CN102775485A - 调节种子脂肪酸组成的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调节种子脂肪酸组成的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与调节植物种子脂肪酸组成相关的由序列2的氨基酸序列衍生的蛋白质。实验证明，转入本发明所提供的蛋白的编码基因的植物种子含油量增加，脂肪酸组成发生改变，油酸含量增加，种子千粒重增加。本发明对于培育种子含油量增加的植物新品种具有重要意义。

Description

调节种子脂肪酸组成的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种调节种子脂肪酸组成的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

中国是大豆、芝麻、油菜籽和花生等油料作物生产大国，提高油料生产的综合生产能力对于稳定食用油供给、控制通货膨胀等具有重要意义。鉴于目前我国油料供需较为严峻的形势，提高油料作物的综合生产能力成为当务之急。因为油料作物的种植面积是有限的，所以提高油料作物的产油率成为提高油产量的一个重要战略手段。

芝麻（Sesamum indicumL）是我国四大食用油料作物的佼佼者，是我国主要油料作物之一。芝麻种子含油量一般可达35-63%，平均可达55%，居食用油料作物之首。通过利用分子遗传学的方法已鉴定出油份代谢途径中编码关键酶的基因。

因此，利用生物工程技术改变植物光周期反应，进而培育性状优良的新品种成为一种有效的育种方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种调节种子脂肪酸组成的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的调节种子脂肪酸组成的蛋白，名称为SiDGAT1，来源于芝麻（Sesamum indicum L.），是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有调节植物种子脂肪酸组成功能的由序列2的氨基酸序列衍生的蛋白质。

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

序列表中序列2由543个氨基酸残基组成。

为了便于SiDGAT1蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（a）中的SiDGAT1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的SiDGAT1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5＇端和/或3＇端连上上表所示的标签的编码序列得到。

编码所述SiDGAT1蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述SiDGAT1蛋白的基因（命名为SiDGATl）；所述SiDGATl基因是如下1）-5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1的第122-1753位所示的DNA分子；

2）序列表中序列1的第118-1809位所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交且编码所述SiDGAT1蛋白的DNA分子；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述SiDGAT1蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列1由2037个核苷酸残基构成，其中从5′端第122-1753位为编码区序列，编码序列表中序列2所示的所述SiDGAT1蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为35S启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）。

更为具体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA3301载体的多克隆位点处插入所述SiDGATl基因得到的重组质粒，所述多克隆位点具体为BglII和BstE II。

所述表达盒由能够启动所述SiDGATl基因表达的启动子，所述SiDGATl基因，以及转录终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述SiDGATl基因的重组农杆菌；所述农杆菌具体可为LBA4404。

所述SiDGAT1蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a7）任一中的应用也属于本发明的保护范围：

a1）调控植物种子脂肪酸含量；

a2）调控植物种子脂肪酸组成；

a3）调控植物种子千粒重；

a4）调控植物种子体积大小；

a5）调控植株株高；

a6）调控植株开花期；

a7）选育满足如下条件中至少一种的植物品种：

（1）种子脂肪酸含量提高；

（2）种子油酸含量提高；

（3）种子亚油酸含量提高；

（4）种子亚麻酸在种子脂肪酸中的比例降低；

（5）种子千粒重增加；

（6）种子体积变大；

（7）植株高度增加；

（8）植株开花期提前。

在本发明的一个实施例中，所述调控植物种子脂肪酸含量具体体现为脂肪酸含量增加；所述调控植物种子脂肪酸组成具体体现为油酸（oleic acid）18:1和/或亚油酸（linoleic acid）18:2的含量提高，和/或亚麻酸（α-linolenic acid）18:3在所述脂肪酸中的比例下降；所述调控植物种子千粒重具体体现为植物种子千粒重增加；所述调控植物种子体积大小具体体现为植物种子体积大小增加；所述调控植株高度具体体现为植株高度增加；所述调控植株开花期（开花时间）具体体现为植株开花期提前。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法包括将编码所述SiDGAT1蛋白的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，满足如下（1）-（8）所示条件中的至少一种：

（1）种子脂肪酸含量提高；

（2）种子油酸含量提高；

（3）种子亚油酸含量提高；

（4）种子亚麻酸在种子脂肪酸中的比例降低；

（5）种子千粒重增加；

（6）种子体积变大；

（7）植株高度增加；

（8）植株开花期提前。

所述SiDGAT1蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述SiDGAT1蛋白的基因（即SiDGATl基因）是如下1）-5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1的第122-1753位所示的DNA分子；

2）序列表中序列1的第118-1809位所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交且编码所述SiDGAT1蛋白的DNA分子；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述SiDGAT1蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

