JP6924191B2 - 新規な高分子誘導体、及びそれらを用いた新規な高分子誘導体イメージングプローブ - Google Patents
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Description
EPR効果の違いに影響を受けないがん組織でも利用できるin vivoイメージングが可能なプローブが求められている。
[1]ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、側鎖にシグナル基及び任意の疎水性置換基を有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントとが連結したブロック共重合体であって、該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量が2kDa以上10kDa以下であり、シグナル基及び任意の疎水性置換基の質量含有率が5質量%以上で50質量%以下であるブロック共重合体。
[2]ポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ(アスパラギン酸−グルタミン酸)鎖である前記[1]に記載のブロック共重合体。
[3]疎水性置換基が側鎖カルボキシ基にエステル結合及び/又はアミド結合している前記[1]又は[2]に記載のブロック共重合体。
[4]シグナル基が蛍光基である、[1]乃至[3]の何れか一項に記載のブロック共重合体。
[5]ポリエチレングリコール鎖の平均分子量が1kDa以上で6kDa以下である前記[1]乃至[4]の何れか一項に記載のブロック共重合体。
[6]ブロック共重合体が、一般式(1)
[式中、R1は水素原子又は置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状または環状の炭素数(C1〜C6)アルキル基を示し、tは20〜140の整数を示し、Aは置換基を有していてもよい炭素数(C1〜C6)アルキレン基を示し、R2は水素原子、炭素数(C1〜C6)アシル基及び炭素数(C1〜C6)アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、R3はシグナル基を示し、R4は、疎水性置換基であり、nは1又は2を示し、x1、x2、y1、y2及びzは、それぞれ独立して0〜20の整数を示し、(x1+x2)は1〜10の整数を示し、(x1+x2+y1+y2+z)は3〜20の整数を示し、前記R3及びR4が結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。]で示される前記[1]乃至[5]の何れか一項に記載のブロック共重合体。
[7]粒子径が20nm未満である前記[1]乃至[6]の何れか一項に記載のブロック共重合体。
[8]前記[1]乃至[7]の何れか一項に記載のブロック共重合体を含む組成物から形成されるナノ粒子。
[9]粒子径が20nm未満である前記[8]に記載のナノ粒子。
[10]前記[1]乃至[7]の何れか一項に記載のブロック共重合体及び/又は前記[8]又は[9]に記載のナノ粒子を含むイメージングプローブ。
シグナル基を付与できるアミノ酸としては、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、スルフヒドリル基等の結合性官能基を側鎖に有するアミノ酸を用いることが好ましい。すなわち、これらの結合性官能基にシグナル基を化学結合により付与させることで、当該疎水性ポリマーセグメントを構築することになる。例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン等を挙げることができる。
本発明のナノ粒子の粒径(平均粒径)は1nm〜30nmである。好ましくは粒子径が20nm未満であって、1nm〜20nm未満である。
[式中、R1は水素原子又は置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状または環状の炭素数(C1〜C6)アルキル基を示し、tは20〜140の整数を示し、Aは置換基を有していてもよい炭素数(C1〜C6)アルキレン基を示し、R2は水素原子、炭素数(C1〜C6)アシル基及び炭素数(C1〜C6)アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、R3は前記シグナル基を示し、R4は前記疎水性置換基であり、nは1又は2を示し、x1、x2、y1、y2及びzは、それぞれ独立して0〜20の整数を示し、(x1+x2)は1〜10の整数を示し、(x1+x2+y1+y2+z)は3〜20の整数を示し、前記R3及びR4が結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。]
反応は、通常0〜180℃、好ましくは5〜100℃の温度で行えばよい。
合成例、及び実施例のブロック共重合体及びそれらを含む組成物の平均粒径の測定は、株式会社島津製作所製シングルナノ粒子径測定装置IG−1000(測定温度:25℃、t=0における光強度:100〜200)にて行った。平均粒径測定サンプルは、超純水を用い、ブロック共重合体濃度として1mg/mLもしくは2mg/mLとなるように調製し、0.45μmメンブレンフィルターで濾過した溶液を用いた。
実施例中、Nile red誘導体は2−(2−アミノエトキシ)−9−(ジエチルアミノ)−5H−ベンゾ[a]フェノキサジン−5−オンを指す。
片末端メトキシ基、片末端3−アミノプロピル基のポリエチレングリコール(SUNBRIGHT M89506、日油社製、平均分子量2kDa、14g)をDMSO(280mL)に溶解後、γ−ベンジル L−グルタミン酸−N−カルボキシ無水物(16.8g)を加え、30℃で22.5時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(5040mL)及びエタノール(560mL)混合液中に2.0時間かけて滴下し、室温にて4.0時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル(1800mL)及びエタノール(200mL)混合溶液を加え、撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物(31.9g)を得た。
