CN102772786A - Bmp2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用，其中BMP2/7的载体采用共价结合肝素的胶原。本发明通过BMP2/7缓释载体的大鼠荷瘤实验、裸鼠颅内移植瘤实验、裸鼠皮下移植瘤实验，进行了BMP2/7缓释载体与化疗药物的协同作用、BMP2/7缓释载体的分布动力学特征、BMP2/7缓释载体的生物相容性研究，阐明了采用复合BMP2/7的缓释载体，在脑胶质瘤的局部可以形成高浓度的给药环境并能缓慢释放BMP2/7，抑制脑胶质瘤的增殖，促进其分化，如果配合传统的治疗手段如放疗或化疗，能够在不同的水平不同的途径发挥作用，增加了消除脑胶质瘤细胞的可能性。

Description

BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用

技术领域

本发明涉及脑胶质瘤治疗领域，具体涉及一种BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用。

背景技术

脑肿瘤的发病率为21/10万人，约占人类所有癌症的2％，其中脑胶质瘤的发病率约占脑肿瘤的60％。在1996年第三届(悉尼)国际肿瘤控制大会总结的资料中统计，脑胶质瘤的发病率为3～10/10万，占全身恶性肿瘤的1％～3％，我国每年新发脑瘤病人大约有4万人。手术加放化疗的平均生存期仅为8～11个月至今我国还没有脑胶质瘤大宗病例的长期追踪随访资料。由于脑胶质瘤的恶性程度高，转移快，复发率高，致残致死率高，目前缺乏有效的治疗手段。因此急待一种切实可行的治疗方法。

目前国内外尚没有治疗脑胶质瘤的有效手段，基本以外科手术与化疗为主，但效果不理想，复发率高。其中化疗的的毒副作用大，病人反应强烈。本研究拟采用的BMP2/7诱导脑胶质瘤干细胞分化的方法是一种无毒的治疗手段，在不增加病人痛苦的前提下，能够有效缓解病人的痛苦，因此具有很高的临床价值。

本专利发明人采用柔性连接技术自行研制开发的BMP2/7的异源二聚体结构类似物与同类其它BMPs药物相比，具有超群的生物活性，与胶原海绵复合后构成新型的BMP缓释系统，能够明显增加局部的药物浓度，提高药效水平。将该缓释系统植入脑组织，可以解决脑胶质瘤治疗时药物难以通过血脑屏障以及局部药物浓度较低的困难，提高药物的作用时间。同时，副反应小，毒性低，将成为良好的新型抗胶质瘤药物。

采用柔性连接技术表达BMP-2/7异源二聚体结构类似物：

1990年，Sampath等人从牛脱矿骨粉分离到一种蛋白，分子量约30,000左右，体内与体外都有明显的骨生成作用。还原型SDS-PAGE电泳则发现该蛋白由两个亚基组成，分别为18,000与16,000左右，经脱糖基处理后，分子量为16,000与14,000，测序后发现前者为BMP-7，后者为BMP-2，均为糖蛋白，但糖基化对二者的活性没有影响。表明天然状况下，就有BMP-2/7异源二聚体的存在。此后，获得BMP-2专利的Genetics Institute公司的研究人员发现，BMP-2/7异源二聚体的活性明显高于BMP-2与BMP-7的同源二聚体，体外实验的结果为20倍左右，体内实验为5-10倍。Wang等人发现，天然组织提取的BMP的诱骨活性比rhBMP2高10倍。Aki Aono等人的研究表明BMP-4/7异源二聚体也具有相同的情况，并猜测体内组织中BMP主要以异源二聚体的形式存在。虽然这一现象尚缺乏明确的理论依据，但许多研究者已将目标集中在此方面的工作上。

根据以上的结果，本专利发明人通过基因重组的方式将BMP-2与BMP-7的碳端用一段柔性肽(GlyGlyGlyGlySer)₄串连起来，并在Pichia Pastoris中得到异源二聚体的高效表达。柔性肽只有Gly与Ser两种氨基酸，因为侧链基团影响小，所以肽键的刚性很小，可以自由旋转，有极强的柔顺性，不会阻碍两侧肽链的自由折叠，又称柔性连接技术，运用很广。目前十分流行的人源化单抗ScFv，即是通过柔性肽的方式获得表达的。好处表现在下述方面：

1.提高异源二聚体的产量：与共表达BMP-2和BMP-7，在内质网中正确折叠，分泌到培养基中进行随机配对形成二聚体的方法相比，将二者用一段柔性肽共价连接起来表达可以得到均一型的异源二聚体，减少同源二聚体杂质，提高了产率，降低了纯化成本。

2.提高重组蛋白的可溶性：BMP单体有较多的疏水性氨基酸，但由于缺乏一个疏水中心，而将疏水集团暴露在单体分子表面，因此分子之间特别容易聚集，形成沉淀。将二者共价串连，可以减少单体之间的空间距离，使得二聚体更易发生，可溶性增加。

3.有利于正确构象的形成：活性形式的异源二聚体具有七对二硫键，其中一个是在分子之间形成的。串连起来的单体由于分子间的距离更加接近，更利于分子间二硫键的形成。

4.活性有所提高：由于BMP-2与BMP-7的协同作用，异源二聚体的比活比同源二聚体提高十几倍。

5.具有自主知识产权：这种新型的BMP由三部分组成，BMP-2、7和一段柔性肽，共同组成了一个完整的分子，我们把它叫做结构类似物，是一种有别于BMP2/7的新型分子，国内外均无报道。因此不会有知识产权的纠纷。

