ES2910550T3 - Conjugados terapéuticos con dendrímeros sulfatados para selección de objetivos intracelulares - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, donde E es una molécula efectora terapéutica o diagnóstica, donde D(OSO3-M+)n es un dendrímero D que porta un número n de grupos sulfato OSO3-M+, en donde el número n de grupos sulfato se selecciona de 6, 8, 12, 16, 18, 24, 30, 32, 36, 40, 48, 72 o 96, donde M es un contraión catiónico inorgánico u orgánico para el grupo sulfato aniónico, donde L es un enlazador o espaciador entre D y E, donde G es un grupo funcional de conexión que forma la unión covalente entre L y E, y donde m es un número entero de 1 a 20 y donde cada uno de los dendrímeros D de dicho conjugado tiene el mismo peso molecular y donde el número n de grupos sulfato es el mismo para cada dendrímero D, donde la unidad enlazadora L está unida covalentemente al punto focal del dendrímero D en una posición, por lo que desde este punto focal, el dendrímero crece para alcanzar su estructura dendrítica, y donde los dendrímeros D(OSO3-M+)n tienen las siguientes proporciones entre n y el peso molecular, dadas siendo M+ un ion alcalino, preferiblemente sodio: **(Tabla)**

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados terapéuticos con dendrímeros sulfatados para selección de objetivos intracelulares
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros y su uso para el tratamiento de enfermedades. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados de dendrímeros con moléculas terapéuticamente activas se administran en la célula utilizando proteínas de transporte que permiten la captación de los conjugados de dendrímeros inventivos y la interacción de estas moléculas terapéuticamente activas con moléculas relevantes para la enfermedad directamente dentro de la célula.
Antecedentes
Durante las últimas décadas se ha avanzado mucho para mejorar la eficacia de los fármacos diagnósticos y terapéuticos. Se siguieron varias estrategias durante las últimas décadas para evitar los efectos indeseados graves de los fármacos en los tejidos y órganos sanos. Predominantemente, la investigación de fármacos se centró en nuevos objetivos farmacológicos que prometían una expresión específica de la enfermedad del mecanismo objetivo. Con respecto al descubrimiento de mecanismos de transducción de señales en células proliferantes y activadas, se han identificado numerosos objetivos nuevos. Sin embargo, con pocas excepciones, el ataque terapéutico de la mayoría de los objetivos farmacológicos recién descubiertos siguió siendo menos efectivo, ya que la molécula terapéutica debe poseer las propiedades fisicoquímicas para penetrar en los tejidos, las barreras de membranas y las células para alcanzar el objetivo, en particular cuando el objetivo se expresa en el interior de las células. Por tanto, se ha dedicado mucho esfuerzo a mejorar la biodisponibilidad de los fármacos terapéuticos clínicamente establecidos. Con el fin de mejorar la biodisponibilidad de los fármacos, la investigación se centró en la modificación química o las formulaciones farmacéuticas de las moléculas terapéuticas. La mayoría de las moléculas de fármacos terapéuticos no llegan al sitio de la enfermedad y solo se aplican en el cuerpo humano para lograr la concentración necesaria del fármaco en la sangre, por lo que no tienen un cierto grado de selectividad por los tejidos enfermos. Por lo tanto, la mayor parte del fármaco aplicado se elimina de la circulación sanguínea sin llegar al sitio de la enfermedad.
Muchas moléculas terapéuticas basadas en proteínas y péptidos se utilizan como agentes terapéuticos altamente específicos y efectivos. Sin embargo, su uso es complicado por sus propiedades fisicoquímicas, lo que se debe a la naturaleza inherentemente polar de la composición de aminoácidos y el esqueleto polipeptídico de las conexiones de amidas polares. En particular, su tamaño molecular y la carga de las proteínas dificultan la biodisponibilidad en el objetivo deseado. La aplicación de proteínas terapéuticas se complica aún más por la circunstancia de que muchos fármacos de proteínas y péptidos tienen sus objetivos terapéuticos dentro de las células. Aquí, el principal desafío que debe abordarse para encontrar nuevos fármacos o tecnologías de administración de fármacos es la penetración de la membrana celular para llevar estos tipos de fármacos al citoplasma o núcleo de las células objetivo. Es bien sabido que las moléculas individuales con un peso molecular superior a 1 kDa no entran directamente en el citoplasma.
Muchas moléculas de diagnóstico, como los colorantes fluorescentes, agentes de contraste para imagenología de resonancia magnética, TC y radioquelatos para imagenología nuclear, son de naturaleza hidrófila y no pueden entrar en la célula, de manera similar a las propiedades descritas anteriormente de los polipéptidos (van der Molen AJ, Eur. J. Radiol. 2008, 66, 168). Por lo tanto, no existe una ruta general disponible que permita seleccionar un agente de diagnóstico con el fin de caracterizar las rutas intracelulares de la enfermedad y detectar la interacción de las moléculas terapéuticas con las moléculas intracelulares.
Los métodos tradicionales de administración intracelular son la electroporación o la microinyección de proteínas. Aquí, la integridad de la membrana celular se altera durante un corto período de tiempo, lo que permite el suministro intracelular de macromoléculas con un tamaño superior a 1 kDa. Sin embargo, el método es invasivo y sólo aplicable para experimentos in vitro, pero no para condiciones clínicas. Otra desventaja es la baja eficacia del procedimiento que puede medirse por el número de células tumorales cargadas con la proteína objetivo. La electroporación o la microinyección generalmente conducen a la administración intracelular en alrededor del 20 al 40 % de las células tratadas, pero la reproducibilidad es muy baja.
Más recientemente, se han establecido nuevos enfoques farmacéuticos para administrar polipéptidos, proteínas y anticuerpos terapéuticos en las células tumorales. Los nanotransportadores farmacéuticos, como los liposomas, los sistemas micelares con autoensamblaje o las nanopartículas poliméricas, se pueden usar para la administración intracelular de proteínas terapéuticas (Du et al., Curr Drug Metab, 2012, 13, 82-92). Son capaces de escapar del metabolismo endosómico, pero carecen de especificidad hacia la célula tumoral. En este sentido, los ligandos selectivos pueden usarse para dirigir dichos nanotransportadores hacia las células tumorales. Sin embargo, las formulaciones liposomales y otras formulaciones de nanopartículas que portan polipéptidos, anticuerpos y proteínas terapéuticos en combinación con ligandos selectivos (van der Meel et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 65, 1284-98) son costosos y se consideran entidades químicas complejas. La optimización de estas entidades a menudo es complicada debido al hecho de que la interacción entre el material transportador y la carga útil terapéutica tiene que adaptarse cuidadosamente. Con respecto a las cargas útiles de diagnóstico, las propiedades fisicoquímicas del agente de diagnóstico deben adaptarse cuidadosamente al transportador de manera similar para recibir las entidades químicas funcionales.
A pesar de las oportunidades de la combinación farmacéutica con sistemas transportadores con nanopartículas, el uso de proteínas y péptidos como agentes terapéuticos se ve obstaculizado per se por el conjunto de propiedades intrínsecas asociadas a su naturaleza como macromoléculas complejas, por lo general ajenas al organismo receptor. Esto conduce a una baja estabilidad de la mayoría de los fármacos peptídicos y especialmente proteicos a valores de pH y temperaturas fisiológicos, particularmente cuando estas proteínas tienen que ser activas en un entorno diferente al normal. Los diferentes procesos que conducen a la inactivación de varias proteínas y péptidos biológicamente activos in vivo incluyen la transformación de proteínas conformacionales en la forma inactiva debido al efecto de la temperatura, el pH, la alta concentración salina o los detergentes. Muy a menudo, la agregación de proteínas conduce a la pérdida de la función y el metabolismo, lo que es difícil de determinar con exactitud en los sistemas de nanotransportadores farmacéuticos.
Solución al problema subyacente de la presente invención
Sorprendentemente, los inventores de la presente solicitud han descubierto una metodología para administrar moléculas terapéuticas, en particular polipéptidos, específicamente en células enfermas. La solución al problema se basa en el descubrimiento sorprendente de que dichos polipéptidos y proteínas pueden administrarse en células tumorales sin una formulación farmacéutica basada en nanopartículas, polímeros, micelas o liposomas. En cambio, se descubrió que un grupo de compuestos basados en dendrímeros definidos unidos covalentemente al efector terapéutico es capaz de transportarse como conjugado de dendrímeros a la célula objetivo. En particular, se descubrió que el tipo de dendrímero que lleva una pluralidad definida de grupos sulfato (-OSO3"M+) puede actuar como resto transportador activo, cuando este dendrímero se conecta covalentemente al respectivo polipéptido terapéutico u otro tipo de efector, incluyendo las moléculas terapéuticas y de diagnóstico.
El documento EP 2 100621 A1 describe un conjugado de dendrón de poliéter de poliol, que comprende a) un resto de dendrón de poliéter de poliol, b) al menos una molécula efectora seleccionada del grupo de tintes fluorescentes o fotosensibilizadores, o una molécula efectora radiactiva, seleccionada del grupo de complejos radiometálicos o quelatos radiometálicos. Los dendrones pueden tener diferentes grupos finales, que incluyen los grupos -OSO3Na.
El documento WO 2010/000713 A1 describe dendrones de poliglicerol, que están perfectamente ramificados y tienen una estructura perfectamente uniforme, en los que los grupos finales también pueden ser grupos -SO3Na.
La presente invención describe una composición farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 21. La presente invención describe también una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para el uso (i) en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende cáncer, inflamación, autoinmunidad metabólica y fibrosis, o (ii) en el tratamiento antiproliferativo, proproliferativo, antiapoptótico, proapoptótico, antifibrótico, profibrótico, antilipogénico, antidiabético, inmunoestimulador y antienvejecimiento
Las moléculas terapéuticas y diagnósticas que son impermeables para las células no pueden ser absorbidas por las células normales y se dirigen solo a aquellas células que tienen mecanismos de absorción basados en transportadores de solutos transmembrana, mejorando así la selectividad y disminuyendo la toxicidad para el organismo. Sorprendente e inesperadamente, mediante la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de dendrímero que permiten la administración transmembrana de moléculas terapéuticamente activas a través de proteínas de transporte. Se descubrió que las moléculas terapéuticamente activas, así como las moléculas diagnósticas, que como compuestos individuales por sí solos no pueden captarse en las células debido a las propiedades descritas anteriormente, son sorprendentemente aplicables para ser transportadas a las células y mostrar un efecto terapéutico o diagnóstico directamente dentro de la célula. Además, los conjugados de dendrímeros de la invención permiten la selección específica como objetivo de las células del organismo. En este contexto, los conjugados de dendrímeros definidos permiten mejorar la biodisponibilidad y la selectividad de un amplio espectro de moléculas efectoras terapéuticas y diagnósticas, incluidos los polipéptidos y agentes terapéuticos de moléculas pequeñas. Las moléculas terapéuticas y diagnósticas que no son capaces de entrar en las células se transportan a las células utilizando proteínas de transporte. Sorprendente e inesperadamente, esto podría lograrse mediante la homogeneidad del peso molecular de cada dendrímero dentro de los conjugados reivindicados, en combinación con la conjugación covalente entre las moléculas efectoras y los dendrímeros sulfatados.
Una formulación farmacéutica con la molécula terapéutica físicamente incrustada o encapsulada en una partícula transportadora o polímero (sin enlace covalente con el transportador) ha mostrado la desventaja de que las moléculas efectoras terapéuticas pueden redistribuirse en el organismo por descomposición del transportador y/o fuga desde el transportador, exhibiendo así su toxicidad original para el organismo. En consecuencia, las moléculas diagnósticas pueden redistribuirse y, por lo tanto, generar señales que hacen que el examinador detecte la situación molecular incorrecta que no está relacionada con el mecanismo de captación.
Descripción detallada de la invención
Las características descritas de la invención se fundamentan en las siguientes descripciones de realizaciones ejemplares que se presentan para apoyar la invención.
La presente invención describe una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula
E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m,
donde E es una molécula efectora terapéutica o diagnóstica,
donde D(OSO3"M+)n es un dendrímero D que porta un número n de grupos sulfato OSO3"M+ , en donde el número n de grupos sulfato se selecciona de 6, 8, 12, 16, 18, 24, 30, 32, 36, 40, 48, 72 o 96,
donde M es un contraión catiónico inorgánico u orgánico del grupo sulfato aniónico,
donde L es un enlazador o espaciador entre D y E,
donde G es un grupo funcional de conexión que forma la unión covalente entre L y E, y donde m es un número entero de 1 a 20 y
donde el número n de grupos sulfato es el mismo para cada dendrímero D, donde la unidad enlazadora L está unida covalentemente al punto focal del dendrímero D en una posición,
por lo que desde este punto focal, el dendrímero crece para alcanzar su estructura dendrítica, y
donde los dendrímeros D(OSO3"M+)n tienen las siguientes relaciones entre n y el peso molecular, dadas para M+ siendo un ion alcalino, preferiblemente sodio:
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Según la presente invención, cada uno de los dendrímeros D de dicho conjugado tiene el mismo peso molecular. Las estructuras dendriméricas tienen un peso molecular único y definido. Esto significa que el conjugado resultante no está compuesto por muchas moléculas dendríticas diferentes cada una con otra estructura, ramificación, tamaño, carga, volumen o polaridad, que es el resultado de una naturaleza polimérica. En el documento WO2011/095311, se describe el uso de conjugados de proteínas terapéuticas con polioles sulfatados, donde estos polioles sulfatados son de naturaleza polimérica con un peso molecular indefinido. Se caracterizan por un peso molecular medio basado en la polidispersidad, con una conjugación estadística con moléculas terapéuticas. Sorprendentemente, se descubrió que un sistema dendrimérico definido (24, 32 o 48 grupos sulfato) con un enlazador definido conjugado con una proteína de toxina conduce a una mayor eficacia en el tratamiento de células tumorales en cultivo celular en comparación con un poliglicerolsulfato polidisperso de peso molecular promedio comparable (véase el Ejemplo 19). Sorprendente e inesperadamente, la presente invención pudo identificar otra ventaja de usar sistemas de dendrímeros definidos de peso molecular único en comparación con el poliglicerol sulfatado polimérico. Después de marcar con un colorante fluorescente (ICC), dando por ejemplo los compuestos del Ejemplo 8 (ICC-d01, ICC-d12, ICC-d18), se realizaron estudios de captación celular en comparación con ICC-poliglicerolsulfato polimérico (peso molecular medio 12000 Da). ICC-d01, ICC-d12, CPI-d18 dieron como resultado una distribución intracelular en el citosol, mientras que el ICC-poliglicerolsulfato polimérico mostró una localización sustancial adicionalmente en los compartimentos endosómicos, probablemente debido a la captación endocítica parcial de la mezcla polimérica. La captación endocítica de polímeros se vuelve predominante por encima de 20 kDa, como también se describe en el documento WO2011/095311 para polímeros sulfatados. En general, la captación de proteínas terapéuticas por el compartimento endosómico debe evitarse por razones importantes. En primer lugar, la membrana endosomal representa una barrera para la translocación de las moléculas efectoras terapéuticas hacia el citosol. Normalmente, las moléculas efectoras terapéuticas dejan de estar disponibles en las moléculas objetivo terapéuticas en el citosol. En segundo lugar, muchas enzimas metabolizadoras y catalíticas pueden destruir las moléculas efectoras terapéuticas antes de que puedan translocarse al citosol. Este aspecto es de particular importancia para las moléculas efectoras terapéuticas proteicas. La síntesis de poliglicerolsulfatos que involucra la polimerización aniónica con apertura de anillos para sintetizar el esqueleto de poliglicerol es un estado de la técnica publicado que generalmente conduce a una cierta distribución de peso molecular alrededor de un peso molecular promedio Mn con un índice de polidispersidad de 15 - 1,8 (Groger et al., Bioconjug. Chem. 2013, 24, 1507-14). Así, para un peso molecular promedio Mn dentro de 5-10 kDa con un índice de polidispersidad de 1,5-1,8, tiene siempre una cantidad sustancial de estructuras de mayor peso molecular (> 20 kDa) en la mezcla que son difíciles de cuantificar. En consecuencia, en el Ejemplo 18, una clara independencia de la endocitosis es evidente solo para los conjugados de proteínas con dendrímeros sulfatados (Asp-d02) y no para conjugados con poliglicerolsulfato.
Además, un experto en la técnica conoce los métodos para demostrar que cada dendrímero tiene el mismo peso molecular, por ejemplo, espectroscopia 1H-RMN, espectroscopia 13C-RMN, análisis elemental, espectroscopia de masas, que son técnicas clásicas de química orgánica.
Otra materia de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, en el que los grupos sulfato OSO3 'M+ derivan preferentemente de grupos hidroxilo que se convierten en grupos sulfato (monóesteres de ácido sulfónico) mediante un proceso de sulfatación.
Los agentes preferidos para llevar a cabo un proceso de sulfatación de grupos hidroxilo son complejos de trióxido de azufre (como el complejo de SO3-piridina, complejo de SO3-trietilamina, complejo de SO3-trimetilamina, complejo de SO3-DMF) o ácido sulfámico (Mol JA et al., Carbohydr Res. 2003338:1397-401).
En otra realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, en el que las unidades repetitivas de monómeros para construir la estructura dendrítica se seleccionan del grupo que comprende glicerol sustituido en 1,2, glicerol sustituido en 1,3, pentaeritritol, glucosa, manosa, galactosa, lisina, tris(hidroximetil)aminometano, tris(ácido propiónico)aminometano, ácido 1,1'-bis(hidroximetil)-propiónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido maleico, ácido glicólico, ácido diglicólico , ácido adípico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido propiónico (2-aminoetil)amida, propilenimina, etilenimina, óxido de propileno, óxido de etileno.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, en donde la unión de monómeros en el dendrímero se basa en grupos funcionales seleccionados de éter, tioéter, éster carboxílico, sulfoniléster, sulfonamida, carboxilamida, amina, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, hidrazona, imina, disulfuro, fosfato, fosfonato, triazol, acetal, cetal.
Según la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3‘ M+)n]m en el que el dendrímero D contiene una unidad central del núcleo de dendrímero (CDCU) con la unión covalente de la unidad enlazadora L al punto focal del dendrímero D. La CDCU puede comprender estructuras seleccionadas de pentaeritritol, glicerol, triglicerol, glicerolamina, tris (ácido propiónico)metilo, tris(hidroximetil)metilo, tetraoxaspiro(5,5)undecano, adamantilo.
Se prefieren estructuras en las que las unidades centrales del núcleo de dendrímero (CDCU) con la unión covalente de una unidad enlazadora comprenden estructuras tales como pentaeritritol, glicerol, triglicerol, glicerolamina, tris(ácido propiónico)metilo y estructuras como se representan a continuación.
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El objeto de otra realización específica de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, en el que D contiene grupos terminales seleccionados de 1,2-disulfatoalquilo, 1,3-disulfatoalquilo, N,N'-di(1-sulfatoalquil)amina, tris(sulfatometil)metilo, 1,2,4-trisulfato-3-alquilo, 1,2,3,4,5-pentasulfatoalquilo derivado de glucosamina.