所述SiDGATl基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物。

在本发明中，所述双子叶植物为大豆或拟南芥。

本发明所提供的SiDGAT1具有调控植物种子脂肪酸组成的作用。实验证明，转入所述SiDGATl基因的植物种子含油量增加，脂肪酸组成发生改变，油酸含量增加。本发明改变了植物品种的种子含油量和脂肪酸组成，克服了以往常规育种中，通过杂交选择高油品种或高油酸品种，或通过辐射和化学试剂进行诱变等常规方法进行品种改良所需时间较长，并且不能预计后代中突变的程度或方向的弱点，用所述SiDGATl基因进行品种改良是一种相对于传统方法而言特别有效并且简单可靠的方法，可应用于培育和改良植物的新品种。

附图说明

图1为PCR扩增SiDGATl基因的结果。其中，泳道M为分子量标准（TaKaRa公司）；泳道1-2为目的片段的PCR产物。

图2为农杆菌转化后克隆的PCR扩增检测结果。

图3为转SiDGATl基因拟南芥植株的抗PPT特性筛选结果。

图4为T₀代转SiDGATl基因拟南芥的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准（TaKaRa公司）；泳道1-10为10个阳性的T₀代转SiDGATl基因拟南芥株系。

图5为T₃代转SiDGATl基因的拟南芥的表型。

图6为T₃代转SiDGATl基因的拟南芥SiDGATl基因的表达结果及种子脂肪酸组成分析结果。其中，A为T₃代转SiDGATl基因的拟南芥SiDGATl基因的表达结果；B为T₃代转SiDGATl基因的拟南芥种子脂肪酸组成分析结果。对于B中的每一个样品，从左到右所表示的脂肪酸依次为油酸（oleic acid）18:1、亚油酸（linoleic acid）18:2和亚麻酸（α-linolenic acid）18:3。

图7为农杆菌介导的子叶节法转化大豆的过程。其中，a为无菌苗的萌发；b为丛生芽的诱导；c为抗性芽的筛选；d为丛生芽的伸长；e为抗性芽生根；f为得到的转化植株。

图8为T₀代转SiDGATl基因的大豆的SiDGATl基因的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准（TaKaRa公司）；泳道1-8为8个SiDGATl基因阳性的T₀代转SiDGATl基因大豆株系。

图9为T₀代转SiDGATl基因的大豆的bar基因的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准（TaKaRa公司）；泳道1-5为5个bar基因阳性的T₀代转SiDGATl基因大豆株系。

图10为T₂代转基因大豆的RT-PCR检测结果。其中，泳道M为分子量标准（TaKaRa公司）；泳道1-3为3个阳性的T₂代转SiDGATl基因大豆株系。

图11为T₃代转SiDGATl基因大豆植株的表型。

图12为T₃代转SiDGATl基因大豆植株种子的大小比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、调节种子脂肪酸组成的蛋白SiDGAT1编码基因的获得

以芝麻（Sesamum indicum L.）品种皖芝1号叶片为材料，采用Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA第一条链作为模板，以正义引物：CGTAGATCTTTTAATGGCGATTTTGGAC（下划线部分为Bgl II酶切位点，其后的序列为序列1的第118-136位），反义引物：GTTGGTGACCGGGGTGTAGTATCATTCCTC（下划线部分为BstE II酶切位点，其后的序列为序列1的第1790-1809位的反向互补序列），进行PCR反应。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，64℃30s，72℃3min，35个循环；72℃5min。将PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果表明PCR产物为1711bp（图1）。经测序，该PCR产物具有序列表中的序列1的第118-1809位核苷酸序列，将该PCR产物所在基因命名为SiDGATl基因。序列表中的序列1的ORF为第122-1753位核苷酸，编码序列表中序列2所示的蛋白，将该蛋白命名为SiDGAT1。

实施例2、转SiDGATl基因拟南芥的获得及其功能分析

一、重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl的构建

将实施例1所得的PCR产物和载体pCAMBIA3301（CLONETECH公司）分别使用限制性内切酶BglII和BstE II双酶切，回收酶切后约为1.7kb的PCR片段和酶切后约7.9kb的载体大片段，将二者连接转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性单菌落，摇菌提取质粒。采用限制性内切酶BglII和BstE II进行双酶切鉴定，将经过鉴定得到的含有大小约为1.7kb和大小约为7.9kb两个片段的质粒送样测序。将经测序表明在pCAMBIA3301载体的BglII和BstE II位点之间插入了序列表中的序列1的第118-1809位核苷酸序列的重组质粒命名为pBICAMBIA-SiDGATl。在该重组表达载体中，启动SiDGATl基因转录的启动子为CaMV35S启动子。