得られた重合物(30.0g)をDMF(336mL)に溶解し、無水酢酸(6.0mL)を加えて20℃にて18時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(3024mL)及び酢酸エチル(336mL)混合液中に2.5時間かけて滴下し、室温にて6.0時間撹拌した。その後、上澄み除去し、ジイソプロピルエーテル(1800mL)及びエタノール(200mL)混合溶液を加え、1.5時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー(23.7g)を得た。
得られたアセチル化ポリマー(22.0g)をDMF(515mL)に溶解し、10%パラジウム−炭素(4.4g)を加えた。その後、反応雰囲気を水素置換し、30℃、1気圧下にて65時間加水素分解を行った。10%パラジウム−炭素触媒を濾別後(洗い込みに酢酸エチル200mL使用)、濾液をヘプタン(3000mL)及び酢酸エチル(1200mL)混合液中に1.5時間かけて滴下し、室温にて5.0晩撹拌した。その後、上澄み除去し、ヘプタン(1333mL)及び酢酸エチル(667mL)混合液を加え、0.5時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥した。この析出物(15.0g)を5%食塩水(1500mL)に溶解し、2.2N水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のpHを約11に調整後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー(HP−20)、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー(Dowex 50)を用いて精製した。溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することでポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体(合成例1 12.3g)を得た。
合成例1は、0.1N水酸化カリウムを用いた滴定法により、グルタミン酸のユニット数は7.9と算出した。これより、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量(2,000)、グルタミン酸7.9ユニット分子量(129.11×7.9=1020)、ポリアミノ酸末端のアセチル基(42)の合計より3,062≒3kDaと算出された。
片末端メトキシ基、片末端3−アミノプロピル基のポリエチレングリコール(SUNBRIGHT MEPA−12K、日油社製、平均分子量12kDa、75.0g)をDMSO(1430mL)に溶解後、γ−ベンジル L−アスパラギン酸−N−カルボキシ無水物(45.0g、29当量)を加えて32.0℃で一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(12L)及びエタノール(3L)混合液中に1時間かけて滴下し、室温にて1時間撹拌した。その後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物(106.0g)を得た。
得られた重合物(105.0g)をDMF(1050mL)に溶解し、無水酢酸(3.3mL)を加えて35℃にて3時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(2、9450mL)及びエタノール(1050mL)混合液中に1時間かけて滴下し、室温にて1時間撹拌した。その後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー(103.0g)を得た。
得られたアセチル化ポリマー(100.0g)をアセトニトリル(2L)に溶解後、0.2規定の水酸化ナトリウム(2L)を加えて、23℃にて3時間加水分解を行った。反応液に2規定の塩酸を加えて中和したのち、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去後、酢酸エチル(2L)を用い濃縮液を3回洗浄した。水層を減圧濃縮後、1規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のpHを11.0に調製し、食塩(100g)を添加後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥し、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体(合成例2 75.4g)を得た。
合成例2は、0.1N水酸化カリウムを用いた滴定法により、アスパラギン酸のユニット数は23.8と算出した。これより、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は、ポリエチレングリコール鎖の分子量(12,000)、アスパラギン酸23.8ユニット分子量(115.09×23.8=2739)、ポリアミノ酸末端のアセチル基(42)の合計より14,781≒15kDaと算出された。
片末端メトキシ基、片末端3−アミノプロピル基のポリエチレングリコール(SUNBRIGHT MEPA−20H、日油社製、平均分子量2kDa、20.0g)をDMSO(400mL)に溶解後、γ−ベンジル L−アスパラギン酸−N−カルボキシ無水物(29.8g、12当量)を加えて32.5℃で20時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(3、200mL)及びエタノール(800mL)混合液中に1時間かけて滴下し、室温にて3時間撹拌した。その後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥し、重合物(31.2g)を得た。