Para lograr una alta densidad de grupos sulfato, su posición en los restos alquilo debe ser tal que estén muy cerca unos de otros. Esto se puede lograr mediante motivos estructurales de 1,2-disulfatoalquilo, 1,3-disulfatoalquilo, N,N'-di(1-sulfatoetil)amina. Hay diferentes estructuras posibles que comprenden motivos estructurales de 1,2-disulfato- o 1,3-disulfato. En tales estructuras también están incluidos los restos de azúcar o glicano que, después de la sulfatación, comprenden también las unidades de 1,2-disulfato- o 1,3-disulfato dentro de la estructura. Son posibles restos de mono-, di- u oligoglicanos, y dentro de estas estructuras son posibles las estructuras cíclicas o de cadena abierta (reducidas). El alcance de la invención incluye las estructuras de 1,2,3,4,5-pentahidroxihexilo derivadas de azúcares de hexosa (glucosa, galactosa, manosa), como glucosamina o glucamina. La D-glucamina se puede utilizar en sistemas de dendrímeros que dan lugar a 5 grupos sulfato por residuo de glucamina. Otro alcance incluye ciclodextrinas (a, p o Y-ciclodextrinas), que están monofuncionalizadas (tales como 6-desoxi-6-azido-ciclodextrinas u otros grupos funcionales conocidos por el experto en la técnica; Roux M et al., Eur Biophys J. 2007, 36, 861-7) para conectar el enlazador L, y puede modificarse en cada grupo hidroxilo con glicerol seguido de sulfatación.
Así, en una realización preferida objeto de la presente invención, los dendrímeros D tienen una unidad terminal de 1,2,3,4,5-pentasulfato, que deriva de azúcares, preferentemente glucosamina, dendrímeros D con una unidad terminal de 1,2-disulfato, que deriva de unidades hidroxiladas más pequeñas que comprenden estructuras de glicerol, dendrímeros D con unidades terminales de 1,3-disulfato derivadas de restos de bis-(hidroximetil)alquilo. Más preferida como entidad estructural en D es la estructura de 1,2-disulfatoalquilo basada en un 1,2-disulfatopropilo terminal sustituido en 1 que deriva de una unidad de glicerol.
Dentro del contexto de esta realización, glicerol sustituido en 1,2 significa que dos grupos hidroxilo adyacentes están formando una conexión con la unidad de monómero subsiguiente de la cubierta de próxima generación en la estructura de los dendrímeros. El glicerol sustituido en 1,3 significa que los dos grupos hidroxilo externos forman esta conexión.
De acuerdo con la presente invención, el dendrímero D contiene grupos sulfato, en lugar de grupos sulfonato y carboxilato que se sabe que se usan en los polímeros dendríticos y dendrímeros (Weinhart et al., Biomacromolecules.
2011, 12, 2502). Como se publicó, los grupos sulfonato y carboxilato se pueden introducir en las moléculas dendriméricas modificando grupos hidroxilo o amino, p. ej., con anhídrido de succinilo, ácido bromoacético, 1,3-propanosultona, 1,4-butansultona. Sorprendentemente, los dendrímeros de sulfato exhiben una absorción celular más eficiente (detectada con conjugados marcados con fluorescencia) también para pesos moleculares más pequeños (número de grupos aniónicos < 24) en comparación con los grupos carboxilato y sulfonato.
Según una realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+ )n]m , donde L es un grupo alquilo C4-100.
En una realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3"M+)n]m, donde L es un grupo alquilo C4-100, en el que el grupo alquilo C4-100 se selecciona del grupo que consiste en unidades alifáticas cíclicas, ramificadas o lineales en las que uno o más grupos metileno pueden estar sustituidos independientemente por una unidad seleccionada del grupo que consiste en O, S, NH, NH-O, C(=O)NH, OC(=O)NH, OC(=O)O, NHC(=O)NH, NHC(=S)NH, C(=NH)NH, C(=O), S(=O)2 , S(=O), S(=O2)O, S-S, CH=N, CH=N-NH, C=N-NHC(=O), OP(=O)(O ' M+)O, P(=O)(O' M+)O, arileno, etenileno o etinileno y triazolileno, en los que cualquier átomo de hidrógeno puede estar independientemente sustituido por metilo, etilo o hidroximetilo.
Según una realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, donde la estructura de L es
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donde el alquilo es un grupo alquilo C4-100 en el que uno o más grupos metileno pueden estar sustituidos por un grupo seleccionado del grupo que consiste en unidades alifáticas cíclicas, ramificadas o lineales en donde uno o más grupos metileno pueden estar sustituidos independientemente por una unidad seleccionada del grupo que consiste en O , S, NH, NH-O, C(=O)NH, OC(=O)NH, OC(=O)O, NHC(=O)NH, NHC(=S)NH, C(=NH)NH , C(=O), S(=O)2 , S(=O), S(=O2)O, S-S, CH=N, CH=N-NH, C=N-NHC(=O), OP(=O)(O' M+ )O, P(=O)(O' M+ )O, arileno, etenileno o etinileno, y triazolileno, en los que cualquier átomo de hidrógeno puede estar sustituidos independientemente por metilo, etilo o hidroximetilo, X es n H , S u O, y a, b y c pueden ser independientemente 0 o 1 (a+b+c = 0 excluido).
En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, donde L es una grupo alquilo C4-50 en el que de uno a diez grupos metileno están sustituidos por un grupo seleccionado del grupo que comprende O, C(=O)NH, OC(=O)NH, OC(=O)O, NHC(=O) NH, NHC(=S)NH, triazol, donde X es NH u O, y a, b y c pueden ser independientemente 0 o 1 (a+b+c = 0 excluido). En una realización más preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, donde L es alquilo que incluye una cadena de carbonos C4 a C18, una unidad C(=O)NH y una cadena de PEG corta de hasta 10 unidades repetitivas de CH2CH2O, al que se le coloca un grupo de conexión G al final de esta cadena como grupo reactivo para la conjugación covalente con E.
En una realización específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, en el que L comprende estructuras que se pueden escindir en condiciones intracelulares, en el que las estructuras escindibles se seleccionan del grupo de disulfuro (S-S), estructuras escindibles con ácido CH=N, CH=N-NH, CH=N-NHC(=O) , C=NO, en donde cualquier átomo de nitrógeno o de carbono puede estar sustituido con etilo o metilo. Otra estructura que se puede escindir en condiciones intracelulares comprende secuencias de aminoácidos de 2 a 10 aminoácidos.
En una realización más específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, en donde L comprende estructuras que exhiben un máximo de absorción óptica en el rango espectral UV a VIS dentro de 280 y 650 nm, preferiblemente entre 300 y 550 nm.
En una realización aún más específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, en el que L comprende estructuras que emplean al menos dos restos aromáticos o bisaromáticos, como bifenilo, naftilo, dibenzocetona, dansilo, pireno, perileno, cumarina, 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno, o colorante de cianina, preferiblemente restos cromóforos de indocarbocianina o monometino. La cuantificación espectroscópica permite la determinación de las proporciones de dendrímero respecto de la proteína/polipéptido. Los ejemplos de estructuras detectables de UV a VIS de L conectadas a D se describen en los Ejemplos 9 y 10.
El uso de un dendrímero sulfatado conjugado covalentemente con un colorante fluorescente se describe por Paulus et al. (Macromol. Biosci. 2014, 14, 643-654). El dendrímero [G4.0] deriva de un poliol de 64 grupos hidroxi, al que estadísticamente se conjuga un enlazador, seguido de sulfatación y marcaje con un tinte. Este diseño produce una estructura imperfecta, ya que el resto enlazador no se puede colocar exactamente en una proporción de 1:1 en una posición deseada. La publicación muestra la captación de estos y de polisulfato polimérico de menor grado de ramificación en células tumorales y enseña la captación óptima con un grado de ramificación moderado del 60% (una estructura dendrímera imperfecta). No hay información sobre el mecanismo de captación y si se puede utilizar una vía mediada por transportadores para transportar moléculas terapéuticamente activas con el fin de hacer que estén disponibles para una interacción intracelular con los mecanismos moleculares de la enfermedad.
En una realización específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3" M+)n]m, donde E es una molécula efectora terapéutica. La molécula efectora comprende sustancias que pueden interferir con los mecanismos intracelulares de proliferación, apoptosis, síntesis de material de tejido conjuntivo (por ejemplo, colágeno, fibronectina), función inmunitaria, senescencia o defensa inmunitaria.
Más específicamente, la interferencia con los mecanismos intracelulares de la enfermedad comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento de células transportando el conjugado al interior de la célula y localizando así la molécula efectora terapéutica E dentro de la célula, donde esta molécula E interactúa directamente con los mecanismos moleculares de la enfermedad. Esta interacción se basa en una unión directa a moléculas dentro de la célula, lo que induce alteraciones o cambios en las vías de señales biológicas. La unión se define como la fuerza de unión o la afinidad de unión que depende de la naturaleza molecular y la estructura de la molécula efectora terapéutica (como se explica más detalladamente en las secciones).
La composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento de células que tienen mecanismos de captación basados en proteínas de transporte del grupo de transportadores de solutos transmembrana, que permiten la administración transmembrana de moléculas terapéuticamente activas a través de transportadores de solutos transmembrana en las células. Estos transportadores de solutos transmembrana comprenden preferiblemente proteínas transportadoras de aniones orgánicos (OATP); Liu T et al., J. Drug Target. 2014,22, 14-22). Una realización preferida son los OATP con expresión específica de tumor, incluidos OATP1B1, OATP1B3 o NTCP (Buxhofer-Ausch et al., J Drug Deliv. 2013, 863539).
En otro aspecto, la presente invención describe la composición farmacéutica según la presente invención para uso (i) en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende cáncer, inflamación, enfermedad autoinmune, enfermedad metabólica y fibrosis, o (ii) en el tratamiento antiproliferativo, proproliferativo, antiapoptótico, proapoptótico, antifibrótico, profibrótico, antilipogénico, antidiabético, inmunoestimulador y antienvejecimiento.
En una realización más preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento y diagnóstico del cáncer, donde dichos conjugados de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas están dirigidos contra objetivos moleculares en las células cancerosas. Los tipos de células cancerosas comprenden preferentemente una alta expresión de OATP1B1, OATP1B3 o NTCP, para el tratamiento de cánceres tales como cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer del SNC, melanoma, cáncer de colon, cáncer de piel, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer hepático. Otra realización preferida es el tratamiento de células madre cancerosas que a menudo expresan altos niveles de UATP1B1, OATP1B3 o NTCP.
La composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades, en el que dichos conjugados de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas se incorporan a las células mediante proteínas transportadoras e interactúan dentro de la célula con los mecanismos moleculares de la enfermedad.
Aún más preferido es un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento de células que tienen mecanismos de captación basados en proteínas de transporte del grupo de transportadores de solutos transmembrana y que de otro modo no son capaces de captar dichas moléculas terapéuticas (véase también el ejemplo 18). Sorprendentemente, las moléculas efectoras terapéuticas se pueden acumular o enriquecer dentro de la célula objetivo en función del mecanismo de captación de los conjugados por las proteínas transportadoras, lo que no ha sido posible antes, ya que estas moléculas terapéuticas no son capaces de alcanzar la molécula objetivo hacia la que exhiben afinidad de unión.
La composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades, en el que dichos conjugados de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas son captados en las células por proteínas transportadoras, interactúan dentro de la célula con los mecanismos moleculares de la enfermedad, y se acumulan en la célula debido a la afinidad de unión de la molécula efectora terapéutica a una molécula objetivo intracelular. Los objetivos intracelulares se fundamentan adicionalmente a continuación.
En una realización específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, en el que las moléculas efectoras se seleccionan de péptidos, proteínas, glucanos y ácidos nucleicos. Se prefieren las moléculas efectoras de estas clases que no se captan en las células por sí solas.
En otra realización muy específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, donde la molécula pequeña se selecciona del grupo que comprende estructuras peptídicas o peptidomiméticas, que incluyen péptidos cíclicos o de cadena abierta con modificaciones estructurales naturales o no naturales. Sorprendentemente, se demostró que los péptidos hidrofílicos sin captación en las células pueden localizarse dentro de las células tumorales después de la conjugación con los dendrímeros de la presente invención.
En otra realización muy específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, en el que las proteínas se seleccionan del grupo que comprende proteínas globulares, glicoproteínas, toxinas, enzimas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos modificados y construcciones de proteínas, incluidos anticuerpos de un solo dominio (sdAb), anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos Fv-Fc de cadena sencilla (scFv-Fc).
En otra realización muy específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, donde las proteínas se seleccionan del grupo que comprende moléculas miméticas de anticuerpos que, al igual que los anticuerpos, pueden unirse específicamente a antígenos, pero que no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Particularmente preferidos son las moléculas miméticas de anticuerpos seleccionadas del grupo de aficuerpos, afilinas, avímeros, anticalinas, DARPinas, dominios de Kunitz, finocuerpos, polipéptidos generados a partir del dominio de tipo III de fibronectina.
En otra realización muy específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, donde los ácidos nucleicos incluyen ARN, ADN, siARN, mARN, a Rn inverso, microARN o formatos manipulados, como aptámeros.
En otra realización específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, en donde E está dirigido contra moléculas involucradas en la proliferación y apoptosis de las células tumorales. Más específicamente, estas moléculas se localizan dentro de la célula tumoral, preferiblemente dentro del citosol de las células tumorales.
En otra realización muy específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado, donde E se selecciona del grupo que comprende polipéptidos o moléculas efectoras de pequeño peso molecular que se unen a objetivos seleccionados del grupo que consiste en Fox01, HDAC, DP-1, E2F, ABL, a Mp K, BRK, BRSK1, BRSK2, BTK, CAMKK1, CAMKK alfa, CAMKK beta, Rb, Suv39H1, SCF, p19INK4D, GSK-3, p18 INK4, myc, ciclina E, CDK2, CDK9, CDG4/6, Ciclina D , p16 INK4A, cdc25A, BMI1, SCF, Akt, CHK1/2, CK1 delta, CK1 gamma, CK2, CLK2, CSK, DDR2, DYRK1A/2/3, EF2K, EPH-A2/A4/B1/B2/B3/ B4, EIF2AK3, Smad2, Smad3, Smad4, Smad7, p53, p21 Cip1, PAX, Fyn, CAS, C3G, SOS, Tal, Raptor, RACK-1, CRK, Rap1, Rac, KRas, NRas, HRas, GRB2, FAK , PI3K, spred, Spry, mTOR, MPK, LKB1, PAK1/2/4/5/6, PDGFRA, PYK2, Src, SRPK1, PLC, PKC, c-Raf, PKA, PKB alfa/beta, PKC alfa/gamma /zeta, PKD, PLK1, PRAK, PRK2, RIPK2, B-Raf, WAVE-2, TSC2, DAPK1, BAD, IMP, C-TAK1, TAK1, TAO1, TBK1, TESK1, TGFBR1, TIE2, TLK1, TrkA, TSSK1 , TTBK1 /2, TTK, Tp12/cot1, MEK1, MEK2, PLD1, Erk1, Erk2, Erk5, Erk8, p90RSK, PEA-15, SRF, p27 KIP1, TIF1a, HMGN1, ER81, MKP-3, c-Fos, FGF- R1, GCK, GSK3 beta, HER4, HIPK1/2/3/, IGF-1R, cdc25, UBF, LAMTOR2, Stat1, Stat3, CREB, JAK, Src, PTEN, NF-kappaB, HECTH9, Bax, HSP70, HSP90, Apaf-1, Cyto c, BCL-2, Bcl-xL, Smac, XIAP, Caspasa-9, Caspasa-3, Caspasa-6, Caspasa-7, CDC37, TAB, IKK, TRADD, TRAF2, RIP1, FLIP, TAK1, JNK1/2/3, Lck, A-Raf, B-Raf, C-Raf, MOS, MLK1/3, MNK1/2, MSK1, MST2/3/4, MPSK1, MEKK1, MEKK4, MELK, ASK1, MINK1, MKK1/2/3/4/6/7, NEK2a/6/7, NUAK1, OSR1, SAPK, STK33, Syk, Lyn, PDK1, PHK, PIM1/2/3, Ataxina-1, mTORCl, MDM2, p21Wafl, Ciclina D1, Lamina A, Tp12, Myc, catenina, Wnt, IKK-beta, IKK-gamma, IKK-alpha, IKK-épsilon, ELK, p65RelA, IRAK1, IRAK2, IRAK4, IRR, FADD, TRAF6, TRAF3, MKK3, MKK6, ROCK2, RSK1/2, SGK1, SmMLCK, SIK2/3, ULK1/2, VEGFR1, WNK1, YES1, ZAP70, MAP4K3, MAP4K5, MAPK1b, MAPKAP-K2/K3, p38 alfa/beta/delta /gamma MAPK, Aurora A, Aurora B, Aurora C, MCAK, Clip, MAPKAPK, FAK, MARK1/2/3/4, Muc1, SHC, CXCR4, Gap-1.
Más específicamente, la catenina objetivo exhibe actividad transcripcional que se basa en la interacción con varios cofactores y proteínas adaptadoras para formar un complejo de factor de transcripción. El complejo de transcripción de catenina representa varias interacciones proteína-proteína que pueden usarse como objetivos terapéuticos. Los motivos peptídicos derivados de la secuencia de aminoácidos de las estructuras de proteínas que interactúan, como las hélices alfa o las láminas beta, se pueden usar como estructuras guía terapéuticas. Los péptidos helicoidales alfa derivados de Bcl9, bcl9/2 o pygopus se utilizan preferentemente como inhibidores del complejo de transcripción de catenina.
Más específicamente, la apoptosis (muerte celular programada) de las células tumorales es reprimida por miembros de la familia bcl-2 como blc-2, bcl-xl y mlp-1. La inducción de la apoptosis se considera un enfoque muy atractivo para la terapia tumoral. Se sabe en la bibliografía que la interacción de los reguladores negativos de la apoptosis como bcl-2, bcl-xl y mcl-1 con proteínas sensibilizadoras de la apoptosis como BIM, BID, NOXA, PUMA puede inducir la apoptosis y muerte de células tumorales. Los motivos peptídicos derivados de la secuencia de aminoácidos de las estructuras de proteínas que interactúan, como las hélices alfa o las láminas beta, se pueden usar como estructuras guía terapéuticas. Los péptidos helicoidales alfa derivados de proteínas sensibilizadoras de la apoptosis tales como BIM, BID, NOXA, PUMA se usan preferentemente como inhibidores de las proteínas que reprimen la apoptosis tales como bcl-2, bcl-xl y mcl-1.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, donde E es una enzima, donde la enzima es una enzima terapéutica que incluye enzimas antitumorales que actúan destruyendo ciertos aminoácidos necesarios para el crecimiento tumoral; enzimas que actúan destruyendo cadenas de oligonucleótidos, enzimas para terapia de reemplazo (generalmente enzimas digestivas) para la corrección de diversas insuficiencias del tracto digestivo; enzimas para el tratamiento de enfermedades de depósito lisosomal; enzimas para terapia trombolítica; enzimas antibacterianas y antivirales, y enzimas hidrolíticas y antiinflamatorias.
En otra realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3"M+ )n]m, en el que E es un polipéptido de toxina de la clase de toxinas vegetales y bacterianas modificadas.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3"M+)n]m, donde E es un polipéptido de toxina de la clase de toxinas vegetales y bacterianas modificadas, donde los polipéptidos de toxina pertenecen a la clase de proteínas inhibidoras ribosómicas y secuencias estructuralmente derivadas para la inhibición del crecimiento tumoral.
