CN101139361A - 一种靶向抗骨质疏松的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明通过化学合成一种新的化合物，结合了依替二膦酸盐的靶向性、对破骨细胞的强抑制作用，以及锶对成骨细胞分化的促进作用，改善了单独使用依替二膦酸盐后所致的成骨活性的不足和单独使用锶起效慢、用药剂量大的问题，为临床治疗骨质疏松症提供了一种疗效明确，性能优良的新药。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向抗骨质疏松的药物，属于化学药物领域。
背景技术
由于骨组织硬度大、渗透性差和特殊的生理生化过程，一般的给药途径很难使药物转运至有效部位；不仅降低了药物的治疗指数，而且也会对病人的非骨组织和器官造成不必要的毒副作用。因此，骨靶向药物具有非常重要的意义。骨基质中主要成分是羟基磷灰石(HA)，凡能与HA特异性结合的分子，即可作为骨靶向药物的载体，从而使药物能选择性地作用于骨靶组织。二膦酸是一类对骨有明显亲和性的化合物，二膦酸盐分子结构的一般式为：
二膦酸盐分子的结构特征决定了它的抑制骨重吸收能力。二膦酸盐分子的第一个重要特征是具有P-C-P键，二膦酸盐与焦磷酸盐一样通过磷酸根上的氧原子与钙离子螯合，形成二配位体。对磷酸根进行修饰如将1个或2个磷酸根甲基化，将减少二膦酸盐对钙的亲合力。二膦酸盐分子中的第二个重要特征是P-C-P键C上的2个取代基R1和R2。R1一般为羟基，二膦酸盐与钙螯合，形成三配位体，增加了对钙离子的亲合力，R1为氯原子或氢原子就会减弱对矿物的亲合力；R1若为烃基，对钙几乎无作用。R2侧链的结构对它的抗吸收性质起着决定性的作用，含伯胺基的二膦酸盐(如pamidronate和alendronate)比不含伯胺基的二膦酸盐(如etidronate和clodronate)的抗骨重吸收的能力强100倍以上，将胺基甲基化或引入含氮杂环，它们的抗骨重吸收能力，还将进一步提高，含仲胺或叔胺的二膦酸盐(如埃本膦酸钠，risedronate和zoledronate)是目前开发出的最强的二膦酸盐。R2为烷基或卤素其抗骨重吸收能力将减弱。正是由于这种明确的骨靶向性，二膦酸不仅单独用于治疗骨病，还可与各种药物分子连接而成为骨靶向的药物。以二膦酸为载体的骨靶向药物，通过二膦酸分子中的一个膦酸基的羟基可以把诸如头孢菌素、庆大霉素、环丙沙星、5-氟尿嘧啶、阿霉素和顺铂等抗菌素和细胞毒类抗癌药与它相连，这样便获得了治疗骨肿瘤和骨组织感染等大量骨病的靶向药物。
对于骨质疏松的治疗方法较多，大致可为以下二类：一、减少骨吸收药物，二膦酸盐虽然对破骨细胞的的强大抑制作用，但其生物利用度不到1％；且影响了骨组织的正常骨改建。二、促进骨形成药物，2004年获准在欧洲上市的Strontium ranelate(雷诺锶盐)，临床前研究以及正在进行的临床研究都证明，雷诺锶盐有望成为具有促成骨作用的、同时具有拆耦联作用的骨质疏松症治疗药物。但该药存在用药剂量偏大、显效较慢、胃肠道副作用等不足。
总之，二膦酸对破骨细胞的的强大抑制作用，不但可以直接用作治疗骨质疏松的药物，而且二膦酸还可以作为骨靶向载体转运其他药物治疗骨质疏松症，但其生物利用度低。锶虽然对骨细胞的直接作用包括对成骨细胞的促进作用和对破骨细胞的抑制作用两个方面，主要体现在对成骨细胞分化的促进作用。但高剂量地摄人锶盐会产生非安全影响，起效慢、用药剂量大。
目前，迫切需要一种骨靶向性好，同时又具有促进骨形成和抑制骨吸收双重功能的治疗骨质疏松的药物
发明内容
本发明所要解决的技术方案是提供一种靶向抗骨质疏松的新化合物，同时具有促进骨形成和抑制骨吸收双重功能，其结构式为：
其中，R1为C1-C4的低分子烃基，如甲基、乙基等，或伯胺基、仲胺基、叔胺基。其制备方法是由锶的盐与下式化合物的钠盐化学反应而成，
其中，R1为C1-C4的低分子烃基，如甲基、乙基等，或伯胺基、仲胺基、叔胺基。
当R1为甲基时为依替二膦酸锶，其制备方法如下：
依替二膦酸二钠溶于水，加入二氯化锶，搅拌后生成沉淀，过滤、干燥即得。其反应方程式如下：
本发明还提供了一种靶向抗骨质疏松的药物，它是由权利要求1所述化合物为有效成分，加上药学上可接受的辅料制备而成。
本发明通过化学合成一种新的化合物，为提供了一种新的靶向抗骨质疏松的药物：依替二膦酸锶。试验表明该化合物结合了依替二膦酸盐的靶向性、对破骨细胞的强抑制作用，以及锶对成骨细胞分化的促进作用，是一种具有高度骨靶向性的既能抑制骨吸收又能促进骨形成的治疗骨质疏松症的新药。该化合物改善了单独使用依替二膦酸盐后所致的成骨活性的不足和单独使用锶起效慢、用药剂量大的问题，为临床治疗骨质疏松症提供了一种疗效明确，性能优良的新药。且该化合物制备方法简单，收率高，不需要特殊设备。
本领域技术人员根据公知常识可以预见当甲基替换为伯胺基、仲胺基或叔胺基它们的抗骨重吸收能力，还将进一步提高。
附图说明书
图1是依替二膦酸锶红外波谱。
图2是依替二膦酸锶对ROS17/2.8成骨样细胞的影响的形态学观察结果，其中，2-a是Normal对照，2-b是酒精对照；2-c、2-d、2-e分别是10-5M、10-4M、10-3M浓度的依替二膦酸锶共培养72h后的ROS17/2.8细胞10×40。
图3是大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果，其中，3-a正常对照；3-b依替膦酸二钠80mg/Kg.da治疗12周，3-c是二氯化锶60mg/Kg.da治疗12周；3-d依替二膦酸锶100mg/Kg.day治疗12周的大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果。
具体实施方式
依替二膦酸锶的合成方法为：依替二膦酸二钠溶于水，加入二氯化锶，充分搅拌后生成大量白色沉淀，过滤、干燥即得。
以下通过具体实施例制备依替二膦酸锶，并通过红外表征其结构，并通过羟基磷灰石(HA)吸附实验，证明其具有明确的骨靶向性。
实施例1依替二膦酸锶的制备
依替二膦酸二钠10g溶于水，加入0.04mol的二氯化锶，充分搅拌后生成大量白色沉淀。将沉淀过滤、干燥后得到纯白色、无味依替二膦酸锶粉未，收率约94％。经反复重结晶后获得纯度为96.7％的依替二膦酸锶；经测定其室温下溶解度为800mg/L；其饱和溶液pH值(室温)为5.6。加热至700℃未熔化，继续加热气化分解。
实施例2依替二膦酸锶的结构表征