二、转SiDGATl基因拟南芥的获得

1、重组表达载体转化农杆菌

将步骤一获得的植物重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404（Invitrogen公司，产品编号18313015）中得到重组菌LBA4404/pBICAMBIA-SiDGATl。具体如下：

（1）取2μL（少于50ng）纯化的质粒DNA（重组表达载体pBICAMBIA-SiDGAT1或pCAMBIA3301），加入到含有100μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的离心管中，轻轻混匀。（2）冰浴30min，于液氮中速冻2min，迅速置37℃水浴热激5min，再迅速冰浴2min。（3）加入500μL无抗生素的YEP液体培养基（胰化蛋白胨1g，酵母提取物1g，NaCl 0.5g，加水至90mL，摇动容器至溶质完全溶解，调pH值至7.0，定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存）于28℃，100rpm轻轻振荡培养3~5h复苏。（4）用移液器将菌液移至YEP固体培养基（胰化蛋白胨1g，酵母提取物1g，NaCl 0.5g，加水至90mL，摇动容器至溶质完全溶解，调pH值至7.0，加1.5g琼脂，定容至100mL，高压灭菌20min）（添加终浓度为50mg/L的链霉素，25mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素）表面，均匀涂布于整个平板。（5）28℃倒置培养1~2d，直至长出合适大小的菌落，取单菌落用碱法提取质粒，使用实施例1所述的正义引物和反义引物进行PCR检测。同时设置pBICAMBIA-SiDGATl作为阳性对照，转入pCAMBIA3301空载体的重组农杆菌为阴性对照。

PCR检测结果如图2所示，大部分转化了重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl的农杆菌都与阳性对照一样，扩增出了大小为1711bp的目的片段。对于转入pCAMBIA3301空载体的重组农杆菌，由于载体上不含有目的片段，所以PCR检测结果无扩增条带。将扩增出1711bp目的片段的重组农杆菌命名为LBA4404/pBICAMBIA-SiDGATl；将转入pCAMBIA3301空载体的重组农杆菌命名为LBA4404/pBICAMBIA。

2、重组农杆菌转化拟南芥

转化植株渗透缓冲液（infiltration medium buffer）：1/2MS培养基中含有1×Gamborg’s B5vitamins（供应商：先进技术工业有限公司，产品货号：CM548762）；终浓度为5%（w/v）的蔗糖；终浓度为50μL/L的Silwet L-77。

采用农杆菌介导法将步骤1获得的重组菌LBA4404/pBICAMBIA-SiDGATl转化拟南芥品种Columbia-0。具体如下：

将野生型拟南芥Columbia-0种子种植在蛭石：土中，植株花蕾萌发后，剪去其主枝顶端，打破顶端优势，促进侧枝发展，在剪顶后的一周内，准备进行农杆菌转化。取100μl鉴定正确并保存于-80℃的菌种（LBA4404/pBICAMBIA-SiDGATl）接种于5ml含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，活化菌种。将活化后的菌种接种于150ml含卡那霉素（100mg/L）和利福平（50mg/L）的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD600＝1.0左右。5000rpm离心10min，收集菌体，将菌体悬浮于转化植株渗透缓冲液（infiltration medium buffer）中，使OD600＝0.8～0.9。将野生型拟南芥花序浸入转化缓冲液中浸泡1min后平放，用保鲜膜包裹花序，覆盖遮光，暗培养24h。24h后，拟南芥将直立正常生长，按常规方法培育植株，10周后收获65株成熟T₀代种子。同时设置转化LBA4404/pBICAMBIA的拟南芥植株作为空载体对照。

3、转基因拟南芥的鉴定

将步骤2获得的T₀代拟南芥种子干燥两周后播种于含5μg/mL浓度草丁膦的MS培养基上，4℃黑暗春化两天后转移到光照培养室（22℃，16/8(L/D，光强130μmol·m^-2s^-1)）中培养。由于pBICAMBIA3301载体上含有编码抗除草剂草丁膦的bar基因，所以成功转入重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl或是空载体pBICAMBIA3301的拟南芥植株理论上能够在草丁膦选择培养基上生长，而未转进去外源基因的非转基因植株则成为白化苗，不能生长（图3）。