En otra realización muy específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3"M+)n]m, en donde E es un polipéptido de toxina de la clase de toxinas vegetales y bacterianas modificadas, en donde los polipéptidos de toxina comprenden toxina diftérica, toxina diftérica que carece de actividad de unión al receptor, exotoxina A de pseudomonas; formas truncadas de exotoxina de pseudomonas que carecen del dominio de unión al receptor Ia, toxina de ricina, saporina, diantina, gelonina, tricosantina, proteína antiviral de hierba carmín (PAP), bouganina, antígeno protector del ántrax, toxina alfa, abrina, polipéptidos inductores de apoptosis.
En una realización muy específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3"M+)n]m, en el que E comprende proteínas seleccionadas de p53 de tipo natural, p21 de tipo natural, factor inductor de apoptosis 1 (AIF1), ASK1, proteína inductora de apoptosis (AIP), caspasa-2, caspasa-3, caspasa-6, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10, Bax, serina proteasa, Snac, citocromo c, Apaf-1, apoptina.
En otra realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3- M+ )n]m, en el que E es un polipéptido selectivo de los mecanismos de la mitosis para la inhibición del crecimiento tumoral.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3- M+)n]m, donde E es un polipéptido tóxico seleccionado del grupo que comprende desoxirribonucleasa I (DNasa I), desoxirribonucleasa II (DNasa II), polipéptidos selectivos de alfa-tubulina, polipéptidos selectivos de beta-tubulina, polipéptidos selectivos de dineína, polipéptidos conjugados selectivos de quinesina, polipéptidos selectivos de NEDD1, polipéptidos selectivos de la proteína TACC de hélice superenrollada ácida transformante, polipéptidos selectivos del tumor hepático colónico que sobreexpresa el gen chTOG.
El aumento del conocimiento sobre las estructuras de las toxinas y el mecanismo de acción conduce a nuevas entidades químicas que ahora se encuentran en investigación preclínica y clínica. La mayoría de las toxinas de proteínas naturales se pueden dividir en tres grupos principales, (1) toxinas que dañan la célula al alterar la integridad de la membrana, (2) toxinas que alteran la actividad eléctrica normal del sistema nervioso del organismo intoxicado, (3) toxinas que alteran o interfieren con los procesos celulares y pueden afectar a las células objetivo mediante actividades enzimáticas o no enzimáticas. Algunos miembros del tercer grupo son polipéptidos extremadamente tóxicos que tienen la capacidad de autotranslocación al citoplasma celular donde ejecutan su actividad que, en la mayoría de los casos, conduce a la muerte de la célula intoxicada. Sin embargo, la aplicación clínica de toxinas modificadas aún afronta muchos desafíos. Dos problemas principales asociados con la administración sistémica de inmunotoxinas son (1) la falta de especificidad resultante de la presencia del antígeno/receptor objetivo que también está presente en el tejido sano y (2) la intoxicación indeseada del tejido sano debido a la unión de la inmunotoxina a los componentes de la superficie celular en lugar de específicamente a su antígeno/receptor objetivo ("toxicidad independiente del objetivo"). Así, en una realización, el objeto de la presente solicitud son conjugados de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+ )n]m, con polipéptidos tóxicos o toxinas para el tratamiento de enfermedades proliferativas mediante la administración intracelular de estos tipos de efectores terapéuticos.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, donde los dendrímeros sulfatados se conjugan químicamente con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o proteínas manipuladas y permiten la administración intracelular en células proliferativas tales como células tumorales y células inflamatorias activadas.
En una realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, donde las moléculas efectoras terapéuticas E tienen un peso molecular igual o inferior a 100 kDa, más preferiblemente por debajo de 80 kDa, aún más preferiblemente por debajo de 60 kDa, que se puede lograr mediante la conjugación de dendrímeros sulfatados con fragmentos de anticuerpos seleccionados de scFv, scFv2 , Fab, anticuerpo de dominio único, minicuerpo, anticuerpo BiTE o diacuerpo, y más preferentemente por debajo de 40 kDa, que se puede lograr mediante la conjugación de dendrímeros sulfatados con fragmentos de anticuerpo seleccionados de scFv, anticuerpo de dominio único o péptidos sintéticos de bajo peso molecular.
Dentro del grupo de péptidos sintéticos, estos son péptidos de cadena abierta, péptidos cíclicos a través de ciclación N/C-terminal, péptidos cíclicos a través de ciclación cisteína-cisteína (disulfuro) y péptidos con ciclos alifáticos conectados a través de aminoácidos no naturales (como los péptidos grapados) de hasta 25 aminoácidos, preferiblemente hasta 20 aminoácidos, más preferiblemente hasta 15 aminoácidos, lo más preferiblemente hasta 10 aminoácidos.
Los péptidos más largos de hasta 30 a 40 aminoácidos también son objeto de la invención, particularmente porque se pueden emplear aminoácidos adicionales con el propósito de espaciar, introducir solubilidad e impartir una estabilidad mejorada.
Otra realización dentro de los péptidos sintéticos descritos anteriormente son preferiblemente motivos estructurales derivados de péptidos de unión naturales implicados en la interacción proteína-proteína y que emplean secuencias que forman hélices alfa específicas. En particular, estas secuencias peptídicas helicoidales alfa se caracterizan por una cierta helicidad en disolución, generando así afinidad de unión a otras proteínas. El grado requerido de helicidad depende de la estructura peptídica aplicada (Bernal F et al., Methods Mol. Biol. 2014, 1176, 107-14), y puede ser medido por un experto, p. ej. mediante espectroscopía de CD o H-RMN (Bonache MÁ et al., ACS Comb Sci. 2014, 16, 250-258). La helicidad se da en [%].
Por tanto, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, donde E es un péptido helicoidal alfa dirigido contra interacciones proteína-proteína o moléculas implicadas en la proliferación y apoptosis de células tumorales, donde el conjugado se localiza dentro de la célula tumoral, preferiblemente dentro del citosol de las células tumorales. Se prefieren los conjugados en los que m es 1. Se prefieren los péptidos sintéticos de hasta 40 aminoácidos, preferiblemente hasta 30 aminoácidos, más preferiblemente hasta 20 aminoácidos que forman una hélice alfa en disolución acuosa. La hélice alfa se puede estabilizar empleando aminoácidos no naturales en la secuencia y/o formando péptidos cíclicos (por ejemplo, pero sin limitación, ciclación de cabeza a cola, ciclación mediante disulfuros, grapado de hidrocarburos). Los valores preferidos de helicidad de estos péptidos están por encima del 40 %, más preferiblemente por encima del 60 %, incluso más preferiblemente por encima del 80 %. La presente invención también comprende el descubrimiento sorprendente con respecto al peso molecular de las moléculas efectoras terapéuticas, particularmente del grupo de polipéptidos o proteínas. Sorprendentemente, se ha descubierto que los dendrímeros sulfatados conjugados químicamente con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o proteínas manipuladas permiten la administración intracelular en células proliferativas tales como células tumorales. Los anticuerpos de tipo IgG son proteínas con un peso molecular promedio de 150 kDa, y generalmente no pueden entrar en el citoplasma. El grado de captación intracelular de conjugados de anticuerpos con dendrímeros se investigó en una serie de diferentes líneas de células tumorales y se determinó mediante mediciones FACS así como mediante microscopía de fluorescencia. Se ha descubierto que ya 3 horas después de comenzar la incubación de células tumorales con conjugados de IgG con dendrímeros, existía una captación intracelular. El número de células positivas, así como el grado total de captación, aumentó con la incubación de las células tumorales con conjugados de IgG con dendrímeros hasta 24 horas. Además, se ha observado sorprendentemente que el peso molecular de las proteínas terapéuticas es crucial con respecto a la cinética de captación. En detalle, los conjugados de proteínas con dendrímeros con un peso molecular total inferior a 150 kDa demuestran una absorción intracelular más rápida y un mayor grado de células positivas que la IgG completa con un peso molecular de 150 kDa. Los fragmentos de anticuerpos como (Fab)2 , scFv-Fc o diacuerpo representan proteínas con un peso molecular promedio de 100 - 120 kDa. La captación intracelular más intensa está presente en los conjugados de proteínas con dendrímeros con un peso molecular inferior a 40 kDa, como los anticuerpos de un solo dominio (15 kDa). Un experto puede medir el grado de captación intracelular por parte de las células tumorales con la medición FACS en diferentes momentos después de comenzar la incubación (véase también el Ejemplo 15).
En una realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende conjugados de dendrímeros, en los que estos conjugados de dendrímeros son conjugados con anticuerpos bi, tri o multiespecíficos, fragmentos de anticuerpos o proteínas diseñadas, en donde estas proteínas están dirigidas a más de un objetivo molecular y pueden inducir efectos terapéuticos en diferentes mecanismos de enfermedad al mismo tiempo.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, en el que E comprende polipéptidos, que comprenden una o más secuencias de localización nuclear (NLS) en su secuencia de aminoácidos, que se sabe que marcan el polipéptido, lo que permite el transporte al núcleo celular mediante transporte nuclear, p. ej. involucrando al receptor de importina. Los expertos conocen las NLS (véase Lange et al., J Biol Chem. 2007, 282, 5101-5) e implica normalmente una o más secuencias de aminoácidos catiónicos (lisinas, argininas).
Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, en la que E es una pequeña molécula efectora terapéutica de la clase de agentes antineoplásicos tales como agentes antineoplásicos alquilantes y similares a alquilantes, p. ej. cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida, melfalano, clorambucilo, alquilsulfonato, busulfano, treosulfano, carmustina, lomustina, nimustina, estramustina, estreptozotocina, procarbazina, dacarbazina, temozolomida, tiotepa, duocarmicina y análogos, centanamicina, adozelesina, bizelesina, carzelesinor, una molécula efectora terapéutica de la clase de los antimetabolitos como los análogos de las purinas (6-tioguanina, pentostatina, azatioprina, 6-mercaptopurina, fludarabina, cladribina) o los análogos de las pirimidinas (gemcitabina, 5-fluouracilo) o los antifolatos (metotrexato), alcaloides y terpenoides vegetales con actividad antimitótica como los alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina), disorazoles y derivados (disorazol A1, A2, E1, Z), podofilotoxina como etopósido y tenipósido, taxanos (docetaxel, paclitaxel), colchicinas y derivados, maitansina y derivados incluidos los análogos con enlazadores, geldanamicina y análogos como aminohexilgeldanamicina o 17-aminogeldanamicina; inhibidores de la topoisomerasa como derivados de la camptotecina irinotecano y topotecano, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido, antibióticos antitumorales como dactinomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, mitomicina, pirrolobenzodiazepinas (PBD) como antramicina, mazetramicina, tomaimicina y análogos como dímeros de PBD, inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de multicinasa como estaurosporina, afatinib, axitinib, cabozantinib, crizotinib, dabrafenib, foretinib, flumatinib, imatinib, ponatinib, regorafenib, rigosertib, sorafenib, sunitimib, tasocitinib, vandetanib, vemurafenib, ruxolitinib, tasozitinib, trametinib y análogos de estos agentes con grupos funcionales para conjugación covalente; otros agentes antimitóticos sintéticos o semisintéticos, tales como derivados de auristatina, que incluyen monometilauristatina E, monometilauristatina F y análogos, derivados de dolastatina que incluyen monometildolastatina N y análogos, tubulisina y análogos, caliqueamicina y derivados que incluyen caliqueamicina 1 y N-acetil y caliqueamicina DMH; inhibidores de la ARN polimerasa II como el péptido cíclico alfa-amanitina y análogos.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, en la que E es una molécula efectora terapéutica, en la que las moléculas efectoras polipeptídicas son anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, que se conjugan con una molécula efectora terapéutica pequeña de la clase de agentes antineoplásicos.
En una realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, en el que las moléculas efectoras polipeptídicas conjugadas con una molécula efectora terapéutica pequeña de la clase de agentes antineoplásicos se seleccionan de trastuzumab-DM1 (anticuerpo conjugado con maitansina), anticuerpos o diacuerpos conjugados con monometil auristatina E o F, anticuerpos conjugados con caliqueamicina.
En otra realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, en la que E es una pequeña molécula efectora terapéutica de la clase de fotosensibilizadores tales como tetrapirroles, porfirinas, safirinas, clorinas, tetrafenilporfirinas, tetrafenilclorinas, bacterioclorinas, tetrafenilbacterioclorinas, feofórbidos, bacteriofeofórbidos, pirofeofórbidos, bacteriopirofeofórbidos, purpurinimidas, bacteriopurpurinimidas, benzoporfirinas, ftalocianinas, naftalocianinas y derivados de las mismas. Preferiblemente, el fotosensibilizador se selecciona del grupo que comprende feofórbido a, pirofeofórbido a, 3-acetilfeofórbido a, 3-acetilpirofeofórbido a, purpurina-18-n-alquilimida, purpurina-18-n-hidroxilimida, 3-acetilpurpurina-18-n-alquilimida, 3-acetilpurpurina-18-n-hidroxilimida, cloro e6, Sn-cloro e6, m-tetrahidroxifenilclorina (m-THLC) y derivado de benzoporfirina, monoácido derivado de benzoporfirina (BPD-MA, verteporfina).
En otra realización específica de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, donde G se selecciona del grupo que consiste en O, S, NH, NH-O, C(=O)NH, OC(=O)NH, OC(=O)O, NHC(=O)NH, NHC(=S)NH, C(=NH)NH, C(=O), S(=O)2 , S(=O), S(=O2)O, S-S, CH=N, CH=N-NH, C=N-NHC(=O), OP(=O)(O-M+)O, P(=O)(O' M+)O, arileno, etenileno, etinileno y triazolileno.
En otra realización muy específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, en el que G se forma por la reacción de conjugación entre un grupo reactivo del enlazador L y la molécula efectora terapéutica E. Los grupos reactivos comprenden COOH, ésteres activados de COOH como éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de p-nitrofenilo, éster de pentafluorofenilo o éster de sulfodiclorofenilo; amino, hidrazina, carboxihidrazino, isotiocianato, isocianato, maleimido, tetrazina, éster vinilsulfónico, vinilsulfona amida, bromoacetilo, yodoacetilo, bromoacetilamida, yodoacetilamida, carbaldehído, tiol, disulfuro de piridilo, tioacetilo, azido, propargilo, etinilo, alilo, vinilo, (difluoro)ciclooctinilo, triarilfosfina, bis(alquiloxi)arilfosfina, (glicil)glicilglicina, guanidina. Se prefieren las conexiones de las siguientes estructuras: C(O)NH derivado de un éster activado en L (que comprende éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de sulfo-N-hidroxisuccinimidilo, éster de p-nitrofenilo), NHC(S)NH derivado de un grupo isotiocianato en L, -S-succinilamida derivada de un grupo maleimido en L, disulfuro -SS- derivado de piridildisulfuro o acetilsulfuro en L, triazol derivado de un grupo propargilo terminal o un grupo ciclooctinilo en L, -CH=N-(imina) derivado de un grupo aldehído en L, -CH2-NH-(amina vía imina mediante aminación reductora) derivado de un grupo aldehído en L.
En otra realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado, en el que G para la conexión comprende un enlace amida C(O)NH, que forma parte de una cadena peptídica derivada de una reacción de ligadura enzimática.
Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, donde el contraión M+ comprende cationes orgánicos e inorgánicos, seleccionados de lisina, meglumina, TRIS, glicina u otras aminas derivadas de aminoácidos, o potasio, sodio, litio, o mezclas de los mismos.
En otra realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, donde m es un número entre 1 y 20, que describe que la realización comprende 1 o más sistemas enlazadores de dendrímeros sulfatados G-L-D(OSO3-M+ )n que están conectados a la molécula efectora terapéutica E.
Para el dendrímero D(OSO3-M+ )n el número de sulfatos también está relacionado con su peso molecular resultante compuesto por la estructura dendrítica y los grupos sulfato incluyendo el contraión. Se descubrió que la densidad de los sulfatos debe estar a un cierto nivel. Así, el peso molecular de D(OSO3 'M+ )n está limitado para cada número n.
Según la presente invención, los dendrímeros D(OSO3 'M+)n tienen las siguientes relaciones entre n y el peso molecular, dadas para M+ siendo un ion alcalino, preferiblemente sodio.
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Se descubrió sorprendentemente que un dendrímero altamente sulfatado acoplado a un fragmento de anticuerpo (50 kDa, marcado con fluorescencia en el rango de Cy3 con colorante ICC, véase el ejemplo 8) permitía una detección 3 veces mayor en células tumorales con un número de sulfatos de 24 o 32, en comparación con un conjugado análogo con un número de sulfatos de 12 o 16. Sin embargo, al usar un efector molecular pequeño E (1200 Da) se observó un efecto similar con un dendrímero de 12 y 18 grupos sulfato.
Por lo tanto y por conveniencia en el proceso de síntesis, un número par de n de 12, 16, 18, 24, 30, 32, 36, 40, 48, 72 o 96 es objeto de la presente invención en una realización preferida. Preferiblemente, n es 12, 18, 24, 32, 36, 40 o 48. Cuando E representa una proteína de peso molecular superior a 40 kDa, n es preferiblemente 24, 32, 36, 40, 48 o mayor. Cuando E representa un compuesto de molécula pequeña o un péptido de aproximadamente 600 a 2000 Da, o una proteína de 1200 a 40000 Da, n es preferiblemente 12, 16, 24 o 32. Cuando m es 2 o mayor, n es preferiblemente 6, 12, 16 o 24.
La composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula general E-[G-L-D(OSO3-M+ )n]m, para uso en el tratamiento de una enfermedad mediante captación intracelular en células activadas o células proliferativas.
Según la presente invención, la composición farmacéutica comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m para el uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende cáncer, inflamación, enfermedad autoinmune, enfermedad metabólica y fibrosis, así como para un tratamiento antiproliferativo, proproliferativo, antiapoptótico, proapoptótico, antifibrótico, profibrótico, antilipogénico, antidiabético, inmunoestimulante y antienvejecimiento.
En una realización más preferida, la composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades metabólicas, en donde dichos conjugados de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas están dirigidos contra objetivos moleculares en células hepáticas tales como hepatocitos o células estrelladas hepáticas.
En una realización más específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades metabólicas tales como diabetes, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática inducida por fármacos o "tóxica", enfermedad hepática grasa (esteatosis hepática), enfermedad del hígado graso no alcohólico, esteatohepatitis, cirrosis secundaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Budd-Chiari, hemocromatosis, amiloidosis hereditaria, síndrome de Gilbert.
En una realización aún más específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades virales del hígado, en donde dichos conjugados están dirigidos contra objetivos moleculares virales y no virales en células hepáticas tales como hepatocitos o células estrelladas hepáticas.
En otra realización más específica, la composición farmacéutica comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades metabólicas tales como hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, hepatitis inducida por el virus de Epstein-Barr, hepatitis inducida por citomegalovirus, hepatitis inducida por el virus del herpes simple, virus de la rubéola, hepatitis inducida por el virus de las paperas, hepatitis inducida por el virus de la rubéola, hepatitis inducida por adenovirus, hepatitis inducida por la fiebre amarilla.