根据红外波谱分析图(图1)，羟乙基二膦酸二钠盐和羟乙基二膦酸一锶盐红外光谱的吸收峰基本相同，但由于一锶盐易于形成交联的大分子，而使吸收光谱略有不同。3000～3500cm-1处出现的强而宽的吸收峰，没有明显的极大值，是羟基在分子内或分子间缔合的结果。由1639和1649cm-1是水的变形振动δH2O峰，可以断定合成的羟乙基二膦酸二钠盐和羟乙基二膦酸一锶盐为水合物；1134cm-1是基团PO3特征吸收峰；1053和1048cm-1是基团PO2的特征吸收峰；P-OH特征吸收峰出现在900cm-1和2361cm-1处；1350～1450cm-1处的弱吸收峰表示-CH3。
具体分析数据如表1：
表1
| 基团 | 振动类型 | 波数(cm-1) | |
| 羟乙基二膦酸二钠 | 羟乙基二膦酸一锶 | ||
| CO-HH2OP-OHPO3PO2-CH3 | VO-HδH2OVP-OHVPO3VPO2δCH3 | 3260～35301649.92361.0900.81155.31053.91446.41386.01363.3 | 3000～35001639.082360.76892.921162.581048.961450.441382.01362.1 |
实施例3羟基磷灰石(HA)吸附实验
(1)锶测定方法---火焰原子吸收法FAAS
使用仪器：Solaar M6原子吸收分光光度计
仪器条件：吸收波长：460.7；光谱通带：0.5nm；燃气流量：1.4L/min；火焰高度：9.0cm；灯电流：95％ 10mA。
(2)依替膦酸测定方法---高效液相色谱法HPLC
使用仪器：HP1100高效液相色谱仪，带紫外检测器。
仪器条件：流动相：18.6MΩ Millipore纯水；流速：1.0ml/min；检测波长λ＝230nm标准品和样品皆进样100μl。
依替膦酸盐羟基磷灰石(HA)吸附实验结果
精密称取羟基磷灰石(HA)10mg，15mg，加入50μg/ml三种(依替二膦酸二钠、氯化锶和依替二膦酸锶，C0＝50μg/m1)供试溶液10ml，超声处理5min后剧烈振摇10min后，4000rpm离心后取上清液进样分析。同时做空白对照。从标准曲线上查出上清液中三种物质的含量(C)，并按下式计算吸附百分率(％)：
3.1依替二膦酸二钠羟基磷灰石(HA)吸附实验
(1)依替二膦酸二钠HPLC标准曲线
梯度稀释得至5.0～50.0μg/ml的依替二膦酸二钠溶液，于高效液相色谱仪下测量并计算于230nm波长处吸收曲线下的面积，并绘制标准曲线。不同浓度依替二膦酸二钠吸收曲线下面积见表2。
表2
| C0(μg/ml) | 0.0 | 5.0 | 10.0 | 200 | 30.0 | 40.0 | 50.0 |
| Area(AU*S) | 0 | 4.2 | 8.6 | 15.1 | 22.3 | 32.0 | 39.6 |
(2)依替二膦酸二钠吸附实验结果：加入不同量羟基磷灰石后依替二膦酸二钠吸收曲线下面积及吸附率见表3。
表3
| 羟基磷灰石加入量(mg) | 10 | 15 | 空白对照1 | 空白对照2 |
| Area(Au*s)C(μg/ml)吸附百分率(％) | 26.543.413.2 | 23.137.824.4 | 00- | 00- |
3.2二氯化锶羟基磷灰石(HA)吸附实验
(1)二氯化锶FAAS标准曲线：不同浓度二氯化锶的FAAS吸收光度值见表4。
表4
| C0(μg/ml) | 0.0 | 5.0 | 10.0 | 20.0 | 30.0 | 40.0 | 50.0 |
| Abs. | -0.0028 | 0.0476 | 0.103 | 0.221 | 0.335 | 0.439 | 0.572 |
(2)氯化锶吸附实验结果：加入不同量羟基磷灰石后二氯化锶的FAAS吸收光度值及吸附率见表5。
表5
| 羟基磷灰石加入量(mg) | 10 | 15 | 空白对照1 | 空白对照2 |
| Abs.C(μg/ml)吸附百分率(％) | 0.56049.80.4 | 0.55549.41.2 | 0.001020- | 0.004850- |
3.3依替二膦酸锶羟基磷灰石(HA)吸附实验
(1)依替二膦酸锶HPLC标准曲线：不同浓度依替二膦酸锶吸收曲线下面积见表6。
表6
| C0(μg/ml) | 0.0 | 10.0 | 20.0 | 30.0 | 40.0 | 50.0 |
| Area(Au*s) | 0 | 2.5 | 5.0 | 7.4 | 10.8 | 13.4 |
(2)依替二膦酸锶吸附实验结果：加入不同量羟基磷灰石后依替二膦酸锶吸收曲线下面积及吸附率见表7。
表7
| 羟基磷灰石加入量(mg) | 10 | 15 | 空白对照1 | 空白对照2 |
| Area(Au*s)C(μg/ml)吸附百分率(％) | 11.7244.311.4 | 10.941.317.4 | 00- | 00- |
(3)依替二膦酸锶FAAS标准曲线：不同浓度依替二膦酸锶的FAAS吸收光度值见表8。
表8
| C0(μg/ml) | 0.0 | 5.0 | 10.0 | 20.0 | 30.0 | 40.0 | 50.0 |
| Abs. | 0.00020 | 0.0401 | 0.0755 | 0.153 | 0.201 | 0.261 | 0.338 |
(4)依替二膦酸锶吸附实验结果：加入不同量羟基磷灰石后依替二膦酸锶的FAAS吸收光度值及吸附率见表9。
表9
| 羟基磷灰石加入量(mg) | 10 | 15 | 空白对照1 | 空白对照2 |
| Abs.C(μg/ml)吸附百分率(％) | 0.29643.712.6 | 0.28942.714.6 | 0.001240- | 0.001490- |
不同药物对羟基磷灰石(HA)吸附对比结果见表10。
表10
| 吸附率(％) | ||||
| 依替二膦酸二钠HPLC | 氯化锶吸FAAS | 依替二膦酸锶HPLC | 依替二膦酸锶FAAS | |
| 羟基磷灰石加入量(mg) | ||||
| 10 | 13.2 | 0.4 | 11.4 | 12.6 |
| 15 | 24.4 | 1.2 | 17.4 | 14.6 |
以下通过①血清骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)检测；②股骨及第2腰椎骨密度检测；③股骨及第2腰椎生物力学测试；④股骨及第1腰椎组织学观察进一步说明本发明化合物依替膦酸锶对治疗骨质疏松具有明确的疗效。
一、动物实验分组