15d后，把草丁膦阳性的转基因植株的拟南芥幼苗（正常生长的绿色拟南芥苗），移栽到基质土中生长。当植株长至20～25d叶时，取叶片提取基因组DNA，用引物ssDGAT(1623)-S和引物ssDGAT(1623)-A进行PCR鉴定。同时以重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl替代模板作为阳性对照，以未转基因的野生型拟南芥植株作为阴性对照，同时设置以水替代模板的空白对照。

ssDGAT(1623)-S：ATTTTGGACTCGCCGGAGA（序列1的第128-146位）

ssDGAT(1623)-A：CCTTGCACTAGCTTTTCGATTC（序列1的第1729-1750位的反向互补序列）

部分植株的PCR鉴定结果如图4所示，部分T₀代转SiDGATl基因拟南芥植株经PCR扩增可得到大小约为1.6kb的目的条带。将经过PCR鉴定进一步表明转入SiDGATl基因的拟南芥植株命名为Col/pBICAMBIA-SiDGATl。同时将转入空载体pBICAMBIA3301的拟南芥植株命名为Col/pBICAMBIA。

PCR鉴定正确的植株成熟后分单株收取种子（T₁代）。将上述PCR鉴定为阳性的T₁代转SiDGATl基因拟南芥中的十二个分别编号为60-23、60-27、60-85、60-53、47-32、47-7、44-6、44-1、3-17、17-2和61-d，并对这十二个植株进行RT-PCR分析，同时以未转基因的野生型拟南芥为对照。结果显示，十二个植株均有特异条带，而未转基因的野生型拟南芥则没有特异条带，表明外源基因SiDGATl已经整合到这十二个T₁代转SiDGATl基因拟南芥植株的基因组中，并在转录水平上得到有效的表达。

将上述十二个T₁代转SiDGATl基因拟南芥植株所结的种子及该种子所长成的植株称为T₂代，将T₂代转SiDGATl基因拟南芥植株所结的种子及该种子所长成的植株称为T₃代。

三、转SiDGATl基因拟南芥的功能分析

以下将对步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥进行表型观察、种子含油量分析、种子脂肪酸组成分析、以及种子千粒重的分析。

1、转SiDGATl基因拟南芥表型的观察

将步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子（编号为60-23和3-27的转基因拟南芥）和未转基因的野生型拟南芥（WT）种子灭菌后分别播种于MS培养基上，16h光/8h暗（长日照），25℃生长10天后转移到土里。对其表型进行观察，涉及植株生长状态、叶片颜色、株高、开花期等。同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的拟南芥植株作为对照。

结果如图5所示，从图中可以看出，T₃代转SiDGATl基因拟南芥植株以及野生型拟南芥植株都能进行正常的生长发育。但转SiDGATl基因拟南芥植株的生长状态更好，植物叶片较绿，且植株株高明显高于野生型拟南芥，同时开花期略早于野生型拟南芥。转入空载体的拟南芥植株的表型与野生型拟南芥植株一致。以上结果说明SiDGATl基因对拟南芥的生长发育具有促进作用。

2、转SiDGATl基因拟南芥种子脂肪酸含量分析

对于大多数脂肪酸而言，气相色谱法是其最佳的分析方法。脂肪酸在室温的条件下可以迅速的被酯化成脂肪酸甲酯，通过测定脂肪酸甲酯间接测定脂肪酸的含量。本研究采用的仪器为日本岛津GC-14C型气象色谱仪。

气相色谱条件如下：

毛细管柱：采用FFAP弹性石英毛细管柱（30m×0.125mm×0.13um）；柱温：210℃；进样口温度：250℃；FID检测器温度：250℃；空气流速：400ml/min；氢气流速：40ml/min；氮气压力：11620kPa；分流比：1︰50；进样量：1μl。

种子含油量分析的具体操作如下：

方法一：称取干燥的步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子（十二个编号为60-23、60-27、60-85、60-53、47-32、47-7、44-6、3-27、44-1、3-17、17-2和61-d的转基因植株）和未转基因的野生型拟南芥种子粉末0.4-0.5g装于磨口三角瓶中，加入5ml乙醚进行油份的提取，过夜。过夜后，将上层清夜倒入广口三角瓶或小烧杯中，在通风橱中通风，挥发去掉乙醚（大约需6-8h）。取油100μl于15ml的磨口刻度试管中，加入2ml乙醚-正己烷（体积比为2︰1）的混合液，充分震荡，再加入2ml甲醇充分震荡，在向试管中加入2ml含有0.8mol/l氢氧化钠的甲醇溶液，充分震荡，混匀，静置10-20min，加入2ml蒸馏水，充分震荡，混匀，静置10min。吸取上清液100μl于小瓶中，加入1ml乙酸乙酯，即可上机测定。