En otra realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de dendrímeros sulfatados y moléculas terapéuticas para el uso en el diagnóstico y tratamiento, donde las moléculas terapéuticas conjugadas con dendrímeros sulfatados pueden seleccionarse del grupo de deleburir, ledipasvir, lamivudina, adefovir, dipivoxil, televudina, tenafavir, ribavarina, telaprevir, boceprevir, simeprevir, asunaprevir, faldaprevir, sofosbuvir, daclatasvir, vaniprevil, entecavir, ABT-333, ABT-072, BMS-791325, interferón alfa, interferón pegilado -alfa, VX-950, VX-222, VX-985, ALS-2200, ALS-2158, SIRNA-034, MK-0608, R7227, R7128 (RO24048), RG7348, TMC435, TMC649128, PF-868554, PF- 4878691, BI 201335, BI 207127, IC41, BMS-790052, BMS-791325, BMS-650032, BMS-824393, ANA598, VCH-759, GI 5005, ITX5061, ITX4520, IDX184, IDX320, IDX375, A-837093, GS 9190, GS 9256, ACH-1095, ACH-1625, ACH-2684, ACH-2928, PPI-461, PPI-1301, TG4040, AZD7295, MBL-HCV1, Clemizol, SPC3649, inhibidor de mRNA122 de ácido nucleico bloqueado, GNI-103, GNI-104, GSK625433, ABT-450, ABT-072, INX-189, PSI-938, EDP-239, SP-30, AVL-181, AVL- 192, ATI-0810, PRO 206, ITX2155, VX-500, VX-813, Albuferón, albinterferón alfa-2b, SCV-07, MX3235 Celgosivir, KPE02001003, KPE00001113, CTS-1027, CB5300, Debio 025, MDX-1106 (ONO -4538), CYT107, CB-183872, inhibidor de entrada de amplio espectro REP 9C, AN 025-1, GEA007.1, IMMU 105.
En una realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica, donde dicha composición tiene una forma farmacéutica unitaria, como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvo, granulado, disoluciones o suspensiones parenterales estériles.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica, en la que la composición es una formulación sólida del conjugado según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, junto con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables conocidos.
En una realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica, en la que la forma farmacéutica es un liofilizado.
En una realización más preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica, en la que la vía de administración es parenteral, que incluye la vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intraocular, intramuscular, intratumoral.
En una realización aún más preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica, en la que la vía de administración se selecciona de una vía de administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal, incluidas las dosis múltiples de compuestos, incluido el tratamiento diario, el tratamiento cada 2 hasta 7 días, el tratamiento más de una vez al día, o intervalos de tiempo como el tratamiento en intervalos de cinco días.
En otra realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica para uso en un tratamiento múltiple, donde el tratamiento múltiple de pacientes comprende una dosis subcutánea de 0,1 mg/kg hasta 1000 mg/kg, preferiblemente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, lo más preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
En otra realización específica, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, donde el número m puede diferir dependiendo de la naturaleza de la molécula E utilizada según dicha fórmula. Las realizaciones ejemplares se describen en detalle a continuación en el contexto de su síntesis. Otro objeto de la presente invención es el uso de proteínas según la fórmula general E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, en donde la conjugación de D a través del enlazador L con el grupo conector G se produce con los grupos amino de las lisinas, que es un procedimiento de conjugación estadística conocido para el experto. Los ejemplos 11 - 13 demuestran varias posibilidades. La conjugación ocurre estadísticamente dependiendo del número de funciones amino accesibles. Por lo tanto, la proporción molar del sistema dendrímero G-L-D(OSO3- M+)n respecto del polipéptido se describe mediante el número m, siendo en promedio 1 o superior. Se prefiere una proporción media entre 1 y 5, más preferiblemente entre 1 y 3 para la conjugación estadística, en la que cada uno de los dendrímeros D tiene el mismo peso molecular. Esto significa que cada dendrímero sulfatado conjugado con E tiene el mismo peso molecular, pero el conjugado puede estar compuesto por una mezcla de conjugados, cada uno con una proporción molar descrita por un valor específico de m, preferiblemente entre 1 y 10. Esto conduce a mezclas no homogéneas basado en un número medio para m. Este número medio lo puede determinar analíticamente un técnico experto, p. ej. mediante HPLC o análisis fotométrico.
En otra realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m,, en el que E comprende tiol, en el que estos son grupos tiol de cisteínas internas que normalmente son accesibles mediante la reducción de enlaces disulfuro. Los tioles se marcan preferentemente con maleimida (p. ej., dendrímeros d02, d03, d13, d14, d19, d20) formando un tioéter o disulfuro de piridilo (por ejemplo, dendrímeros d04, d05, d15, d21) formando un disulfuro para G.
En una realización preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3- M+)n]m, donde la molécula efectora E basada en polipéptidos o moléculas efectoras de moléculas pequeñas puede modificarse sintéticamente para introducir grupos funcionales reactivos que no están presentes en el polipéptido original, no son accesibles o causan pérdida de funcionalidad de E, cuando el grupo funcional respectivo se conjuga covalentemente con los dendrímeros sulfatados, p. ej. los grupos tiol de cisteínas internas que se generaron mediante la reducción de enlaces disulfuro. Los ejemplos de reacciones de polipéptidos para introducir grupos funcionales, como tiol o azida, son reacciones con 2-iminotiolano, ácido acetiltiopropiónico, ácidos azidoalquilcarboxílicos, ácidos azido-PEG-alquilcarboxílicos y otros, como sabe el técnico experto (Bioconjugate Techniques; Greg T. Hermanson; Academic Press, 2008).
En una realización preferida, el objeto de la presente invención es el uso de polipéptidos que se modifican mediante ingeniería biotecnológica para transportar estructuras en posiciones definidas en la secuencia polipeptídica que tienen la función de conjugación covalente específica del sitio con cargas útiles (Wang et al., Front Biosci. 2008, 13, 1716). Son muy conocidos los motivos de cisteína (etiqueta de Cys, como la secuencia de aminoácidos GGGCA o GGGCGGG), las funciones de azida para el marcaje mediante química clic codificadas a través del reemplazo de metionina por azidohomoalanina (Kiick et al., PNAS 2002, 99, 19-24), o motivos para la ligadura enzimática, como la ligadura mediada por sortasa de la secuencia C-terminal LPXTG con un motivo de glicina N-terminal (Popp et al., Nature Chem Biol., 2007, 11, 707). Los polipéptidos son accesibles mediante la tecnología conocida de producción recombinante o mediante síntesis de péptidos en fase sólida. Así, la realización comprende también una proporción molar m del sistema dendrímero G-L-D(OSO3 'M+)n respecto del polipéptido que es exactamente 1 debido a la conjugación dirigida al sitio, al contrario de la conjugación estadística que proporciona números promedio para m, como se describió anteriormente. Se prefiere la conjugación con el grupo tiol de una etiqueta de cys con maleimida formando un tioéter, o piridildisulfuro formando un disulfuro para G, así como la ligadura enzimática mediada por sortasa para la secuencia LPXTGG (p. ej., con dendrímero d25), y el marcaje mediante química clic de azidas derivadas de azidohomoalanina.
En una realización específica, el objeto de la presente invención es un conjugado según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m, en donde la molécula efectora E tiene un peso molecular mayor que el dendrímero sulfatado conjugado. Una realización preferida comprende conjugados en los que E se basa en un polipéptido que tiene un peso molecular hasta 20 veces mayor (en Dalton) en relación con la suma del peso molecular dado por el número n de unidades dendriméricas idénticas [G-L-D(OSO3 'M+)n]m conjugadas con el polipéptido, más preferentemente un peso molecular de hasta 10 veces, incluso más preferentemente un peso molecular de hasta 5 veces.
En otra realización, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un conjugado según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, donde E es un polipéptido terapéutico de la clase de enzimas que eliminan nutrientes o factores indispensables del citosol de las células tumorales. Por ejemplo, sorprendentemente se descubrió que los conjugados de dendrímeros de L-asparaginasa actúan como un fuerte agente antiproliferativo en muchas líneas de células tumorales. Hasta el momento, un experto no pudo administrar la macromolécula terapéutica L-asparaginasa en el citosol de la célula tumoral. Sin embargo, esta característica es de suma importancia, ya que la mayoría de las células tumorales pueden compensar la falta de captación de asparagina mediante la síntesis intracelular de novo. Esto incluye también conjugados de proteínas con dendrímeros selectivos del metabolismo tumoral. Se prefieren proteínas enzimáticas como moléculas efectoras terapéuticas tales como glicosilasas, hidrolasas, piruvato quinasas, fumarato hidratasas, hexoquinasas, aldolasas, enolasas, glucosa fosfato isomerasas.
En una realización particularmente preferida, el objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un dendrímero conjugado según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m con L-asparaginasa, que es un homotetrámero, y cada una de las cuatro unidades proporciona un puente disulfuro para la reducción y la conjugación sin pérdida de la función enzimática (Balan et al., Bioconjugate Chem. 2007, 18, 61), véase el Ejemplo 12a para la síntesis y los Ejemplos 15 y 16 para los datos biológicos.
En otra realización, el objeto de la presente invención es el uso de proteína A o proteína G, que está disponible en diferentes formatos, incluidos los que emplean una etiqueta de cys. Por ejemplo, los dendrímeros se conjugan con rCys-proteína G (ejemplo 12c), manteniendo la afinidad de unión de la proteína G a la estructura Fc de la IgG murina o humana. Por lo tanto, el objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende conjugados de dendrímeros según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m, en donde el efector terapéutico es un complejo anticuerpo IgG - proteína A o proteína G, con la conjugación covalente del dendrímero sulfatado a la proteína A o G, utilizando técnicas de conjugación como las descritas anteriormente. El número m es preferiblemente 1, 2 o 3, usando un dendrímero sulfatado en la proteína A o G, y ajustando la proporción entre la IgG y la proteína A/G del dendrímero mediante ensamblaje no covalente en disolución.
En una realización preferida, el objeto de la presente invención es un método para tratar una enfermedad como la descrita anteriormente que comprende el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros sulfatados con moléculas efectoras terapéuticas según la Fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m, en donde el efector terapéutico E se administra al citosol. Este método es aún más preferido, en donde el suministro al citosol se produce con enlazadores L estables, lo que no permite la liberación/escisión del efector terapéutico E del dendrímero sulfatado. La medición de la liberación del fármaco a partir de una molécula transportadora se puede realizar mediante métodos conocidos por los expertos, p. ej. descritos por Wakankar et al., MAbs 2011,3, 161-172, incluidos los métodos de HPLC o espectroscopia de masas utilizados para analizar conjugados de fármacos incubados en suero humano. Dentro de la realización, un método preferido es la aplicación descrita en la presente memoria con una estabilidad de los conjugados de dendrímeros descritos, lo que lleva a que el fármaco libre no supere preferiblemente el 10 %, más preferiblemente el 5 % de la cantidad conjugada (100 %), medida después de 24 h de incubación en suero humano a 37 °C mediante HPLC.
En una realización preferida, el objeto de la presente invención es un método para tratar una enfermedad como la descrita anteriormente que comprende el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros sulfatados con moléculas efectoras terapéuticas según E-[G-L-D(OSO3"M+ )n]m, en el que el efector terapéutico E no es aplicable como fármaco solo sin conjugación, debido a que las concentraciones en plasma y tejido son demasiado tóxicas para el organismo. Estos son preferiblemente maitansina y análogos, auristatina y análogos y estaurosporina y análogos. Los conjugados de dendrímeros sulfatados con estas moléculas terapéuticas exhiben una toxicidad mucho menor para las células que no proliferan en comparación con las moléculas de fármaco solas. En el organismo, se detectan niveles bajos de fármaco libre en plasma, cuando se utiliza una estructura enlazadora no escindible para L que es estable en condiciones fisiológicas en el organismo.
Otro aspecto de la realización se refiere a los compuestos terapéuticos E con respecto a su propiedad de exhibir solo una penetración limitada en la célula sin conjugación con un dendrímero sulfatado. Estas suelen ser las estructuras de proteínas y polipéptidos descritas anteriormente, pero también compuestos citotóxicos sintéticos hidrofílicos. El ejemplo 15 muestra que la proteína L-asparaginasa no muestra captación en las células tumorales, mientras que la L-asparaginasa conjugada con un dendrímero sulfatado muestra una concentración sustancialmente mejorada dentro de las células tumorales (tabla 5). Por lo tanto, tras la conjugación del dendrímero, se potencia la captación celular. Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es un método en el que se produce una captación mejorada de 3 veces, preferiblemente de 5 veces, lo más preferiblemente por encima de 10 veces, con respecto al número de moléculas conjugadas de dendrímeros sulfatados con moléculas efectoras terapéuticas de acuerdo con la Fórmula E-[GLD(OSO3-M+ )n]m localizándose dentro de la célula (p. ej., medido en FACS utilizando conjugados marcados con un colorante, véase el ejemplo 15) respecto de las moléculas terapéuticas E no conjugadas.
Dentro del alcance de la presente invención, los compuestos de fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+)n]m muestran un efecto citotóxico sobre las células tumorales, como también se describe en los ejemplos auxiliares. Este efecto puede ser cuantificado por un valor de CI50 en M [mol/L], como se indica en varios ejemplos. Por lo tanto, también es objeto de la presente invención proporcionar un método para tratar una enfermedad como la descrita anteriormente que comprende el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros sulfatados con moléculas efectoras terapéuticas de acuerdo con dicha Fórmula al exhibir un valor de CI50 en cultivo de células tumorales inferior a 10' 7 M, preferiblemente menos de 10' 8 M, más preferiblemente menos de 10' 9 M. Se entiende que este valor puede diferir según la línea celular utilizada y el método de análisis (que puede ser la proliferación celular analizada mediante la prueba MMT o el recuento de células vivas frente a células muertas).
Entre el grupo de proteínas que actúan como reactivos de unión y que normalmente se aplican para bloquear la interacción proteína-proteína, los armazones de polipéptidos modificados genéticamente tienen una gran importancia. Los armazones polipeptídicos representan polipéptidos que portan una estructura polipeptídica natural rígida que se puede utilizar para modificar un sitio de unión existente o implementar uno nuevo para un objetivo molecular. Por lo general, dicho armazón deriva de un polipéptido monomérico soluble pequeño y robusto (como los inhibidores de Kunitz o las lipocalinas) o de un dominio extramembrana plegado de manera estable de un receptor de la superficie celular (p. ej., proteína A, fibronectina o la repetición de anquirina). En comparación con los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, estos armazones polipeptídicos a menudo brindan ventajas prácticas que incluyen una mayor estabilidad y un alto rendimiento de producción en los sistemas de expresión microbiana, junto con una situación de propiedad intelectual independiente. Dado que estos polipéptidos de unión se obtienen por medio de un proceso de ingeniería biomolecular para lograr una fuerte actividad de unión al objetivo, también pueden someterse a otros esquemas de selección centrados en otras propiedades deseadas (como solubilidad, estabilidad térmica, resistencia a proteasas, etc.). Se han propuesto más de 50 armazones polipeptídicos diferentes en los últimos 10-15 años. Los enfoques más avanzados en este campo comprenden las siguientes clases de polipéptidos (1) aficuerpos basados en el dominio Z de la proteína A estafilocócica, un haz de tres hélices de 58 residuos que proporciona una interfaz en dos de sus hélices a, (2) dominios de Kunitz diseñados basados en un inhibidor de serina proteasa reticulado con disulfuro, pequeño (aprox. 58 residuos) y robusto, típicamente de origen humano (p. ej., LACI-D1), que puede diseñarse para diferentes especificidades de proteasa, (3) monocuerpos o adnectinas basados en el décimo dominio extracelular de la fibronectina III humana (10Fn3), que adopta un pliegue en sándwich p similar a Ig (94 residuos) con 2-3 bucles expuestos, pero que carece del puente disulfuro central, (4) anticalinas derivadas de las lipocalinas, un familia diversa de proteínas de barril p de ocho hebras (aprox. 180 residuos) que forman naturalmente sitios de unión para ligandos pequeños por medio de cuatro bucles estructuralmente variables en el extremo abierto, que son abundantes en humanos, insectos y muchos otros organismos, ( 5) DARPinas, dominios de repeticiones de anquirina diseñados (166 residuos), que proporcionan una interfaz rígida que surge típicamente de tres giros p repetidos y, finalmente, algunas otras proteínas de unión basadas en pliegues más peculiares, como un módulo l Dl R-A multimerizado (Avímeros o péptidos de knottina ricos en cisteína).
Además de muchas propiedades atractivas de los armazones diseñados, se ven obstaculizados por su bajo peso molecular, lo que conduce a una eliminación rápida después de la inyección intravenosa. Otro objeto de la presente invención son los conjugados de dendrímeros y polipéptidos modificados por ingeniería genética para la administración intracelular de los polipéptidos modificados por ingeniería genética con el fin de interferir con los mecanismos de crecimiento tumoral. En una realización preferida, el objeto de la presente invención son conjugados de dendrímeros sulfatados y polipéptidos modificados genéticamente, en los que los polipéptidos son conjugados de dendrímeros con aficuerpos, conjugados de dendrímeros con dominios de Kunitz, conjugados de dendrímeros con anticalina, conjugados de dendrímeros con afilina, conjugados de dendrímeros con monocuerpo (adnectina), conjugados de dendrímeros con DARPinas y conjugados de dendrímeros con péptidos. En una realización particularmente preferida, el objeto de la presente invención son las composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros y proteínas diseñadas que ejercen una alta afinidad de unión al objetivo terapéutico en el rango picomolar y una alta estabilidad como las DARPinas.
Un experto sabe que los polipéptidos de armazones diseñados pueden sintetizarse y expresarse como dímeros o multímeros de más de 3 cadenas polipeptídicas con unión selectiva al antígeno idéntico, así como antígenos similares o diferentes. De este modo, se puede lograr un aumento de la vida media circulatoria en la sangre y un aumento de la fuerza de unión al objetivo. Los conjugados de dendrímeros y polipéptidos diseñados diméricos o múltiples son inventivos y no se conocen en la bibliografía. Sorprendentemente, se ha observado que los conjugados de dendrímeros y un armazón diseñado que consta de 2 a 100 cadenas polipeptídicas repetidas tienen una actividad inhibidora del crecimiento mucho más fuerte que los conjugados de dendrímeros y un único polipéptido diseñado. Por tanto, en una realización preferida, el objeto de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros y de 2 a 20 cadenas polipeptídicas repetidas. En una realización particularmente preferida, el objeto de la presente invención son conjugados de dendrímeros y de 2 a 10 polipéptidos repetidos. En otra realización, el objeto de la presente invención son conjugados de dendrímeros y múltiples polipéptidos repetidos, en los que los polipéptidos están conectados por moléculas enlazadoras escindibles, tales como secuencias de aminoácidos escindibles enzimáticamente.
Otro aspecto de la invención está relacionado con la inhibición de la unión molecular de la L-selectina, que se puede determinar como se describe por Dernedde et al. en PNAS, 2010, 107, 19679-84. En la presente memoria, poliglicerolsulfato polimérico no definido (Mn ~ 10 kDa) exhibe una alta capacidad de inhibición de la unión de L-selectina con una CI50 de 8 nM, por ejemplo, usando un polímero con 61 grupos sulfato en promedio. Con un dendrímero sulfatado definido según la invención, que de manera comparable alberga 48 grupos sulfato, los valores (~ 300 nM) son sorprendentemente más altos, lo que indica una inhibición de la unión de L-selectina mucho más débil. Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de dendrímeros según la fórmula E-[G-L-D(OSO3 'M+ )n]m , que exhiben valores para CI50 de inhibición de la unión de L-selectina de > 30 nM, preferentemente > 100 nM, más preferentemente > 300 nM, lo más preferentemente > 500 nM, medida según PNAS, 2010, 107, 19679-84.
