=1-100。
在更优选的实施方案中，本发明包括通式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m的化合物，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的聚甘油，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=1-10。
具有共价连接的连接物单元以与治疗性或诊断性效应分子共价结合的硫酸化聚甘油是新的，并且以前未被描述过。因此，本发明包括具有下列通式的化合物：
P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代的聚甘油，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，L=用于P与E之间共价连接的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=1-100。
硫酸根基团的可能数量取决于大分子的分子量。作为具体实施方案，大分子基于聚甘油，所述聚甘油由甘油单元的重复单元构成，每个单元能够在大分子中提供一个OH基团。例如，根据理论单分散分子计算，10,000g/mol的聚甘油核心能够提供135个OH基团，2,000g/mol的聚甘油核心能够提供27个OH基团（参见下面进一步的解释）。
在实施方案的更详细描述中，本发明的化合物是硫酸化聚甘油，其包含：
a）聚合的聚甘油核心，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有1至1,000个OH基团、优选1至4个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有0至67%、优选20至67%、更优选高于60%的支化度，以及500至1,000,000g/mol、优选2,000至20,000g/mol、更优选4,000至15,000g/mol、最优选7,000至10,000g/mol的平均分子量，
b）所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-OSO3 -M+取代，使得-OSO3H或-OSO3 -M+基团的数量大于16，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，
c）由此产生的所述硫酸化聚甘油的平均分子量为1,000至5,000,000g/mol，优选为4,000至50,000g/mol，更优选为6,000至30,000，最优选为10,000至20,000g/mol。
根据本发明，“支化度”是指通过聚合过程中甘油单元的两个可用OH基团都与两个其他单体分子（在阴离子聚合的情况下是缩水甘油）的反应获得的支化的程度。支化度为0表示完全直链的聚甘油，没有甘油单元附着于甘油单元的两个OH基团上。67%（2/3）的支化度是对于高支化聚甘油来说理论上可获得的最大值，意味着甘油单元的所有OH基团都已与两个其他甘油单元反应。根据本发明，使用20至67%支化的聚合的聚甘油核心。优选使用高度支化的结构，优选具有30至67%、更优选50至67%的支化度，特别优选具有高于60%的支化度。
聚合的聚甘油核心通过在缩水甘油的开环聚合期间分别使用（多）官能起始分子或引发剂来生产。起始分子或引发剂分别是具有1至1,000、优选1至100、更优选1至10、最优选1至4个OH基团的多羟基化合物。起始分子具有通式R-(OH)x，其中R可以是在阴离子聚合条件下稳定的任何分子，x是1至1,000、优选1至100、更优选1至10、最优选1至4。优选，所使用的引发剂是三或四官能引发剂，例如1,1,1-三羟基甲基丙烷（TMP）或1,1,1-三羟基甲基乙烷（TME）作为优选的三官能引发剂，或季戊四醇（PE）作为优选的四官能引发剂。起始分子或引发剂分别能够携带其他官能团，例如特别是SH基团、NH2基团。在具体实施方案中，起始分子含有OH基团和/或其他异质官能团（例如用适合的保护基团衍生的SH、NH2）。另一种起始分子可以是具有3个以上、优选10个以上、更优选20个以上OH基团的小的聚合的聚甘油。其他适合的引发剂、异质官能团和保护基团，对于本技术领域的专业人员来说是已知的。
根据本发明，术语“聚甘油核心”是指在多官能起始分子上通过聚合过程产生的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成的聚合分子。因此，核心只包含游离羟基和C、H、O元素。核心的分子量可以通过例如质谱术（MALDI）测定。核心经历进一步衍生化或官能化，产生本发明的化合物。这些官能化包括使用本技术领域的专业人员已知的适合试剂进行硫酸化，或包括连接物分子的共价连接。优选，使用SO3和吡啶的复合物作为硫酸化试剂。该试剂将-OH基团转变成-OSO3H或-OSO3 -Na+基团。所述硫酸化试剂优选以对应于所需硫酸化度的浓度使用。这意味着硫酸化试剂以相对于待转化的聚合的聚甘油核心的OH基团等摩尔或更高摩尔当量的浓度使用。因此，可以通过SO3与聚甘油的OH基团的比率来调整所得到的官能化，即硫酸化。
根据本发明，“硫酸化度”是指聚合的聚甘油核心的甘油单元的官能化（硫酸化）OH基团相对于总OH基团数的百分数。官能化得自于甘油单元的一个或多个OH基团被-OSO3H或-OSO3 -M+基团的取代，或得自于带有-OSO3H或-OSO3 -M+基团的低聚间隔基团在甘油单元的一个或多个OH基团处的连接。
阳离子性反离子M+选自无机碱金属钠、钾、锂、钙或有机阳离子化合物葡甲胺、赖氨酸、甘氨酸或其混合物。优选的是产生-OSO3 -Na+基团的钠。
对于多元醇、特别是聚甘油来说，本发明提供的数据表明，聚合物的分子量参数以及羟基的硫酸化度，对于提高与细胞内靶的结合亲和性来说是重要的。意外地发现，硫酸化度的增加和分子量的增加两者都增加与NF-κB的结合亲和性。这种增加是出乎意料的，并且是所述分子的新性质的强力指示。因此，优选的硫酸化聚甘油是核心分子量高于3,000g/mol、更优选高于6,000g/mol、更加优选高于10,000g/mol的聚甘油。优选的硫酸化度高于38%，更优选高于50%，更加优选高于76%，更优选高于86%，最加优选高于90%。优选的值和100%的最大可实现程度被理解为是基于通过硫的元素分析得到的测量值的±5%的通用标准误差。
取决于引发剂和聚合条件的选择，聚合的聚甘油核心达到一定支化度和可任意调整的平均分子量，所述分子量不是确定的分子量，而是覆盖一定分子量范围的分布。这种所谓的多分散性可以由多分散性指数（PDI）来描述。PDI被定义为Mw/Mn，其中Mw是重均分子量，Mn是数均分子量。高硫酸化聚甘油的优选多分散性指数低于2.3，更优选低于1.8，最优选低于1.5。用于描述聚甘油核心的平均分子量是数均分子量Mn。
如上所述，硫酸化反应对本技术领域的专业人员来说是已知的。硫酸化优选通过使用三氧化硫复合物（吡啶-SO3、三甲胺-SO3、三乙胺-SO3、二甲基甲酰胺-SO3）来实现。硫酸化在分离的聚甘油上执行，或在聚合反应后通过向聚合反应器直接加入硫酸化试剂在一个步骤中执行。这种用于获得本发明的硫酸化聚甘油的一步程序是新的，并且以前未被描述。通过改进硫酸化条件，将硫酸化度提高到超过现有技术水平。硫酸化试剂的1.2倍过量与在至少18小时的反应时间内将反应温度维持在高于80℃、优选高于90℃相组合，适合于获得高于85%的硫酸化度。令人吃惊的是，没有检测到分解和副产物。
意外地发现，对硫酸化聚甘油所演示的附着于大分子的附加连接物单元，不妨碍本发明的作用方式和化合物的使用。在实施例11中显示了用连接物进行修饰导致与没有连接物的硫酸化聚甘油相比，与NF-κB的结合亲和性具有相同的IC50值。使用连接物修饰的合成方法，然后进行硫酸化和去保护步骤，以产生具有反应性官能团的衍生物，这显示出可以获得与诊断和/或治疗性效应分子的有效的共价结合。WO2008/015015宣称了带有信号传导分子的聚甘油硫酸盐，然而没有讲授通过合理的连接物修饰获得这样的结合物的详细合成信息，并且没有示例所述结合物。
WO2008/015015没有提供关于信号传导分子的化学详情以及如何使用的技术解决方案。此外，没有提供也不清楚使支持所使用的术语“荷载”或“结合于”的合成化学类型。
连接物单元L是附着于至少一个OH基团的带有官能团的烷基，官能团G有能够与其他治疗性或诊断性效应分子E结合的潜力。根据本发明，连接物连接于至少一个OH基团，由此形成醚、羧酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、三唑键。本发明的带有附加连接物的聚甘油硫酸盐是新的，并且以前未被描述过。
因此，在实施方案的更详细描述中，本发明的化合物是具有连接物的硫酸化聚甘油P(OSO3 -M+)n(L-G)m，其包含：
a）聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有1至1,000个OH基团、优选1至4个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有0至67%、优选20至67%、更优选高于60%的支化度，以及500至1,000,000g/mol、优选2,000至20,000g/mol、更优选4,000至15,000g/mol、最优选7,000至10,000g/mol的平均分子量，
b）所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-OSO3 -M+取代，其中-OSO3H或-OSO3 -M+基团的优选数量大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，
c）所述硫酸化聚甘油由此产生的平均分子量为1,000至5,000,000g/mol，优选为4,000至50,000g/mol，更优选为6,000至30,000，最优选为10,000至20,000g/mol，
d）带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，其中所述官能团有能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合的潜力，其中X是硫酸化度。
优选的是式（I）、（II）或（III）的硫酸化聚甘油
Figure BDA00001971575200281
式I    式II    式III