方法二：取干燥的步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子（十二个编号为60-23、60-27、60-85、60-53、47-32、47-7、44-6、3-27、44-1、3-17、17-2和61-d的转基因植株）和未转基因的野生型拟南芥种子粉末0.5g于10ml EP管中，加入5ml含有1%（1g/100ml）甲醇的氢氧化钠溶液，震荡，使样品和溶液充分混匀，静置30min，滴入5滴10%（10g/100ml）乙酸，再加入3ml正庚烷，充分震荡，静置2min，即可吸取上清液上机测定。

取1μl溶液上机检测，每测定一个样品需7min。气相色谱图结果计算按峰面积归一法在N3000工作站下完成。同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的拟南芥植株作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示，在十二个T₃代转SiDGATl基因拟南芥株系种子中，总含油量较野生型上升了1.44-26.06%，尤其是株系44-1含油量上升了26.06%，株系44-6含油量上升了22.48%。而株系60-23，47-32，47-7和60-27分别上升了13.88%，12.70%，12.46%和9.96%。转入空载体的拟南芥植株的总含油量与野生型拟南芥植株一致，无显著差异。以上结果说明SiDGATl基因在种子油份积累过程中具有重要作用。

3、转SiDGATl拟南芥种子脂肪酸组成分析

一方面，采用气相色谱分析步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子（十一个编号为3-27、3-17、61-d、60-23、60-27、60-85、60-53、47-32、47-7、44-6和44-1的转基因植株）和未转基因的野生型拟南芥种子中脂肪酸组成进行分析。种子进行上机前处理方法同步骤2，所采用的仪器以及色谱条件同步骤2。上机后各脂肪酸甲酯按其碳原子数目增加的次序流出色谱柱，若碳原子数相同，则按照不饱和成度增加的次序流出。同时本研究采用标准物在相同条件下进行色谱，从而对各流出组分进一步定性，进而确定流出组分的具体成分。气相色谱图结果计算按峰面积归一法在N3000工作站下完成。本研究同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的拟南芥植株作为对照。

另一方面，采用RT-PCR检测步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子（十一个编号为3-27、3-17、61-d、60-23、60-27、60-85、60-53、47-32、47-7、44-6和44-1的转基因植株）中SiDGATl基因的表达情况。从而分析转SiDGATl基因拟南芥种子中SiDGATl基因的表达情况与脂肪酸组成之间的关系。RT-PCT所采用的SiDGATl基因的扩增引物为ssDGAT(1623)-S和ssDGAT(1623)-A。本研究同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的拟南芥植株作为对照。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如图6所示，与未转基因的野生型拟南芥相比，T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子，在35S启动子启动下，SiDGATl基因表达水平有不同程度的提高，相对应的脂肪酸组成也发生变化，油酸（oleic acid）18:1和亚油酸（linoleic acid）18:2的含量有小幅提高，而亚麻酸（α-linolenic acid）18:3在总的脂肪酸中的比例有所下降。转入空载体的拟南芥植株的脂肪酸组成与野生型拟南芥植株一致，无显著差异。

4、转SiDGATl拟南芥种子千粒重分析

随机选取步骤二获得的T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子（十二个编号为60-23、60-27、60-85、60-53、47-32、47-7、44-6、3-27、44-1、3-17、17-2和61-d的转基因植株）和未转基因的野生型拟南芥种子各1000粒，称其重量。

千粒重检测结果如表1所示，十二个T₃代转SiDGAT1基因拟南芥种子的千粒重比野生型普遍显著提高，其中以株系60-27和60-23最为明显，株系60-27的千粒重提高了46.47%，株系60-23提高了40%。同时，株系60-53、株系60-85、株系44-1、株系44-6、株系47-7和株系47-32的千粒重也分别提高了37.53%、37.06%、37.65%、32.77%、28.94%和27.94%。转入空载体的拟南芥植株种子的千粒重与野生型拟南芥植株一致，无显著差异。以上结果说明SiDGATl基因对拟南芥种子干物质积累具有重要作用，可以推测过表达SiDGATl基因可能增加拟南芥产量。

表1T₃代转SiDGATl基因拟南芥种子千粒重和总含油量比较分析

株系	千粒重（mg）	总含油量%（w/w）
			60-23	23.80±0.16**	42.99±0.02**
60-27	24.90±0.26**	39.07±0.02**
			60-85	23.30±0.69**	37.72±0.29**
60-53	23.38±0.45**	35.36±0.01**
			47-32	21.75±0.19**	41.81±0.01**
47-7	21.92±0.25**	41.57±0.01**
			44-6	22.57±0.29**	51.59±0.05**
44-1	23.40±0.28**	55.17±2.80**
			3-27	22.00±1.05**	40.57±0.49**
3-17	19.53±0.67*	39.52±0.12**
			17-2	21.11±0.21**	30.55±0.11*
61-d	18.02±1.26*	32.11±0.13**
			WT	17±0.34	29.11±0.02