10月龄SD雌性大鼠204只，购入时体重300～410g。随机分为3组：假手术组(sham组)、卵巢切除对照组(OVX组)、卵巢切除干预治疗组(氯化锶治疗组，依替二膦酸钠治疗组，依替二膦酸锶治疗组)。实验期间动物死亡36只，168只动物实际分布情况如表10。
二、骨质疏松模型建立及验证
1.OVX骨质疏松模型建立
所有雌性大鼠购入后先适应性饲养1w；其后随机选择动物手术去势。卵巢去势手术按0.3ml/100g体重腹腔注射10％水合氯醛溶液，约10min后麻醉效果满意后，俯卧位固定。于腰背部作正中切口约2cm，并向两侧游离皮下组织，于竖脊肌两侧腰背筋膜的肌肉与筋膜交界处切开腹外斜肌腱膜进入，于腰方肌腹侧作约1cm切口后，可见到白色腹膜后脂肪显露于切口内；轻轻将其提出，在脂肪组织内可见到粉红色的桑甚状卵巢和输卵管，结扎输卵管后游离切除卵巢；缝合筋膜及皮肤。术后每只动物肌注青霉素4万u。假手术组只结扎输卵管游离卵巢，而不行卵巢切除。所有动物都在同等条件下饲养。
2.骨质疏松模型验证
随机选取手术去势12w后大鼠及sham组大鼠各6只；采用如下方法进行骨质疏松模型鉴定：①血清骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)检测；②股骨及第2腰椎骨密度检测；③股骨及第2腰椎生物力学测试；④股骨及第1腰椎组织学观察。
三、分组给药
1.假手术组、卵巢切除对照组不给与任何药物，正常饲养；分别于16w、18w、20w及24w处死。
2.氯化锶治疗组，于OVX后12w开始每天灌胃一次(随机分为3个小组，各组用药量见表11)；分别于第16w、18w、20w及24w处死。
3.依替膦酸二钠治疗组，于OVX后12w开始每天灌胃一次(随机分为3个小组，各组用药量见表11)；分别于第16w、18w、20w及24w处死。
4.依替膦酸锶治疗组，于OVX后12w开始每天灌胃一次(随机分为3个小组，各组用药量见表11)；分别于第16w、18w、20w及24w处死。
其中，80mg/Kg.day依替二膦酸二钠，60mg/Kg.day二氯化锶，100mg/Kg.day依替二膦酸锶的用量选择是基于依替二膦酸根离子或锶离子摩尔比相同。
表11
| Sham | OVX | 干预治疗组 | ||||||
| 氯化锶(mg/Kg.d) | 依替二膦酸二钠(mg/Kg.d) | 依替二膦酸锶(mg/Kg.d) | ||||||
| 饲养时间 | 60 | 80 | 50 | 100 | 150 | |||
| 12w | 8 | 9 | OVX建模12w后灌胃 | |||||
| 16w | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 7 | ||
| 18w | 7 | 6 | 6 | 7 | 8 | 6 | ||
| 20w | 6 | 6 | 5 | 6 | 6 | 6 | ||
| 24w | 6 | 8 | 5 | 4 | 6 | 6 | 4 | |
四、取材
取材大鼠腹腔注射过量10％水合氯醛溶液；麻醉满意。
1.新鲜血清采集，挖出其一侧眼球，采血约4ml于EDTA抗凝管内混匀；收集血清以3500rpm离心后取淡黄色上清液约1ml于离心管内于-20℃冰箱内冻存。
2.组织学标本采集，随机采集一侧全长完整股骨及腰1椎体置于4％多聚甲醛溶液内固定；为确保固定效果，所有股骨均从中部锯断。
3.骨密度及生物力学标本采集，随机采集一侧全长完整股骨及腰2椎体置于0.9％生理盐水内，-20℃冰箱内冻存。
试验例1血清酶学实验
去势后大鼠血清骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性膦酸酶5b(TRAP-5b)检测结果见表12，表13。
去势12周后，与假手术组相比大鼠血清骨钙素(BGP)升高了40％，抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)也升高了46.4％；两者均表现出明显统计学差异。
表12
| 组别 | 血清骨钙素(U/L) | 抗酒石酸酸性磷酸酶5b(ng/ml) |
| Sham组OVX组 | 103.58±28.91145.01±19.22(P＝0.014) | 1.12±0.531.64±0.44(P＝0.010) |
去势24周后，与假手术组相比大鼠血清骨钙素(BGP)升高24.7％，抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)升高了31.2％；其中骨钙素变化表现出的差异具有统计学意义。
表13
| 组别 | 血清骨钙素(U/L) | 抗酒石酸酸性磷酸酶5b(ng/ml) |
| Sham组OVX组 | 80.25±7.84100.05±13.71(P＝0.125) | 1.09±0.391.43±0.37 |
去势不同时期不同药物治疗后大鼠血清骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)检测结果见表14和表15。
表14大鼠血清骨钙素(BGP)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 122.49±20.65 | 128.25±20.65 | 109.06±12.25 | 116.96±12.20 | 114.28±11.86 | 140.42±35.17 |
| 18W | 6W | 117.13±53.43 | 118.47±31.30 | 103.38±124.98 | 107.74±15.61 | 105.50±18.69 | 130.69±15.38 |
| 20W | 8W | 105.99±17.54 | 104.94±16.68 | 105.85±17.55 | 115.87±26.20 | 80.05±13.01 | 138.11±16.29 |
| 24W | 12W | 100.05±13.71 | 89.86±8.78 | 101.10±12.81 | 122.16±19.98(P＝0.036) | 73.38±9.56(P＝0.091) | 143.16±15.23(P＝0.008) |
表15抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 1.58±0.31 | 1.56±0.25 | 1.10±0.16(P＝0.068) | 1.19±0.44 | 0.75±0.11(P＝0.016) | 1.99±0.98 |