应用共价结合肝素的胶原作为BMP的载体，这种设计方案国内外均未见报道：

理想的载体应该具有：①生物相容性，使宿主不发生或仅发生轻微的炎症反应，使骨诱导的干扰因素最小化；②生物降解性，在体内以水解的方式降解，产生天然的中间代谢产物排出体外；③可吸收性，使残余载体对于骨修复生物机制特性的影响最小化。胶原具有原有良好的组织相容性和可吸收性，用胶原 作为BMP的载体，可避免复合材料的移动，防止被过快吸收，具有缓释作用。另外，胶原中含有一些生长因子，可以协同促进BMP的成骨作用。从牛腱重组的可吸收性的胶原海绵体和从牛骨提取的盐酸胍来源的胶原基质，分别作为BMP-2和BMP-7的载体已经得到应用。

本专利发明人将BMP的缓冲溶液直接涂布在胶原的表面，虽然可以得到较好的释放动力学模式，但仍不足以维持足够的时间来诱导成骨活动，如果使用化学方法增加BMP与胶原的亲和力，使细胞因子的释放维持更长的时间应该是一种理想的选择。考虑到BMP分子上存在的肝素亲和域，我们将肝素通过共价键固 定存胶原表面，便可以实现BMP与载体的有效结合。同时，肝素的存在，对维持BMP的结构，防止BMP的降 解具有十分重要的作用。通过调整结合肝素的BMP数量，获得了“二阶段”释放动力学模式，让游离的BMP以“爆发”方式进行释放，以形成诱导骨祖细胞的趋化环境，结合BMP以“缓释”方式进行释放，并维持较长时间，以维持局部的高浓度环境。

作用机理不依赖于细胞毒性作用，降低了毒副作用，提高治疗耐受性：

BMP2/7能够直接靶向脑组织的肿瘤干细胞，促进其分化，抑制其生长，有别于传统的化疗药物广泛的细胞毒性作用，副作用低，损伤小。如果配合传统的治疗手段，如放疗与化疗，能够在不同的水平，不同的途径发挥作用，增加了消除肿瘤细胞的可能性。

发明内容

本发明的目的是提供BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用。

为实现上述目的，本发明的BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用，其中BMP2/7的载体采用肝素化胶原蛋白。所述的肝素化胶原蛋白的制作步骤如下：

胶原蛋白的交联：取冻干胶原片称重，记录胶原片的质量，配置0.05M的2-甲基吗啡磺酸(MES)100ml(PH5.0)。室温下，将胶原片浸泡于上述溶质与酒精的混合物中(酒精体积为40％)，再向溶液中加入N，N-环己基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，按质量比为每克胶原蛋白1.731克EDC和0.415克NHS，浸泡4小时。

胶原蛋白的肝素化：交联的胶原蛋白PH5.0的MES缓冲液中浸泡30分钟以上，按1∶0.6配制EDC/NHS溶液，将肝素溶于0.05M的MES缓冲液(PH5.0)中，肝素浓度为2％(w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液。10min后，按每克胶原蛋白188.3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小时后，分别用0.1M的Na2HPO4，4M NaCl与无菌蒸馏水漂洗。

本发明的BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用，其中采用柔性连接技术表达BMP2/7异源二聚体类似物。柔性连接技术参考本发明人的专利“一种BMP2/7异源二聚体结构类似物及其表达方法与应用”，专利200610034620.2。

将BMP2/7异源二聚体与肝素化胶原蛋白结合制成BMP2/7缓释系统，结合步骤为：将直径10mm的肝素化胶原膜浸泡于5ml PBS溶液中过夜，晾干后滴入0.25ml的BMP2/7PBS溶液，室温静置90min后，PBS漂洗3次。

通过构建大鼠颅内荷瘤模型，在瘤体内注射BMP2/7缓释载体，表明：BMP2/7缓释载体能够明显抑制肿瘤的增殖，起到明显的治疗效果；BMP2/7缓释载体能够协同化疗药物抑制肿瘤的生长；缓释系统不但提高了靶区脑组织的药物浓度，同时降低了非靶区组织的浓度，避免药物的毒副作用；所有大鼠均未发生明显行为改变和神经功能缺陷，未出现全身或者局部毒性反应，表明BMP2/7缓释载体的生物相容性良好。

通过构建裸鼠颅内移植瘤模型，BMP2/7缓释系统单独作用能部分抑制肿瘤组织的形成，肿瘤组织对化疗药物不够敏感，而两者却又明显的协同作用，充分证明BMP2/7治疗脑胶质瘤的潜在价值。

通过构建裸鼠皮下移植U251胶质瘤模型，BMP2/7能够协同化疗药物显著抑制裸鼠皮下瘤的生长。

综上所述，本发明通过BMP2/7缓释载体的大鼠荷瘤实验、裸鼠颅内移植瘤实验、裸鼠皮下移植瘤实验，进行了BMP2/7缓释载体与化疗药物的协同作用、BMP2/7缓释载体的分布动力学特征、BMP2/7缓释载体的生物相容性研究，阐明了采用复合BMP2/7的缓释载体，在脑胶质瘤的局部可以形成高浓度的给药环境并能缓慢释放BMP2/7，抑制脑胶质瘤的增殖，促进其分化，如果配合传统的治疗手段如放疗或化疗，能够在不同的水平不同的途径发挥作用，增加了消除脑胶质瘤细胞的可能性。