其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个（优选为1至3个）不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3Na、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C，其中-OH、-NH2、-SH、-COOH可以用专业技术人员已知的保护基团官能化或保持官能化。
所述结构式为了简化起见显示了一个连接物单元的化学结构，并将硫酸化聚甘油显示为简图（球泡），并作为示例在甘油亚单元处画出两个硫酸盐基团。应该理解，从相应的硫酸化度可以得出，其他甘油亚单元除了硫酸盐基团之外还能携带游离羟基。根据本发明，连接物单元可以连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，其中X是硫酸化度。
连接物修饰的硫酸化聚甘油可用于将诊断和/或治疗性效应分子共价连接于聚合物，并将效应分子运输到靶位点。根据本发明，这些效应分子是间接效应子，然而如上所述，多个硫酸盐是直接效应子。已显示，与诊断效应分子的结合引起在靶组织中的积累，提供了靶特异性摄入的证据。在实施例8和9中显示了带有属于荧光花青染料类型的诊断性效应分子的硫酸化聚甘油，与仅与一个三甘油单元结合的低分子量染料（ICC-三甘油）相比，引起染料在细胞内的运输和结合的增加。因此，连接物修饰的硫酸化聚甘油是意外地鉴定到的本发明化合物类型，其基于将诊断和/或治疗性效应分子与聚合物共价连接的能力而提供间接治疗效能。诊断性结合物的合成在实施例2-5中进一步描述。
此外，根据本发明，大分子治疗性化合物可用于靶特异性递送表现出间接治疗效果的分子。现有技术状态描述了基于大分子的各种结合物（Nori等，Adv Drug Deliv Rev.57:609,2005；Haag等，Angew.Chem.Int.Ed.45:1198,2006）。带有多个硫酸盐以及治疗性效应分子的大分子，特别是带有这种效应分子的硫酸化聚甘油，在文献中是未知的。实施例6和17证实了与属于细胞抑制剂和siRNA类型的治疗性效应分子的共价连接，通过本发明的细胞内摄取的作用方式以及与转录因子NF-κB和AP-1结合并抑制TGF-β合成，诱导了提高的治疗效果。
因此，在实施方案的更详细描述中，本发明的化合物是符合式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m的硫酸化聚甘油与诊断性或治疗性效应分子的结合物，其包含：
a）聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有1至1,000个OH基团、优选1至4个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有0至67%、优选20至67%、更优选高于60%的支化度，以及500至1,000,000g/mol、优选2,000至20,000g/mol、更优选4,000至15,000g/mol、最优选7,000至10,000g/mol的平均分子量，
b）所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-OSO3 -M+取代，其中-OSO3H或-OSO3 -M+基团的优选数量大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，
c）所述硫酸化聚甘油由此产生的平均分子量为1,000至5,000,000g/mol，优选为4,000至50,000g/mol，更优选为6,000至30,000，最优选为10,000至20,000g/mol，
d）带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，其中所述官能团有能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合的潜力，其中X是硫酸化度。
e）诊断性和/或治疗性效应分子，其共价连接于一个直至最大可能数量的所述官能团，所述诊断性效应分子选自荧光染料或用于放射活性或顺磁性金属的螯合剂，所述治疗性效应分子选自细胞抑制剂、抗血管生成药物、光敏化剂、siRNA。
因此，优选的是具有连接物单元L的衍生物，其使用杂原子官能团G与诊断性和/或治疗性效应分子E反应，并由式（IV）、（V）或（VI）显示
Figure BDA00001971575200301
式IV    式V    式VI
支化度、硫酸化度和连接物单元如上所述并在此相应使用。硫酸化聚甘油如上所述显示为球泡。
根据本发明，诊断性效应分子选自荧光染料或具有放射活性或顺磁性金属的螯合剂，治疗性效应分子选自细胞抑制剂、抗血管生成药物、光敏化剂、siRNAs。
作为选自荧光染料的具有诊断功能的效应分子（E），所述分子包含在UV/可见（400-800nm）或近红外（700-1000nm）光谱范围内具有荧光发射的荧光染料。优选，具有诊断功能的光学效应分子选自NBD、荧光素、罗丹明、苝染料、克酮酸染料、方酸菁染料、聚甲炔染料、吲哚羰花青染料、吲哚二羰花青染料、吲哚三羰花青染料、部花青染料、酞菁、萘酞菁、三苯基甲炔染料、克酮酸染料、方酸菁染料、苯并吩噁嗪染料、苯并酚噻嗪染料及其衍生物。更优选，具有诊断功能的光学效应分子选自聚甲炔染料、吲哚羰花青染料、吲哚二羰花青染料、吲哚三羰花青染料、部花青染料、酞菁、萘酞菁、三苯基甲炔染料、克酮酸染料、方酸菁染料及其衍生物。更加优选，具有诊断功能的光学效应分子选自吲哚羰花青、吲哚二羰花青染料、吲哚三羰花青染料及其衍生物。实例是Cy7、Cy5.5、Cy3、AlexaFluor染料、吲哚菁绿（ICG）。
产生可用于本发明的具有诊断功能的光学效应分子的合成路线的实例，出版在下述文献中：《应用化学主题：红外吸收染料》（Topicsin Applied Chemistry:Infrared absorbing dyes），Ed.M.Matsuoka,Plenum,N.Y.1990；《应用化学主题：染料的化学和应用》（Topics in AppliedChemistry:The Chemistry and Application of Dyes），Waring等，Plenum,N.Y.,1990；J.Org.Chem.60:2391-2395（1995）；Lipowska等，Heterocyclic Comm.1:427-430（1995）；Fabian等，Chem.Rev.92:1197（1992）；WO 96/23525；Strekowska等，J.Org.Chem.57:4578-4580（1992）；Bioconjugate Chem.16:1275-128（2005）；Lee等，J.Org.Chem.73:723（2008）。
最优选，具有诊断功能的光学效应分子是包含图20的吲哚菁绿（ICG）及其衍生物的结构元件的荧光染料。由此，ICG的衍生物优选在结构上被描述为：
a）用C1-6烷基-R2任选代替吲哚氮处的一个或两个磺丁基链，其中R2是-OH、-COOH、-OSO3H、-OSO3Na、-NH2、-N3、-COOH、-SH或-C≡C，和/或
b）用在中心碳原子处具有残基R3的取代聚甲炔链代替聚甲炔链，由此两个相邻的碳原子可以与聚甲炔链的三个碳原子一起形成5或6员环，其中R3选自-C1-6-烷基-R2、-S-C1-6-烷基-R2、-O-C1-6-烷基-R2、-苯基-C1-6-烷基-R2、-苯基-R2、-S-苯基-C1-6-烷基-R2、-S-苯基-R2、-O-苯基-C1-6-烷基-R2、-O-苯基-R2、-苯基-NH-C1-6-烷基-R2、-苯基-NHR2、-S-苯基-NH-C1-6-烷基-R2、-S-苯基-NHR2、-O-苯基-NH-C1-6-烷基-R2、-O-苯基-NHR2，其中R2如上所述，并且其中C1-6-烷基的1-2个碳原子可以被羰基代替，和/或
c）用一个或多个基团R4取代外部苯并吲哚环，所述基团R4独立地选自-SO3-Na+、-COOH或-OH。
更优选，聚甲炔链在中心碳原子处具有如上所述的残基R3，R4是H或表示一个或两个-OSO3 -Na+基团，其中R2是-COOH或-OSO3 -Na+，并且其中两个相邻的碳原子可以与聚甲炔链的三个碳原子一起形成5或6员环（图20b）。
ICG的最优选衍生物如图20c所确定，其中残基R3是-S-CH2-CH2-COOH、-苯基-COOH、-苯基-CH2-COOH、-苯基-CH2CH2-COOH、-苯基-CH2CH2CH2-COOH、-苯基-NH2、-苯基-NH(CO)-CH2CH2-COOH、-苯基-NH(CO)-CH2CH2CH2-COOH，其中在苯基处的取代是对位的。另一个实施方案描述了具有在中间碳上带有残基R3的五甲炔链的衍生物（图17d）。
ICG的最优选实施方案描述了图20c-d的包含6个磺酸盐基团以及反应性连接物的衍生物，因此基于磺酸盐基团提供了最高的亲水性。已经显示，以大于3的标记比率标记IgG和Fab抗体而不影响抗体的功能性并且不引起结合物沉淀是可能的。与这些结果相反，具有包含4个或以下磺酸盐基团的ICG衍生物的结合物在溶液中不太稳定，引起沉淀和结合物功能的丧失。本发明的花青染料被用作与本发明的硫酸化聚甘油共价结合的效应子（实施例3，图5）。