| 18W | 6W | 1.49±0.42 | 0.98±0.53 | 0.95±0.27(P＝0.057) | 0.94±.08 | 0.87±0.22 | 1.39±0.37 |
| 20W | 8W | 1.52±0.43 | 0.73±0.16(P＝0.020) | 0.84±0.21(P＝0.036) | 0.98±0.36 | 0.80±0.18 | 1.44±0.33 |
| 24W | 12W | 1.43±0.37 | 0.66±0.17(P＝0.045) | 0.66±0.11(P＝0.046) | 0.67±0.20 | 0.70±0.09(P＝0.023) | 1.65±0.45 |
药物干预治疗4周后，100mg/Kg.day依替二膦酸锶及80mg/Kg.day依替二膦酸二钠组大鼠血清BGP较去势组略有下降，而60mg/Kg.day二氯化锶治疗组大鼠血清BGP略上升；在药物干预治疗的6～12周，与同期的去势组相比较，100mg/Kg.day依替二膦酸锶治疗组大鼠血清BGP基本与去势对照组相同；80mg/Kg.day依替二膦酸二钠治疗组大鼠血清BGP表现为持续下降，于12周末时为去势对照组的73.3％，但并未表现出统计学差异；60mg/Kg.day二氯化锶治疗组的大鼠血清BGP基本维持于相对较高的水平，于12周末时为去势对照组的143％，且其差异表现出极显著的统计学意义。
药物干预治疗4周后，依替二膦酸锶及依替二膦酸二钠组大鼠血清TRAP-5b较去势组下降，分别为同期去势组的69.6％和47.5％，并且依替二膦酸二钠治疗组的差异表现出统计学意义；然而二氯化锶治疗组大鼠血清TRAP-5b有所上升，为同期去势对照组的125.9％。在药物干预治疗的6～12周，与同期的去势组相比较，依替二膦酸锶治疗组大鼠血清TRAP-5b逐渐下降到基本与依替二膦酸二钠治疗组相同水平，两者均明显低于周期去势对照组，并且两新差异均表现出明显的统计学差异；二氯化锶治疗组的大鼠血清依替二膦酸二钠基本维持于相对较高的水平，于12周末时为去势对照组的115.4％，且其差异无统计学意义(见表15)。
表14和15结果显示，药物干预治疗4周后，依替二膦酸锶50mg/Kg.day治疗组、100mg/Kg.day治疗组和150mg/Kg.day组其大鼠血清BGP，与同期的去势组相比较未见明显变化。在药物干预治疗的6～12周，与同期的去势组相比较，50mg/Kg.day治疗组其血清BGP略有下降，于12周末时为去势对照组的89.8％，但并未表现出统计学差异；100mg/Kg.day治疗组的大鼠血清BGP保持于原水平，于用药8周～12周基本与去势对照组一致；150mg/Kg.day治疗组其血清BGP有缓慢上升的趋势，于12周末时为去势对照组的122.1％，且其差异表现出显著的统计学意义。
药物干预治疗4周后，依替二膦酸锶50mg/Kg.day治疗组大鼠血清TRAP-5b与去势对照组相比未见明显变化；100mg/Kg.day治疗组和150mg/Kg.day组其大鼠血清TRAP-5b，与同期的去势组相比明显下降，分别为去势对照组的69.6％和75.3％。在药物干预治疗的6～12周，与同期的去势组相比较，50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day治疗组其血清TRAP-5b均逐渐下降，于8周末时50mg/Kg.d与100mg/Kg.d治疗组血清TRAP-5b分别为去势对照组的48％和55.3％，且表现出明显统计学差异。于用药12周末，三个不同剂量治疗干预组的血清TRAP-5b浓度趋向一致，均明显低于去势对照组，为同期去势对照组的46.2％；而且50mg/Kg.day与100mg/Kg.day治疗组表现出明显统计学差异。
试验例2大鼠股骨及腰椎BMD测定
去势12w后大鼠椎体BMD和股骨BMD检测结果见表16和表17。
去势12周后，与假手术组相比大鼠股骨BMD降低了16.8％，低于假手术组3SD；股骨BMD也降低了6.9％；两者均未表现出明显统计学差异。
表16去势12周后大鼠骨密度检测结果：
| 组别 | 椎体BMD(g/cm2) | 股骨BMD(g/cm2) |
| Sham组OVX组 | 0.464±0.0260.386±0.057 | 0.349±0.0310.325±0.007 |
去势24周后大鼠椎体BMD和股骨BMD检测结果见表17。
去势24周后，与同期假手术组相比大鼠椎体BMD降低12.3％，股骨BMD降低了5.1％；两者均未表现出明显统计学差异。
表17去势24周后大鼠骨密度检测结果：
| 组别 | 椎体骨密度(g/cm2) | 股骨骨密度(g/cm2) |
| Sham组OVX组 | 0.416±0.0500.365±0.041 | 0.337±0.0240.320±0.014 |
去势不同时期不同药物，不同剂量治疗后大鼠椎体BMD和股骨BMD检测结果见表18和表19。
表18大鼠椎体骨密度(g/cm2)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 0.398±.032 | 0.4155±.0666 | 0.416±.051 | 0.402±.031 | 0.393±.040 | 0.392±.030 |
| 18W | 6W | 0.368±.038 | 0.408±.0378 | 0.417±.040 | 0.4225±.0314 | 0.400±.029 | 0.406±.022 |
| 20W | 8W | 0.377±.039 | 0.441±.039 | 0.436±.023 | 0.446±.036 | 0.424±.034 | 0.416±.022 |
| 24W | 12W | 0.365±.041 | 0.463±.0589 | 0.457±.035 | 0.461±.023(P＝0.048) | 0.451±.039(P＝0.088) | 0.408±.050(P＝0.054) |
表19大鼠股骨骨密度(g/cm2)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 0.327±.027 | 0.322±.014 | 0.328±.012 | 0.324±.018 | 0.319±.013 | 0.321±.015 |
| 18W | 6W | 0.316±.006 | 0.321±.015 | 0.333±.012 | 0.334±.014 | 0.324±.016 | 0.3177±.029 |