Definiciones
En química, un conjugado se refiere a un compuesto formado por la unión de dos o más compuestos químicos. Como se usa en la descripción de la invención y en las reivindicaciones, el término "conjugado" tiene particularmente el significado de un grupo unido de compuestos que tienen los elementos de fórmula E-[G-L-D(OSO3-M+ )n]m, en particular la molécula efectora E, el grupo funcional de conexión G, el enlazador L, el dendrímero D y los n grupos sulfato (OSO3' M+), donde M es un contraión catiónico inorgánico u orgánico, donde m es un número entero de 1 a 20.
El término "dendrímero" D como, se usa en la presente memoria, generalmente denota moléculas repetidamente ramificadas, en las que un dendrímero es típicamente simétrico alrededor del núcleo y, a menudo, adopta una morfología tridimensional esférica. Las moléculas dendríticas se caracterizan por la perfección estructural. Los dendrímeros son compuestos esféricos monodispersos y generalmente altamente simétricos. El campo de las moléculas dendríticas se puede dividir aproximadamente en especies de bajo peso molecular y de alto peso molecular. La primera categoría incluye dendrímeros y dendrones, y la última incluye polímeros dendronizados, polímeros hiperramificados y el cepillo de polímero.
Las propiedades de los dendrímeros están dominadas por los grupos funcionales en la superficie molecular, sin embargo, existen ejemplos de dendrímeros con funcionalidad interna. La encapsulación dendrítica de moléculas funcionales permite el aislamiento del sitio activo, una estructura que imita la de los sitios activos en los biomateriales. Además, es posible hacer que los dendrímeros sean solubles en agua, a diferencia de la mayoría de los polímeros, mediante la funcionalización de su capa exterior con especies cargadas u otros grupos. Otras propiedades controlables de los dendrímeros incluyen la toxicidad, la cristalinidad, la formación de tecto-dendrímeros y la quiralidad.
D es un dendrímero o estructura dendrítica estructuralmente definida con respecto a su peso molecular, siendo una estructura química de un solo peso molecular.
D(OSO3 'M+)n significa que el dendrímero D está altamente sulfatado y lleva un número n de grupos sulfato (OSO3 'M+). Los grupos sulfato derivan preferiblemente de grupos hidroxilo que se convierten en grupos sulfato (monoésteres de ácido sulfónico) mediante un proceso de sulfatación (véanse también los ejemplos). Por consiguiente, los dendrímeros comprenden un cierto número de grupos sulfato derivados de grupos OH. Estos grupos OH se ubican preferentemente en la superficie o cubierta externa del dendrímero y son parte de los bloques de construcción utilizados para constituir la estructura del poliol dendrítico.
El dendrímero D consta de unidades repetitivas de monómeros para construir la estructura dendrítica que comprende estructuras como glicerol sustituido en 1,2, glicerol sustituido en 1,3, pentaeritritol, lisina, tris(hidroximetil)aminometano. Además, estructuras de ácido alquil-carboxílico o ácido alquil-biscarboxílico, tales como tris(ácido propiónico)aminometano, ácido 1,1'-bis(hidroximetil)-propiónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido maleico, ácido glicólico, ácido diglicólico, ácido adípico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido propiónico (2-aminoetil)amida, así como estructuras de alquilamino, tales como propilenimina, etilenimina y bloques de construcción de aminoácidos son parte de la realización. Además, las estructuras de monosacáridos, como la glucosa, la manosa y la galactosa, son posibles unidades repetitivas en los dendrímeros. Los ejemplos representativos pero no limitantes se representan en las Figuras 1 a 7. Los dendrímeros preferidos contienen glicerol sustituido en 1,2 y/o glicerol sustituido en 1,3. Los dendrímeros más preferidos contienen glicerol sustituido en 1,2 y/o glicerol sustituido en 1,3, opcionalmente en combinación con unidades de ácido alquilcarboxílico, lo que permite conexiones preferentemente seleccionadas entre los grupos funcionales éster, éter y amida.
La síntesis de dendrímeros es conocida por el experto en la técnica. La estructura general del dendrímero puede construirse mediante una vía sintética convergente o una vía sintética divergente (Tomalia, documento WO2006/115547; Medina et al., Chem. Rev. 2009, 109, 3141; Crespo et al., Chem. Rev. 2005, 105, 1663). Una realización preferida de la síntesis es una ruta sintética en la que se modifica una unidad central (como se describió anteriormente) de tal manera que se establece una unidad enlazadora o un grupo funcional para la prolongación adicional con una unidad enlazadora adicional. Luego, el dendrímero se construye de manera divergente agregando más capas a partir de la unidad central. Por lo tanto, el enlazador unido a la unidad central está en la posición central como punto focal. Se puede seguir una combinación con rutas sintéticas convergentes agregando una unidad dendrímera adicional que se haya construido previamente mediante rutas divergentes o convergentes a la unidad central o las cubiertas, creando así una cubierta adicional. Además, un dendrímero sintetizado de forma convergente con unión de enlazador focal puede modificarse adicionalmente mediante una adición divergente de otras capas. La realización está respaldada por los ejemplos (1 - 11) de síntesis.
La unión de monómeros en el dendrímero se basa en grupos funcionales seleccionados de éter, tioéter, éster carboxílico, sulfoniléster, sulfonamida, carboxilamida, amina, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, hidrazona, imina, disulfuro, fosfato, fosfonato, triazol. Por lo tanto, el dendrímero consta de subunidades repetitivas o capas basadas en diferentes unidades monoméricas, incluidos, entre otros, los ejemplos descritos en la presente memoria (Figuras 1-7). Los dendrímeros preferidos contienen glicerol 1,2-sustituido y/o glicerol 1,3-sustituido, opcionalmente en combinación con unidades de ácido alquilcarboxílico, lo que permite conexiones preferiblemente seleccionadas entre los grupos funcionales éster, éter y amida.
El término dendrímero se usa a través de las realizaciones, que comúnmente se entiende como una estructura ramificada en forma de árbol. El término dendrón generalmente describe un dendrímero con un solo grupo direccionable químicamente llamado punto focal, pero los términos generalmente se usan indistintamente.
El dendrímero D está compuesto de manera que una unidad enlazadora L está unida covalentemente a él. Se prefieren las estructuras en las que la unidad enlazadora L está unida covalentemente a una posición central del dendrímero, que también se denomina punto focal. A partir de este punto focal, el dendrímero crece hasta alcanzar su estructura dendrítica. En las Figuras 1 a 7 se representan ejemplos representativos pero no limitantes, en los que la "estrella" ilustra la conexión del enlazador L al punto focal del dendrímero.
Un "enlazador" o "espaciador" de acuerdo con la invención indica una estructura química que entrecruza dos moléculas químicas formando un enlace covalente con la primera molécula y otro enlace covalente con la segunda molécula. Un enlazador normalmente comprende dos grupos reactivos, que pueden ser idénticos (enlazador homobifuncional) o diferentes (enlazador heterobifuncional). En el contexto de la presente invención, el dendrímero sulfatado D es la primera molécula y el conector forma un enlace covalente con el punto focal del dendrímero. La molécula efectora terapéutica E es la segunda molécula con un enlace covalente formado por la estructura G. El término "espaciador' se usa a menudo de manera similar, más con la intención de describir que con esta estructura se genera una cierta distancia ("espacio") entre las dos moléculas unidas.
De acuerdo con la invención, un "conjugado" es una molécula que consta de dos o más tipos diferentes de moléculas que están unidas covalentemente entre sí por un enlazador o espaciador, formando así un conjugado.
El término "grupo terminal", en el contexto de una estructura química del dendrímero D, describe las unidades de monómero de la cubierta exterior, que es el monómero al que no se une ninguna unidad de monómero adicional. La mayoría de las propiedades químicas de la molécula dependen de los tipos de grupos terminales. Las propiedades físicas de las moléculas, como la solubilidad y la viscosidad, también se ven afectadas por los grupos terminales. Por consiguiente, los grupos terminales dentro del alcance de la presente invención proporcionan grupos sulfato derivados de grupos hidroxilo. Estos grupos sulfato determinan las propiedades biológicas de los conjugados de dendrímeros de la invención con moléculas efectoras, como se describió anteriormente.
El contraión M+ comprende cationes orgánicos e inorgánicos. Los cationes orgánicos comprenden lisina, meglumina, TRIS, glicina u otras aminas derivadas de aminoácidos. Los cationes inorgánicos comprenden potasio, sodio, litio o mezclas de los mismos. Se prefiere el sodio que conduce a grupos -SO3-Na+
El término "anticuerpo" es muy conocido en la técnica. Como se usa en la presente memoria, indica una inmunoglobulina o cualquier fragmento funcional de la misma. Abarca cualquier polipéptido que tenga un sitio de unión al antígeno. Incluye, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, policlonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, humanos, monocatenarios, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados y generados in vitro . El término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb y cualquier otro fragmento de anticuerpo que conserve la función de unión al antígeno. Típicamente, dichos fragmentos comprenderían un dominio de unión al antígeno. El término "anticuerpo", como se definió anteriormente, se caracteriza preferiblemente por una constante de unión de al menos 10-7 - 10-10 M de acuerdo con la invención. Además, un "anticuerpo" es una proteína que se produce como reacción a un estímulo antigénico y reconoce y se une específicamente al antígeno que produce el estímulo.
Como se usa en la presente memoria, el término "moléculas miméticas de anticuerpos" son compuestos orgánicos que, como los anticuerpos, pueden unirse específicamente a antígenos, pero que no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Suelen ser péptidos o proteínas artificiales con una masa molar de unos 3 a 20 kDa. Los ácidos nucleicos y las moléculas pequeñas a veces también se consideran moléculas miméticas de anticuerpos, pero no los anticuerpos artificiales, los fragmentos de anticuerpos y las proteínas de fusión compuestas a partir de estos. Algunos tipos tienen una estructura de hoja beta similar a un anticuerpo. Las ventajas comunes sobre los anticuerpos son una mejor solubilidad, penetración en los tejidos, estabilidad frente al calor y las enzimas y costos de producción comparativamente bajos. Las moléculas miméticas de anticuerpos se están desarrollando como agentes terapéuticos y de diagnóstico. El término "armazones", como se usaron anteriormente, se incluye en el término "moléculas miméticas de anticuerpos". Como se usa en la presente memoria, el término "efector" se refiere a una molécula efectora que puede actuar como una molécula efectora terapéutica o diagnóstica. Una molécula efectora terapéutica suele ser una molécula que se une selectivamente a una proteína y regula su actividad biológica. De esta manera, las moléculas efectoras terapéuticas actúan como ligandos que pueden aumentar o disminuir la actividad enzimática, la expresión génica o la señalización celular. Las moléculas efectoras también pueden regular directamente la actividad de algunas moléculas de ARNm (riboconmutadores). En el contexto de la presente invención, se considera que los polipéptidos, incluidas las proteínas y los anticuerpos descritos anteriormente, funcionan como moléculas efectoras terapéuticas, especialmente en cascadas de transducción de señales celulares.
El término molécula efectora de diagnóstico se refiere a moléculas que, tras las interacciones biológicas mencionadas anteriormente, proporcionan una señal detectable o registrable que permite cuantificar o controlar la presencia de esta molécula en la célula objetivo. Esta señal se puede medir mediante técnicas analíticas, químicas o físicas, como ELISA, inmunoensayos, diagnóstico por imágenes, incluida la detección de fluorescencia, emisión radiactiva o relajación magnética. En particular, las moléculas efectoras se pueden marcar con moléculas detectables seleccionadas de colorantes fluorescentes, isótopos radiactivos, y metales paramagnéticos.
El término "proteína transportadora" abarca diferentes términos que incluyen una bomba transmembrana, proteína transportadora, proteína acompañante, proteína transportadora de ácidos, proteína transportadora de cationes o proteína transportadora de aniones. En consecuencia, es una proteína que mueve otros materiales dentro de un organismo. Se conocen diferentes tipos de proteínas de transporte según su función. Estos incluyen proteínas transportadoras involucradas en el movimiento de iones, moléculas pequeñas o macromoléculas, como otra proteína o un virus, a través de una membrana biológica. Las proteínas transportadoras son proteínas de membrana, lo que significa que existen dentro de una membrana a través de la cual transportan sustancias. También se denominan proteínas transportadoras de solutos transmembrana que ayudan en el transporte pasivo o activo, también llamado transporte mediado por transportadores.
Descripción de las figuras
La Figura 1 representa estructuras químicas ejemplares de dendrímeros sulfatados de acuerdo con la invención.
Figura 1A: núcleo derivable, p. ej. de pentaeritritol o TRIS, unidades dendriméricas: glicerol, sustituido en 1,2, conectado como éter (-O-), 24 grupos sulfato,
Figura 1B: núcleo derivable, p. ej. de glicerol o 2-amino-propano-1,3-diol, unidades dendriméricas: glicerol, sustituido en 1,3, conectado como éter (-O-), 32 grupos sulfato (el grupo sulfato se ilustra como S en las esferas, la estrella indica una conexión al enlazador L).
La Figura 2 representa estructuras químicas ejemplares de dendrímeros sulfatados de acuerdo con la invención.
Figura 2A: núcleo derivable, p. ej. de pentaeritritol o TRIS, unidades dendriméricas: pentaeritritol y glicerol, sustituidos en 1,2, conectados como éter (-O-), 36 grupos sulfato,
Figura 2B: núcleo de ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico, unidades dendriméricas: ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico, conectado como éster, y glicerol, 1,2-sustituido, conectado como éter (-O-), 32 grupos sulfato.
La Figura 3 representa estructuras químicas ejemplares de dendrímeros sulfatados de acuerdo con la invención.
Figura 3A: núcleo derivable, p. ej. de aminometil-tris(ácido propiónico) o hidroximetiltris(ácido propiónico) conectado como amida, unidades dendriméricas: glicerol, 1,2-sustituido y glicerol 1,3-sustituido, conectado como éter (-O-), 24 grupos sulfato,
Figura 3B: núcleo derivable, p. ej. pentaeritritol o TRIS, unidades dendriméricas: ácido propiónico conectado como amida, glicerol sustituido en 1,3 y glicerol sustituido en 1,3, conectado como éter (-O-), 24 grupos sulfato.
La Figura 4 representa estructuras químicas ejemplares de dendrímeros sulfatados de acuerdo con la invención. Figura 4A: núcleo derivable, p. ej. de tris(ácido propiónico)metilamina, unidades dendriméricas: pentaeritritol, conexión como éster, glicerol, sustitución 1,2 conectada como éter, 36 grupos sulfato,
Figura 4B: núcleo derivable, p. ej. de tris(ácido propiónico)metilamina, unidades dendriméricas: bis(ácido propiónico)etilendiamina, conexión como amida, triglicerolamina conectada como amida, 32 grupos sulfato.
La Figura 5 representa estructuras químicas ejemplares de dendrímeros sulfatados de acuerdo con la invención. Figura 5A: núcleo derivable, p. ej. de glicerol o 2-amino-propano-1,3-diol, unidades dendriméricas: glicerol, sustituido en 1,3, conectado como éter (-O-), ácido succínico, conectado como éster, 32 grupos sulfato,
Figura 5B: núcleo derivable, p. ej. de tris(ácido propiónico)metilamina, unidades dendriméricas: glicerol, ácido succínico 1,3-sustituido; 24 grupos sulfato.
La Figura 6 representa estructuras químicas ejemplares de dendrímeros sulfatados basados en restos de azúcar de acuerdo con la invención.
Figura 6A: núcleo basado en ciclodextrina monofuncionalizada (aquí p-ciclodextrina): unidades dendriméricas: glicerol, sustituido en 1,2, conectado como éter (-O-), 40 grupos sulfato,
Figura 6B: núcleo derivable, p. ej. de pentaeritritol o TRIS, unidades dendriméricas: ácido propiónico conectado como amida, bis(glucamina) conectado como amida, 30 grupos sulfato.
La Figura 7 representa una estructura química ejemplar de dendrímero sulfatado: núcleo derivable, p. ej. de pentaeritritol o TRIS; unidades de óxido de etileno, conectadas mediante enlace éter a pentaeritritol; unidades dendriméricas en pentaeritritol: glicerol, sustituido en 1,2, conectado vía éter; 36 grupos sulfato de acuerdo con la invención.
La Figura 8 ilustra la captación celular de conjugados de dendrímeros (Ejemplo 15) de acuerdo con la invención. La Figura 8A representa una imagen microscópica de células SKBR3 que muestra fluorescencia de ICC-d02 como una distribución homogénea que permite la visualización del cuerpo celular.
La Figura 8B muestra el espectro de absorción del lisado celular de SKBR3 después de la incubación con ICC-d02 dando 5 Mio de moléculas/célula recuperadas del compartimento intracelular.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pueden repetirse con un éxito similar sustituyendo los reactivos y/o las condiciones operativas de esta invención descritos genéricamente o específicamente. Se cree que un experto en la técnica puede determinar fácilmente las características esenciales de esta invención y entiende los Ejemplos de la invención como ilustrativos. Por lo tanto, los siguientes ejemplos no limitan el objeto de la invención.
Ejemplo 1:
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y aminodecilo enlazador (compuesto d01). Ejemplo 1a:
Síntesis de 10-azidodecil-trialilpentaeritritol
Figure imgf000020_0001
A una disolución de trialilpentaeritritol (5 g, 19,5 mmol) en 50 ml de THF seco, se le añade NaH sólido (3,9 g, 98 mmol, dispersión al 60 % en aceite mineral) en porciones. La mezcla se agita a 40 °C durante 3 h, seguido de la adición de 0,3 g de yoduro de potasio y una disolución de 1,10-dibromodecano (29,3 g, 98 mmol) en 20 ml de THF. Después de 24 h a reflujo, la mezcla se trata con agua, se evapora a sequedad y el residuo se disuelve en agua/diclorometano. El producto se extrae en diclorometano, se seca sobre Na2SO4 y se purifica mediante cromatografía en sílice (ciclohexano/acetato de etilo) dando 8,1 g del intermedio 10-bromodecil-trialilpentaeritritol. Se disuelven 8 g (16,8 mmol) del intermedio en DMF (50 mL) y se añade azida sódica (5,6 g, 84 mmol). La mezcla se agita a 80 °C durante 24 h, seguido de filtración y evaporación del disolvente. La purificación cromatográfica (ciclohexano, luego diclorometano:metanol 95:5 a 1:1) produjo 4,0 g (55%) de producto como un aceite ligeramente amarillo.