在另一个实施方案中，至少一种效应分子效应分子（E）是放射性标记的复合物，其包含放射性核素和选自四氮杂环十二烷螯合物和大环或开链氨基羧酸的螯合结构。优选，放射性标记的复合物包含螯合剂，其选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N″′-四乙酸（DOTA）、l,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N"-三乙酸（DO3A）、1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-N,N',N"-三乙酸（OTTA）、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N"-三乙酸（NOTA）、反式(1,2)-环己烷二亚乙基三胺五乙酸（CDTPA）、N,N,N',N",N"-二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、N-(2-羟基)乙二胺四乙酸、氮川三乙酸（NTA）、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸及其衍生物，以及选自90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb、141Ce、86Y、94mTc、110mIn、68Ga、64Cu的放射性核素。更优选，放射性标记的复合物选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N″′-四乙酸（DOTA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N"-三乙酸（DO3A）、N,N,N',N",N"-二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）和选自90Y、99mTc、111In、68Ga、86Y、64Cu的放射性核素。更加优选，放射性标记的复合物选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N″′-四乙酸（DOTA），其中使用反应性结构将一个乙酸修改成酰胺以与G共价结合（式I-III）；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N"-三乙酸（DO3A），其中带有羟乙基组成部分的一个氮被反应性结构取代以与G共价结合（式I-III）；以及选自111In、68Ga、86Y、64Cu的放射性核素。应该理解，放射性同位素可以提供诊断功能，并且当选择发射治疗活性放射线的放射性同位素、例如发射β-射线的放射性核素时，也提供治疗功能。络合化学在原理上是一致的，并且不依赖于射线发射的类型。在本发明中，优选发射β射线的放射性同位素，优选为90Y。用于成像和放射治疗的放射性标记对于专业技术人员来说是已知的；也参见：Liu等，Adv Drug Deliv Rev.60:1347,2008；Zwanziger等，Curr Pharm Des.14:2385,2008；Maecke,Ernst Schering Res FoundWorkshop.49:43,2005。
在另一个实施方案中，至少一种效应分子（E）是包含顺磁性金属和选自四氮杂环十二烷螯合物和大环或开链氨基羧酸的络合结构的络合物（Kobayashi等，Curr Pharm Biotechnol.5:539,2004）。本发明描述了将最多5个钆络合物偶联到叠氮化物改性的硫酸化聚甘油的能力（实施例5）。由于钆高度细胞内递送到活化细胞中，这种本发明的结合物被用作核磁共振成像（MRI）的造影剂。因此，顺磁性金属优选为钆（Gd3+），并且络合结构选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N″′-四乙酸（DOTA），其中使用反应性结构将一个乙酸修改成酰胺以与G共价结合（式I-III）；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N"-三乙酸（DO3A），其中带有羟乙基部分的一个氮被反应性结构取代以与G共价结合（式I-III）。
在另一个优选的实施方案中，效应分子（E）是具有治疗功能的效应分子，其包含在UV/可见（400-800nm）或近红外（700-1000nm）光谱范围内激发后具有光治疗效能的光敏化剂（实施例6a）。更优选，光敏化剂选自四吡咯、卟啉、sapphyrin、二氢卟酚、四苯基卟啉、四苯基二氢卟酚、菌绿素、四苯基菌绿素、脱镁叶绿酸、细菌脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸、细菌焦脱镁叶绿酸、紫红素酰亚胺、细菌紫红素酰亚胺、苯并卟啉、酞菁、萘酞菁及其衍生物。更加优选，光敏化剂选自脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a、3-乙酰脱镁叶绿酸a、3-乙酰焦脱镁叶绿酸a、紫红素-18-N-烷基酰亚胺、紫红素-18-N-羟基酰亚胺、3-乙酰紫红素-18-N-烷基酰亚胺、3-乙酰紫红素-18-N-羟基酰亚胺、二氢卟酚e6、Sn-二氢卟酚e6、间-四羟基苯基二氢卟酚（m-THLC）和苯并卟啉衍生物、苯并卟啉衍生单酸（BPD-MA，维替泊芬）。还更优选，光敏化剂选自脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a、3-乙酰脱镁叶绿酸a、3-乙酰焦脱镁叶绿酸a、紫红素-18-N-烷基酰亚胺、紫红素-18-N-羟基酰亚胺、3-乙酰紫红素-18-N-烷基酰亚胺、3-乙酰紫红素-18-N-羟基酰亚胺和二氢卟酚e6、苯并卟啉衍生物、苯并卟啉衍生单酸（BPD-MA，维替泊芬）。最优选，光敏化剂选自脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a、紫红素-18-N-烷基酰亚胺、紫红素-18-N-羟基酰亚胺和二氢卟酚e6、维替泊芬。
产生可以在本发明中使用的光敏化剂的合成路线的实例，出版在下述文献中：WO 2003/028628；US 2005/0020559；Zheng G等，J MedChem 2001,44,1540-1559；Li G等，J.Med.Chem.2003,46,5349-5359；Lunardi CN等，Curr Org Chem 2005,9,813-821；Chen Y等，Curr OrgChem 2004,8,1105-1134。
在另一个优选实施方案中，任选至少一种效应分子（E）是抗肿瘤药剂类型的治疗性效应分子例如烷基化和类烷基化抗肿瘤药剂，例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺、美法仑、苯丁酸氮芥、烷基磺酸盐、白消安、曲奥舒凡、卡莫司汀、洛莫司丁、尼莫司汀、雌莫司汀、链脲佐菌素、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、噻替哌，或抗代谢物类型的治疗性效应分子例如嘌呤类似物（6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨）或嘧啶类似物（吉西他滨、5-氟尿嘧啶）或抗叶酸剂（甲氨蝶呤），植物生物碱和萜类例如长春花生物碱类（长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛），地索拉唑（disorazole）及其衍生物（地索拉唑A1、A2、E1、Z），鬼臼毒素例如依托泊苷和替尼泊苷，紫杉烷类（多西他赛、紫杉醇），拓扑异构酶抑制剂例如喜树碱衍生物伊立替康和托泊替康，安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷，抗肿瘤抗生素类例如更生霉素、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、博来霉素、丝裂霉素。
另一类治疗性效应分子是毒素，例如相思子毒素、α-毒素、白喉毒素、外毒素、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、皂苷和假单胞菌外毒素。
另一类治疗性效应分子是小干扰RNA（siRNA），例如VEGF或EGF siRNA。siRNA优选通过可切开的键例如二硫键结合到聚甘油连接物上（实施例6e和实施例20）。
优选的是治疗性效应分子紫杉醇和苯丁酸氮芥、其具有适合于与大分子形成共价键的官能团的衍生物。本发明用于合成结合物的是其带有用于共价结合的反应性基团的前体衍生物。优选的基团是炔丙基、羧酸、羧酸-NHS-酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、二硫化吡啶盐。最优选的是紫杉醇-琥珀酸-NHS-酯（表1中式E28，Thierry等，J.Am.Chem.Soc.127:1626,2005）和苯丁酸氮芥-NHS-酯（式E25，WO96/022303）、紫杉醇-琥珀酸-炔丙基酰胺（式E27）、苯丁酸氮芥-炔丙基酰胺（式E24）。
因此，根据本发明，效应分子（E）连接于聚甘油硫酸盐衍生物的至少一个连接物的官能团（G）上，由此形成醚、硫醚、羧酸酯、磺基酯、酰胺、胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、腙、亚胺、二硫化物、三唑或乙烯基键。
本发明的具体实施方案是式P(OSO3 -M+)n(L-G)m的化合物，其中L是-O-，m是大于1的数，G表示SO3 -M+，因此提供了硫酸根基团。如上所述，硫酸根基团当它们以多个装配时是直接效应功能物，能够执行摄取到活化和增殖细胞中的效应。M优选为钠。
根据本发明，大分子能够将如上所述的共价连接的效应分子运输到活化和增殖细胞中。在本发明的实施例中显示了可以对效应分子的类型进行选择，而不妨碍硫酸化聚甘油的生物效能。在本发明的一个实施方案中，硫酸化聚甘油与1-100个效应分子结合。然而，效应分子的总分子量不应超过硫酸化聚甘油的平均分子量。因此，优选实施方案是结合1-10个效应分子、更优选1-5个效应分子。所得到的硫酸化聚甘油的平均分子量与结合于硫酸化聚甘油的所有效应分子的总分子量的比率，优选为3，更优选为5，更加优选为10。
硫酸化聚甘油在水性溶液中的溶解度高，为>200mg/mL。在水性介质中不溶的亲脂效应分子通过与硫酸化聚甘油结合而被带入溶液中。令人吃惊的是，与紫杉醇的结合物（实施例6b）在水中表现出>100mg/mL的溶解度。因此，所得到的效应子结合物在水或水性缓冲液（pH范围6.0至8.5）中的总溶解度优选>50mg/mL，更优选>100mg/mL。
针对硫酸化聚甘油显示的装配了多个硫酸盐基团的大分子，以低于10nM的IC50值结合细胞内转录因子NF-κB（实施例11）并抑制TGF-β释放（实施例10）。因此，本发明的优选实施方案是硫酸化聚甘油以及作为结合物的聚甘油，在实施例11中所描述的结合测定法中，其与NF-κB结合的IC50高于50nM、更优选高于20nM、最优选高于10nM。
作为前体用于与大分子、特别是基团G（式I-III）共价结合的反应性效应分子的优选实例，描述在表1中：
Figure BDA00001971575200381
Figure BDA00001971575200391
Figure BDA00001971575200401
Figure BDA00001971575200411
Figure BDA00001971575200421
Figure BDA00001971575200431
Figure BDA00001971575200441