| 20W | 8W | 0.309±.004 | 0.334±.021 | 0.331±.025 | 0.327±.015 | 0.3275±.022 | 0.328±.027 |
| 24W | 12W | 0.320±.014 | 0.337±.021 | 0.336±.025 | 0.338±.014(P＝0.026) | 0.339±.024 | 0.333±.019 |
药物干预治疗后，80mg/Kg.day依替二膦酸二钠组大鼠椎体BMD逐渐上升，而去势对照组椎体BMD逐渐下降，其与去势对照组的差距逐渐加大；100mg/Kg.day依替二膦酸锶治疗组在治疗4周后的椎体BMD改变不明显，但8周～12周其值与去势对照组的差距逐渐拉大；60mg/Kg.day二氯化锶治疗组的大鼠椎体BMD基本维持于原有水平，并表现出略有增加。各药物治疗组椎体BMD的变化，未见统计学意义。
药物干预治疗后，100mg/Kg.day依替二膦酸锶、80mg/Kg.day依替二膦酸二钠及60mg/Kg.day二氯化锶治疗组大鼠股骨BMD与去势组的缓慢下降相比，无下降现象，表现为平稳之中略有上升。
药物干预治疗后，依替二膦酸锶50mg/Kg.day治疗组、100mg/Kg.day治疗组和150mg/Kg.day组其大鼠椎体BMD，与同期的去势组相比不但避免了进行性下降，反而出现不断升高；在治疗12同后三组BMD值，至少高出去势对照组25.2％，且在150mg/Kg.day治疗组其椎体BMD与为去势对照组相比，其差异显著性具有统计学意义。
药物干预治疗后，依替二膦酸锶50mg/Kg.day治疗组、100mg/Kg.day治疗组和150mg/Kg.day组其大鼠股骨BMD，与同期的去势组相比不但避免了进行性下降，反而有所升高；且在150mg/Kg.d治疗组其股骨BMD与为去势对照组相比，其差异显著性具有统计学意义。
不同干预方式下大鼠股骨三点弯曲试验检测结果(表20，21)：
表20股骨Max-Load(N)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 107.92±12.39 | 113.38±12.99 | 105.05±18.43 | 120.98±12.89 | 113.30±113.44 | 117.81±14.30 |
| 18W | 6W | 111.24±12.36 | 112.49±12.09 | 116.88±8.14 | 116.79±7.89 | 121.83±12.99 | 115.46±10.01 |
| 20W | 8W | 104.33±15.04 | 123.43±12.25 | 127.18±23.23(P＝0.020) | 124.87±11.64 | 113.49±10.27 | 110.67±18.83 |
| 24W | 12W | 108.91±3.66 | 112.645±8.95 | 133.18±15.91(P＝0.035) | 129.21±15.53(P＝0.042) | 119.27±5.40(P＝0.028) | 106.36±15.18 |
随着去势时间的延长，在16～24周内，并未观察到去势对照组大鼠股骨于三点弯曲试验下的最大负荷(Max Load)的明显变化；60mg/Kg.day二氯化锶干预组其MaxLoad变化亦不明显；80mg/Kg.day依替二膦酸二钠治疗12周后其股骨的Max Load与去势对照组相比升高9.5％，并且其差异表现出统计学意义；100mg/Kg.day依替二膦酸锶干预组8周、12周后，其股骨的Max Load分别升高21.9％和22.3％，且两者均表现出统计学差异。50mg/Kg.day其股骨Max Load变未观察到明显变化；100mg/Kg.day和150mg/Kg.day干预组干预8周后，其股骨Max Load升高，并表现出统计学意义。
表21股骨Flexure extension at Maximum Flexure Load(mm)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 0.68±.14 | 0.68±.08 | 0.62±.11 | 0.69±.12 | 0.64±.08 | 0.62±.05 |
| 18W | 6W | 0.66±.12 | 0.65±.11 | 0.60±.10 | 0.64±.12 | 0.74±.07 | 0.73±.10 |
| 20W | 8W | 0.69±.13 | 0.67±.15 | 0.62±.10 | 0.72±.09 | 0.72±.12 | 0.70±.08 |
| 24W | 12W | 0.75±.21 | 0.71±.08 | 0.77±.19 | 0.77±.10 | 0.70±.11 | 0.79±.26 |
随着去势时间的延长，在16～24周内，并未观察到60mg/Kg.day二氯化锶、80mg/Kg.day依替二膦酸二钠及100mg/Kg.day依替二膦酸锶干预组股骨于最大负荷下变形的明显变化。50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和50mg/Kg.day干预组干预后，其股骨于Max Load下变形与去势对照组相似，并未表现出明显差异。
不同干预方式下大鼠第二腰椎轴向压缩试验检测结果(表22，23)：
表22椎体Max-Load(N)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 242.97±45.33 | 315.45±40.68(P＝0.031) | 331.81±85.54 | 328.91±84.68(P＝0.060) | 302.79±68.02 | 304.74±51.83 |
| 18W | 6W | 234.59±62.12 | 277.23±69.229 | 290.47±52.61(P＝0.020) | 270.96±22.43 | 307.58±58.37 | 279.49±162.43 |
| 20W | 8W | 240.13±70.92 | 266.94±24.52 | 268.42±69.97 | 271.96±27.79 | 290.16±76.52 | 251.17±39.31 |