注：^**表示在0.01水平上与对照（WT）相比差异极显著；^*表示在0.05水平上与对照（WT）相比差异显著。

综上所述，转SiDGATl基因的拟南芥比未转基因的野生型拟南芥的种子含油量增加、油酸和亚油酸含量略有增加，千粒重增加，说明SiDGAT1促进植物种子油份的积累和种子重量的增加。

实施例3、转SiDGATl基因大豆的获得及其功能分析

一、转SiDGATl基因大豆的获得

1、外植体的获得

选取当年收获的表面光滑无病的健康饱满的大豆（Glycine max(L.)Merrill.）品种东农50（东北农业大学大豆科学研究所，商品名称：东农50）的种子，利用氯气消毒法灭菌：将选取好的大豆种子放在培养皿中，称量96ml的次氯酸钠（10g/100ml）放于广口瓶中，将其与放好种子的培养皿平稳的放在通风橱内密闭的容器内，称取4ml的浓盐酸（质量分数为38%）混于盛有次氯酸钠广口瓶中，迅速密封容器，进行消毒。

将消毒后的种子接种于含6-BA萌发培养基（B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，2%(2g/100ml)蔗糖，0.7mg·L^-16-BA，0.8%(0.8g/100ml)琼脂，pH=5.8）上。培养条件为：温度24±1℃；光周期为16/8h。种子萌发5～7d后，去掉种皮，在子叶节下3～4mm处切去下胚轴，纵向切开子叶，去掉顶芽和腋芽。每粒种子获得两个子叶节外植体。

2、侵染与共培养

在子叶节生长点附近轻划伤口，并与预先制备的实施例2步骤二1中获得的重组农杆菌LBA4404/pBICAMBIA-SiDGATl或LBA4404/pBICAMBIA的菌液混合在一起。将其置于摇床上，120rpm侵染30min。将外植体取出，吸干菌液，倒扣在铺有一层滤纸的共培养培养基（1/10浓度的B5大量盐和微量盐，1/10浓度的MS铁盐，B5维生素，3%(3g/100ml)蔗糖，3.9g·L^-12-吗啉乙磺酸，40mg·L^-1AS，0.25μg·L^-1GA3，1mMDTT，8.8mM L-半胱氨酸，1.70mg·L^-16-BA，0.5%(0.5g/100ml)琼脂，pH=5.4）上，暗培养3d。

3、丛生芽的诱导及筛选

将步骤2共培养后的子叶节用无菌水清洗两次，然后再用加有除菌剂（头孢霉素）的液体芽诱导培养基（B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3%蔗糖(3g/100ml)，0.59g·L^-12-吗啉乙磺酸，1.7mg·L^-16-BA，100mg·L^-1头孢霉素，0.8%琼脂，pH=5.6）清洗两次，用无菌滤纸吸干子叶节，接种在添加了除菌剂的芽诱导培养基上，进行恢复培养。

在芽诱导培养基上培养7d后，将其转入含有草丁膦（PPT）浓度为5mg·L^-1的芽诱导培养基（即筛选培养基）中进行筛选7d。培养条件为：温度24±1℃；光周期为16/8h。

4、抗性芽的伸长和生根

将通过步骤3筛选得到的外植体转入芽伸长培养基（MS大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3%蔗糖(3g/100ml)，0.59g·L^-12-吗啉乙磺酸，0.5mg·L^-1GA3，0.1mg·L^-1IAA，1mg·L^-1玉米素（ZR），50mg·L^-1L-天冬酰胺，100mg·L-1L-焦谷氨酸，100mg·L^-1头孢霉素，0.8%(0.8g/100ml)琼脂，pH=5.6）中，转入时切掉子叶以及下胚轴基部的老化组织，每7d继代一次。当芽伸长至3～4cm时，将其贴根剪下，转入生根培养基（1/2浓度的B5大量盐和微量盐，MS铁盐，2%(2g/100ml)蔗糖，0.59g·L^-12-吗啉乙磺酸，1m g·L^-1IAB，0.8%(0.8g/100ml)琼脂，pH=5.6）中进行生根培养。培养条件为：温度24±1℃；光周期为16/8h。

5、抗性植株的驯化

待根足够发达后，洗净根部的培养基，将小苗移入液体培养液（1/2MS液体培养基）中炼苗3～5d，同时打开瓶口，使无菌苗逐渐适应有菌的外界环境。然后将植株取出转至蛭石中避光培养驯化，同时套袋以保湿，然后逐渐降低湿度、增强光照。待小植株成活后转入正常的土壤中栽培，保持温、湿度和正常光照至结荚成熟，获得T₀代转基因大豆种子。