如上所述，硫酸化聚甘油的合成对于本技术领域的专业人员来说是已知的。连接物衍生物的合成包含一个或多个其他合成步骤。一般来说，连接物通过与聚甘油的一个或多个OH基团反应而共价连接到聚甘油核心上。与OH基团的反应是通过以1-50mol%的缩水甘油单体量向反应溶液加入适当的亲电连接物前体，在聚合反应期间原位完成的。此外，与OH基团的反应使用分离的聚甘油材料进行，所述聚甘油材料使用适合的碱去质子化、然后以1-50mol%的缩水甘油单体量向反应溶液加入适合的亲电连接物前体。适合的碱的实例是氢化钠、甲醇钠、碳酸钠、叔丁酸钾。硫酸化优选通过使用三氧化硫复合物（吡啶-SO3、三甲胺-SO3、三乙胺-SO3、二甲基甲酰胺-SO3）来实现。硫酸化在分离的聚甘油或聚甘油-连接物衍生物上执行，或在聚合反应后通过向聚合反应器中直接加入硫酸化试剂在一个步骤中执行。
适合的亲电连接物前体材料是通式（VII）-（XI）的材料：
Figure BDA00001971575200451
式VII    式VIII    式IX    式X    式XI
其中L是支链或直链C1-20-烷基，其中一个或多个（优选为1至4个）不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(NH2 +)NH、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3Na、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C，其中-OH、-NH2、-SH、-COOH任选用专业技术人员已知的保护基团官能化，并且其中Y表示亲核取代反应的离去基团例如Cl、Br、I、对甲苯磺酸、甲磺酸、三氟甲磺酸或间硝基苯磺酸，并且其中Z表示选自Cl、N-羟基琥珀酰亚胺基、咪唑基、对硝基苯氧基的离去基团。
优选的亲电连接物前体材料是式VII的材料，其中L是直链C1-20-烷基，其中一个或多个（优选为1至4个）不连续的亚甲基可以被提供-CH2CH2O-单元的基团O和/或C(O)NH、C(NH2 +)NH、C(O)代替，并且其中G选自-NH2、-N3、-COOH、-SH，其中这些基团任选用专业技术人员已知的保护基团官能化。本发明的示例性结构描绘在图4中。应该理解，式VII化合物的共价连接表示添加3碳甘油部分，其中一个羟基被亚单元L-G代替。这导致在聚甘油中，在通过打开环氧化物反应性部分以与羟基反应时，连接物向总体聚合物骨架增添了附加的游离羟基。被打开的环氧化物由此产生的游离羟基因此将经历硫酸化（参见图4，第一条）。
优选的反应性连接物前体是N-2,3-环氧丙基邻苯二甲酰亚胺、N-Boc-2,3-环氧丙胺、N-Cbz-2,3-环氧丙胺。
特别优选的连接物通过将氨基与亚氨基硫烷（Traut试剂）进行反应以产生连接物单元-NH-C(NH2 +)-CH2CH2CH2SH来获得。
连接物前体化合的化学结构显示在表2中：
Figure BDA00001971575200471
本发明的化合物当例如用作药物时，可以提供成药物组合物的形式，其包含一种或多种本发明的化合物以及可药用载体。
优选，这些药物组合物具有单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液或悬液。其他剂型对于本技术领域的专业人员来说是已知的。另一个实施方案是本发明的化合物与已知的可药用载体和/或赋形剂在一起的固体制剂。取决于所需的施用途径（例如皮下、静脉内、腹膜内），可药用载体和/或赋形剂可以具有多种多样的形式。适合的载体和赋形剂在本技术领域中是已知的，并且可以由本技术领域的专业人员来选择。载体包括惰性药物赋形剂例如粘合剂、悬浮剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、着色剂和包衣剂。
特别优选的实施方案是冷冻干燥剂的药物剂型。意外地发现，硫酸化聚甘油在水性介质或缓冲液中的溶液随着储存时间增加表现出形成团块或较大聚集物的倾向。已发现，从含有可药用添加剂的冷冻干燥固体立即重构溶液不产生团块或较大聚集物。重构可以在给药之前进行。优选的添加剂是低温保护性化合物（低温防护剂或冻干保护剂）例如蔗糖、甘露糖或海藻糖，其可以单独、作为混合物或与已知的其他粘合剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、着色剂和包衣剂组合使用。蔗糖、甘露糖或海藻糖优选以本发明的硫酸化聚甘油及其结合物的量的1-100倍、更优选5-20倍的量使用。最优选的是以5-20倍的量使用海藻糖，例如10mg药物使用100mg海藻糖。
实施例21显示了水性溶液中的ICG衍生物与硫酸化聚甘油的结合物（结合物P17/E1）的荧光的时间过程。荧光强度的降低指示了引起荧光淬灭的聚集的进行程度。意外地发现，从使用上述添加剂的冷冻干燥药物物质新鲜制备的溶液，在所研究的时间尺度（约1小时）内不表现出聚集。因此，本发明的步骤提出了本发明的硫酸化大分子、优选为硫酸化聚甘油、带有连接物的硫酸化聚甘油、及其与效应分子的结合物的冷冻干燥材料。
药物或药物组合物包含治疗有效量的药物或几种药物，即治疗有效量的一种或多种本发明的化合物。专业技术人员将能够在待治疗的疾病的基础上并考虑到患者的状态来确定治疗有效量。药物或药物组合物可以适合地含有约5至1000mg、优选约10至500mg之间的本发明的化合物。
本发明的化合物的给药途径优选为肠胃外，包括皮下、静脉内、腹膜内、眼内、肌肉内、肿瘤内。最优选的是静脉内和皮下给药途径。意外地发现，在不同动物的疾病模型中重复每日给药（皮下）长达30天（实施例13、14、15），在整个治疗时间范围内没有观察到毒性，并且没有引起不良事件。因此，本发明包含硫酸化聚甘油和硫酸化聚甘油与效应分子的结合物在以多种化合物剂量治疗选自癌症、炎症、自体免疫病和纤维化的疾病中的用途。多种剂量意味着治疗使用一种以上剂量，包括每日一次治疗、每2至7天治疗、每日治疗多于一次或以一定时间间隔例如以5天的时间间隔治疗。更具体来说，本发明包括使用10mg/kg直至1000mg/kg、优选20mg/kg至500mg/kg、最优选50mg/kg至200mg/kg体重的皮下剂量对患者进行多次治疗。本发明还包括使用1mg/kg直至200mg/kg、优选10mg/kg至100mg/kg、最优选20mg/kg至50mg/kg体重的静脉内剂量对患者进行多次治疗。
实施例
实施例1：通过硫酸化聚甘油的合成产生用于增殖和蛋白质合成的细胞内靶向的聚阴离子多价大分子
实施例1a：
通过缩水甘油的阴离子聚合产生树枝状聚甘油核心：按照下述文献获得树枝状聚甘油并对其进行性质研究：Bioconjugate Chemistry 15,2004,162-167；Advanced Materials 12,2000,235-239；Macromolecules32,1999,4240。
从不同起始分子（1,1,1-三(羟甲基)丙烷（TMP）、1,1,1-三(羟甲基)乙烷（TME）和季戊四醇（PE））获得不同平均分子量的各种聚合材料，并应用于硫酸化反应。
实施例1b：
高度硫酸化聚甘油的合成：根据Bioconjugate Chemistry 15,2004,162-167中的实验描述合成硫酸化聚甘油。为了获得高硫酸化度，对发表的程序进行了改良。在90℃下以1.2倍摩尔过量加入SO3/吡啶复合物，并在90℃连续搅拌18小时。通过透析和超滤（MW截留值2000）进行纯化。通过元素分析确定硫酸化度。所有化合物作为钠盐获得（表3）。
不能通过在反应混合物中使用限定摩尔比率的硫酸化试剂来调整所需硫酸化度，因为它的反应性取决于所使用的试剂和起始材料的性质、纯度和来源。然而，使用过量的硫酸化试剂，能够确保硫酸化度高于90%，而较少的硫酸化试剂、优选为0.6至1摩尔当量时，允许获得硫酸化在50至90%范围内的产物。
表3：在实施例1b中获得的硫酸化聚甘油
Figure BDA00001971575200501
实施例1c:
作为“一步”程序合成硫酸化聚甘油的一般程序。反应在装备有机械搅拌器的反应器中进行。将整个装置在真空下干燥，并用无水氩气冲洗。将干燥程序重复4次。将施加的来自于Acros的缩水甘油（纯度>96%）在CaH2上搅拌过夜，并在45℃和1mbar下蒸馏。级份1（使用的缩水甘油量的5%）由二/三聚体构成。级份2是所需的纯缩水甘油。将蒸馏过的缩水甘油保留在冰箱中，只在干燥条件下才打开。向反应器加入TMP（2,68g，20mmol），并在真空中在60℃下熔化。在氩气气氛下加入KOtBu（1M在THF中，6mL），并通过添加NMP来溶解沉淀物。将混合物加热至120℃并搅拌2h以除去正丁醇。将缩水甘油（100g，1.35mol）溶解在225mL无水THF中（比率1:2.5），并使用计量泵用18小时添加。将混合物冷却至90℃，并用200mL无水DMF稀释。加入固体的吡啶-SO3复合物（215g，1.35mol），并进一步加入50mL无水DMF。在搅拌24h后，在分液瓶中向反应混合物加入350mL水，并将混合物用2M NaOH中和至pH约9-10。在蒸发至干后，将结晶固体在二乙醚上搅拌以除去NMP。通过超滤（水，再生纤维素膜；MWCO 1000）达到纯化。在高真空中蒸发并干燥后，获得作为浅黄色无定形固体的产物。
实施例2：通过合成带有用于共价结合效应分子的连接物的硫酸化聚甘油来产生用于增殖和蛋白质合成的细胞内靶向的聚阴离子大分子载体分子
实施例2a：
用于在聚合反应过程中合成连有附加官能化连接物单元的树枝状聚甘油核心的一般程序：基于Bioconjugate Chemistry 15,2004,162-167中发表的合成方法，进行了改良的聚合合成。在完成单体反应配偶体缩水甘油的添加后，通过在60-100℃的温度下添加连接于去质子化羟基的反应性连接物，继续进行聚合反应。连接物以相对于缩水甘油1-50mol%的量添加，并将反应继续2-24h。通过从甲烷/丙酮重复沉淀并在高真空中在50-80℃下干燥24h，获得粗品聚合物。将该材料用于硫酸化反应中。
实施例2b：
通过使用分离的聚甘油材料的第二合成步骤，经醚键连接连接物以产生实施例化合物P14至P25的一般程序：将在实施例1a中获得的树枝状聚甘油通过透析（水，MWCO 3000）、在真空中蒸发和在60℃下在高真空（0.05mbar）中干燥24h，来进行纯化。将1g聚甘油在60℃下溶解在无水DMF（20mL）中，并用氢化钠（每个准备用连接物衍生的OH 2.5摩尔当量）进行处理，然后在80℃搅拌18h。然后，在80℃下加入等摩尔量的含有溴化物或对甲苯磺酸离去基团或环氧化物反应性基团的连接物（表2）在DMF中的溶液，并将溶液继续搅拌18h。通过加入甲醇将产物淬灭，用丙酮沉淀，在真空中干燥并在甲醇中透析（MWCO 1000）2天，然后在60℃下在高真空中干燥。