| 24W | 12W | 225.37±43.59 | 285.12±27.64 | 300.88±49.12 | 294.57±25.77(P＝0.018) | 281.80±78.37 | 229.33±24.56 |
随着去势时间的延长，在16～24周内，观察到去势对照组大鼠椎体于压缩试验下的最大负荷(Max Load)随着时间延长有所下降。所有干预组在治疗4周后其大鼠椎体的抗压缩强度(Max Load)均明显高于去势对照组；且随着治疗时间的延长，均表现为逐渐下降。其中，60mg/Kg.day二氯化锶干预组其Max Load亦表现为随着时间明显下降；80mg/Kg.day依替二膦酸二钠治疗后其大鼠椎体的Max Load下降较为缓慢；而100mg/Kg.day依替二膦酸锶干预组前8周其椎体(Max Load)表现为逐渐下降，而12周后，其股骨的Max Load明显升高，并表现出统计学差异。50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day干预组于治疗前其椎体的抗压缩强度明显高于去势对照组，并具有统计学意义；干预后，其椎体Max Load均表现为在治疗的前8周逐渐降低，而12周后明显升高；其中100mg/Kg.day和150mg/Kg.day治疗明显高于去势对照组，并表现出统计学意义。
表23椎体Comp-extension at Maximum Comp-Load(mm)
| 去势时间 | 用药时间 | OVX组 | 依替二膦酸锶组 | 依替二膦酸二钠组 | 氯化锶组 | ||
| 50(mg/Kg.d) | 100(mg/Kg.d) | 150(mg/Kg.d) | 80(mg/Kg.d) | 60(mg/Kg.d) | |||
| 16W | 4W | 1.59±.44 | 1.77±.30 | 3.64±.92 | 2.25±.78 | 2.55±1.40 | 1.98±.77 |
| 18W | 6W | 2.26±.52 | 3.39±1.20 | 3.16±1.39 | 2.41±.80 | 1.76±.67 | 2.265±1.30 |
| 20W | 8W | 2.20±.53 | 3.10±.74 | 3.54±.96(P＝0.10) | 2.72±1.11 | 2.967±.70 | 2.28±.77 |
| 24W | 12W | 2.47±.81 | 3.43±.45 | 3.72±.82(P＝0.007) | 3.26±.66(P＝0.036) | 3.03±.74 | 3.33±1.04 |
随着去势时间的延长，在16～24周内，并未观察到60mg/Kg.day二氯化锶、80mg/Kg.day依替二膦酸二钠椎体于最大负荷下变形的明显变化；100mg/Kg.day依替二膦酸锶干预组大鼠其椎体于最大负荷下的变形一直明显高于去势对照组，但并无统计学意义。50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day干预组于治疗前其椎体的于Max Load下的变形高于去势对照组，并具有统计学意义；干预后，其椎体变形均有所增加，于12周后100mg/Kg.day和150mg/Kg.day治疗明显高于去势对照组，并表现出统计学意义。
综上所述，二氯化锶、依替二膦酸二钠和依替二膦酸锶三种不同治疗措施干预下；观察到：①去势后随着时间的延长大鼠股骨于三点弯曲实验下其生物力学性质变化不明显；60mg/Kg.day二氯化锶治疗对股骨的力学强度和变形能力并无明显影响；80mg/Kg.day依替二膦酸二钠对股骨力学强度的影响于治疗12周后可观察到明显的效果；而100mg/Kg.day依替二膦酸锶治疗8周后即可明显增强股骨的抗弯曲强度。②去势大鼠腰椎对所有的三种干预措施的反应于治疗4周后即有明显表现，三种治疗措施均可起到防止去势所致的大鼠腰椎抗压缩强度迅速下降，减缓腰生物椎力学褪变；治疗12周后100mg/Kg.day依替二膦酸锶可以逆转大鼠腰椎抗压缩强度的降低，增强其抗压缩能力。
通过不同剂量依替二磷酸锶治疗，我们观察到：①随着去势时间的延长，在16～24周内，去势对照组大鼠股骨于有三点弯曲实验试验下的最大负荷(Max Load)无明显变化。50mg/Kg.day其股骨Max Load变未观察到明显变化；100mg/Kg.day和150mg/Kg.day干预组干预8周后，其股骨Max Load升高，但并表现出统计学意义；50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day干预组干预后，其股骨于Max Load下变形与去势对照组相似，并未表现出明显差异。以上结果说明：治疗12周内以上三种不同剂量的依替二磷酸对改善去势大鼠股骨于三点弯曲实验中的力学强度无明显效果。②在16～24周内，观察到去势对照组大鼠椎体于压缩实验试验下其最大负荷(MaxLoad)的逐渐降低。50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day干预组于治疗前其椎体的抗压缩强度明显高于去势对照组，并具有统计学意义；干预后，其椎体Max Load均表现为在治疗的前8周逐渐降低，而12周后明显升高；其中100mg/Kg.day和150mg/Kg.day治疗明显高于去势对照组，并表现出统计学意义。随着去势时间的延长，在16～24周内，去势对照组大鼠椎体于压缩实验试验下其最大负荷(Max Load)时的椎体变形逐渐增加。50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day治疗干预后，其椎体变形均有所增加，于12周后100mg/Kg.dayg和150mg/Kg.day治疗明显高于去势对照组，并表现出统计学意义。实验结果说明：100mg/Kg.day和150mg/Kg.day治疗剂量治疗12周后，依替二磷酸能够明显改善大鼠腰椎的抗压缩力学强度，增加其于压缩应力下的变形能力。
以上生物力学实验证实，依替二膦酸锶治疗可明显增强股骨的抗弯曲强度和大鼠腰椎抗压缩强度；且该作用明显优于简单的锶盐(如二氯化锶)和依替二膦酸二钠。我们有理由相信，在依替二膦酸锶的治疗下骨组织的的生物力学性质明显改善；依替二膦酸锶对绝经期后的骨质疏松症的治疗效果将明显优于简单的无机锶盐(二氯化锶)，也明显优于二膦酸盐(如依替二膦酸二钠)。
试验例3ROS17/2.8(大鼠骨肉瘤)成骨样细胞株细胞功能
ROS17/2.8成骨样细胞的碱性磷酸酶测定结果：