附图说明

图1：大鼠9L细胞神经干细胞球囊培养，其中A、B为无血清培养基中培养9L神经干细胞，C为含血清培养基诱导贴壁。

图2：含血清培养诱导胶质瘤干细胞的分化。

图3：不同浓度BMP2/7处理9L干细胞的分化检测。

图4：9L细胞接种后，大鼠研究外突，眶周出血，肢体偏瘫，肌张力增高。

图5：9L细胞接种2周后，大鼠脑胶质瘤的MRI成像，表现为肿瘤实质部分强化，中央无强化的液体坏死区(箭头)。

图6：9L移植瘤病例表现(N：正常组织)。

图7：9L原位移植大鼠的荷瘤生存曲线。

图8：BMP2/7治疗大鼠移植脑胶质瘤的MRI检测，蓝色区域为计算机伪色。

图9：小动物活体成像检测BMP2/7缓释系统与化疗药物协同治疗大鼠颅内移植瘤。

图10：肝素浓度与BMP2/7的结合能力。

图11：BMP2/7结合力与BMP2/7浓度的关系。

图12：复合BMP2/7肝素化胶原膜的缓释动力学分析。

图13：复合BMP2/7肝素化胶原膜的缓释动力学分析。

图14：缓释系统组织相容性检测，A1为正常脑组织(200倍)，B1为正常脑组织(400倍)，A2为植入脑组织后1d(200倍)，B2为植入脑组织后1d(400倍)，A3为植入脑组织后3d(200倍)，B3为植入脑组织后3d(400倍)，A4为植入脑组织后1w(200倍)，B4为植入脑组织后1w(400倍)，A5为植入脑组织后2w(200倍)，B5为植入脑组织后2w(400倍)A6为植入脑组织后3w(200倍)B6为植入脑组织后3w(400倍)。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容，所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的授权之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1大鼠荷瘤生存试验

(一)材料与方法

1、试剂

DMEM/F12(1∶1)培养基，B27添加剂(Invitrogen)，N2添加剂(Invitrogen)胰蛋白酶(Sigma)，人表皮生长因(EGF，Invitrogen)，人碱性成纤维生长因子(bFGF，Invitrogen)，白血病抑制因子(LIF，Chemieon)，左旋谷胺酞氨(Sigma)，特级胎牛血清(Hycl。ne)，胰岛素、青霉素和链霉素(华北制药)，左旋多聚赖氨酸(Sigma)，红细胞裂解液(自配，含0.155mol/LNH4CI，0.01mol/LKHCO3，0.1M EDTA)，免疫磁珠分选液0.5％(v/v)BSA、2mM EDTA，加入0.01M PBS至100ml，用1N NaOH或1N HCl调节pH值为7.2，免疫磁珠(CD133⁺)细胞分选试剂盒为德国Miltenyi Biotec公司产品。

2、Fisher344大鼠9L细胞脑胶质瘤模型的建立

(1)9L细胞的复苏和培养：从-80℃取出冻存管，迅速放入37℃水浴中，使其融化，约lmin左右；室温下5min内，用低糖DMEM培养基稀释至原来体积的10倍。800rpm/min低速离心5min。去上清，加含10％胎牛血清的新鲜培养基，接种细胞进行培养，细胞融合超过80％时进行传代培养。

(2)细胞接种液的制备：对数生长期的单层培养细胞，0.25％胰酶消化，用PBS液洗涤二次，离心机转数为1000转/min，部分细胞到置显微镜下细胞计数，制备成细胞悬液10μL，待接种。部分细胞进行消化、洗涤后继续培养，观察其生长情况，做接种细胞的对照。结果细胞生长良好，细胞存活率＞95％。9L细胞的细胞形态如图所示。

3、免疫磁珠法分离大鼠脑胶质瘤干细胞方法

将大鼠胶质瘤细胞株9L分为两组，一组用少量缓冲液(0.5％牛血清白蛋白、2mM乙二胺四乙酸，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)，0.22μm过滤除菌，保持4～8℃)充分混悬细胞(按0.3ml/1×10⁸细胞浓度即可)，加入CD133抗体包被的超微磁珠，混匀后置4℃孵育30min。将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml缓冲液，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。将孵育完的细胞悬液加到分离柱中，自然流尽。洗柱两次。从磁场中取下分离柱，插在试管口，加1～2ml的缓冲液，用针芯推尽液体，冲出阳性结合的细胞，用无血清培养基洗一次，离心1000rpm，5min，接种到含EGF(20ng/ml)，bFGF(20ng/ml)，LIF(10ng/ml)，B27(1x)的无血清培养基中，置入37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养，对照组台盼蓝染色计数后不进行磁珠分选，直接接种到上述培养基中。两组视具体情况每2～4d换液一次。

4、流式细胞仪检测分选细胞中CD133的表达

分别收集血清和无血清培养基中大鼠胶质瘤细胞，消化离心后重悬于10％的马血清中，4℃孵育20分钟，离心后弃上清。细胞与羊抗-CD133多克隆抗体(1∶200，Santa cruz，美国)在4℃中孵育半小时，PBS洗两次。再将细胞与驴抗羊Alexa488荧光二抗(Molecular protect，美国)混合，4℃避光孵育15分钟，以PBS液洗涤。充分吹打成单细胞悬液后，用美国BD公司的流式细胞仪进行分析检测。同时以小鼠IgG作为一抗的细胞悬液作为阴性对照.

5、肿瘤细胞在含血清和无血清培养基中的相互转化

将原代无血清培养基中的悬浮克隆球消化后制备成单细胞悬液，以1x10⁵/ml的密度接种到含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，二周后将细胞收集后以同样密度接种到含生长因子的无血清培养基中培养二周，连续三次相同密度细胞在不同培养基条件转化培养后，观察细胞的克隆球形成能力以及生长状况。

6、单细胞悬液的制备和单细胞克隆分析

9L胶质瘤细胞以1000-2000cell/cm，的克隆密度接种于5ml含生长因子的DMEM/F12培养基中，1-2周后收集克隆球细胞消化后重悬于PBS溶液中，轻轻吹打后经300目的滤网过滤，离心后将细胞重悬于DMEM/F12培养基中，充分吹打后制备成单细胞悬液，台盼蓝染色镜下计数。将细胞梯度稀释到1000cell/ml的浓度，在每个96孔板孔中加入1-2ul的细胞悬液，再分别加入250ul含生长因子的无血清培养基进行培养观察。4小时后显微镜下仔细观察每个孔中的细胞接种数目，记录含有单个肿瘤细胞的孔。隔天观察一次细胞的分裂生长情况，一个月后计数单细胞克隆形成率。单细胞孔克隆球长至100-200细胞以后，将克隆球连同培养液吸出，轻轻吹打后接种于新的96孔板中，观察亚克隆形成情况。