实施例2c：
通过使用分离的聚甘油材料的第二合成步骤，经氨基甲酸酯键连接连接物以产生实施例化合物P26和P27的一般程序：将在实施例1a中获得的树枝状聚甘油通过透析（水，MWCO 3000）、在真空中蒸发和在60℃下在高真空（0.05mbar）中干燥24h，来进行纯化。将1g聚甘油溶解在无水DMF（20mL）中。向该溶液加入羰基二咪唑（CD1；每个准备用连接物衍生的OH 5摩尔当量），并将溶液搅拌24h。然后加入丙酮以沉淀活化的聚甘油。将残留物溶解在15mL DMF中，加入LP 12（每个OH 1.5当量；总共12当量；参见表2）在DMF中的溶液，并将混合物在室温继续搅拌18h。将产物用丙酮沉淀，在真空中干燥并在甲醇中透析（MWCO 2000）2天，然后在60℃下在高真空中干燥。
实施例2d：
通过实施例2a-c的化合物的硫酸化，合成带有连接物的硫酸化聚甘油：反应按照Bioconjugate Chemistry 15,2004,162-167和实施例1b进行。通过透析和超滤实现纯化。通过元素分析确定硫酸化度。所有化合物作为钠盐获得（表4）。
表4：在实施例2a-d中获得的带有连接物的聚甘油硫酸盐P14-P27（在切开保护基团之前）和在实施例2e中获得的P28：
Figure BDA00001971575200531
可以使用下列用于去除保护基团的程序，但不限于此。Boc-保护的氨基、叔丁基酯、叔丁基保护的羟基、THP保护的羟基：将100mg聚合物溶解在5mL三氟乙酸/水（1:2）中，并在室温下搅拌2h。将溶剂在真空中去除，并将残留物用二氯甲烷重复处理并蒸发。然后加入5mL水。通过添加1M NaOH溶液将溶液的pH调整到8。最终产物的纯化通过在蒸馏水中超滤来实现。
邻苯二甲酰亚氨基保护的氨基：将100mg聚合物溶解在5mL甲醇/水（1:1）中，并向该溶液加入一水合肼（1mL）。将溶液在室温下搅拌4h。在真空中除去溶剂，将残留物用二氯甲烷重复处理并蒸发。然后加入5mL水。通过添加1M NaOH溶液将溶液的pH调整到8。最终产物的纯化通过在水中超滤来实现。
使用硼氢化钠和乙酸将邻苯二甲酰亚氨基去保护的第二种方法描述在实施例2e中。
羰基苯甲氧基（Cbz）保护的氨基、苯甲基和二苯甲基保护的氨基、苯甲基酯：将100mg聚合物溶解在10mL甲醇/水（9:1）中，并向该溶液加入10mg 10%Pd/C催化剂。将溶液在3mbar氢气下搅拌24h。将混合物通过硅藻土进行过滤，在真空中除去溶剂，将残留物用二氯甲烷重复处理并蒸发。然后加入5mL水。通过添加1M NaOH溶液将溶液的pH调整到8。最终产物的纯化通过在蒸馏水中超滤来实现。
叠氮基还原成氨基：将100mg聚合物溶解在20mL THF/水（1:1）中并向该溶液加入每个叠氮基5摩尔当量的三苯基膦。将溶液在室温下在氩气下搅拌48h。在真空中除去溶剂，将残留物重悬浮在水中，过滤出沉淀物并丢弃。然后将水性溶液在蒸馏水中进行超滤。
实施例2e：
使用连接物前体衍生物N-(2,3-环氧丙基)邻苯二甲酰亚胺（LP2），作为“一步”程序合成带有连接物的硫酸化聚甘油的程序：反应在装备有机械搅拌器的反应器中进行。将整个装置在真空下干燥，并用无水氩气冲洗。将干燥程序重复4次。将所用的来自于Acros的缩水甘油（纯度>96%）在CaH2上搅拌过夜，并在45℃和1mbar下蒸馏。级份1（所用缩水甘油量的5%）由/三聚体构成。级份2是所需的纯缩水甘油。将蒸馏过的缩水甘油保留在冰箱中，只在干燥条件下才打开。向反应器加入TMP（2,68g，20mmol），并在真空中在60℃下熔化。在氩气气氛下加入KOtBu（1M，在THF中，6mL），并通过添加NMP来溶解沉淀物。将混合物加热至120℃并搅拌2h以除去叔丁醇。将缩水甘油（100g，1.35mol）溶解在225mL无水THF中（比率1:2.5），并使用计量泵经18小时添加。通过加热将N-(2,3-环氧丙基)邻苯二甲酰亚胺（27,4g，135mmol）溶解在55mL无水THF中，使用注射器经70分钟加入并搅拌过夜。将混合物冷却至90℃，并用200mL无水DMF稀释。加入作为固体的吡啶-SO3复合物（215g，1.35mol），并进一步加入50mL无水DMF。在搅拌24h后，在分液瓶中向反应混合物加入350mL水，并将混合物用2M NaOH中和至pH约9-10。在蒸发至干后，将结晶固体在二乙醚上搅拌以除去NMP。通过超滤（水，再生纤维素膜；MWCO 1000）实现纯化。在高真空中蒸发并干燥后，获得作为浅黄色无定形固体的产物。
对于实施例化合物P28来说，在加入吡啶-SO3复合物之前去除探针的GPC分析（洗脱液：水，标准品：普鲁兰多糖）得到Mn为5,500g/mol，多分散性指数为1.4。MALDI-TOF可以测定具有平均4-5个邻苯二甲酰亚胺基连接物的样本。硫酸化产生88%的硫酸化度。通过在25mL水中将10g（约13,000g/mol）硫酸化中间体用硼氢化钠（1.5g）在室温下处理5h，实现去保护。向该混合物加入乙酸（5mL），然后在80℃搅拌3h。通过超滤（饱和NaCl，然后蒸馏水，再生纤维素膜；MWCO 2000）实现纯化，产生8g作为白色无定形固体的硫酸化氨基聚甘油。
实施例3：硫酸化聚甘油与属于花青染料类型的诊断效应分子（E）的结合物的合成
实施例3a：
通过异硫氰酸酯花青染料（E3）与氨基改性的硫酸化聚甘油P14的反应来产生花青染料结合物：按照实施例2d将200mg P14用肼去保护，在透析后产生160mg材料。将这160mg聚合物P14溶解在1mL乙酸钠缓冲液（100mM）中，并用异硫氰酸酯花青染料E3（3eq.）在40℃下处理24h。通过在水中超滤（再生纤维素，MWCO 3000）分离未反应的染料以纯化产物，然后进行冷冻干燥。产物：140mg绿色无定形固体（参见图5）。
实施例3b：
通过炔丙基花青染料（E2）与叠氮基改性的硫酸化聚甘油P26的反应来产生花青染料结合物：将聚合物P26（30mg）和染料E2（5.5mg）溶解在0.6mL磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4）与0.2mL甲醇的混合物中。向该混合物加入0.1mL五水CuSO4溶液（12mg/mL，在PBS中）和0.1mL抗坏血酸钠（3.8mg/mL，在PBS中）。将溶液在剧烈振摇下、在光保护下在40℃温育5天。通过在蒸馏水中超滤（再生纤维素，MWCO 4000-6000），然后通过孔径排阻层析（Sephadex G-50）实现纯化。冷冻干燥产生绿色固体（19mg）（参见图5）。
实施例3c：
通过炔丙基花青染料E5（Sisson等，Angew.Chem.Int.Ed.48:7540-7545,2009）与叠氮基改性的硫酸化聚甘油P17的反应来产生花青染料结合物：将聚合物P17（30mg）和染料E5（5mg）溶解在0.4mL磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4）与0.4mL乙醇的混合物中。向该混合物加入0.1mL五水CuSO4溶液（12mg/mL，在PBS中）和0.1mL抗坏血酸钠（3.8mg/mL，在PBS中）。将溶液在剧烈振摇下、在光保护下在40℃温育5天。通过在甲醇中超滤（再生纤维素，MWCO4000-6000）和制备型HPLC（RP18，水）的组合实现纯化，得到作为立即洗脱峰的产物。冷冻干燥产生18mg吲哚羰花青（ICC）结合物（紫红色冷冻干燥物）（参见图5）。
实施例3b和3c的反应程序可进一步用于制备基于聚合物/染料组合例如P17/E1、P17/E2、P26/E1、P26/E5、P27/E1、P27/E2、P27/E5的结合物。
实施例3d：
通过花青染料-NHS-酯E7与氨基改性的硫酸化聚甘油P28的反应来产生花青染料结合物：将200mg P28溶解在9:1的DMF/水混合物（2mL）中。向该混合物加入86mg NHS-酯染料E7（4mol-eq.），然后在室温下搅拌48h。在蒸发至干后，如实施例3c中所述实现固体残留物的纯化。冷冻干燥产生185mg吲哚二羰花青结合物（蓝色冷冻干燥物）。
实施例3d的反应程序可进一步用于制备P28与染料E8以及诊断和治疗性效应分子的其他NHS酯的结合物（也参见实施例4b）。
实施例3e：
在实施例3a-d中使用的花青染料的合成：用Lee等J.Org.Chem.73:723（2008）的改进方法合成炔丙基花青染料（E1），所述文献描述了使用苯基硼酸前体，通过Suzuki反应对IR-820进行衍生化。在本发明中，将IR-820与4-羧基乙基苯基硼酸反应，得到相应的Suzuki偶联产物。使用已知的酰胺形成程序，用炔丙基胺和HBTU实现向E1的转化。根据该程序，获得了芳香环被硫酸盐基团较高取代的新的IR-820类似物，然后进行Suzuki偶联并用炔丙基胺进行酰胺化（参见表1中的E2-E4）。
为此，按照已出版的方法制备了l-(4-磺酰基丁基)-2,3,3-三甲基苯并吲哚-5,7-二磺酸二钠盐和l-(4-磺酰基丁基)-2,3,3-三甲基苯并吲哚-6-磺酸钠盐，然后使用N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺单盐酸盐转变成IR-820类似物（Salon等，J.Heterocycl.Chem.42:959（2005）））。
实施例3f：
花青染料E1与硫酸化甘油树枝状聚合物的结合物的合成：所述合成产生了染料与包含16个硫酸盐基团的规定树枝状聚合物的结合物。按照实施3b中所述将E1与[G3.0]-叠氮化物（Wyszogrodzka等，Chemistry 14:9292（2008）中的化合物14）进行反应。按照Wyszogrodzka等所述实现缩醛的去保护，然后按照实施例2d进行硫酸化。HPLC分析得到结合物的收率为25%。
实施例4：合成硫酸化聚甘油与螯合物/络合剂类型的诊断效应分子（E）的结合物用于放射性标记
实施例4a：
通过炔丙基-DOTA（E13）与叠氮基改性的硫酸化聚甘油P17的反应产生聚甘油螯合剂结合物：将聚合物P17（30mg）和炔丙基-DOTAE13（3mg）溶解在0.4mL磷酸缓冲盐水（PBS；pH7.4）与0.4mL乙醇的混合物中。向该混合物加入0.1mL五水CuSO4溶液（12mg/mL，在PBS中）和0.1mL抗坏血酸钠（3.8mg/mL，在PBS中）。将溶液在剧烈振摇下、在光保护下在40℃温育5天。通过在水中超滤（再生纤维素；MWCO 4000-6000）实现纯化，产生20mg作为白色固体的结合物（图6）。