培养24h后，各不同药物干预组及正常组其ROS17/2.8成骨样细胞内碱性均为磷酸酶染色阳性，但各药物干预组的碱性磷酸酶活性强度(酶组化着色的程度)未见明显差异；同一干预方式，不同浓度(10-5M，10-4M，10-3M)各组间其碱性磷酸酶活性强度也未见明显差异。
培养48h后，各不同药物干预组及正常组其ROS17/2.8成骨样细胞内碱性均为磷酸酶染色阳性。依替膦酸二钠10-5M及10-4M浓度组其碱性磷酸酶活性强度与正常对照之间未见明显差异；但10-3M浓度组其碱性磷酸酶着色较正常对照明显差加深。二氯化锶干预各浓度组碱性磷酸酶着色均较正常对照明显差加深；且其10-3M浓度组其着色程度明显深于10-5M组。依替二膦酸锶干预各浓度组碱性磷酸酶着色均较正常对照明显差加深；其10-3M浓度组其着色程度也明显深于10-5M组。
培养72h后，各不同药物干预组及正常组其ROS17/2.8成骨样细胞内碱性均为磷酸酶染色阳性。依替膦酸二钠干预各浓度组碱性磷酸酶着色均较正常对照明显差加深；其10-3M浓度组其着色程度明显深于10-5组。二氯化锶干预各浓度组碱性磷酸酶着色均较正常对照明显差加深；且其10-3M浓度组其着色程度明显深于10-5M组。依替二膦酸锶干预各浓度组碱性磷酸酶着色均较正常对照明显差加深；其10-3M浓度组其着色程度也明显深于10-5M组。
同一时间点，同一浓度的不同药物干预时，除24h后各干预组与正常对照相比未见明显差异外；于48h和72h后，其着色均明显深于正常对照组，且二氯化锶组与依替二膦酸锶组其着色程度均深于同摩尔浓度的依替二膦酸二钠；但二氯化锶组与依替二膦酸锶组尽管其细胞数量存在明显不同，其成骨样细胞内碱性磷酸酶着色深度并未见明显差异。
依替二膦酸锶于同一时间点，不同浓度干预时，除24h后各干预组与正常对照相比未见明显差异外；于48h和72h后，其着色均明显深于正常对照组。且其细胞内碱性磷酸酶着色深度随着药物浓度的增加而明显加深。
ROS17/2.8成骨样细胞的I胶原测定结果：
培养24h后，各不同药物干预组及正常组其ROS17/2.8成骨样细胞I型胶原为染色阳性，但各药物干预组的I型胶原活性强度(酶组化着色的程度)未见明显差异；同一干预方式，不同浓度(10-5M，10-4M，10-3M)各组间其I型胶原活性强度也未见明显差异。
培养48h后，各不同药物干预组及正常组其ROS17/2.8成骨样细胞内I型胶原染色阳性。依替膦酸二钠10-5M及10-4M浓度组其I型胶原活性强度与正常对照之间未见明显差异；但10-3M浓度组其I型胶原着色较正常对照明显差加深。二氯化锶干预各浓度组I型胶原着色均较正常对照明显差加深；且其10-3M浓度组其着色程度明显深于10-5M组。依替二膦酸锶干预各浓度组I型胶原着色均较正常对照明显差加深；其10-3M浓度组其着色程度也明显深于10-5M组。
培养72h后，各不同药物干预组及正常组其ROS17/2.8成骨样细胞内I型胶原染色阳性。依替膦酸二钠干预各浓度组I型胶原着色均较正常对照差加深；其10-3M浓度组其着色程度明显深于10-5M组。二氯化锶干预各浓度组I型胶原着色均较正常对照明显差加深；且其10-3M浓度组其着色程度明显深于10-5M组。依替二膦酸锶干预各浓度组I型胶原着色均较正常对照明显差加深；其10-3M浓度组其着色程度也明显深于10-5M组。
同一时间点，同一浓度的不同药物干预时，除24h后各干预组与正常对照相比未见明显差异外；于48h和72h后，其着色均明显深于正常对照组，且二氯化锶组与依替二膦酸锶组其着色程度均深于同摩尔浓度的依替膦酸二钠；但二氯化锶组与依替二膦酸锶组尽管其细胞数量存在明显不同，其成骨样细胞内I型胶原着色深度并未见明显差异。
依替二膦酸锶于同一时间点，不同浓度干预时，除24h后各干预组与正常对照相比未见明显差异外；于48h和72h后，其着色均明显深于正常对照组。且其细胞内I型胶原着色深度随着药物浓度的增加而明显加深。
试验例4ROS17/2.8成骨样细胞的活力
不同浓度药物对ROS17/2.8成骨样细胞形态影响：
10-5M、10-4M、10-3M浓度的依替二膦酸锶、依替二膦酸二钠、二氯化锶和阴性对照组细胞呈贴壁生长，折光性强，为长梭形、鳞片形、短梭形。随培养时间延长，细胞数目增多，细胞的生长和形态未受影响。阳性对照组(酒精)中，细胞生长繁殖明显受到抑制，但细胞形态仍未见明显改变。
不同药物对ROS17/2.8成骨样细胞活力的影响：
台盼蓝排斥实验结果：
台盼蓝染色在培养的24、48、72小时，均见少数蓝染的死亡细胞。用血球计数板分别计数活细胞和死细胞(死细胞蓝染)，计算细胞成活率见表24。
表24不同时间成骨细胞成活率
| 时间 | 依替二膦酸二钠 | 二氯化锶 | 依替二膦酸锶 | 对照 | |||||||
| 24h48h72h | 10-5M96.5％95.1％92.8％ | 10-4M96.4％94.3％93.5％ | 10-3M97.3％94.7％91.6％ | 10-5M96.7％94.2％93.1％ | 10-4M96.6％95.4％92.3％ | 10-3M97.1％94.5％91.7％ | 10-5M96.3％94.6％92.5％ | 10-4M96.2％95.2％93.4％ | 10-3M95.8％94.8％91.7％ | 正常98.1％96.3％93.7％ | 阳性74.6％68.2％65.4％ |
MTT比色实验结果见表25：
表25ROS17/2.8成骨样细胞在不同药物中的MTT值变化
| 依替二膦酸锶 | 依替二膦酸二钠 | 二氯化锶 | 对照 | ||||||||
| 24h48h72h | 10-5M.058±.0039#.066±.008#.100±.009# | 10-4M.049±.014＊.068±.010＊.106±.007# | 10-3M.057±.015＊.087±.017#.104±.011# | 10-5M.037±.009＊.059±.005#.075±.004# | 10-4M.039±.005＊.056±.004＊.085±.009# | 10-3M.048±.021.079±.010#.093±.010# | 10-5M.020±.004.039±.001.057±.017 | 10-4M.016±.008.037±.004.052±.011 | 10-3M.024±.021.054±.010.051±.011 | 阴性.018±.005.020±.004#.025±.014＊ | 正常.013±.005.045±.006.048±.004 |
与正常对照比较，P＜0.05以*标注，若P＜0.01以#标注.