通过农杆菌介导的子叶节法转化大豆的过程如图7。

6、转基因大豆的分子鉴定

（1）T₀代转基因大豆基因组DNA的PCR检测

提取上述步骤5获得草丁膦抗性的转SiDGATl基因大豆植株和转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株叶片的基因组DNA，用实施例2步骤二3中所述引物ssDGAT(1623)-S和引物ssDGAT(1623)-A针对SiDGATl基因进行PCR扩增。用引物BAR-F和引物BAR-R针对草丁膦抗性基因bar进行PCR扩增。同时以重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl替代模板作为阳性对照，以未转基因的大豆品种东农50作为阴性对照，同时设置以水替代模板的空白对照。

BAR-F：CCGGCAACAATTAATAGACT

BAR-R：TCCATAGTTGCCTGACTCCC

SiDGATl基因的PCR鉴定结果如图8所示，部分转SiDGATl基因大豆植株与阳性对照一致，经PCR扩增可得到大小约为1623bp的目的条带。而空白对照、阴性对照，以及转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株均没有目的条带产生。

Bar基因的PCR鉴定结果如图9所示，转SiDGATl基因大豆植株与阳性对照一致，经PCR扩增可得到大小为472bp的目的片段，而空白对照和阴性对照均未扩增出目的条带。转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株的检测结果也为阳性。

将经过上述两种PCR鉴定进一步表明转入SiDGATl基因的大豆植株命名为东农50/pBICAMBIA-SiDGATl。同时将转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株命名为东农50/pBICAMBIA。

将鉴定后的抗性转基因植株经生根，移栽后，正常生长结实。最后得到4个株系的T₁代转SiDGATl基因大豆，编号分别为7-13、5-18、23-19和14-15。将T₁代转SiDGATl基因大豆自交后获得T₂代转SiDGATl基因大豆。

（2）T₂代转基因大豆的RT-PCR检测

为了进一步鉴定SiDGATl基因能否在转基因大豆中正常表达，提取PPT筛选阳性的T₂转SiDGATl基因大豆植株和转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株的RNA，反转录后进行RT-PCR。所用引物为针对SiDGATl基因的实施例2步骤二3中所述引物ssDGAT(1623)-S和引物ssDGAT(1623)-A。同时以重组表达载体pBICAMBIA-SiDGATl替代模板作为阳性对照，以未转基因的大豆品种东农50作为阴性对照，同时设置以水替代模板的空白对照。

结果如图10所示，转SiDGATl基因大豆植株中可以扩增出1623bp的目的片段，而空白对照、阴性对照，以及转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株均没有目的条带产生。这一结果说明SiDGATl基因在转基因大豆中可以被正常转录成mRNA。

将PCR检测阳性并且RT-PCR检测阳性的转SiDGATl基因大豆植株保留，进行下一步分析，并获得籽粒。将T₃代转SiDGATl基因大豆植株所结的种子及该种子所长成的植株称为T₃代。

二、转SiDGATl基因大豆的功能分析

以下将对步骤一获得的T₃代转SiDGATl基因大豆植株进行表型观察、种子含油量分析、以及种子体积大小的分析。

1、转SiDGATl基因大豆植株的表型观察

将步骤一获得的T₃代转SiDGATl基因大豆种子（编号为7-13、5-18、23-19和14-15的转基因大豆）和未转基因的大豆品种东农50（CK）种子灭菌后分别播种于MS培养基上，16h光/8h暗（长日照），25℃生长10d后转移到土里。对其表型进行观察，涉及植株生长状态、叶片颜色、株高等。同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的大豆作为对照。

结果如图11所示，从图中可以看出，T₃代转SiDGATl基因大豆植株以及未转基因的大豆品种东农50植株都能进行正常的生长发育。但转SiDGATl基因大豆的植株株高明显高于未转基因的大豆品种东农50。转入空载体的大豆植株的表型与未转基因的大豆品种东农50植株一致。以上结果说明SiDGATl基因对大豆的生长发育具有促进作用。

2、转SiDGATl基因大豆种子脂肪酸含量分析

对于大多数脂肪酸而言，气相色谱法是其最佳的分析方法。脂肪酸在室温的条件下可以迅速的被酯化成脂肪酸甲酯，通过测定脂肪酸甲酯间接测定脂肪酸的含量。本研究采用的仪器为日本岛津GC-14C型气象色谱仪。