得られた重合物(30.0g)をDMF(300mL)に溶解し、無水酢酸(7.3mL)を加えて35℃にて3時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(2、700mL)及びエタノール(300mL)混合液中に1時間かけて滴下し、室温にて1時間撹拌した。その後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することによりアセチル化ポリマー(26.6g)を得た。
得られたアセチル化ポリマー(25.0g)をMeCN(500mL)に溶解後、0.2規定の水酸化ナトリウム(500mL)を加えて、23℃にて3時間加水分解を行った。反応液に2規定の塩酸を加えて中和したのち、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去後、酢酸エチル(500mL)を用い濃縮液を3回洗浄した。水層を減圧濃縮後、1規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のpHを11.0に調製し、食塩(50g)を添加後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥し、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体(合成例3 13.0g)を得た。
合成例3は、0.1N水酸化カリウムを用いた滴定法により、アスパラギン酸のユニット数は12.5と算出した。これより、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は3,481≒3kDaと算出された。
合成例1(1000mg)、Nile red誘導体(東京化成工業社製、46.9mg)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP 315mg)をDMF(21mL)に溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI 38μL)を加え、25℃にて5時間撹拌した。その後、4−フェニル−1−ブタノール(266μL)及び 794μLを加え15時間撹拌後、さらにDIPCI 397μLを加え、5.5時間撹拌した。反応液をMWCO1000の透析膜に移液し、外液を水として透析を行った。内液を凍結乾燥することで、生成物を得た。得られた生成物をアセトニトリル/水(50/50(v/v)、50mL)に溶解後、溶液をMWCO1000の透析膜に移液し、外液をアセトニトリル/水(50/50(v/v)として透析を行った。その後、外液をアセトニトリルとして透析を行った。透析終了後、内液がアセトニトリル/水(50/50(v/v)、)になるように水を加え、イオン交換樹脂(Dowex 50)を加えて室温にて0.5時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記の4−フェニル−1−ブタノール結合ブロック共重合体(実施例1 1012mg)を得た。
実施例1を1N−水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解処理を行い、遊離した4−フェニル−1−ブタノールを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて定量して4−フェニル−1−ブタノール含有量を求めた。その結果、実施例1における4−フェニル−1−ブタノール含有量は15.9質量%であった。Nile red誘導体結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のNile red誘導体の消費率から0.37分子であった。したがって、実施例1の総Nile red誘導体分子量は138≒0.1kDaと算出された。
これらの値より、実施例1の総分子量は4,169≒4kDaと算出された。また、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は3,062≒3kDaと算出された。
これより、実施例1におけるNile red誘導体の含有量は3.32質量%、4−フェニル−1−ブタノールの含有量は15.9質量%、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は48.0質量%である。
IG−1000により粒径測定したところ、平均粒径は18nm(2mg/mL)であった。
合成例3(205.6mg)及びカバジタキセル(CBZ 166.3mg)及びNile red誘導体(5.1mg)をNMP(5.7mL)に溶解し、n−ブチルアミン(36μL)、DMAP(45.0mg)、DIPCI(265μL)を加え、20℃にて17.5時間撹拌した。その後、DIPCI(66μL)を追加し、さらに4.5時間撹拌した。反応液に酢酸エチル(5.5mL)を加えた後、ジイソプロピルエーテル(440mL)中に10分間かけて滴下し、室温にて1時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することで生成物(300mg)を得た。得られた生成物をアセトニトリル/水(50/50(v/v)、20mL)に溶解後、イオン交換樹脂を加えて5℃にて30分間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記のタキサン類結合高分子誘導体(実施例2 270.9mg)を得た。
実施例2のCBZ結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のCBZの消費率から1.7分子であった。したがって、実施例2の総CBZ分子量は1,421≒1kDaと算出された。