Ejemplo 1b:
Síntesis de 10-azidodecil-tris(2,3-dihidroxipropil)pentaeritritol
Figure imgf000021_0001
La reacción se lleva a cabo según Zieringer et al., ChemPhysChem. 2010, 11, 2617. Se disuelve 10-azidodeciltrialilpentaeritritol (4,0 g, 9,1 mmol) en 300 ml de una mezcla de t-butanol/agua (1:1). A esta mezcla se le añade N-óxido de trimetilamina dihidrato (9,1 g, 82,4 mmol), ácido cítrico (10,0 g, 47,7 mmol) y osmiato de potasio dihidrato (0,4 g, 1,1 mmol), seguido de agitación a temperatura ambiente durante 24 h. Se añade la resina de intercambio iónico Lewatit K6267 (70 g) y se deja agitar la mezcla durante 1 hora más. Después de filtrar y lavar con t-butanol/agua 1:1, la disolución se evapora a sequedad y el residuo se purifica mediante cromatografía (RP C-18 Licroprep) usando agua/metanol en un sistema MPLC. Rendimiento 3,5 g (71%) de un aceite viscoso incoloro.
Ejemplo 1c:
Generación de dendrímeros a partir de 10-azidodecil-tris(2,3-dihidroxipropil)pentaeritritol
El dendrímero está formado por un dendrón que consta de monómeros de glicerol (patrón de sust. en 1,2) que emplea 24 grupos hidroxi mediante métodos publicados (Zieringer et al., Chem. Phys. Chem. 2010, 11,2617 y Wyszogrodska et al., Eur. J. Org. Chem. 2008, 53) en 4 etapas de reacción de alilación alterna con NaH/alilbromuro y dihidroxilación. El producto es 10-azidodecil-glicerol (OH24), peso molecular 1873 g/mol, que se sulfató en la siguiente etapa.
Ejemplo 1d:
Sulfatación de 10-azidodecil dendrón(OH)24
Se disuelven 100 mg (0,053 mmol) de 10-azidodecil dendrón(OH24) en 0,5 ml de DMF seco y se calienta a 60 °C. Con agitación, se añade complejo de SO3-piridina (245 mg, 1,54 mmol), seguido de 5 h de agitación a 60 °C y 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se para con agua, se ajusta a pH 9-10 usando NaOH 1 mM, se filtra y se somete a ultrafiltración (MWCO 1000) con agua. El producto 10-azidodecil dendrón (OSO3-Na+ )24 (150 mg, 65%) se obtiene después de la liofilización. El análisis elemental reveló una sulfatación completa. N 0,863, C 21,70, S 17,83, H 3,042, peso molecular 4322 g/mol.
Ejemplo 1e:
Síntesis de 10-aminodecil dendrón (OSO3-Na+)24 (compuesto d01)
Figure imgf000022_0001
A una disolución de 10-azidodecil dendrón (OSO3-Na+ )24 (150 mg, 0,035 mmol) en agua/metanol 1:1 (2 ml) se le añade TCEP (60 mg, 0,2 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 h. Después de la evaporación, el residuo se dializa frente a NaCl al 20 % y agua destilada (celulosa reg., MWCO 1000), rendimiento 107 mg (72%) de compuesto d01 después de la liofilización (peso molecular 4296 g/mol).
El ejemplo también se puede extender a los sustituyentes alcano más allá del decano, incluidos, p. ej. el uso de 1,6-dibromohexano, 1,8-dibromooctano, 1,11-dibromoundecano u otros dibromoalcanos que emplean fracciones insaturadas, cíclicas o sustituidas de acuerdo con la descripción del enlazador L de la fórmula general E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m. Además, el conector puede introducirse mediante un resto PEG-alcano, como bromuro/yoduro (o mesilato, tosilato) de azido-PEG-alquilo, como azido-PEG3-10-(CH2)2-18-Br.
Ejemplo 2:
Síntesis de un sistema dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y grupos reactivos para la bioconjugación a partir de d01 por reacción con ésteres bifuncionales de PEG-COOH NHS.
Ejemplo 2a:
Síntesis del sistema dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y grupo reactivo maleimido (compuesto d02) a partir de d01 por reacción con éster de maleimido-PEG(4)-COOH NHS.
Figure imgf000023_0001
Se disuelven 10 mg (2,33 pmol) de compuesto d01 en 1 ml de DMF/agua 9:1 y se añade éster de maleimido-PEG(4)-COOH NHS (3,0 mg, 5,83 pmol), seguido de agitación a 40 °C durante 48 h. El producto (compuesto d02) se precipita mediante la adición de diclorometano, centrifugación y lavado repetido con diclorometano, seguido de liofilización a partir de agua dest. El grado de acoplamiento se determina mediante H-RMN (700 MHz) en función de la proporción de señales de maleimido (2H, s) y espaciador alifático (multipletes < 1,5, 16H) que dan un grado de acoplamiento del 88 % para d02 (PM 4694 g/mol).
Ejemplos 2b-h:
La síntesis de sistemas de dendrímeros de poliglicerol con 24 grupos sulfato y conectores reactivos adicionales se logra mediante el uso de diferentes ésteres de PEG-COOH NHS bifuncionales que comprenden un grupo azido, propargilo, ciclooctinilo, disulfuro de piridinilo, tioacetilo o maleimido. La reacción con el compuesto d01 se lleva a cabo de acuerdo con el ejemplo 2a (rendimientos 70 - 85%). La tabla 1 resume los productos d03 a d09.
Ejemplo 2i:
Síntesis de un sistema dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y grupo isotiocianato para bioconjugación (compuesto d10)
El grupo amino se puede convertir alternativamente directamente en un grupo isotiocianato. Se disuelven 10 mg (2,33 pmol) de compuesto d01 en 0,5 ml de DMF y se añade di(2-piridil)-tionocarbonato (1,1 mg, 4,66 pmol), seguido de agitación a 40 °C durante 6 h. El producto d10 se aísla como se describe en el ejemplo 2a. La conversión se monitoriza mediante FTIR (2100 cm-1) (PM 4338 g/mol).
Tabla 1: Enlazadores reactivos o grupos acoplados a d01 y caracterización del producto resultante (la línea punteada indica enlace al grupo amino en d01 formando una amida).
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0001
Los sistemas dendrímeros antes mencionados de tipo d01 deben entenderse como ejemplares y son extensibles a la aplicación de otros números n como los específicos que se muestran aquí, p. ej. al duplicar los grupos hidroxilo a través de la alilación/dihidroxilación dando 48 grupos sulfato después de la sulfatación, que dan compuestos análogamente a d03 - d10.
Ejemplo 3:
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y grupo éster NHS para bioconjugación del ejemplo 1d (enlazador azido) por reacción con enlazadores bifuncionales de propargil-PEG-COOH.
Ejemplo 3a:
Acoplamiento de clic de dendrímero azido (ejemplo 1d) con éster propargil-PEG(4)-ácido carboxílico-t-butilo.
A una disolución de 100 mg (0,023 mmol) de dendrímero azido (ejemplo 1d) en 1 mL de una mezcla de agua/DMF (1:1), se le añadió CuSO4-5 H2O (5,7 mg, 0,023 mmol), ácido ascórbico (0,035 mmol) y éster propargil-PEG4-CoOtbutilo (0,058 mmol) (Broadpharm Ltd., EE. UU.) y la mezcla se agitó a 80 °C durante 18 h. El residuo obtenido tras la liofilización se suspende en una mezcla de diclorometano (5 mL), ácido trifluoroacético (3 mL) y agua (0,1 mL), se agita durante 5 h a 40 °C para obtener el grupo ácido carboxílico libre. Después de la evaporación, el residuo se suspende en MeOH y se precipita en éter dietílico, se lava con diclorometano y se aísla mediante centrifugación. El residuo se dializa contra NaCl y agua dest. (celulosa reg., MWCO 1 kDa), y se producen 80 mg de carboxi dendrímero (MW 4582 g/mol) después de la liofilización.
Ejemplo 3b:
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y grupo éster NHS para bioconjugación (compuesto d11)
Figure imgf000025_0001
A una disolución de 80 mg (17,5 pmol) de carboxi dendrímero (ejemplo 3a) en 2 ml de DMF, se le añaden 6 pl (35 pmol) de DIPEA, seguido de la adición de 13 mg de hexafluorofosfato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HSTU; 35 pmol). Después de 18 h de agitación a temperatura ambiente, el producto se aísla mediante precipitación con diclorometano (ciclos repetidos de DMF/CH2Cl2), y secado a vacío, y se producen 82 mg de éster NHS (compuesto d11; PM 4679 g/mol) como un sólido amorfo, usado sin purificación adicional.
El alcance de la invención con respecto a los sistemas de dendrímeros de poliglicerol de tipo d11 muestra que se puede sintetizar una función éster de NHS en dendrímeros polisulfatados y no se limita al ejemplo, y puede incluir otros números n de grupos sulfato, p. ej. duplicando los grupos hidroxilo mediante alilación/dihidroxilación dando 48 grupos sulfato después de la sulfatación, u otros derivados del ácido azidoalquilcarboxílico para sintetizar ésteres de NHS de sistemas de dendrímeros sulfatados.
Ejemplo 4
Síntesis de sistema de dendrímero de poliglicerol con 32 grupos sulfato y grupos reactivos para bioconjugación (compuesto d12-d17).
Ejemplo 4a
Modificación de dendrímero de poliglicerol basado en un dendrón de poliglicerol [G3.0]-OH (Wyszogrodzka M. et al., Chemistry 2008, 14, 9202) con enlazador de azidoundecilo.
Una disolución de 0,3 g (0,21 mmol) de [G3.0]-OH (16 grupos OH, protegido con acetal) en 2 ml de THF seco se hizo reaccionar con 1,10-dibromodecano y posteriormente con NaN3 como se describió en el ejemplo 1a, seguido de la escisión de los grupos acetal en MeOH/HCl y la purificación mediante cromatografía RP C-18 (Licroprep) usando agua/metanol, dando 0,15 g (52 %) de [G3.0]-O-(CH2)n -Na (PM 1355 g/mol).
Ejemplo 4b
Formación de dendrímero de poliglicerol con enlazador de azidodecilo (ejemplo 4a) mediante alilación/dihidroxilación, sulfatación y reducción para dar un sistema de dendrímero de aminoundecilo con 32 grupos sulfato (compuesto d12).
Figure imgf000026_0001
La síntesis se realiza como se describió en el ejemplo 1d-e, dando 155 mg de producto d12 como un sólido amorfo incoloro (MW 5721 g/mol).
Ejemplo 4c-h
La síntesis de sistemas de dendrímeros de poliglicerol con 24 grupos sulfato y conectores reactivos adicionales se logra mediante el uso de diferentes ésteres de NHS de PEG-COOH bifuncionales que comprenden un grupo azido, propargilo, ciclooctinilo, disulfuro de piridinilo, tioacetilo o maleimido. La reacción con el compuesto d01 se lleva a cabo de acuerdo con el ejemplo 2a/4c (rendimientos del 65 - 86%). La Tabla 2 resume los productos alcanzables d13 a d17. Tabla 2: Enlazadores reactivos acoplados a d12 y caracterización del producto resultante (la línea punteada indica enlace al grupo amino en d12 formando una amida).
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0002
El alcance de la invención con respecto a los sistemas de dendrímeros de poliglicerol de tipo d12 no se limita a los Ejemplos y puede incluir otros números n de grupos sulfato, p. ej. al duplicar los grupos hidroxilo a través de la alilación/dihidroxilación dando 64 grupos sulfato después de la sulfatación, que dan compuestos análogamente a d13 - d17.
Ejemplo 5:
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol/amido con 24 grupos sulfato y grupos reactivos para bioconjugación a base de aminometil-tris(ácido propiónico) y triglicerol (compuestos d18-d22).
Ejemplo 5a:
Síntesis de aminometil-tris(ácido propiónico)-tris(triglicerolamida).
Figure imgf000027_0001
A una disolución de ácido nitrometano-trispropiónico (1,5 g, 5,4 mmol) y DIPEA (3,9 g, 30 mmol) en 15 ml de DMF, se le añade una disolución de HBTU (9,3 g, 24 mmol) en 2 ml de DMF. Después de 30 min agitando a temperatura ambiente se añade una disolución de triglicerolamina (7,3 g, 23 mmol), (1,3-bis[2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-2-propilamina protegida con acetal; según Wyszogrodzka M. et al., Chemistry 2008, 14, 9202) en 2 ml de DMF, seguido de agitación a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se evapora hasta sequedad y se filtra a través de una columna corta de sílice con ciclohexano/acetato de etilo. Las fracciones que contienen el producto se recogen, se evaporan y el residuo se disuelve en 20 ml de metanol, a lo que se añaden 1,7 ml de HCl conc. para escindir los grupos protectores de acetal agitando otras 24 h. Después de evaporar hasta sequedad, el residuo se purifica mediante cromatografía RP C-18 (Licroprep) usando agua/metanol; se producen 2,7 g (53%) de producto intermedio (H-RMN, ESI MS). La reducción del grupo nitro a un grupo amino se logra disolviendo 2,7 g del intermedio en 120 ml de metanol, a lo que se añade Pd/C (0,3 g) y formiato de amonio (1,27 g, 20 mmol). La mezcla se hidrogena a 5 bar/temp. ambiente durante 48 h, seguido de filtración sobre celite, evaporación y cromatografía RP C-18 como se describió anteriormente, se obtienen 1,9 g (74 %) de aminometil-tris(ácido propiónico)-tris(triglicerolamida) como un aceite viscoso.
Ejemplo 5b:
Modificación del enlazador con ácido 11-azidoundecano carboxílico
A una disolución de ácido 11-azidoundecano carboxílico (0,11 g, 0,5 mmol) y DIPEA (0,16 g, 1,2 mmol) en 2 ml de DMF, se le añade HBTU (0,2 g, 0,56 mmol) y la mezcla se agita durante 1 h, seguido de la adición de aminometiltris(ácido propiónico)-tris(triglicerolamida) (0,3 g, 0,33 mmol; ejemplo 5a). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 48 h, se evapora hasta sequedad y se purifica mediante cromatografía RP C-18 (Licroprep) usando agua/metanol; se obtienen 0,26 g (71%) como un aceite viscoso.
Ejemplo 5c:
Formación de dendrímero de poliglicerol/amido con enlazador de azidodecilcarbonilo (ejemplo 5b) mediante alilación/dihidroxilación, sulfatación y reducción de azida para dar un sistema de dendrímero de aminodecilcarbonilo con 24 grupos sulfato (compuesto d18).
Figure imgf000028_0001
La síntesis se realiza como se describe en el ejemplo 1d-e dando 120 mg de producto d18 como sólido amorfo incoloro (MW 4432 g/mol).
Ejemplo 5c-h
La síntesis de sistemas de dendrímero de poliglicerol/amido con 24 grupos sulfato y enlazadores reactivos adicionales se logra mediante el uso de diferentes ésteres bifuncionales de PEG-COOH NHS que comprenden un grupo azido, propargilo, ciclooctinilo, piridinildisulfuro, tioacetilo o maleimido. La reacción con el compuesto d01 se lleva a cabo de acuerdo con el ejemplo 2a/4c (rendimientos del 65 - 86%). La Tabla 3 resume los productos alcanzables d19 a d22. Otra opción es la derivatización del grupo amino con anhídridos, como el anhídrido de ácido diglicólico mediante métodos conocidos para introducir un ácido carboxílico libre (producto d22) o la conversión del grupo amino en un grupo isotiocianato (producto d23; véase también el ejemplo 2i).
Tabla 3: Enlazadores reactivos acoplados a d18 y caracterización del producto resultante (la línea punteada indica el enlace al grupo amino en d18 formando una amida).
Figure imgf000028_0002
El alcance de la invención con respecto a los sistemas de dendrímeros de poliglicerol de tipo d18 no se limita a los ejemplos y puede incluir otros números n de grupos sulfato, p. ej. al duplicar los grupos hidroxilo a través de la alilación/dihidroxilación dando 48 grupos sulfato después de la sulfatación, que dan compuestos análogamente a d19 - d22.
Ejemplo 6
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato, grupo reactivo éster NHS y unidad disulfuro
Figure imgf000029_0001
Una disolución de compuesto d09 (ejemplo 2h) (25 mg, 5,3 pmol) y 20 mg de resina de intercambio iónico Dowex® 50W en 0,5 ml de metanol/DMF 1:1 se agita durante 3 h, se filtra y se evapora hasta sequedad. El residuo se disuelve en tampón PBS (50 mM; pH 7,4, incluido EDTA 1 mM)/metanol 1:1, al que se le añade ácido 4-(2-piridilditio)butanoico (2,4 mg, 10,6 pl; Widdison et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 4392). Después de 18 h de agitación, el residuo se evapora y se dializa frente a NaCl al 20 % y agua dest. (celulosa reg., MWCO 1000), rendimiento 21 mg de compuesto d24 como un liofilizado (MW 4764 g/mol).
Ejemplo 7
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol/amido con 24 grupos sulfato y motivo de triglicina para ligación enzimática mediada por sortasa (d25).
Figure imgf000029_0002
Se disuelve Boc-GlyGlyGly-OH (Bachem; 25 mg, 0,085 mmol) y DIPEA (11 mg, 0,17 mmol) en 3 ml de DMF y se añade HATU (38 mg, 0,1 mmol). Después de 1 h, se añade el compuesto d18 (95 mg, 0,021 mmol). La mezcla se agita a 50 °C durante 48 h. El producto se precipita mediante la adición de éter dietílico y se recoge mediante filtración. El residuo se lava repetidamente con diclorometano y luego se suspende en 5 ml de una mezcla de diclorometano/ácido trifluoroacético 1:1, seguido de 5 h de agitación a temperatura ambiente.
Ejemplo 8
Síntesis de conjugados de sistemas de dendrímeros con colorante fluorescente ICC
Ejemplo 8a-c
Conjugación de los compuestos de dendrímeros de amino d01, d12 y d18 con colorante de cianina.
Los colorantes de cianina para marcaje, como Cy3 o ICC, que emplean diferentes grupos funcionales y patrones de sustitución, son accesibles sintéticamente según la bibliografía conocida. El tinte ICC (éster NHS) es un tinte VIS publicado (abs/fluoresc. ~ 550 nm/575 nm) (Groger et al., Bioconjugate Chem 2013, 24, 1507).
Figure imgf000030_0001
Se disuelven 10 mg (2,33 pmol) de compuesto d01 en 1 ml de DMF/agua (9:1) y se añade éster de NHS de ICC (éster MiDye550 NHS, Iris Biotech., Alemania) (8,9 mg, 12 pmol), seguido de agitación a 40 °C durante 72 h. El producto (ICC-d01) se precipita mediante la adición de diclorometano y se purifica mediante cromatografía RP C-18 (Licroprep) utilizando agua/metanol. El grado de acoplamiento se determina mediante espectrofotometría (Amáx del colorante ICC a 550 nm, £ 120.000 L-1 M-1) dando un grado de acoplamiento del 54%. Los dendrímeros d12 y d18 se conjugan covalentemente con el éster de NHS del colorante ICC de forma análoga.
Se pueden conjugar otros ésteres de NHS de tinte fluorescente como se describe aquí, como el éster de NHS de colorante de cianina ITCC, los ésteres de NHS de Cy3 a Cy7, los ésteres de NHS de rodamina o fluoresceína. Además, se pueden usar derivados de isotiocianato (ITC) comúnmente conocidos de dichos colorantes, como FITC.
Otro método para la conjugación de colorantes es usar dendrímeros de amino (p. ej. d01, d12, d18) en combinación con colorantes de 2-iminitiolano y maleimido (p. ej., ICC maleimida) dando, por ejemplo, ICC-IT-d01 o ICC-IT-d18.