气相色谱条件如下：

毛细管柱：采用FFAP弹性石英毛细管柱（30m×0.125mm×0.13um）；柱温：210℃；进样口温度：250℃；FID检测器温度：250℃；空气流速：400ml/min；氢气流速：40ml/min；氮气压力：11620kPa；分流比：1︰50；进样量：1ul。

种子含油量分析的具体操作如下：

方法一：称取干燥的将步骤一获得的T₃代转SiDGATl基因大豆种子（编号为7-13、5-18、23-19和14-15的转基因大豆）和未转基因的大豆品种东农50（CK）种子粉末0.4-0.5g装于磨口三角瓶中，加入5ml乙醚进行油份的提取，过夜。过夜后，将上层清夜倒入广口三角瓶或小烧杯中，在通风橱中通风，挥发去掉乙醚（大约需6-8h）。取油100μl于15ml的磨口刻度试管中，加入2ml乙醚-正己烷（体积比为2︰1）的混合液，充分震荡，再加入2ml甲醇充分震荡，在向试管中加入2ml含有0.8mol/l氢氧化钠的甲醇溶液，充分震荡，混匀，静置10-20min，加入2ml蒸馏水，充分震荡，混匀，静置10min。吸取上清液100μl于小瓶中，加入1ml乙酸乙酯，即可上机测定。

方法二：取干燥的将步骤一获得的T₃代转SiDGATl基因大豆种子（编号为7-13、5-18、23-19和14-15的转基因大豆）和未转基因的大豆品种东农50（CK）种子粉末0.5g于10ml EP管中，加入5ml含有1%（1g/100ml）甲醇的氢氧化钠溶液、，震荡，使样品和溶液充分混匀，静置30min，滴入5滴10%（10g/100ml）乙酸，再加入3ml正庚烷，充分震荡，静置2min，即可吸取上清液上机测定。

取1μl溶液上机检测，每测定一个样品需7min。气相色谱图结果计算按峰面积归一法在N3000工作站下完成。同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的大豆植株作为对照。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表2所示，转SiDGATl基因的大豆株系的种子含油量普遍增加，尤其是株系14-15含油量为23.57%，株系23-19含油量为22.70%，株系7-13含油量为23.19%，而未转基因的大豆品种东农50（CK）为19.39%。转入空载体的拟南芥植株的总含油量与野生型拟南芥植株一致，无显著差异。以上结果说明SiDGATl基因在大豆种子油份积累过程中具有重要作用。

表2转SiDGATl基因大豆T₃代种子含油量

基因型	含油量%(wt/wt)
		CK	19.39±0.65
7-13	22.34±0.13*
		14-15	24.31±0.62**
5-18	21.65±0.12*
		23-19	23.75±0.77**

注：^**表示P<0.01（Student’s t-test）；^*表示P<0.05（Student’s t-test）。

3、转SiDGATl基因大豆植株的种子体积大小的分析

比较步骤一获得的T₃代转SiDGATl基因大豆种子（编号为7-13、5-18和23-19的转基因大豆）和未转基因的大豆品种东农50（CK）种子体积的大小。同时设置转入空载体pBICAMBIA3301的大豆种子作为对照。

如图12所示，从图中可以看出，转SiDGATl基因大豆籽粒大于未转基因的大豆品种东农50的对照籽粒，推测SiDGATl基因可能提高大豆产量。转入空载体pBICAMBIA3301的大豆种子体积大小与未转基因的大豆品种东农50的对照籽粒大小基本一致，无差异。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有调节植物种子脂肪酸组成功能的由序列2的氨基酸序列衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）-5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1的第122-1753位所示的DNA分子；

2）序列表中序列1的第118-1809位所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。

7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）-a7）任一中的应用：

a1）调控植物种子脂肪酸含量；

a2）调控植物种子脂肪酸组成；

a3）调控植物种子千粒重；

a4）调控植物种子体积大小；

a5）调控植株株高；

a6）调控植株开花期；

a7）选育满足如下条件中至少一种的植物品种：

（1）种子脂肪酸含量提高；

（2）种子油酸含量提高；

（3）种子亚油酸含量提高；

（4）种子亚麻酸在种子脂肪酸中的比例降低；

（5）种子千粒重增加；

（6）种子体积变大；

（7）植株高度增加；

（8）植株开花期提前。

8.一种培育转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，满足如下（1）-（8）所示条件中的至少一种：

（1）种子脂肪酸含量提高；

（2）种子油酸含量提高；

（3）种子亚油酸含量提高；

（4）种子亚麻酸在种子脂肪酸中的比例降低；

（5）种子千粒重增加；

（6）种子体积变大；

（7）植株高度增加；

（8）植株开花期提前。

9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述双子叶植物为大豆或拟南芥。

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