実施例2のn−ブチルアミン結合量は、n−ブチルアミンの仕込量が全て反応したと仮定すると、6.2分子であった。したがって、実施例2の総n−ブチルアミン分子量は453≒0.4kDaと算出された。
実施例2のNile red誘導体結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のNile red誘導体の消費率から0.23分子であった。したがって、実施例2の総Nile red誘導体NR分子量は87≒0.1kDaと算出された。
これらの値より、実施例2の総分子量は5,846≒6kDaと算出された。また、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は3,481≒3kDaと算出された。
これより、実施例2におけるCBZの含有量は24.3質量%、n−ブチルアミンの含有量は7.8質量%、Nile red誘導体の含有量は1.5質量%、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は34.2質量%である。
IG−1000により粒径測定したところ、平均粒径は14nm(1mg/mL)であった。
ポリエチレングリコール(2kDa)−ポリグルタミン酸(8.3重合体)ブロック共重合体の7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン(EHC)及びAlexa Fluor(登録商標)594 cadaverin(Alexa)結合体の合成
合成例1と同様な方法で合成したポリエチレングリコール(2キロダルトン)−ポリグルタミン酸(8.3重合体)ブロック共重合体(40.0mg)、Alexa Fluor(登録商標)594 cadaverin(Alexa、Life Technologies社製、2.00mg)及び7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン(EHC、ScinoPharm Taiwan社製、20.0mg)をDMF(3.20mL)に溶解し、35℃にて20分間撹拌した。その後、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP 1.98mg)を加え、25℃にて45分間撹拌した後、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI 33.1μL)を加え、25℃にて21時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(43.2mL)、酢酸エチル(4.8mL)混合液中に滴下し、室温にて撹拌した後、上澄み液を38.0mL除去し、ジイソプロピルエーテル(21.6mL)、酢酸エチル(2.4mL)混合液を加えた。その後、室温にて撹拌した後、析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た(49.7mg)。得られた生成物をアセトニトリル/水(98.7/1.3(v/v)、1.5mL)に溶解後、イオン交換樹脂(Dowex 50)を加えて0℃にて30分間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記のポリエチレングリコール(2キロダルトン)−ポリグルタミン酸(8.3重合体)ブロック共重合体の7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン及びAlexa Fluor(登録商標)594 cadaverin結合体(実施例3 48.8mg)を得た。
実施例3のEHC結合量は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定した反応溶液中のEHCの消費率から3.9分子であった。したがって、実施例3の総EHC分子量は1,530≒2kDaと算出された。
実施例3のAlexa結合量は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定した反応溶液中のAlexaの消費率から0.19分子であった。したがって、実施例3のAlexa分子量は153≒0.2kDaと算出された。
これらの値より、実施例3の総分子量は4,690≒5kDaと算出された。また、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は3,114≒3kDaと算出された。
これより、実施例3におけるEHCの含有量は32.5質量%、Alexaの含有量は3.29質量%、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は42.6質量%である。
IG−1000により粒径測定したところ、平均粒径は10nm(1mg/mL)であった。
合成例1と同様な方法で合成したポリエチレングリコール(12kDa)−ポリグルタミン酸(22.0重合体)ブロック共重合体(676mg)、Nile red誘導体(東京化成工業社製、17.0mg)及びDMAP(122mg)をDMF(8.0mL)に溶解し、DIPCI(14μL)を加え、25℃にて1.5時間撹拌した。その後、4−フェニル−1−ブタノール(102mg)及びDIPCI(308μL)を加え25時間撹拌後、反応液をジイソプロピルエーテル(120mL)、エタノール(15mL)及び酢酸エチル(15mL)混合液中に滴下し、室温にて撹拌した後、析出物を濾取し、減圧化で乾燥することで生成物を得た(770mg)。得られた生成物をアセトニトリル/水(50/50(v/v)、20mL)に溶解後、イオン交換樹脂(Dowex 50)を加えて0℃にて2.0時間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記のポリエチレングリコール(12kDa)−ポリグルタミン酸(22.0重合体)ブロック共重合体の4−フェニル−1−ブタノール及びNile red誘導体結合体(比較例1 720mg)を得た。