实施例4b：
通过炔丙基-DO3A（E14）与叠氮基改性的聚甘油硫酸盐P17的反应产生聚甘油螯合剂结合物：如实施例4a所述进行反应。
此外，可以按照实施例3d中的程序，通过将氨基改性的硫酸化聚甘油与DOTA-NHS酯进行反应，例如使用P28和E12，来获得DOTA螯合剂结合物。
实施例5：合成硫酸化聚甘油与属于Gd3+络合物类型的诊断性效应分子（E）的结合物用于核磁共振成像（MRI）
实施例5a：
通过炔丙基-Gd3+-DO3A衍生物（E16）与叠氮基改性的聚甘油硫酸盐P27的反应产生聚甘油与钆络合物的结合物。需要更高数量的叠氮基（15%）来产生高的效应子/聚合物比率。将聚合物P27（50mg）与络合物E16（36mg）溶解在0.8mL磷酸缓冲盐水（PBS；pH8.5）与0.4mL甲醇的混合物中。向该混合物加入0.2mL五水CuSO4溶液（12mg/mL，在PBS中）和0.2mL抗环血酸钠（3.8mg/mL，在PBS中）。将溶液在剧烈振摇下在25℃保持3天。通过在水中超滤（再生纤维素，MWCO 4000-6000）实现纯化，得到52mg作为白色固体的结合物。通过ICP-MS进行的金属分析得出钆含量为每摩尔聚合物5摩尔钆络合物（图6）。
实施例6：合成硫酸化聚甘油与属于光敏化剂、细胞抑制剂或siRNA类型的治疗性效应分子（E）的结合物
实施例6a：
通过马来酰亚胺基光敏化剂（E20）与巯基改性的硫酸化聚甘油的反应产生光敏化剂结合物：使用聚合物P16来获得硫酸化聚甘油的巯基改性。将50mg聚合物P16在1mL水/三氟乙酸中搅拌2h，然后用乙醇沉淀，随后在高真空中干燥。将该材料溶解在0.5mL 10mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，并用10摩尔当量的2-亚氨基硫烷在室温下处理1h。向该混合物加入0.67mL（10摩尔当量）马来酰亚胺基-焦脱镁叶绿酸（E16）在DMF中的溶液（浓度20mg/mL）。将反应混合物在45℃剧烈振摇24h。通过蒸发混合物，将残留物用二氯甲烷清洗/离心几次来分离产物。最后的纯化通过制备型HPLC（RP18，水/甲醇）来实现，得到20mg结合物（图7）。
实施例6b：
通过苯丁酸氮芥-N-羟基琥珀酰亚胺基酯（E25）与氨基改性的硫酸化聚甘油的反应产生苯丁酸氮芥结合物：按照实施例2e将200mgP14用硼氢化钠/乙酸去保护，在透析后得到160mg材料。将这160mg聚合物P14溶解在DMF与50mM磷酸缓冲液（pH8.0）的1mL混合物（9:1）中。向该混合物加入E25（15eq.），然后在40℃下剧烈搅拌24h。通过蒸发混合物，将残留物用二氯甲烷清洗/离心几次来分离产物。1H-NMR中的芳香族化合物信号揭示出每个聚合物平均结合约1.8个苯丁酸氮芥分子（图7）。
同样地，与紫杉醇琥珀酸NHS酯（E28）的反应得到每个聚合物平均1.2个紫杉醇分子。
实施例6c：
通过马来酰亚胺基紫杉醇（E26）与巯基改性的硫酸化聚甘油的反应来产生紫杉醇结合物：按照实施例6a中所述使用2-亚氨基硫烷获得聚甘油硫酸盐的巯基改性。向巯基改性的硫酸化聚甘油的溶液（50mg/mL）加入10摩尔当量的马来酰亚胺基紫杉醇（E20；在DMF中的10mg/mL溶液）。将反应混合物在25℃下剧烈搅拌24h。通过蒸发混合物，将残留物用二氯甲烷清洗/离心几次来分离产物。1H-NMR中的芳香族化合物信号揭示出每个聚合物平均结合约2个紫杉醇分子（图7）。
同样地，与苯丁酸氮芥马来酰亚胺（E22或E23）的反应得到每个聚合物平均2.2个苯丁酸氮芥分子。
此外，可以按照实施例3d中的程序，使用P28和E28，通过氨基改性的硫酸化聚甘油与紫杉醇-NHS酯的反应来获得紫杉醇结合物，得到每个聚合物平均1个紫杉醇分子的结合物。
实施例6d：
通过马来酰亚胺基连接物衍生物（E31）与巯基改性的硫酸化聚甘油的反应来产生与二胺铂（II）复合物（卡铂类似物）的结合物：如实施例6a中所述使用2-亚氨基硫烷来实现聚甘油硫酸盐的巯基改性。卡铂马来酰亚胺（E31）按照Warnecke等，Bioconjugate Chem.2004,15（6）,1348-1359来合成。向巯基改性的硫酸化聚甘油溶液（50mg/mL）加入15摩尔当量的E31（在乙醇中的20mg/mL溶液），将反应混合物在25℃下剧烈振摇24h。通过蒸发混合物，将残留物用二氯甲烷和正丁醇清洗/离心几次来分离产物。通过ICP-MS来确定铂含量（金属与聚合物比率为2:1）。
实施例6e：
硫酸化聚甘油与siRNA的结合物的合成
VEGF siRNA按照J.Contr.Release 2006,116,123-129来获得。
正义链：5'-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3'
反义链：5'-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3'-己基aminom（E32）
使用给出2-吡啶基二硫化物基团的SPDP来实现活化（J.Contr.Release 2006,116,123-129），产生用于与巯基改性的硫酸化聚甘油反应的效应子E33，允许通过巯基交换反应进行共价结合。使用聚合物P16，按照实施例6a，获得了氨基改性的硫酸化聚甘油的巯基改性。将10mg聚合物P16在100μL水/三氟乙酸中搅拌2h，然后用乙醇沉淀，然后在高真空下干燥。将该材料溶解在200μL 10mM HEPES缓冲液（pH 8.0）中，并用5摩尔当量的2-亚氨基硫烷在室温下处理1h。向该溶液加入VEGF siRNA（1.2摩尔当量），并将混合物在室温下40℃下温育温育2h。使用HEPES缓冲液（pH8.0）将该混合物通过NAP10柱，然后直接用于细胞培养实验中（图7）。
实施例7：人类肺肿瘤A549细胞与不同分子量的荧光聚甘油的温育和体外荧光成像
将人类上皮肺癌细胞系如下常规繁殖：DEMEM培养基，添加有10%胎牛血清、2%谷氨酰胺和青霉素/链霉素（都来自于PAN Biotech）。将细胞以1x105个细胞/ml接种到培养基中，在37℃和5%CO2下进行培养，并且每周以1:5分拆两次。对于体外荧光成像来说，将细胞以2x105个细胞/ml接种在盖玻片上的24孔培养板（Sigma）上，并在37℃培养24小时。然后，将细胞用含有结合有吲哚羰花青（ICC）炔丙基酯（化合物E5）的具有不同分子量的10-6M聚甘油或作为对照的10-6M ICC-三甘油结合物（Angew Chem Int Ed Engl.48:7540,2009）的培养基，在37℃培养1小时。然后将细胞用冷丙酮固定。使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Abeam）作为核复染剂。图像获取使用LeicaDMRB显微镜（Leica）来执行。使用数字相机（Spot 32，DiagnosticInstruments）获取图像。
具有较低分子量（最高20kDa）的聚甘油或ICC-三甘油结合物没有被细胞摄入。明确证实了具有高分子量（120或208kDa）的聚甘油在细胞内的集中。结果显示在图8中。
实施例8：人类肺肿瘤A549细胞与荧光聚阴离子大分子的温育和体外荧光成像
如实施例7中所述，将人类上皮肺癌细胞系进行常规繁殖并在24孔培养板中处理。将细胞用含有10-6M肝素-ICC结合物或硫酸化聚甘油-ICC结合物（实施例3c）或作为对照的10-6M ICC-三甘油结合物（Angew Chem Int Ed Engl.48:7540,2009）的培养基，在37℃培养4小时。然后将细胞用冷丙酮固定。使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Abeam）作为核复染剂。图像获取使用Leica DMRB显微镜（Leica）来执行。使用数字相机（Spot 32，Diagnostic Instruments）获取图像。肝素或甘油-ICC结合物没有被细胞摄入，而证实了硫酸化聚甘油-ICC在A549细胞的细胞质中。结果显示在图9中。
实施例9：与结合有ICC的硫酸化聚甘油温育的分离的人类外周血单核细胞的流式细胞术分析
通过在Ficoll-Hypaque上差速离心从人类血液的单核级份分离细胞，然后用含有10%胎牛血清的RPMI（PAN Biotech）清洗。将细胞以2x105个细胞/ml在24孔板中使用RPMI培养基或含有10-6M硫酸化聚甘油-ICC结合物（实施例3c）或作为对照的10-6M ICC-三甘油结合物（Angew Chem Int Ed Engl.48:7540,2009）的培养基培养4小时。然后将细胞用PBS清洗并用200μl/孔accutase（PAA）松脱，用PBS清洗两次。将细胞用500μl 3%多聚甲醛在4℃固定10min，用2ml PBS终止，并在4℃下以250g离心10min。除去上清液，将细胞重悬浮在含有0.5%牛血清白蛋白（Roth）的200μl PBS中。将固定的细胞保持在4℃下，直至在FACS Calibur分析仪器（Becton-Dickinson）中进行分析。单核细胞或淋巴细胞通过分析细胞的大小和颗粒度（正向/侧向散射）来鉴定，并对硫酸化聚甘油-ICC结合物的摄入进行定量。在单核细胞中检测到比在淋巴细胞中高约100倍的硫酸化聚甘油的量。结果显示在图10中。
实施例10：TGF-β-1释放的抑制
将CASKI细胞如下进行培养：DEMEM培养基，添加有10%胎牛血清（FCS）、2%谷氨酰胺和青霉素/链霉素（都来自于PAN Biotech）。将细胞以1x 105个细胞/ml接种在培养基中，在37℃和5%CO2下进行培养，并且每周以1:5分拆两次。将具有不同硫酸化度（30%、70%、86%或92%硫酸化）或不同分子量的聚甘油核心（2600或7500Da）的硫酸化聚甘油，以10-8M的浓度施加于CASKI细胞48小时。以仅使用培养基进行的培养作为对照。离心抽取培养上清液，并将其储存在-20℃。使用可商购的ELISA试剂盒（eBioscience Inc）检测培养上清液中TGF-β-1的含量。结果显示在图11中。
实施例11：使用SPR技术检测硫酸化聚甘油的NF-κB结合
实验在BIACORE X仪器（Biacore AB,Uppsala，瑞典）上在25℃下进行。配体固定化包括使用HBS-EP缓冲液（Biacore AB），其由pH 7.4的10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005%表面活性剂P20构成。在测定期间使用HBS-EP缓冲液以及运行缓冲液。κBDNA序列基序的生物素化单链（粗体）（5'-生物素-AGTTGA