7、单细胞来源克隆球的分化检测

收集克隆密度下无血清培养基中的单细胞来源克隆球，将其接种于含盖玻片的6孔板中，盖玻片事先用多聚赖氨酸浸泡10分钟。4小时后与5ug/ml Hoechst33342孵育10min，再用2％多聚甲醛固定20分钟。2)将单细胞来源的克隆球消化解离后，接种到6孔板中，含血清培养基培养一周后进行下一步检测。PBS缓冲液洗涤三次后加入EDTA修复液，于95℃水浴进行抗原修复15分钟。用10％马血清或羊血清封闭20分钟后加入一抗：羊抗-CD133多克隆抗体(1∶200，Santa Cruz，美国)、于37℃水浴孵育两小时，PBS冲洗三次，每次5分钟。加入羊抗兔Alexa fluor568(1∶100)和驴抗羊Alexa fluor488(1∶100)荧光二抗(Molecular Protect，美国)，4℃避光孵育45分钟，PBS液洗涤三次，每次五分钟。荧光显微镜下观察拍照，注意要始终保持盖玻片的湿润，最后计算阳性细胞表达率。

8、胶原海绵处理方法：

胶原海绵的膜片规格：3mm直径，1mm厚，将直径3mm的胶原膜和肝素化胶原膜浸泡于5ml PBS溶液中过夜，晾干后分别滴入0.25ml rhBMP2/7PBS溶液(高中低剂量组分别为400ng/ml，100ng/ml，25ng/ml)，低温真空干燥，备用。

9、大鼠颅内成瘤实验

采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下，将肿瘤细胞悬液以1μl/min的速度注射入靶区，除针前留针5min，使细胞充分沉淀，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。

造模后3天，按照完全随机的方法将荷瘤大鼠分为以下四组：高剂量组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵；中剂量组：100ng/ml BMP2/7+3mm海绵；低剂量组：25ng/ml BMP2/7+3mm海绵；胶原海绵组：400ng/mlBSA+3mm海绵。每组大鼠10只。

随机分组完成后，采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下1mm处，将肿瘤细胞悬液以1μl/min的速度注射入靶区，除针前留针5min，使细胞充分沉淀，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。按照上述的方法进行胶原海绵移植，分组如下：

高剂量组：原位移植400ng/ml BMP2/7+3mm海绵。

中剂量组：原位移植100ng/ml BMP2/7+3mm海绵

低剂量组：原位移植25ng/ml BMP2/7+3mm海绵

胶原海绵组：原位移植400ng/ml BSA+3mm海绵

各组大鼠的行为学观察：治疗各组细胞移植后，每日观察大鼠的神态、进食、活动等状态。

各组大鼠的生存周期观察：治疗后，每日观察各组大鼠的存活情况，记录生存时间。

MRI检测：自治疗后1周，每周对治疗各组大鼠进行MRI检查。采用10％水合氯醛对Fisher344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于特制固定架，分别取冠状、矢状及轴位扫描。扫描条件：采用3英寸表面线圈，TIWITR＝300ms，TE＝15ms，采集2次，T2WITR＝2000，TE＝90ms，层厚3.0mm，采集2次.扫描矩阵256×256，扫描野为3cm×3cm。并测量肿瘤直径。增强扫描时腹腔注射二乙三胺五乙酸轧(Gadoliniumdiethylene triaminepen taacetie acid，GDDTPA，2ml/kg)，然后进行扫描。

肿瘤体积的计算：取MRI扫描的最大冠状面和矢状面，测量最大前后径(L)、宽径(W)和高径(H)，观察肿瘤生长情况。肿瘤大小以下述公式计算肿瘤体积(V)：V＝(4/3×π×L×W×H)×1/8计算。

10、种植瘤细胞的体外培养

种植瘤取出后放入含PBS缓冲液的平皿中，利用有齿镊仔细剔除肿瘤中的血管成分和坏死组织，消化过程同步骤一。将细胞以1×10⁶/ml密度接种到无血清培养基中培养。裸鼠以过量麻醉处死。种植瘤细胞经一代培养后作进一步的96孔板单细胞克隆实验免疫荧光抗原检测实验以及克隆球细胞接种裸鼠实验

11、组织切片免疫组织化学抗原检测

固定于4％多聚甲醛的种植瘤组织以及患者原始肿瘤组织经脱水、石蜡包埋、切片等步骤后，切片在60℃烘箱中烘干过夜。

1)二甲苯脱蜡：在三个盛有二甲苯溶液的瓶中各浸泡10分钟，以达到彻底脱蜡的效果。

2)水化：100％无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟。0.01M的PBS缓冲液冲洗三次。

3)将PH为9.0的EDTA修复液放入玻璃杯中煮沸，放入切片，保持15-20分钟，注意防止脱片。

4)室温下放置45分钟后冷却，用PBS液冲洗三次。

5)切片放入湿盒中，加入3％H₂O₂，室温下10分钟，PBS冲洗三次。

6)加入10％的兔血清或者山羊血清封闭20分钟，弃去封闭液，不洗。

7)加入羊抗-CD133多克隆抗体、兔抗-GEAP多克隆抗体、兔抗-NSE多克隆抗体于37℃孵育2小时。用PBS液仔细冲洗三次。

8)加入SP试剂盒中的兔抗山羊或山羊抗兔二抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗三次。

9)加入SP试剂盒中辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育10分钟，PBS冲洗三次。

10)加入现配的DAB工作液，镜下观察待胞浆变黄后用自来水冲洗。

11)苏木素溶液中浸染5-10分钟，自来水冲洗。

12)盐酸酒精分化1秒，自来水冲洗。

13)氢氧化氨水溶液或60℃水浴中蓝化10分钟

14)在95％-100％的梯度酒精中脱水各2分钟。

15)待切片干燥后用中性树脂封片，镜下观察。

16)随机选择10个高倍视野，计数不少于200个细胞，计算阳性细胞所占肿瘤细胞百分率。

12、免疫荧光法检测多抗原共表达现象

收集原代无血清培养基中的悬浮克隆球接种到含盖玻片的6孔板中，加含血清培养基培养，分别在接种后4小时、2周时用2％的多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光检测。常规步骤同前，经马血清封闭后，每个玻片同时与混合一抗进行孵育，二抗为羊抗兔Alexa fluor568(1∶100)和驴抗羊Alexa fluor488(1∶100)荧光二抗混合液，避光孵育45分钟。固定细胞前均要与5ug/ml Hoechst33342孵育10min，以标记细胞核。荧光显微镜下，同一视野分别用不同波长的激发光观察，拍照记录。