比較例1の4−フェニル−1−ブタノール結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中の4−フェニル−1−ブタノールの消費率から15分子であった。したがって、比較例1の総4−フェニル−1−ブタノール分子量は2,224≒2kDaと算出された。
また、比較例1のNile red誘導体結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のNile red誘導体の消費率から1分子であった。したがって、比較例1の総Nile red誘導体分子量は376≒0.4kDaと算出された。
これらの値より、比較例1の総分子量は18,091≒18kDa、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は14,882≒15kDaと算出された。
これより、比較例1における4−フェニル−1−ブタノールの含有量は12質量%、Nile red誘導体の含有量は2.1質量%、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は67質量%である。
IG−1000により粒径測定したところ、平均粒径は36nm(2mg/mL)であった。
合成例2(200mg)及びカバジタキセル(CBZ 99.7mg)及びNile red誘導体(5.2mg)をN−メチルピロリドン(NMP 2.5mL)に溶解し、DMAP (4.4mg)、DIPCI(118μL)を加え、20℃にて21時間撹拌した。その後、DIPCI(29μL)を追加し、さらに5時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル(18mL)及びエタノール(4.5mL)混合液中に10分間かけて滴下し、室温にて1時間撹拌した後、析出物を濾取し、減圧下で乾燥することで生成物(235.0mg)を得た。得られた生成物をアセトニトリル/水(50/50(v/v)、10mL)に溶解後、イオン交換樹脂を加えて5℃にて30分間撹拌した。イオン交換樹脂を濾別後にアセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥することにより標記のタキサン類結合高分子誘導体(比較例2 205.6mg)を得た。
比較例2のCBZ結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のCBZの消費率から4.3分子であった。したがって、比較例C−2の総CBZ分子量は3,594≒4kDaと算出された。
比較例2のNile red誘導体結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のNile red誘導体の消費率から1.0分子であった。したがって、比較例2の総Nile red誘導体分子量は377≒0.4kDaと算出された。
これらの値より、比較例2の総分子量は20,988≒21kDaと算出された。また、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は14,781≒15kDaと算出された。
これより、比較例2におけるCBZの含有量は17.1質量%、Nile red誘導体の含有量は1.8質量%、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は57.2質量%である。
IG−1000により粒径測定したところ、平均粒径は29nm(1mg/mL)であった。
合成例3(205.7mg)及びNile red誘導体(5.1mg)をN−メチルピロリドン(NMP 5.7mL)に溶解し、DMAP(45.0mg)、DIPCI(265μL)を加え、20℃にて18.5時間撹拌した。その後、DIPCI(66μL)を追加し、さらに2.5時間撹拌した。反応液をMWCO10、000の透析膜に移し、水中で透析後、凍結乾燥することにより標記のタキサン類結合高分子誘導体(比較例3 247.7mg)を得た。
比較例3のNile red誘導体結合量は、HPLCにより測定した反応溶液中のNile red誘導体の消費率から0.3分子であった。したがって、比較例3の総Nile red誘導体分子量は113≒0.1kDaと算出された。
これらの値より、比較例3の総分子量は5,126≒5kDaと算出された。また、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量は3,481≒3kDaと算出された。
これより、比較例3におけるNile red誘導体の含有量は2.2質量%、ポリエチレングリコールセグメントの含有量は39.0質量%である。
比較例3は合成例3の蛍光標識体として後記の分布試験に用いた。
BALB/cヌードマウスの皮下移植で継代したヒト膵臓がんBxPC−3の腫瘍塊を約3mm角のブロックにし、套管針を用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。比較例1及び実施例1をそれぞれ5%ブドウ糖注射液で溶解し、Nile red誘導体換算量5mg/kgで、それぞれ静脈内に単回投与した。投与1時間後にマウスを、イソフルラン麻酔下で脱血し、取り出した腫瘍及び腎臓の凍結包埋切片を作製し、蛍光を観察した。結果を図1に示す。
また、それらの画像を元にImage−Pro Premier(Media Cybernetics)を用いて輝度を算出し、腫瘍内の輝度の値を図2に、腎臓内の輝度の値を図3に示した。
BALB/cヌードマウスの皮下移植で継代したヒト腎がんRCC−01−JCKの腫瘍塊を、約3mm角のブロックにし、套管針を用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。比較例1及び実施例1をそれぞれ5%ブドウ糖注射液で溶解し、Nile red誘導体換算量5mg/kgで、それぞれ静脈内に単回投与した。投与1時間後にマウスを、イソフルラン麻酔下で脱血し、取り出した腫瘍及び腎臓の凍結包埋切片を作製し、蛍光を観察した。結果を図4に示す。