Figure BDA00001971575200631
CAGGC-3'（正向）和5'-生物素-GCCTG
Figure BDA00001971575200641
CTCAACT-3'（反向）购自metabioninternational AG（Martinsried，德国）。将30μl这两种单链溶液（浓度各为100μM）混合，在80℃加热5min，并缓慢冷却至室温以便能够完美杂交。随后向样品加入60μl HBS-EP缓冲液，并将生物素化的探针固定化在链亲合素功能化的传感芯片SA（Biacore AB）上。出于参比的目的，将同一芯片的第二道保持空出。为了获得更好的性能，在开始固定化之前，通过三次连续的1min注射含1M NaCl的50mMNaOH，对传感器芯片进行初始调制。将芯片用κB DNA序列基序装载至基线偏移为1300共振单位（RU）。在固定化程序后用运行缓冲液清洗几次以平衡芯片表面。重组NF-κB p50蛋白购自Active Motif（Carlsbad,CA,USA）。NF-κB蛋白的最终工作浓度约为28.6nM（摩尔浓度是基于NF-κB单体的分子量；50,000Da）。在载样之前，将每种样品与相应的硫酸化聚甘油化合物（参见表5）在室温下温育18min，最终抑制剂浓度为0nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或100μM。将样品以20μl/min的流速注射到参比和配体（κB DNA寡核苷酸）道上。每个测量循环由105s的样品注射时期（结合阶段）、180s的不受扰乱的解离阶段和使用1M NaCl的流动系统清洗构成。对于数据评估来说，从配体（κB DNA序列）道的数据中减去参比道的数据。在设置在注射开始时（0秒）和解离阶段结束时（285秒）的报告点之间提取样品注射的响应。将最终的响应值用于曲线生成。每个数据点表示两个测量值的平均值（±SEM）。结合曲线显示在图12中。IC50值列于表5中。结合亲和性随着硫酸化度和分子量的增加而增加，显示为IC50值的减小。连接物和效应分子不妨碍结合亲和性。在树枝状聚合物上仅有16个硫酸盐数量的硫酸盐装配没有显示出足够的结合亲和性（G3.0-树枝状聚合物/E1）.
表5：硫酸化聚甘油、带有连接物的硫酸化聚甘油和带有效应分子的结合物（实施例1、2、3）的IC50值：
实施例12：在体外抑制肺肿瘤细胞生长
为了测试硫酸化聚甘油对肺肿瘤细胞的细胞生长的潜在影响，使用了人类A549细胞系。将A549细胞系如下进行常规繁殖：DEMEM培养基，添加有10%胎牛血清（FCS）、2%谷氨酰胺和青霉素/链霉素（都来自于PAN Biotech）。将细胞以1x 105个细胞/ml接种在培养基中，在37℃和5%CO2下进行培养，并且每周以1:5分拆两次。
细胞增殖的分析使用在24孔板中培养的细胞来执行。将2x105个细胞/ml在含有浓度渐增的测试物质的1ml培养基中温育。培养2天后，在细胞计数器和分析仪系统（
Figure BDA00001971575200652
Figure BDA00001971575200653
Systems）中分析细胞数量、生存力和作为凋亡过程的一个参数的细胞直径。此外，使用MTT测定法（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑的细胞还原）作为细胞代谢活性的测试法在体外评估药物的影响。简单来说，将1x104个细胞/孔在96孔板中的100μl含有浓度渐增的测试物质的培养基中铺板。在培养2天后，向每个孔加入10μl MTT（5mg/ml，在PBS中，从Sigma获得），并将板温育4h。将得到的甲臜产物用酸性异丙醇溶解，并在微孔板分光光度计（Anthos htII,Microsystems）上读取570nm波长处的吸光度（Ex570）。
将硫酸化聚甘油（化合物P3）以10-5M至10-9M的浓度施用于A549细胞48小时。使用仅含培养基的培养物作为对照。
结果显示在图13中。
实施例13：在肿瘤小鼠模型中的体内效能
为了测试硫酸化聚甘油是否在体内有效抑制肿瘤生长，使用了沿用已久的肺癌的裸小鼠模型。将人类非小细胞肺癌细胞A549（0.7x107个细胞/小鼠）皮下注射到无胸腺雄性NMPI nu/nu小鼠（TaconicEurope）的胁部。在细胞移植后第12-16、19-23和26-30天，用100μlPBS或在100μl PBS中的30mg/kg体重的硫酸化聚甘油（化合物P3）进行每日皮下治疗。在细胞移植后第12至44天之间的10个时间点测定肿瘤体积。肿瘤尺寸使用卡尺来测量，并按照下式估算体积：体积（cm3）_1/2（L_W2），其中L和W是被移植肿瘤的长度（cm）和宽度（cm）。结果显示在图14中。此外，在小鼠治疗的整个时间内，没有鉴定到由药物治疗造成的毒性和不良事件的迹象。
实施例14：在胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎模型中的效能
为了测试硫酸化聚甘油是否有效抑制类风湿性关节炎，在大鼠中诱导了实验性胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎（CIA）。通过用牛II型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂的乳液（DIFCO Laboratories）免疫接种雌性Lewis大鼠来诱导CIA。两周后通过爪体积的增加来评估爪的炎症。每日监测大鼠的疾病临床征兆，并为疾病指派0至3的评分值。对于体内治疗来说，在免疫接种后第14天至第16天，将200μl PBS中的30mg/kg体重的硫酸化聚甘油（化合物P3）每日通过皮下注射给药到对照和CIA大鼠。在膝关节石蜡切片中的组织学变化的基础上，评估骨和软骨的病变以及炎性浸润。将肥大细胞用0.5N HCL（Roth）中的甲苯胺蓝（Sigma）染色过夜，并在滑膜中计数。结果显示在图15中。此外，在小鼠治疗的整个时间内，没有鉴定到毒性和不良事件的迹象。
实施例15：在实验性EAE模型中的效能
为了测试硫酸化聚甘油是否有效抑制实验性多发性硬化症，在小鼠中诱导了实验性自身免疫性脑炎（EAE）。通过用100μl PBS和100μl CFA中的100μgPLP对小鼠进行皮下免疫接种，在8至12周龄的雌性SJL小鼠中诱导EAE。CFA通过将不完全弗氏佐剂（DIFCOLaboratories）与8mg/ml结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37RA（干燥的；DIFCO Laboratories）进行混合来制备。在免疫接种时和2天后，用100μl PBS中的200ng百日咳毒素（List BiologicalLaboratories）对小鼠进行静脉内注射。每日监测小鼠的疾病临床征兆，并根据EAE的严重性如下所述为疾病指派从0至5的评分值：0，无疾病；1，尾不举；2，后肢无力；3，后肢瘫痪；4，后肢和前肢瘫痪；5，发病和死亡。
对于体内治疗来说，从第2天直到第20天每天通过皮下注射向PLP免疫接种的小鼠给药硫酸化聚甘油（化合物P3）。每日监测小鼠的疾病临床征兆。表6证实了30mg/kg的每日皮下剂量中的硫酸化聚甘油的治疗效果。尽管对照动物在免疫接种后第10天和第20天分别表现出3.1和2.3的临床评分值，但每日给药30mg/kg体重的硫酸化聚甘油将该临床评分值分别降低至1.7和1.1。此外，在小鼠治疗的整个时间内，没有鉴定到由药物治疗造成的毒性和不良事件的迹象。
表6：在EAE小鼠模型中硫酸化聚甘油（P3）对临床评分值的影响
  第10天的临床评分值   第20天的临床评分值
  对照组   3.1   2.3
  治疗组   1.7   1.1
实施例16：在实验性亚急性败血症模型中的效能
将硫酸化聚甘油在雌性NMRI小鼠的亚急性败血症模型中进行测试。通过单次腹膜内注射单剂0.2mg/kg LPS来诱导败血症。阴性对照接受单次盐水注射。在施用LPS（Sigma Aldrich）之前30分钟，通过皮下注射施用单剂15mg/kg的硫酸化聚甘油（化合物P3）。测量补体蛋白C5a（Alpco Diagnostics）的血清水平作为非致死性败血症的指标。测量在施用LPS后2小时或6小时执行。与阴性对照相比，LPS诱导了对血清C5a的刺激，达245%。单剂15mg/kg的硫酸化聚甘油诱导了对LPS介导的刺激的强烈抑制，达阴性对照水平的105%。在施用LPS后6小时，抑制也是明显的。
表7：在小鼠中硫酸化聚甘油对LPS诱导的败血症诱发的影响
Figure BDA00001971575200681
实施例17：通过体内荧光成像研究硫酸化聚甘油在类风湿性关节炎实验模型中的摄入
将效应子结合物P26/E2（实施例3b）溶解在0.9%NaCl中（浓度：1mg/ml），并注射到具有胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎的大鼠的尾静脉中（如实施例14中所述的动物模型；剂量：2mg/kg）。按照J.Biomed.Optics 10,41205（2005）使用由激光单元（激发波长760nm）和带有长通滤光片（观察>780nm）的CCD相机构成的平面荧光成像装置。在注射后10min、30min、1h、6h和24h获取麻醉大鼠的荧光图像。结果显示在图16中，其显示了快速和大量的摄入，并且患关节炎的关节中的荧光对比（10min）持续直至24h（数据未显示），而健康的关节没有显示出增强的荧光。箭头指示疾病进程逐渐增加（疾病评分值1、2和3）的患关节炎的关节，其中荧光对比随着评分值而增加，因此证明了结合物监测疾病活性的能力。
实施例18：通过体内PET成像研究硫酸化聚甘油结合物与DOTA结合物在皮炎实验模型（小鼠）中的摄入
通过在腹部皮肤上局部施用450μgTNCB，使C57B1/6小鼠（雌性，8周）对TNCB致敏。在5天后，通过在右耳上局部施用45μgTNCB对小鼠进行激惹。按照文献中发表的方法（产生Cu-64的CuCl2溶液形式（generation of Cu-64in the form of CuCl2solution）：Appl.Radiat Isot.2007,65,1115），将实施例4a的效应子结合物P17/E13用Cu-64标记。使用0.1mg结合物，在乙酸缓冲液（pH 5）中在37℃下进行1h（100MBq）标记。放射化学纯度通过HPLC和放射TLC测定。放射化学收率为90%。在SEC纯化后，获得Cu-64标记的HSPG DOTA结合物在pH 7.4的磷酸缓冲液中的溶液。将100μCi注射到小鼠的尾静脉中。使用临床PET扫描仪重复获取高分辨率10min PET图像。在Cu-64标记的HSPG DOTA结合物注射后30分钟时获取麻醉小鼠的图像。结果显示在图17中，其显示了在箭头所指示的炎症区域（小鼠耳朵处的发炎组织）中快速和大量的摄入。