13、统计学分析

各组计量资料均采用表示，细胞生长曲线采用重复测量方差分析，不同时间点的组间比较采用oneway ANOVA，多重比较采用LSD法比较分析；生存周期采用Kaplan-Meier，Long-rank分析；其余实验数据采用oneway ANOVA，多重比较采用LSD法比较分析。采用SPSS13.0统计软件包处理，P＜0.05时认为差异具有显著意义。

(二)结果与分析

1、大鼠9L肿瘤干细胞培养

在无血清培养基中，可在24-48小时后发现有单个或多个成簇悬浮细胞的形成，1w后细胞球明显增多，增大，形状多规则，由数量不等的圆形细胞组成，2周后可达到数百个细胞以上，晃动培养瓶时可见细胞球滚动。大部分细胞在无血清培养基中仍呈贴壁生长，随培养时间的延长贴壁细胞数有所减少(图1)。

撤去无血清培养基，换含血清培养基，导致球囊开始贴壁，分别检测神经干细胞标记物Nestin、胶质细胞标记物GFAP、神经元标记物Tuji的表达，如图2所示结果，0h时，只能检测到Nestin的表达，表明细胞处于未分化状态，24h后GFAP与Tuji的表达水平明显增加，Nestin标记几乎很难检测到，充分说明大鼠脑胶质瘤干细胞9L具有分化为胶质细胞与神经元细胞的能力(图2)。

我们尝试用不同浓度的BMP2/7处理9L干细胞，24h后检测分化水平，发现三种浓度的BMP2/7都能够明显促进分化，而且与单纯有血清培养相比，时间明显缩短(图3)。

2、荷瘤大鼠的行为学观察

Fisher344大鼠接种9L细胞1周后，表现为自行觅食、饮水较正常鼠减少，体重下降，反应迟钝，少动，并可出现行走不稳。接种后14天逐渐出现进行性颅内高压症状，部分鼠出现眶周出血、眼球外突，后期可有癫痈样发作、偏瘫及肌张力增高等症状(图4)。未干预组大鼠均于21天内逐渐死亡，死亡前出现肢体屈曲，不自主搐动。高剂量组400ng/ml BMP2/7+3mm胶原海绵移植组约3周左右，中剂量100ng/mlBMP2/7+3mm胶原海绵移植组约4周左右出现进行性颅内压增高症状。

3、荷瘤大鼠的MRI及病理表现

肿瘤种植2周后MRI显示大鼠脑内均有不同大小的胶质瘤生长，证明接种成功。常规MRI胶质瘤表现为圆形或类圆形肿块，边界较清楚，周围有片状水肿区，增强后肿瘤实质部分不同程度地强化，中央多出现无强化的液化坏死区(图5)。肿瘤最大直径在3.5-12mm之间，平均6.8上3.1mm。HE染色光镜下肿瘤细胞密集，核浆比例高，核分裂像少见，并有部分分化现象(图6)。

4、各组荷瘤大鼠的生存周期

经生存周期分析发现：各组大鼠的中位生存期分别为：生理盐水组18天，95％可信区间为15.078-20.922天；高剂量组400ng/ml BMP2/7+3mm胶原海绵移植组：57天，95％可信区间为47.703-66.297天；中剂量组100ng/ml BMP2/7+3mm胶原海绵移植组25天，95％可信区间为23.482-26.518天；低剂量组25ng/mlBMP2/7+3mm胶原海绵移植组23天，95％可信区间为18.868-27.123天。高剂量组400ng/ml BMP2/7+3mm胶原海绵移植组大鼠的生存时间最长，40％大鼠存活时间超过60天，与其余各组比较有显著性差异P＜0.01；高中剂量BMP2/7胶原海绵移植组大鼠生存时间较生理盐水组明显延长P＜0.01；低剂量BMP2/7胶原海绵移植组与对照组之间无显著性差异P＝0.924(图7)。

5、各组大鼠肿瘤大小的变化

根据每周MRI检查的结果，计算各组大鼠肿瘤的体积变化，统计学分析表明：7天、14天时BMP2/7胶原海绵高中低剂量组与BSA胶原海绵组比较有显著性差异(P＜0.01)，高剂量组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵；中剂量组：100ng/ml BMP2/7+3mm海绵与低剂量组：25ng/ml BMP2/7+3mm海绵和对照组400ng/mlBSA+3mm海绵比较有显著性差异(P＜0.01)；而低剂量组：25ng/ml BMP2/7+3mm海绵与400ng/ml BSA+3mm海绵(7天时＝0.725；14天时P＝0.620)无显著差异。21天时400ng/ml BSA+3mm海绵组大鼠全部死亡，高剂量组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵与对照组400ng/ml BSA+3mm海绵有显著性差异(P＜0.01)；28天，56天时高剂量组大鼠的肿瘤体积仍相对较小分别为32.40±2.15和45.35±2.52(表1)。MRI的结果显示，与对照组相比，中剂量与高剂量BMP2/7能够明显移植肿瘤的增殖，起到明显的治疗效果(图8)。

实施例2缓释载体与化疗药物的协同作用

(一)材料与方法

1、9L细胞的复苏和培养：从-80℃取出冻存管，迅速放入37℃水浴中，使其融化，约1min左右；室温下5min内，用低糖DMEM培养基稀释至原来体积的10倍。800rpm/min低速离心5min。去上清，加含10％胎牛血清的新鲜培养基，接种细胞进行培养，细胞融合超过80％时进行传代培养。