また、それらの画像を元にImage−Pro Premier(Media Cybernetics)を用いて輝度を算出し、腫瘍内の輝度の値を図5に、腎臓内の輝度の値を図6に示した。
BALB/cヌードマウスの皮下移植で継代したヒトグリオーマU87MGの腫瘍塊を、約3mm角のブロックにし、套管針を用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。比較例1及び実施例1をそれぞれ5%ブドウ糖注射液で溶解し、Nile red誘導体換算量5mg/kgで、それぞれ静脈内に単回投与した。投与1時間後にマウスを、イソフルラン麻酔下で脱血し、取り出した腫瘍及び腎臓の凍結包埋切片を作製し、蛍光を観察した。結果を図7に示す。
また、それらの画像を元にImage−Pro Premier(Media Cybernetics)を用いて輝度を算出し、腫瘍内の輝度の値を図8に、腎臓内の輝度の値を図9に示した。
BALB/cヌードマウスの皮下移植で継代したヒト膵臓がんBxPC3の腫瘍塊を約3mm角のブロックにし、套管針を用いてヌードマウスの背側部皮下に移植した。実施例2、比較例2及び比較例3をそれぞれ5%ブドウ糖注射液で溶解し、Nile red誘導体換算量5mg/kgで、それぞれ静脈内に単回投与した。投与1時間後にマウスをイソフルラン麻酔下で脱血し、取り出した腫瘍及び腎臓の凍結包埋切片を作製し、蛍光を観察した。結果を図10に示す。
また、腎臓において、実施例2及び比較例3は尿細管に蛍光が観察された。一方で、比較例2は血管内以外では蛍光が認められなかった。このことから、実施例2は比較例2に比較して、速やかに腎排泄を受けることができる物性であることが示された。
ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せたを合せた主鎖ポリマーの平均分子量が3481≒3kDaであり、シグナル基の質量含有率が2.2%であり疎水性置換基の質量含有率が0%である比較例3のブロック共重合体は、速やかに腎排泄を受けるが腫瘍への集積性が低い結果であった。また、ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合わせた主鎖ポリマーの平均分子量が14781≒15kDaである比較例2のブロック共重合体は、腎排泄を受けないが腫瘍への集積性が実施例2より低い結果であった。
ポリエチレングリコール鎖とポリアミノ酸鎖とを合せたを合せた主鎖ポリマーの平均分子量が3481≒3kDaであり、シグナル基の質量含有率が1.5%であり疎水性置換基の質量含有率が32%である実施例2は速やかに腎排泄を受け、速やかに腫瘍集積性を示すことが明らかとなった。
Claims (4)
- ポリエチレングリコール鎖を含有する親水性ポリマーセグメントと、側鎖にシグナル基及び任意の疎水性置換基を有するポリアミノ酸鎖を含有する疎水性ポリマーセグメントとが連結したブロック共重合体を含むイメージングプローブであって、
前記ブロック共重合体が、一般式(1)
[式中、
R 1 は、水素原子又は置換基を有していてもよい直鎖状、分岐状または環状の炭素数(C1〜C6)アルキル基を示し、
tは、20〜140の整数を示し、
Aは、置換基を有していてもよい炭素数(C1〜C6)アルキレン基を示し、
R 2 は、水素原子、炭素数(C1〜C6)アシル基及び炭素数(C1〜C6)アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基を示し、
R 3 は、蛍光基、放射性元素含有基及び磁性基からなる群から選択されるシグナル基を示し、
R 4 は、疎水性置換基であり、
前記疎水性置換基は、置換基を有していてもよい炭素数(C1〜C30)の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数(C1〜C30)の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい炭素数(C1〜C30)の直鎖状、分岐鎖状または環状のジアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数(C1〜C8)アルキルアミノカルボニル(C1〜C8)アルキルアミノ基、水酸基及び/又はアミノ基を有する生理活性物質、及び水酸基からなる群から選択される1種以上の置換基を示し、
nは、1又は2を示し、
x 1 、x 2 、y 1 、y 2 及びzは、それぞれ独立して0〜20の整数を示し、
(x 1 +x 2 )は、1〜10の整数を示し、
(x 1 +x 2 +y 1 +y 2 +z)は、3〜20の整数を示し、
前記R 3 及びR 4 が結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基が分子内環化した構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。]
で示され、
該ポリエチレングリコール鎖と該ポリアミノ酸鎖とを合せた主鎖ポリマーの平均分子量が2kDa以上10kDa以下であり、
該シグナル基及び任意の疎水性置換基の質量含有率が5質量%以上で50質量%以下であり、
粒子径が20nm未満であるブロック共重合体を含む、
イメージングプローブ。 - ポリアミノ酸鎖が、ポリアスパラギン酸鎖、ポリグルタミン酸鎖又はポリ(アスパラギン酸−グルタミン酸)鎖である請求項1に記載のイメージングプローブ。
- シグナル基が蛍光基である、請求項1又は請求項2に記載のイメージングプローブ。
- ポリエチレングリコール鎖の平均分子量が1kDa以上で6kDa以下である請求項1乃至請求項3の何れか一項に記載のイメージングプローブ。
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