Ejemplo 9
Síntesis de dendrímero con enlazador detectable por UV (d26)
Figure imgf000031_0001
La síntesis de d26 se logra de manera análoga al ejemplo 4, usando 4,4'-di-(3-bromopropiloxi)benzofenona (Yan et al., Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 508) en lugar de 1,10-dibromodecano, como enlazador. El dendrímero d26 luego puede modificarse adicionalmente como se describe en los ejemplos 4c-h para usarlo para la conjugación de proteínas. Pueden usarse enlazadores de 4,4'-di-(3-bromopropiloxi)benzofenona para construir dendrímeros del tipo de los ejemplos 1-3.
Ejemplo 10
Síntesis de dendrímero con colorante de cianina detectable por VIS (d28)
Ejemplo 10a
Síntesis del sistema de dendrímero de poliglicerol con 24 grupos sulfato y enlazador de aminohexilo (compuesto d27). El compuesto d27 es un análogo a d01 con grupo aminohexilo y se sintetiza según el ejemplo 1a-e utilizando 1,6-dibromohexano como material de partida; peso molecular de d27 4240 g/mol.
Ejemplo 10b
Conjugación con resto de indocianina como enlazador detectable por VIS y grupo reactivo de éster de NHS (d28).
Figure imgf000032_0001
Se sintetiza monoacetato de 5,5'-dicarboxi-1,1'-dimetilindocarbocianina de acuerdo con los procedimientos conocidos. A una disolución de 0,1 g (0,2 mmol) de este colorante y DIPEA (0,11 g, 0,8 mmol) en 3 mL de DMF se le añade una disolución de HBTU (0,31 g, 0,8 mmol) en 0,5 mL de DMF. Después de 90 min de agitación a temperatura ambiente, se añade d027 (0,17 g, 0,04 mmol) en porciones como un sólido y la mezcla resultante se agita a 60 °C durante 72 h. El producto se precipita añadiendo 3 ml de éter dietílico y se recoge mediante centrifugación. La purificación mediante cromatografía RP C-18 (Licroprep) usando agua/metanol produce 0,12 g de intermedio después de la liofilización. La conversión en el éster de NHS se realiza añadiendo HSTU (75 mg, 0,2 mmol) a una disolución de intermedio y 35 pL de DIPEA en 1 mL de DMF y agitando durante 18 h a temperatura ambiente, seguido de precipitación en éter dietílico (ciclos repetidos de DMF/éter dietílico), dando 0,10 g de producto d28 (peso mol. 4743 g/mol).
Ejemplo 11
Síntesis de conjugados de sistemas de dendrímeros con proteínas y anticuerpos.
Ejemplo 11a
Procedimiento general para la conjugación mediante sistemas de dendrímeros con grupos maleimido (d02, d03, d13, d14, d19, d20):
Una disolución de 2 mg de proteína en 1 mL de tampón fosfato 50 mM de pH 7,4 / EDTA 10 mM se hace reaccionar con 10 mol-eq. de 2-iminotiolano durante 60 min. A esta mezcla se le añaden 14 mol-eq. de dendrímero funcionalizado con maleimido (p. ej. d02, d03, d13, d14, d19, d20), seguido de incubación durante 18 h. La mezcla se somete a purificación en disolución salina tamponada con TRIS (TBS; pH 7,4) usando una columna NAP10 o casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (celulosa reg., MWCO 10 kDa).
Ejemplo 11b
Procedimiento general para la conjugación utilizando sistemas de dendrímeros con grupo disulfuro de piridilo (d04, d05, d15, d21): Una disolución de 2 mg de proteína en 1 mL de tampón fosfato 50 mM de pH 7,4 / EDTA 10 mM se hace reaccionar con 10 mol-eq. de 2-iminotiolano durante 60 min. A esta mezcla se le añaden 10 mol-eq. de dendrímero funcionalizado con maleimido (p. ej. d04, d05, d15, d21), seguido de incubación durante 3 h. La mezcla se somete a purificación en disolución salina tamponada con TRIS (TBS; pH 7,4) usando una columna NAP10 o casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (celulosa reg., MWCO 10 kDa).
Ejemplo 11c
Procedimiento general para la conjugación utilizando sistemas de dendrímeros con isotiocianato o grupo éster de NHS (d 10, d11, d23): Una disolución de 2 mg de proteína en 1 mL de PBS de pH 7,4 se hace reaccionar con 10 moleq. de isotiocianato o dendrímero de éster de NHS (p. ej. d10, d11, d23) durante 24 h. La mezcla se somete a purificación en disolución salina tamponada con TRIS (TBS; pH 7,4) usando una columna NAP10 o casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (celulosa reg., MWCO 10 kDa).
Ejemplo 12
Síntesis de conjugados de sistemas de dendrímeros con enzimas.
Ejemplo 12a
Conjugación de sistemas de dendrímeros con grupos maleimido (d02, d13, d19) con la enzima L-asparaginasa. La L-asparaginasa es un homotetrámero de 4 unidades de 34 kDa de peso molecular, que puede modificarse en un puente disulfuro en cada una de las unidades monoméricas (Balan et al., Bioconjugate Chem 2007, 18, 61). Se disuelve L-asparaginasa (10 mg, 0,29 pmol de monómero; L-asparaginasa 5000E, Medac, Alemania) en 2 ml de tampón fosfato 50 mM de pH 8 / EDTA 10 mM. Se añade ditiotreitol (DTT; 80 mg) y la disolución se agita durante 1 hora. El exceso de DTT se elimina mediante SEC (Sephadex G50; tampón fosfato de pH 8 / EDTA 10 mM). A la disolución resultante (aprox. 8 mg en 4 mL, medida por UV), se le añade una disolución de 2,3 pmol (8 mol-eq.) de dendrímero de maleimido (p. ej., d02, d13, d19) en aprox. 0,2 ml de agua, seguido de incubación durante 24 h con agitación suave. La purificación se logra por ultrafiltración (matraces Centriprep, celulosa reg., MWCO 20.000).
Ejemplo 12b
Conjugación de sistemas de dendrímeros con grupo maleimido (d02) con la enzima ADNasa.
La síntesis se logra como se describió en el ejemplo 11 a produciendo ADNasa-d02 como disolución en TBS de pH 7,4. Ejemplo 12c
Conjugación de sistemas de dendrímeros con grupo isotiocianato (d 10) con la enzima ADNasa.
A una disolución de 2 mg (65 nmol) de ADNasa (desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, 31 Da) en 1 ml de PBS de pH 7,4 se le administran 5 mol-eq. de dendrímero de isotiocianato d10 (1,4 mg) en 0,2 ml de PBS, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 18 h. La purificación se lleva a cabo en casetes de diálisis Float-A-Lyzer (éster de celulosa, MWCO 10 kDa) en TBS de pH 7,4.
Tabla 4: Conjugados de proteínas con sistemas de dendrímeros según los ejemplos 11 y 12
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Los conjugados de proteínas con sistemas de dendrímeros según la tabla 4 se pueden conjugar adicionalmente con colorantes fluorescentes para detectar los conjugados en los sistemas biológicos. El marcaje por fluorescencia es un procedimiento conocido y se puede lograr con una variedad de fluoróforos reactivos. Aquí, el éster de NHS de colorante ICC (Groger et al., Bioconjugate Chem 2013, 24, 1507) se usa en los ejemplos que demuestran los resultados de captación celular mediante FACS y microscopía.
Ejemplo 13
Síntesis de conjugados de sistemas de dendrímeros con péptidos de molécula pequeña y moléculas peptidomiméticas
Ejemplo 13a
Síntesis de conjugado de dendrímero con monometil auristatina E
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La maleimidocaproil-monometil auristatina E (mc-MMAE) se puede sintetizar de acuerdo con la bibliografía (Doronina et al., 2006, 17, 114). La conjugación se logra disolviendo el dendrímero d09 (2 mg, 0,43 pmol) en 0,5 ml de una disolución acuosa de hidroxilamina 50 mM, seguido de la adición de maleimidocaproil-monometil auristatina E (0,37 mg en 0,5 ml de DMF/PBS 1:1). Después de 18 h de incubación a 25 °C, el producto se precipita con diclorometano, seguido de purificación mediante HPLC (agua/metanol) dando MMAE-d09 (1.1 mg).
Otros ejemplos no limitantes de las estructuras de dendrímeros d01 con moléculas efectoras de auristatina que se sintetizan de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir:
Figure imgf000035_0001
Ejemplo 13b
Síntesis de conjugado de dendrímero con péptido grapado
Figure imgf000035_0002
El péptido grapado para la activación de la vía de p53 (ATSP-3900 con p-alanina N-terminal) se puede sintetizar de acuerdo con la bibliografía (Chang et al., PNAS 2013, 110, E3445). La conjugación se logra disolviendo el dendrímero d10 (2 mg, 0,46 pmol) en 0,5 ml de tampón fosfato 50 mM de pH8. A esta disolución se le añade una disolución de p-alanil-ATSP-3900 (0,65 mg, 0,40 pmol) en 0,2 ml de DMF, seguido de reacción a 40 °C durante 24 h. La purificación se logra mediante HPLC (agua/metanol) dando un conjugado ATSP3900-d10 (0,8 mg).
Ejemplo 13c
Síntesis de conjugados de dendrímeros con péptidos helicoidales alfa derivados de motivos de unión naturales
Las secuencias peptídicas P1 a P7 (como amidas terminales C) se sintetizaron mediante síntesis peptídica en fase sólida común. Estos péptidos llevan una cisteína N-terminal para la conjugación de dendrímeros de maleimido al grupo tiol. Se realizó la conjugación a dendrímeros d02, d03, d13, d14, d19. Como ejemplo, se describe el procedimiento que emplea el dendrímero d02: Se disuelve 1 mg de péptido en 200 pL de DMF y se diluye adicionalmente con tampón fosfato 50 mM (hasta 500 pL). A esta disolución se le añaden 5 mol-eq. de TCEP (disolución de reserva en agua) seguido de 0,9 mol-eq. de dendrímero, disuelto en 200-300 pL de agua. La mezcla se agita suavemente a 25 °C durante 18 h. La purificación se logra mediante HPLC (agua/acetonitrilo) o SEC (Sephadex LH-20, agua/DMF), o una combinación de ambos, dando los conjugados enumerados en la tabla 5.
Tabla 5: Conjugados peptídicos con dendrímeros según el ejemplo 13c
Figure imgf000035_0003
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Ejemplo 14
Síntesis de conjugados de sistemas de dendrímeros con inhibidores de molécula pequeña
Ejemplo 14a
Síntesis de conjugado de dendrímero con estaurosporina
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La estaurosporina es un inhibidor de la cinasa que se puede conjugar con moléculas transportadoras manteniendo su actividad inhibidora. La succinoil-estaurosporina se sintetiza como se describe (Caravatti et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 399) y conjugado a d01 en DMF usando condiciones de acoplamiento con HATU/DIPEA.
Ejemplo 14b
Síntesis de conjugado de dendrímero con derivado de maitansina
Figure imgf000036_0002
N2-desacetil-N2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina es un derivado publicado adecuado para la conjugación covalente con biomoléculas a través de enlaces disulfuro o grupos maleimido (Erikson et al. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 84). La conjugación covalente a los sistemas de dendrímeros de tipos d02, d03, d13, d19, d20 (maleimidas) es posible. De manera ejemplar, una disolución de N2'-desacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (5 mg, 6,8 pmol) y dendrímero d02 (24 mg, 5,2 pmol) en 0,5 ml de DMF/tampón fosfato 50 mM de pH 7,0 EDTA 5 mM (9:1) se hace reaccionar durante 3 h a temperatura ambiente, el producto se precipita añadiendo 1 ml de diclorometano. El exceso de maitansina se elimina mediante ciclos repetidos de precipitación de DMF/diclorometano, dando 21 mg de maid02 (peso mol. 5432 g/mol).
Ejemplo 15
Captación celular de conjugados de dendrímero-colorante ICC (ejemplo 8) y conjugados de dendrímero-proteína (ejemplo 11)
Las líneas celulares de cáncer humano A2780 y QGP-1 se cultivan en medio RPMI, con un 10 % de suero de ternera fetal (FCS), 2 % de glutamina y penicilina/estreptomicina añadidas. Todas las células se siembran en el medio a 1 * 105 células/ml, se cultivan a 37 °C con un 5 % de CO2, y se dividen 1:5 dos veces a la semana. Las líneas celulares de cáncer humano epitelial A549, MCF7, HaCaT y HepG2 se propagan en medio DMEM (PAN Biotech), con FCS fetal al 10 %, glutamina al 2 % y penicilina/estreptomicina. Las células se siembran en el medio a 1 * 105 células /ml (37 °C con un 5% CO2, división 1:5 dos veces por semana). Las células HT29 se cultivan en medio de McCoy (PAN biotech), con FCS al 10 %, glutamina al 2 % y penicilina/estreptomicina. Las células se siembran en el medio a 1 * 105 células/ml (37 °C con un 5% CO2, división 1:10 dos veces por semana). Para la microscopía celular, las células se siembran a 2 * 105 células/ml en una placa de cultivo de 24 pocillos sobre un cubreobjetos de vidrio (Sigma), se cultivan durante 24 horas a 37 °C, luego se cultivan con medio que contiene 10'6 M de ICC-d01, ICC-d12, lCC-d18 o los derivados respectivos con 48 grupos sulfato, o conjugados de dendrímeros con proteínas (ejemplos 12 y 13) o glicerol-ICC 10­ 6 M (control) durante hasta 24 horas a 37 °C. Posteriormente, las células se fijan con acetona fría, se lavan y se cubren con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Abcam) para la contratinción nuclear. La adquisición de imágenes se realiza utilizando un microscopio Leica DMRB (Leica). Las imágenes se toman con una cámara digital (Spot 32, Diagnostic Instruments) con el mismo tiempo de exposición para todas las imágenes. La Fig. 8 A muestra un ejemplo de distribución intracelular en las áreas citosólicas (ICC-d01, ejemplo 8).
Para cuantificar la captación celular mediada por los dendrímeros sulfatados, se utiliza ICC-d01 (ejemplo 8) para incubar 107 células tumorales SKBR3 con ICC-d01 10'6 M durante 24 h. Esta cantidad y tiempo es suficiente para medir el sobrenadante después de la combinación y la lisis celular con DMSO. La Figura 8 B muestra el espectro de absorción resultante (coef. de ext. de ICC (559 nm) 150,000 M'1 c irr1) dando 10'17 moles por célula, lo que corresponde a aprox. 5 millones de moléculas por célula.
Para los estudios FACS, las células se cultivan a 2 * 105 células/ml en placas de 24 pocillos con medio de cultivo normal o medio que contiene diferentes concentraciones de sustancias de prueba durante 3 o 24 horas. Posteriormente, las células se lavan con PBS y se separan con 200 pl/pocillo de Accutase (PAA) y se lavan dos veces con PBS. Las células se fijan con 500 pl de paraformaldehído al 3 % durante 10 min a 4 °C, se detienen con 2 ml de PBS y se centrifugan con 250 * g durante 10 min a 4 °C. Se eliminan los sobrenadantes y las células se suspenden en 200 pl de PBS con albúmina de suero bovino al 0,5 % (Roth). Las células fijadas se mantienen a 4 °C hasta su análisis en un instrumento FACS Calibur (Becton-Dickinson). La Tabla 5 muestra ejemplos de análisis FACS.
Tabla 5: Valores de captación medidos por FACS, relativos a ICC-d01 (rango de diferentes líneas celulares: HT29, HepG2, QGP-1, A431, MCF-7, A2780) después de la incubación durante 24 h. Todos los conjugados se conjugaron adicionalmente con éster de NHS de ICC, y los valores se corrigieron por la fluorescencia debido a las diferencias en la proporción de colorante respecto de la proteína o la carga del dendrímero.
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Ejemplo 16
Actividad de los conjugados proteína-dendrímero en células tumorales
Para las mediciones de citotoxicidad, se incubaron 2 * 105 células con 1 ml de medio de cultivo que contenía concentraciones crecientes de las sustancias de ensayo. Después de 72 h de tratamiento, se analizó el número de células, la viabilidad y el diámetro celular como parámetro de los procesos apoptóticos en un sistema de contador y analizador de células (CASY®, Scharfe Systems). Además, se evaluó la citotoxicidad del fármaco in vitro utilizando el ensayo MTT (reducción celular de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) como prueba de la actividad metabólica de las células. Se sembraron 1 * 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos en 100 pl de medio de cultivo que contenía una concentración creciente de la sustancia de ensayo. Se añadieron 10 pl de m Tt (5 mg/ml en PBS, obtenido de Sigma) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 4 h, 24 h, 48 h o hasta 72 h. El producto de formazano resultante se disolvió con isopropanol ácido y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (Ex. 570) en un espectrofotómetro de microplacas (Anthos htlI, Microsystems). En un par de experimentos, se eliminó el medio con las sustancias de prueba después de 48 horas, se contaron las células y se sembró un número idéntico de células con medio nuevo sin las sustancias de prueba en placas nuevas. El ensayo de MTT se realizó después de una incubación adicional durante 72 horas.
Como ejemplos, la tabla 6 muestra que los conjugados de toxinas inhibidoras de ribosomas exhiben una citotoxicidad aumentada debido a la captación celular y la actividad intracelular. Los efectos se pueden obtener usando p. ej. los compuestos Sap-d02, Sap-d13 o Sap-d19. Pueden obtenerse efectos similares en diferentes líneas de células tumorales, tales como células tumorales de colon HT29, células tumorales hepáticas HepG2, células tumorales pancreáticas QGP-1, células tumorales epidermoides A431.
Tabla 6: Valores de CI50 de la inhibición de la proliferación celular medidos mediante la prueba MTT (rango de diferentes líneas celulares: HT29, HepG2, QGP-1, A431, MCF-7, A2780).
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Ejemplo 17
Actividad de los conjugados péptido-dendrímero en células tumorales
Las mediciones del cultivo celular se realizaron como se describió en el ejemplo 16. La Tabla 7 muestra los resultados para los diferentes conjugados de péptido-dendrímero.
Tabla 7: Valores de CI50 de la inhibición de la proliferación celular medidos mediante la prueba MTT (rango de diferentes líneas celulares: HT29, HepG2, QGP-1, A431, MCF-7, A2780).
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Ejemplo 18
Selectividad de la captación intracelular de conjugados de dendrímeros con proteínas: efectos de los inhibidores sobre la captación del conjugado de L-asparaginasa Asp-d02 (ejemplo 12a).
Los estudios sobre la captación celular medidos mediante FACS se realizaron como se describió en el ejemplo 13. El compuesto Asp-d13 se incuba a una concentración de 10-7 M en células tumorales QGP-1 durante 3 h y 6 h. La incubación se realiza en presencia de uno de los dos sustratos siguientes: (1) genisteína 0,1 mM, un inhibidor de la captación endocítica (Rejman et al., Mol. Ther. 2005, 12, 468-474) o (2) rifamicina 50 mM, un inhibidor de la captación a través de proteínas transportadoras de aniones orgánicos (OATP; Bi et al., Drug Metab Dispos. 2012, 40, 1085-92). Los resultados demuestran que las señales de FACS relativas a Asp-d13 sin inhibidor (definido como 100 %) disminuyen en presencia de rifamicina a 37 - 40 %, mientras que no se puede medir una disminución significativa en presencia de genisteína (80 - 85 %), véase la tabla 7 para obtener los datos. Para L-asparaginasa acoplada a un poliglicerolsulfato (peso molecular medio de 12000 Da; utilizado según el documento WO2011/095311) podría identificarse la endocitosis debido a la inhibición por genisteína.