2、免疫磁珠法分离大鼠脑胶质瘤干细胞方法

将大鼠胶质瘤细胞株9L分为两组，一组用少量缓冲液(0.5％牛血清白蛋白、2mM乙二胺四乙酸，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)，0.22μm过滤除菌，保持4～8℃)充分混悬细胞(按0.3ml/1×10⁸细胞浓度即可)，加入CD133抗体包被的超微磁珠，混匀后置4℃孵育30min。将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml缓冲液，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。将孵育完的细胞悬液加到分离柱中，自然流尽。洗柱两次。从磁场中取下分离柱，插在试管口，加1～2ml的缓冲液，用针芯推尽液体，冲出阳性结合的细胞，用无血清培养基洗一次，离心1000rpm，5min，接种到含EGF(20ng/ml)，bFGF(20ng/ml)，LIF(10ng/ml)，B27(1x)的无血清培养基中，置入37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱中培养，对照组台盼蓝染色计数后不进行磁珠分选，直接接种到上述培养基中。两组视具体情况每2～4d换液一次。

3、胶原海绵处理方法：

胶原海绵的膜片规格：3mm直径，1mm厚，将直径3mm的胶原膜和肝素化胶原膜浸泡于5ml PBS溶液中过夜，晾干后分别滴入0.25ml rhBMP2/7PBS溶液(高中低剂量组分别为400ng/ml，100ng/ml，25ng/ml)，低温真空干燥，备用。

4、动物模型制备

采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下，将肿瘤细胞悬液以1μl/min的速度注射入靶区，除针前留针5min，使细胞充分沉淀，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。

5、抗胶质瘤化疗药物

替尼泊甙(teniposide，VM-26)，顺铂(cis-diamminedichlo-roplatin，CDDP)，长春新碱(vincristine，VCR)。按Limburg推荐的公式计算药物的血浆峰浓度(peak plasma concentration，PPC)(μg/ml)＝50×D/5000×2×10³，其中D为临床化疗剂量(mg/kg/d)，分别选用0.1×PPC、1×PPC、10×PPC为实验用药浓度。联合用药根据各药半数有效浓度(50％inhibiting concentration，IC₅₀)来确定实验用药浓度。见下表2。

6、实验动物的分组

造模后3天，按照完全随机的方法将荷瘤大鼠分为以下八组：

BMP2/7+化疗药物干预：

BMP2/7+VM-26组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵+0.05ug/mlVM-26

BMP2/7+CDDP组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵+0.3ug/mlCDDP

BMP2/7+VCR组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵+3.0ug/mlVCR

单纯化疗药物：

VM-26组：400ng/ml BSA+3mm海绵+5.0ug/mlVM-26

CDDP组：400ng/ml BSA+3mm海绵+3.0ug/mlCDDP

VCR组：400ng/ml BSA+3mm海绵+3.0ug/mlVCR

对照组：

BMP2/7组：400ng/ml BMP2/7+3mm海绵

胶原海绵组：400ng/ml BSA+3mm海绵

每组各10只大鼠。

7、荷瘤大鼠的胶原海绵移植

随机分组完成后，采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下，除针前留针5min，使细胞充分沉淀，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。按照上述的方法进行胶原海绵移植，分组如下：BMP2/7+VM-26组；BMP2/7+CDDP组；BMP2/7+VCR组；VM-26组；CDDP组；VCR组；BMP2/7组对照组；胶原海绵组对照组。

8、结果观察

(1)各组大鼠的行为学观察：治疗各组细胞移植后，每日观察大鼠的神态、进食、活动等状态。

(2)各组大鼠的生存周期观察：治疗后，每日观察各组大鼠的存活情况，记录生存时间。

(3)肿瘤体积的计算：取MRI扫描的最大冠状面和矢状面，测量最大前后径(L)、宽径(W)和高径(H)，观察肿瘤生长情况。肿瘤大小以下述公式计算肿瘤体积(V)：V＝(4/3×π×L×W×H)×1/8计算。

9、统计学分析

各组计量资料均采用

表示，细胞生长曲线采用重复测量方差分析，不同时间点的组间比较采用oneway ANOVA，多重比较采用LSD法比较分析；生存周期采用Kaplan一Meier，Long-rank分析；其余实验数据采用oneway ANOVA，多重比较采用LSD法比较分析。采用SPSS13.0统计软件包处理，P＜0.05时认为差异具有显著意义。

(二)结果与分析

1、生存周期分析：经生存周期分析发现，各组大鼠的中位生存期见下表3。

2.各组大鼠肿瘤大小的变化

根据每周MRI检查的结果(见表4)，计算各组大鼠肿瘤的体积变化，统计学分析表明：

7，14天BMP2/7组与化疗药物干扰组比较无显著差异，而与胶原海绵对照组比较P＜0.01有显著差异。21-56天BMP2/7与化疗药物干扰组出现显著差异，P＜0.01。BMP2/7与单纯的化疗药物组比较也表现显著差异，说明BMP2/7可以协同化疗药物抑制肿瘤生长。同时，我们采用小动物成像系统检测BMP2/7的协同作用，结果如图9所示，具有明显的协同效应。

实施例3缓释载体的药物分布动力学特征

EDC是一种具有良好水溶性的碳二亚胺类化合物，容易与醇、羧酸、胺等化合物中的活泼氢发生加成反应，转化为结构稳定的化合物，因而是一种应用广泛的缩合剂。它能够激活胶原中谷氨酸和天冬氨酸残基上羧基，使之与胶原中的赖氨酸或羟基赖氨酸上的氨基形成酰胺键，从而提高胶原的机械性能及其热稳定性。