实施例19：通过与硫酸化聚甘油结合的细胞抑制剂效应子增加细胞抑制药物对肿瘤细胞的细胞毒性效应
为了测试与硫酸化聚甘油的结合对细胞抑制剂药物的细胞毒性效应的潜在影响，使用了A549细胞系。将A549细胞系如下进行常规繁殖：DEMEM培养基，添加有10%胎牛血清（FCS）、2%谷氨酰胺和青霉素/链霉素（都来自于PAN Biotech）。将细胞以1x 105个细胞/ml接种在培养基中，在37℃和5%CO2下进行培养，并且每周以1:5分拆两次。
细胞增殖的分析使用在24孔板中培养的细胞来执行。将2x 105个细胞/ml在含有浓度渐增的测试物质的1ml培养基中温育。培养24小时后，去除带有测试物质的培养基并用正常培养基替代。在继续培养24小时后，在细胞计数器和分析仪系统（Scharfe Systems）中分析细胞数量、生存力和作为凋亡过程的一个参数的细胞直径。此外，使用MTT测定法（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑的细胞还原）作为细胞代谢活性的测试法在体外评估药物的影响。简单来说，将1x 104个细胞/孔在96孔板中的100μl含有浓度渐增的测试物质（实施例6b的紫杉醇结合物）的培养基中铺板。在培养2天后，向每个孔加入10μl MTT（5mg/ml，在PBS中，从Sigma获得），并将板温育4h。将得到的甲臜产物用酸性异丙醇溶解，并在微孔板分光光度计（Anthos htII,Microsystems）上读取570nm波长处的吸光度（Ex570）。将紫杉醇（泰素）以10-7M的浓度施用于A549细胞，待测物质的浓度为10-7M至10-10M。使用仅含培养基的培养物作为对照。
结果显示在图18中，其显示了在10-7M的可比浓度下优越的效能以及在低100倍的浓度下的细胞毒性效应。
实施例20：通过与效应子VEGF-siRNA结合的硫酸化聚甘油抑制VEGF的表达
肺癌细胞系A549按照实施例11中所述进行生长。为了收集用于VEGF检测的上清液，将细胞以1x106个细胞/ml接种在24孔培养板中24小时。然后，使用VEGF-siRNA或与硫酸化聚甘油结合的VEGF-siRNA（结合物P16/E33，实施例6e）与细胞进行温育，不添加其他转染试剂。转染后4小时，将培养基用含有10%FCS的新鲜培养基替换。继续培养48h后，收集培养上清液用于ELISA。上清液中VEGF的含量使用可商购的ELISA试剂盒（Quantikine,R&D Systems）检测。结果显示在图19中，其显示了在与测试物质温育后在A549肺癌细胞系中的VEGF生产。在48h条件细胞培养基中通过ELISA测量VEGF蛋白。每个柱是来自三个独立实验的三个测定值的平均值±SEM。
实施例21：测试硫酸化聚甘油在缓冲液中的溶液聚集
以0.1μM的浓度制备了与花青染料结合的硫酸化聚甘油（化合物P17/E1）在0.9%NaCl（盐水）中的溶液。在室温下在暗处储存不同时间（0、1、2.5、3、4、24h）后，测定溶液的荧光强度（激发760nm，检测>780nm）。结果显示在图21中，其显示了由于在溶液中的聚集，荧光的稳定降低。在蒸馏水或甲醇中没有观察到这样的衰减。在蒸馏水中透析，添加海藻糖（每mg硫酸化聚甘油10mg）并冷冻干燥，产生固体物质。重悬浮在蒸馏水中产生初始水平的荧光信号。

Claims (24)

1.药物组合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的的治疗性或诊断性效应分子。
2.权利要求1的药物组合物，其为式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，P是多元醇大分子，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，和m是1-100的数目。
3.权利要求1或2的药物组合物，其通过所述硫酸化聚甘油和治疗性或诊断性效应分子细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病。
4.结合物，其包含硫酸化聚甘油和与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子。
5.权利要求4的结合物，其为式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，P是多元醇大分子，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，和m是1-100的数目。
6.权利要求4或5的结合物，其为式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，且n是大于10的数目。
7.权利要求4至6的结合物，其中所述效应分子占所述结合物的小于50重量%，并且所述结合物在水中的溶解度在100mg/mL以上。
8.权利要求4至7的结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子以通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗疾病。
9.权利要求4至8的结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子以治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
10.权利要求4至9的结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子以按照权利要求3或4来治疗疾病，其中以每次给药1mg/kg至1000mg/kg的剂量进行多次治疗。
11.权利要求4至10的结合物，其包含：
a）聚合的聚甘油P，其由在多官能起始分子上的式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有1至1,000个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，核心具有0至67%的支化度、500至1,000,000g/mol的平均分子量，
b）所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-OSO3 -M+取代，其中-OSO3H或-OSO3 -M+基团的优选数目大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，
c）由此产生的硫酸化聚甘油的平均分子量为1,000至5,000,000g/mol，
d）带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，官能团能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合，其中X是硫酸化度，
e）诊断性和/或治疗性效应分子，其共价连接于一个直至最大可能数量的所述官能团，诊断性效应分子选自荧光染料或用于放射活性或顺磁性金属的螯合剂，并且治疗性效应分子选自细胞抑制剂、抗血管生成药物、光敏化剂、siRNA。
12.权利要求5至11的结合物，其为式P(OSO3 -M+)n(L-G-E)m，其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3 -、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C。
13.一种通式P(OSO3 -M+)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3 -M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链C1-20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH、C(O)、SO2、SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-OH、-OSO3H、-OSO3 -、-NH2、-N3、-COOH、-SH、-SO3 -、-C≡C。
14.权利要求13的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
15.权利要求13的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病，其中以每次给药1mg/kg至1000mg/kg的剂量进行多次治疗。
16.权利要求4、5和6的硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途。
17.权利要求13和14的硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途。
18.权利要求16和17的硫酸化聚甘油的用途，其中所述治疗性或诊断性效应分子与所述硫酸化聚甘油共价连接。
19.权利要求4的硫酸化聚甘油的无水制剂。
20.权利要求13的硫酸化聚甘油的无水制剂。
21.权利要求19和20的无水制剂，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κB和/或AP-1和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病。
22.权利要求19和20的无水制剂，其用于治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
23.权利要求19和20的无水制剂，其中以每次给药1mg/kg至1000mg/kg的剂量进行多次治疗。
24.权利要求19和20的无水制剂，其包含含有缓冲盐和/或选自蔗糖、甘露糖、海藻糖的至少一种低温防护剂的冷冻干燥物。
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