Tabla 7: Valores relativos de inhibición de la captación en células QGP-1 en presencia de rifamicina o genisteína.
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Ejemplo 19
Actividad de los conjugados de proteína-dendrímero en células tumorales en comparación con el polímero sulfatado
En este ejemplo, el conjugado de saporina Sap-d02 (ejemplo 11) se compara con un conjugado análogo utilizando un poliglicerolsulfato de naturaleza polimérica no definida con un peso molecular comparable (valor medio a 6000 g/mol; sintetizado según Groger et al., Bioconjugate Chem 2013, 24, 1507). Este polímero se funcionaliza con el enlazador de éster de NHS de maleimido-PEG(4)-COOH como se describe en el ejemplo 2a y se purifica adicionalmente mediante cromatografía RP. La conjugación a saporina se logra como se describió en el ejemplo 11. Las mediciones de citotoxicidad comparativas se realizan de acuerdo con el ejemplo 16, dando valores de CI50 de la prueba MTT en 4 líneas celulares diferentes (véase la tabla 8).
Tabla 8: Valores de CI50 de la inhibición de la proliferación celular medidos mediante la prueba MTT (rango de diferentes líneas celulares: HT29, HepG2, QGP-1, MCF-7).
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Ejemplo 20
Métodos de conjugación quimioselectivos y específicos de sitio de dendrímeros con proteínas que emplean una cisteína N-terminal (etiqueta de Cys)
Ejemplo 20a
Los dendrímeros se pueden conjugar con proteínas y anticuerpos terapéuticos, así como con péptidos sintéticos, cuando estos poliaminoácidos se proporcionan con una etiqueta de cisteína, lo que permite la conjugación quimioselectiva a cisteína con dendrímeros que portan maleimido, piridinildisulfuro u otros grupos selectivos de tiol conocidos por el técnico experto (como bromoacetilo, vinilsulfona).
Protocolo general para la conjugación de proteínas (25 - 30 kDa) con la etiqueta de Cys: 1 mL de una disolución de proteína (conc. 2 mg/mL) en PBS que contiene EDTA 1 mM se incuba con una disolución de TCEP en PBS (dando TCEP 1 mM en la mezcla) durante 3 h a temperatura ambiente, seguido de la adición de 2 mol-eq. de dendrímeros sulfatados que contienen maleimido o disulfuro de piridinilo (p. ej. d02-d05, d 13-d 15) y la reacción de otras 2 h a temperatura ambiente. La purificación se lleva a cabo en casetes de diálisis Float-A-Lyzer (éster de celulosa, MWCO 10 kDa) en TBS pH 7,4.
Ejemplo 20b
Las proteínas con cisteína N-terminal o sustitutos de cisteína se pueden fusionar con otras macromoléculas empleando un resto tioéster mediante el proceso de ligación química nativa (NCL) (Wong CT et al., Mol Biosyst. 2013, 9, 826-33). Sorprendentemente, los dendrímeros sulfatados se pueden sintetizar como tioésteres y permiten la conjugación de tipo NCL con proteínas con cisteína N-terminal.
Síntesis de dendrímeros sulfatados con grupo tioéster: Una disolución de dendrímero sulfatado con éster de NHS (d11; 10 mg) en DMF (1 mL) se hace reaccionar con 10 mol-eq. de éster metílico de ácido 3-tiopropiónico (Xiao et al., Bioorg Med Chem Lett 2013, 23, 6046-6051) durante 24 horas a 40 °C. Después de precipitaciones repetidas en DMF/acetato de etilo y liofilización desde agua dest., se obtuvieron 11 mg de producto d29 como un sólido amarillo.
Protocolo general para la conjugación de proteínas (25 - 30 kDa) con etiqueta de Cys: 1 mL de una disolución de proteína (conc. 2 mg/mL) en tampón NCL que contiene MPAA y TCEP en tampón fosfato 50 mM de pH 7,0 se incuba con 2,5 mol -eq. de dendrímero d29 durante 24 h a temperatura ambiente. La purificación se logra en casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (celulosa reg., MWCO 20 kDa) en PBS pH 7,4. El producto contiene una cisteína libre según el mecanismo de NCL y se puede conjugar adicionalmente con un colorante de fluorescencia (como ICC-maleimida).
Ejemplo 21
Conjugación quimioselectiva mediante aminación reductora usando un dendrímero sulfatado con grupo carbaldehído
Ejemplo 21a
Síntesis de dendrímero sulfatado d31 con grupo carbaldehído
Figure imgf000040_0001
El grupo azido del dendrímero d06 (ejemplo 2e) se reduce hasta la amina mediante TCEP. A una disolución de d06 (50 mg, 0,011 mmol) en 1 mL de una mezcla de agua/metanol (1:1) se le añade TCEP (20 mg, 0,067 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 h. Después de la evaporación, el residuo se dializa frente a NaCI al 20 % y agua dest. (celulosa reg., MWCO 1000), rendimiento 45 mg (90%) de compuesto d30 después de la liofilización (peso molecular 4631 g/mol). La modificación con un carbaldehído se logra mediante la reacción con el éster N-hidroxisuccinimidílico del ácido 4-formilbenzoico (Hooker, JM et al., Nano Letters 2007, 7, 2207-2210) en DMF/agua, produciendo el dendrímero sulfatado d31 como un precipitado sólido (peso molecular 4763 g/mol).
Ejemplo 21b
Conjugación quimioselectiva de dendrímeros sulfatados d31 a las proteínas a través de la aminación reductora
El proceso se realiza con disoluciones proteicas de 2,5 mg/mL en tampón fosfato 50 mM de pH 7,0. Procedimiento general: Una disolución de 1 mg de proteína (0,4 mL) y 3 mol-eq. de dendrímero d31 se trata con una disolución madre de cianoborohidruro de sodio (NaBHaCN) en agua dando una concentración final de NaBHaCN 1 mM en la mezcla, que se agita suavemente durante 48 h a 20 °C. La purificación se logra en casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (celulosa reg., MWCO 20 kDa) en TBS de pH 7,4. La conjugación de dendrímero se determina mediante electroforesis en gel, lo que produce una conversión del 50-70 % de la proteína en los conjugados (se desconoce la proporción de dendrímero respecto de la proteína). Las proteínas utilizadas fueron ovoalbúmina, saporina, toxina diftérica y una IgG inespecífica. La purificación se consigue mediante SEC HPLC. El análisis de la proporción de dendrímero respecto de la proteína se realiza mediante electroforesis en gel.
Ejemplo 22
Conjugación de dendrímero sulfatado a proteínas a través de un enlace escindible con ácido: Síntesis de dendrímero sulfatado con enlazador de hidrazona y grupo maleimido
Figure imgf000041_0001
El dendrímero d31 se fusiona con EMCH (hidrazida del acido £-maleimidocaproico) de acuerdo con los métodos publicados (Walker GF et al., Molecular Therapy 2005, 11, 418-425).
Estos tipos de modificación se pueden extender a otros restos de aldehídos alifáticos y aromáticos, así como restos de cetonas (como el ácido 4-acetilbenzoico) que producen hidrazonas, carboxihidrazonas e iminas.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fórmula
E-[G-L-D(OSO3-M+)n]m,
donde E es una molécula efectora terapéutica o diagnóstica,
donde D(OSO3"M+)n es un dendrímero D que porta un número n de grupos sulfato OSO3"M+, en donde el número n de grupos sulfato se selecciona de 6, 8, 12, 16, 18, 24, 30, 32, 36, 40, 48, 72 o 96,
donde M es un contraión catiónico inorgánico u orgánico para el grupo sulfato aniónico,
donde L es un enlazador o espaciador entre D y E,
donde G es un grupo funcional de conexión que forma la unión covalente entre L y E, y donde m es un número entero de 1 a 20 y
donde cada uno de los dendrímeros D de dicho conjugado tiene el mismo peso molecular y donde el número n de grupos sulfato es el mismo para cada dendrímero D, donde la unidad enlazadora L está unida covalentemente al punto focal del dendrímero D en una posición, por lo que desde este punto focal, el dendrímero crece para alcanzar su estructura dendrítica, y
donde los dendrímeros D(OSO3"M+)n tienen las siguientes proporciones entre n y el peso molecular, dadas siendo M+ un ion alcalino, preferiblemente sodio:
Figure imgf000042_0001
2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que las unidades repetitivas de monómeros para construir el dendrímero D se seleccionan del grupo que consiste en glicerol sustituido en 1,2, glicerol sustituido en 1,3, pentaeritritol, glucosa, manosa, galactosa, lisina, tris(hidroximetil)aminometano, tris(ácido propiónico)aminometano, ácido 1,1'-bis(hidroximetil)-propiónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido maleico, ácido glicólico, ácido diglicólico, ácido adípico, ácido láctico, ácido cítrico, (2-aminoetil)amida de ácido propiónico, propilenimina, etilenimina, óxido de propileno y óxido de etileno.
3. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la unión de dichos monómeros en el dendrímero D se basa en grupos funcionales seleccionados de éter, tioéter, éster carboxílico, sulfoniléster, sulfonamida, carboxilamida, amina, carbamato, tiocarbamato, urea , tiourea, hidrazona, imina, disulfuro, fosfato, fosfonato, triazol, acetal y cetal.
4. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que D contiene grupos terminales seleccionados de 1,2-disulfatoalquilo, 1,3-disulfatoalquilo, 1,2,4-trisulfato-3-alquilo, N,N'-di(1-sulfatoalquil)amina, tris(sulfatometil)metilo y 1,2,3,4,5-pentasulfatoalquilo.
5. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que L es un grupo alquilo C4-100, seleccionado del grupo formado por unidades alifáticas cíclicas, ramificadas o lineales en las que uno o más grupos metileno pueden estar sustituidos independientemente por una unidad seleccionada del grupo formado por O, S, NH, NH-O, C(=O)NH, OC(=O)NH, OC(=O)O, NHC(=O)NH, NHC(=S)NH, C(=NH)NH, C(=O), S(=O)2, S(=O), S(=O2)O, S-S, CH=N, CH=N-NH, C=N-NHC(=O), OP(=O)(O-M+)O, P(=O)(O'M+)O, arileno, etenileno o etinileno y triazolileno, en los que cualquier átomo de hidrógeno puede estar independientemente sustituido por metilo, etilo o hidroximetilo.
6. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que las moléculas efectoras se seleccionan del grupo que consiste en péptidos, proteínas, glicanos y ácidos nucleicos.
7. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6, en la que la molécula efectora es una molécula efectora terapéutica que comprende sustancias que pueden interferir con los mecanismos intracelulares de proliferación, apoptosis, síntesis de material de tejido conjuntivo (por ejemplo, colágeno, fibronectina), función inmunitaria, senescencia o defensa inmunitaria.
8. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la molécula efectora es un polipéptido o una molécula pequeña que se une a objetivos seleccionados del grupo que consiste en Fox01, HDAC, DP-1, E2F, ABL, AMPK, BRK, BRSK1, BRSK2, BTK, CAMKK1, CAMKK alfa, CAMKK beta, Rb, Suv39H1, SCF, p19INK4D, GSK-3, p18INK4, myc, ciclina E, CDK2, CDK9, CDG4/6, ciclina D, p16INK4A, cdc25A, BMI1, SCF, Akt, CHK1/ 2, CK1 delta, CK1 gamma, CK2, CLK2, CSK, DDR2, DYRK1A/2/3, EF2K, EPH-A2/A4/B1/B2/B3/B4, EIF2AK3, Smad2, Smad3, Smad4, Smad7, p53, p21 Cip1, PAX, Fyn, CAS, C3G, SOS, Tal, Raptor, RACK-1, CRK, Rap1, Rac, KRas, NRas, HRas, GRB2, FAK, PI3K, spred, Spry, mTOR, MPK, LKB1, PAK1 /2/4/5/6, PDGFRA, PYK2, Src, SRPK1, PLC, PKC, c-Raf, PKA, PKB alfa/beta, PKC alfa/gamma/zeta, PKD, PLK1, PRAK, PRK2, RIPK2, B-Raf, WAVE-2, TSC2, DAPK1, BAD, IMP, C-TAK1, TAK1, TAO1, TBK1, TESK1, TGFBR1, TIE2, TLK1, TrkA, TSSK1, TTBK1/2, TTK, Tp12/cot1, MEK1, MEK2 , PLD1, Erk1, Erk2, Erk5, Erk8, p90RSK, PEA-15, SRF, p27 KIP1, TIF1a, HMGN1, ER81, MKP-3, c-Fos, FGF-R1, GCK, GSK3 beta, HER4, HIPK1/2/3, IGF-1R, cdc25, UBF, LAMTOR2, Stat1, Stat3, CREB, JAK, Src , PTEN, NF-kappaB, HECTH9, Bax, HSP70, HSP90, Apaf-1, Cyto c, BCL-2, Bcl-xL, Smac, XIAP, Caspasa-9, Caspasa-3, Caspasa-6, Caspasa-7, CDC37, TAB, IKK, TRADD, TRAF2, RIP1, FLIP, TAK1, JNK1/2/3, Lck, A-Raf, B-Raf, C-Raf, MOS, MLK1/3, MNK1/2, MSK1, MST2/ 3/4, MPSK1, MEKK1, MEKK4, MELK, ASK1, MINK1, MKK1/2/3/4/6/7, NEK2a/6/7, NUAK1, OSR1, SAPK, STK33, Syk, Lyn, PDK1, PHK, PIM1/2/3, Ataxina-1, mTORC1, MDM2, p21Wafl, Ciclina D1, Lamina A, Tpl2, Myc, catenina, Wnt, IKK-beta, IKK-gamma, IKK-alfa, IKK-épsilon, ELK, p65RelA, IRAK1 , IRAK2, IRAK4, IRR, FADD, TRAF6, TRAF3, MKK3, MKK6, ROCK2, RSK1/2, SGK1, SmMLCK, SIK2/3, ULK1/2, VEGFR1, WNK1, YES1, ZAP70, MAP4K3, MAP4K5, MAPK1b, MAPKAP -K2/K3, p38 alfa/beta/delta/gamma MAPK, Aurora A, Aurora B, Aurora C, MCAK, Clip, MAPKAPK, FAK, MARK1/2/3/4, Muc1, SHC, CXCR4 y Gap-1.
9. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la molécula efectora es un polipéptido que se une a objetivos seleccionados del grupo que consiste en p19INK4D, GSK-3, myc, p16INK4A, p53, KRas, NRas, Hras, p27KIP1, GSK3 beta, HER4, Src , PTEN, Bcl-2, Bcl-xL, mcl-1, Ataxina-1, catenina, IRAK1, IRAK2, IRAK4, VEGFR1, ZAP70, Aurora A, Aurora B y Aurora C.
10. La composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que la molécula efectora es un polipéptido que se une a objetivos seleccionados del grupo que consiste en myc, Bcl-2, Bcl-xL, mcl-1, catenina y p53.
11. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que la molécula pequeña se selecciona del grupo que consiste en agentes citostáticos y estructuras peptídicas o peptidomiméticas, incluidos los péptidos cíclicos o de cadena abierta con modificaciones estructurales naturales o no naturales.
12. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la molécula efectora es un péptido en hélice alfa derivado de proteínas sensibilizadoras de la apoptosis que se selecciona del grupo que consiste en BIM, BID, NOXA y PUMA.
13. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho conjugado es un dendrímero de maleimido, conectado a un péptido por medio del grupo tiol de una cisteína N-terminal de dicho péptido,
donde dicho dendrímero de maleimido se selecciona del grupo que consiste en d02, d03, d13, d14 y d19,
donde dicho péptido se selecciona del grupo que consiste en P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7,
donde d02 es un dendrímero de maleimido que tiene la estructura
Figure imgf000044_0001
donde d03 es un dendrímero de maleimido que tiene la estructura
Figure imgf000044_0002
donde d13 es un dendrímero de maleimido que tiene la estructura
Figure imgf000045_0001
donde d14 es un dendrímero de maleimido que tiene la estructura
Figure imgf000045_0002
donde d19 es un dendrímero de maleimido que tiene la estructura
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que dicho conjugado se selecciona del grupo que consiste en d02-P1, d02-P2, d02-P3, d03-P3, d02-P4, d03-P4, d02-P5, d02-P6 y d02-P7, y donde d02, d03, P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7 se definen como en la reivindicación 13.
15. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la molécula efectora es un polipéptido de toxina seleccionado del grupo que consiste en toxina diftérica, toxina diftérica que carece de actividad de unión al receptor, exotoxina A de pseudomonas, formas truncadas de exotoxina de pseudomonas que carece del dominio de unión al receptor la , toxina de la ricina, saporina, diantina, gelonina, tricosantina, proteína antiviral de la hierba carmín (PAP), bouganina, antígeno protector del ántrax, toxina alfa, abrina, polipéptidos inductores de la apoptosis.
16. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la molécula efectora es un polipéptido tóxico seleccionado del grupo que consiste en desoxirribonucleasa I (DNasa I), desoxirribonucleasa II (DNasa II), polipéptidos selectivos de tubulina alfa, polipéptidos selectivos de tubulina beta, polipéptidos selectivos de dineína, polipéptidos conjugados selectivos de quinesina, polipéptidos selectivos de NEDD1, polipéptidos selectivos de la proteína TACC de hélice superenrollada ácida transformante, polipéptidos selectivos de un tumor hepático colónico que sobreexpresa el gen chTOG.
17. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que las proteínas se seleccionan del grupo que consiste en proteínas globulares, glicoproteínas, toxinas, enzimas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos modificados y construcciones de proteínas, incluidos los anticuerpos de dominio único (sdAb), anticuerpos Fv de cadena única (scFv), anticuerpos Fv-Fc de cadena única (scFv-Fc).
18. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la proteína es IgG.
19. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la molécula efectora es una proteína seleccionada del grupo que consiste en p53 de tipo natural, p21 de tipo natural, factor inductor de apoptosis 1 (AIF1), ASK1, proteína inductora de apoptosis (AIP), caspasa-2, caspasa-3, caspasa-6, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10, Bax, serina proteasa, Smac, citocromo c, Apaf-1, apoptina.
20. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que E está dirigida contra moléculas implicadas en la proliferación y apoptosis de células tumorales.
21. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que G es un grupo funcional conector que forma la unión covalente entre E y L, seleccionado del grupo que consiste en O, S, NH, NH-O, C(=O)NH, OC(=O)NH, OC(=O)O, NHC(=O)NH, NHC(=S)NH, C(=NH)NH, C(=O), S(=O)2, S(=O), S(=O2)O, S-S, CH=N, CH=N-NH, C=N-NHC(=O), OP(=O)(O-M+)O, P(=O)(O-M+)O, arileno, etenileno, etinileno y triazolileno.
22. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para el uso (i) en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende cáncer, inflamación, enfermedad autoinmune, enfermedad metabólica y fibrosis, o (ii) en tratamientos antiproliferativos, proproliferativos, antiapoptóticos, proapoptóticos, antifibróticos, profibróticos, antilipogénicos, antidiabéticos, inmunoestimuladores y antienvejecimiento.
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