而肝素是一种线型阴离子多糖，其含有的多种-OH、-COOH、-SO3H、NH2等官能团，均能用于高分子材料的肝素化反应，因此本试验条件下，肝素中的羧基经EDC活化后，与胶原膜中的-NH2等基团发生交联反应。

(一)材料与方法

1、胶原蛋白的交联：取冻干胶原片称重，记录胶原片的质量，配置0.05M的2-甲基吗啡磺酸(MES)100ml(PH5.0)。室温下，将胶原片浸泡于上述溶质与酒精的混合物中(酒精体积为40％)，再向溶液中加入N，N-环己基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，按质量比为每克胶原蛋白1.731克EDC和0.415克NHS，浸泡4小时。

2、胶原蛋白的肝素化：交联的胶原蛋白PH5.0的MES缓冲液中浸泡30分钟以上，按1∶0.6配制EDC/NHS溶液，将肝素溶于0.05M的MES缓冲液(PH5.0)中，肝素浓度为2％(w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液。10min后，按每克胶原蛋白188.3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小时后，分别用0.1M的Na₂HPO₄，4M NaCl与无菌蒸馏水漂洗。

3、rhBMP2/7与肝素化胶原蛋白的结合：将直径10mm的胶原膜和肝素化胶原膜浸泡于5ml PBS溶液中过夜，晾干后分别滴入0.25ml的¹²⁵I标记的rhBMP2/7PBS溶液，室温静置90min后，PBS漂洗3次，γ液闪计数器测定放射强度。

4、rhBMP2/7的¹²⁵I标记：按常规方法进行。

5、rhBMP2/7释放实验

取复合了rhBMP2/7的10mm肝素化胶原膜(对照为非肝素化胶原膜)，置于C2C12细胞培养液中(10％FBS，DMEM)，37℃5％CO2培养箱中温育，每24h换液1次，-20℃冻存，10d后ELISA检测培养液中rhBMP2/7的浓度。

6、rhBMP2/7体内释放实验

采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下1mm处，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。分别于术后4h及1、2、3、7、15d 6个时间点处死动物，取出脑组织内残余缓释微球，去离子水冲洗表面，冷冻干燥以除去残留水分。液闪计数器检测BMP2/7残余量，与植入时胶原中BMP2/7量比较，绘出不同剂量胶原海绵的释放曲线，并进行对比。

7、体内rhBMP2/7药物分布

将35只大鼠按时间点随机分成7组，每组5只。采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下1mm处，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。分别于术后4h及1、2、3、7、10、15d 7个时间点处死动物，取大鼠脑植入部位、对侧对称部位脑组织各1g及血0.5ml，以4N浓度NaOH溶液37℃水浴消化组织，过滤，置入5ml放射液闪溶液中进行放射性计数。

8、脑组织对复合胶原海绵的炎症反应

7只雄性SD大鼠，采用10％水合氯醛对Fisher 344大鼠按0.4ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后，颅平位固定与脑立体定位仪上，门齿低于耳根连线3mm。碘酒、酒精常规消毒，安装立体定向接种针。选定右侧额叶为接种靶点，其坐标为：冠状缝前1mm，矢状缝右3mm处切开皮肤，钻孔(直径3mm)，将BMP2/7复合胶原海绵植于额叶脑皮质下1mm处，颅骨骨孔用消毒骨蜡密闭，缝合。每天2次观察动物，尤其注意警惕性降低、被动、烦躁、易激惹、恐惧等行为改变以及运动障碍和步态不稳等神经功能障碍。分别于术后4h及1、2、3、7、10、15d 7个时间点处死动物，取出完整脑组织，10％福尔马林固定1w，12林m切片，常规HE染色，光镜下观察。

9、数据处理

实验数据以均数±标准差x(±)s表示，组间比较采用方差分析，SAS件进行统计学处理，P＜0.05为差异有显著的统计学意义。

(二)结果与分析

1、肝素化载体结合能力与肝素浓度的关系

¹²⁵I标记的rhBMP2/7与肝素化的胶原蛋白结合，检测载体结合rhBMP2/7的能力，肝素化胶原载体的结合能力与肝素浓度有一定的相关性，肝素浓度为30-40mg/g胶原时(EDC:Hep为0.4-0.6)结合的rhMP2/7最多，以后进入平台期，肝素浓度继续增高时结合rhBMP2/7的量有一定下降。(见图10)

2、肝素化载体结合能力与rhBMP2/7浓度的关系

我们又分析了肝素化胶原载体(EDC:Hep为0.4)结合能力与rhBMP2/7浓度的关系，结果表明二者之间呈线性关系，而且各作用浓度下，肝素化胶原结合的重组蛋白明显高于非肝素化的对照组。(见图11)

3、rhBMP2/7的缓释性能

我们将rhBMP2/7复合肝素化胶原浸泡于C2C12细胞的培养基中，在体外研究复合载体的缓释动力学特征。起始条件下，肝素化胶原蛋白(EDC:Hep为0.4)与对照胶原蛋白结合rhBMP2/7的量分别为27ng与49ng。48h内对照载体有41％的重组蛋白释放，而实验组只释放约15％的重组蛋白，10d之后对照组累积释放22.4ng(83％)的rhBMP2/7，而实验组的释放水平为20ng(42％)，其缓释能力明显优于对照组。(见图12)

4、rhBMP2/7的体内缓释能力

我们将rhBMP2/7复合肝素化胶原植于大鼠皮层下1mm处，在体研究复合载体的缓释动力学特征。4h时，肝素化胶原蛋白(EDC:Hep为0.4)与对照胶原蛋白结合rhBMP2/7的缓释程度分别为30％与10％。48h内对照载体有60％的重组蛋白释放，而实验组只释放约40％的重组蛋白，15d之后对照组累积释放92％的rhBMP2/7，而实验组的释放水平为56％，其缓释能力明显优于对照组。(见图13)

5、缓释载体植入后体内药物分布

实验数据以均数±标准差x(±)s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有显著的统计学意义。按照缓释载体植入的不同位置进行方差分析，不同位置的放射计数不同，P＜0.01。按照缓释载体植入后的不同时间进行方差分析，不同时间的放射计数不同，P＜0.01(见表5)。结果表明，BMP2/7缓释载体植入局部脑组织的BMP2/7浓度明显高于血清及对侧组织P(均＜0.0001)，48h以内大脑组织的每分钟计数为血液中的6-15倍。2W时缓释微球植入侧脑组织药物浓度是血清浓度的70倍，说明缓释系统不但提高了靶区脑组织的药物浓度，同时降低非靶区组织药物浓度，避免药物的毒副作用。血清中的BMP2/7缓释载体植入体内BMP2/7药物分布情况如见表6。

实施例4缓释系统的生物相容性研究

(一)材料与方法：同实施例3。

(二)结果与分析

大鼠脑组织与缓释系统的生物相容性(见图14)：

所有动物均未发现明显行为改变和神经功能缺陷，未出现全身或局部毒性反应，均存活到预计处死时间点，体重均增加。系统置入大鼠皮层后4h和ld，HE染色发现置入区周围组织水肿伴有少量出血，伴有小胶质细胞和少枝胶质细胞。植入后2d脑组织表现为坏死、炎性反应、中性白细胞侵润。植入后3d HE染色：周围脑组织水肿，小胶质细胞浸润，类似脑梗塞表现。植入后7d HE染色：胶质细胞侵润。植入后15d HE染色：星形细胞增生。植入后21d HE染色：星形细胞、胶质细胞增生、神经元呈缺血表现。微球置入后临近及周围脑组织呈现胶质细胞反应，包括多量肥大星形细胞，21d后胶质细胞反应开始减轻。

表1 9L细胞接种后7-56天，MRI检测各组肿瘤体积变化(单位：mm³)

¹与对照组比较P＜0.01；²与低剂量组比较；³与中剂量组比

表2三种药物的血浆峰浓度(ug/ml)和IC₅₀(ug/ml)

Means and Medians for Survival Time

a.Estimation is limited to the largest survival time if it is censored.

表3各组大鼠的中位生存期

表4 9L细胞接种后7-56天，MRI检测各组肿瘤体积变化(单位：mm³)

¹与胶原海绵组比较P＜0.01；²与BMP2/7+VCR组比较；

³与BMP2/7+CDDP组比较；BMP2/7+VM-26组⁴

表5大鼠颅内植入BMP2/7缓释载体后放射计数(x±s，n＝5)min-1

表6大鼠颅内植入缓释载体后BMP2/7浓度，单位nmol/mL

Claims (10)

1.一种BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：BMP2/7的载体采用肝素化胶原蛋白；所述的肝素化胶原蛋白的制作步骤：

步骤1：胶原蛋白的交联，取冻干胶原片称重，记录胶原片的质量，配置0.05M的2-甲基吗啡磺酸(MES)100ml(PH5.0)；室温下，将胶原片浸泡于上述溶质与酒精的混合物中(酒精体积为40％)，再向溶液中加入N，N-环己基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，按质量比为每克胶原蛋白1.731克EDC和0.415克NHS，浸泡4小时；

步骤2：胶原蛋白的肝素化，交联的胶原蛋白PH5.0的MES缓冲液中浸泡30分钟以上，按1∶0.6配制EDC/NHS溶液，将肝素溶于0.05M的MES缓冲液(PH5.0)中，肝素浓度为2％(w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液；10min后，按每克胶原蛋白188.3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小时后，分别用0.1M的Na2HPO4，4M NaCl与无菌蒸馏水漂洗。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：BMP2/7采用异源二聚体类似物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：采用柔性连接技术表达BMP2/7异源二聚体类似物；柔性连接技术参考本发明人的专利“一种BMP2/7异源二聚体结构类似物及其表达方法与应用”，专利200610034620.2。

5.根据权利要求2和权利要求4的应用，其特征在于：BMP2/7异源二聚体与肝素化胶原蛋白结合制成BMP2/7缓释系统，结合步骤如下：

将直径10mm的肝素化胶原膜浸泡于5ml PBS溶液中过夜，晾干后滴入0.25ml的BMP2/7PBS溶液，室温静置90min后，PBS漂洗3次。

6.根据权利要求5的应用，其特征在于：通过构建大鼠颅内荷瘤模型，进行BMP2/7缓释载体与化疗药物的协同作用、BMP2/7缓释载体的分布动力学特征、BMP2/7缓释载体的生物相容性研究。

7.根据权利要求6的应用，其特征在于：在瘤体内注射BMP2/7缓释载体，能够明显抑制肿瘤的增殖，起到明显的治疗效果；BMP2/7缓释载体能够协同化疗药物抑制肿瘤的生长；缓释系统不但提高了靶区脑组织的药物浓度，同时降低了非靶区组织的浓度，避免药物的毒副作用；所有大鼠均未发生明显行为改变和神经功能缺陷，未出现全身或者局部毒性反应，表明BMP2/7缓释载体的生物相容性良好。

8.根据权利要求5的应用，其特征在于：通过构建裸鼠颅内移植瘤模型，BMP2/7缓释系统单独作用能部分抑制肿瘤组织的形成，肿瘤组织对化疗药物不够敏感，而两者却又明显的协同作用，充分证明BMP2/7治疗脑胶质瘤的潜在价值。

9.根据权利要求5的应用，其特征在于：通过构建裸鼠皮下移植U251胶质瘤模型，BMP2/7能够协同化疗药物显著抑制裸鼠皮下瘤的生长。

10.根据权利要求7、权利要求8、权利要求9的应用，其特征在于：采用复合BMP2/7的缓释载体，在脑胶质瘤的局部可以形成高浓度的给药环境并能缓慢释放BMP2/7，抑制脑胶质瘤的增殖，促进其分化，如果配合传统的治疗手段如放疗或化疗，能够在不同的水平不同的途径发挥作用，增加了消除脑胶质瘤细胞的可能性。

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