各组随培养时间的延长MTT值均增加。各浓度药物组与阴性对照组在同一时间无显著性差异(P＞0.05)，与阳性对照组有显著性差异(P＜0.01)。
实验各组的MTT值均值逐日增加；且其48h后与阴性对照组均有显著性差异。
10-5～10-3M浓度的二氯化锶在24h～72h培养期间其细胞的MTT值与正常对照组无明显差异。
10-5～10-3M浓度的依替二膦酸二钠在24h～72h培养期间其细胞的MTT值均明显高于正常对照组，且各组于各时间点均有显著性甚至极显著性差异；在不同浓度的依替二膦酸二钠进行比较时发现，在同一时间点高浓度的依替二膦酸二钠组MTT值高于低浓度组，且三个时间点均存在此现象，但同一时间点各浓度组间MTT值并不存在统计学差异。
10-5～10-3M浓度的依替二膦酸锶在24h～72h培养期间其细胞的MTT值均明显高于正常对照组，且各组于各时间点均有显著性甚至极显著性差异；在不同浓度的依替二膦酸锶进行比较时也发现，在同一时间点高浓度的依替二膦酸二钠组MTT值高于低浓度组，但同一时间点各浓度组间MTT值并不存在统计学差异。本实验发现，10-5～10-3M浓度的依替二膦酸锶在24h～72h培养期间其细胞的MTT值均高于依替二膦酸二钠组，但相同时间相同浓度各组间并不存在统计学差异；10-5～10-3M浓度的依替二膦酸锶在24h～72h培养期间其细胞的MTT值均明显高于二氯化锶各组，且相同时间相同浓度各组间存在显著或极显著统计学差异。
试验结果显示，二氯化锶对ROS17/2.8成骨样细胞的生长和增殖并不具有明显的促进作用。依替二膦酸二钠对ROS17/2.8成骨样细胞的生长和增殖具有明显的促进作用，该作用表现出统计学差异。依替二膦酸锶对ROS17/2.8成骨样细胞的生长和增殖具有明显的促进作用，该作用表现出统计学差异。
不同浓度依替二膦酸锶在不同时点对ROS17/2.8成骨样细胞的影响的形态学观察：
10-5～10-3M浓度的依替二膦酸锶在24h、48h和72h三个时点，对ROS17/2.8成骨样细胞的影响的形态学观察(见图2)。
试验例4组织学检测结果
去势12周后大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果
去势12周后大鼠椎体及股骨髁骨小梁变细；骨小梁排列较正常对照疏松，以在靠近椎管部分尤其明显。Mason染色均匀，散在少许红染，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质较少。可见骨小梁间连接处散在断裂点，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色染色下可见上述部位明显的破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处均未见明显的着色。
去势24周后大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果
去势24周后大鼠椎体及股骨髁骨小梁明显变细；骨小梁排列较正常对明显照疏松，以在靠近椎管侧部分甚至出现大片缺如。Mason染色均匀，散在少许红染，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质较少。可见骨小梁间连接处较多散在断裂点，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色染色下可见部分骨小梁断裂处，可见到的破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处均未见明显的着色。
不同药物治疗后大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果
①治疗4周后，
80mg/Kg.day依替二膦酸二钠：椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组细；骨小梁排列较正常对照疏松，以在靠近椎管部分明显。Mason染色均匀，散在部分点状红染区，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质不明显。可见骨小梁间连接处散在断裂点，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下偶尔可见上述部位部分破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处着色不明显。
60mg/Kg.day二氯化锶：椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组细；骨小梁排列较正常对照疏松，以在靠近椎管部分明显。Mason染色均匀，散在较多点片状红染区，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质较明显。可见骨小梁间连接处散在断裂点，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见上述部位有破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处部分着色。
100mg/Kg.day依替二膦酸锶：椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组细；骨小梁排列较正常对照疏松，以在靠近椎管部分明显。Mason染色均匀，散在较多点状红染区，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质较明显。可见骨小梁间连接处散在断裂点，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见上述部位部分破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处少许着色。
②治疗6周后：
80mg/Kg.day依替二膦酸二钠，60mg/Kg.day二氯化锶，100mg/Kg.day依替二膦酸锶：与第4周相比无明显改变。
③治疗8周后，
80mg/Kg.day依替二膦酸二钠：在椎体和股骨髁原骨小梁疏松部位和骨小梁连接处可见到少许软骨形成；Mason染色不均匀，散在较多点状红染区，皮质骨板和其内骨小梁中所含新形成骨质明显。于抗酒石酸酸性磷酸酶染色染色下偶尔可见上述部位部分破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处少许着色。
60mg/Kg.day二氯化锶：在椎体和股骨髁原骨小梁疏松部位和骨小梁连接处可见到较明显的软骨形成；Mason染色不均匀，散在较多片状红染区，皮质骨板和其内骨小梁中所含新形成骨质明显。于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见上述部位部分破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处较明显着色。
100mg/Kg.day依替二膦酸锶：在椎体和股骨髁原骨小梁疏松部位和骨小梁连接处可见到明显的软骨形成；Mason染色不均匀，散在较多片状红染区，皮质骨板和其内骨小梁中所含新形成骨质明显。于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见上述部位部分破骨细胞聚积，溶骨现象较前减少。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处明显着色。
④治疗12周后：
大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果见图3。
80mg/Kg.day依替二膦酸二钠：椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组无明显变细；骨小梁排列较正常对照无明显疏松；骨小梁断裂现象较前期更为明显。Mason染色均匀，散在点状红染区较8周时减少，皮质骨外板和其内骨小梁中仍含有部分新形成骨质。于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见少许破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处着色仍不然明显。
60mg/Kg.day二氯化锶：椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组明显变细；骨小梁排列较正常对照明显疏松，以靠近椎管部分的骨小梁疏松更为明显。Mason染色均匀，散在点片状红染区较8周时更多，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质仍较明显。可见骨小梁间连接处散在断裂点仍多见，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色染色下可见新骨附近部分破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处着色仍然明显。
100mg/Kg.day依替二膦酸锶：椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组无明显变细；骨小梁排列较正常对照无明显疏松，靠近椎管部分的骨小梁明显恢复。Mason染色均匀，散在点片状红染区较8周时减少，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质仍较明显。可见骨小梁间连接处散在断裂点少见，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色染色下可见新骨附近部分破骨细胞聚积及溶骨现象。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处着色仍然明显。
不同剂量依替膦酸锶治疗后大鼠股骨及第二腰椎组织学观察结果：
50mg/Kg.day、100mg/Kg.day和150mg/Kg.day依替二膦酸锶治疗后观察：
①治疗4周后，三个不同剂量治疗组其椎体及股骨髁骨小梁均较正常对照组细；骨小梁排列较正常对照疏松。Mason染色均匀，三组均存在散在点状红染区，皮质骨外板和其内骨小梁中均有新形成骨质；但上述改变与三种不同用药剂量呈正相关。均可见骨小梁间连接处散在断裂点，于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见上述部位部分破骨细胞聚积及溶骨现象；该现象无明显差异。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处三组均能够见到I型胶原着色；着色的深浅未见明显差异。
②治疗6周后以上改变与第4周相比无明显改变。
③治疗8周后，三个不同剂量组均可见到软骨形成；但以100mg/Kg.day和150mg/Kg.day剂量组更为明显。Mason染色不均匀，散在较多片状红染区，皮质骨板和其内骨小梁中所含新形成骨质明显；以100mg/Kg.day和150mg/Kg.day剂量组更为明显。于抗酒石酸酸性磷酸酶染色下可见小梁连接处部分破骨细胞聚积及溶骨现象；并未见到不同剂量组之间的明显差异。于免疫组织化学I型胶原染色下，于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处着色；以100mg/Kg.day和150mg/Kg.day剂量组尤其明显。
④治疗12周后，50mg/Kg.day剂量组其椎体及股骨髁骨小梁均较正常对照组细；骨小梁排列较正常对照疏松；而100mg/Kg.day和150mg/Kg.day剂量组更为明显椎体及股骨髁骨小梁仍较正常组无明显变细；骨小梁排列较正常对照无明显疏松，靠近椎管部分的骨小梁明显恢复。Mason染色下，散在点片状红染区较8周时减少，皮质骨外板和其内骨小梁中所含新形成骨质仍较明显。100mg/Kg.day和150mg/Kg.day剂量骨小梁间连接处散在断裂点少见；抗酒石酸酸性磷酸酶染色染色下三个不同剂量组均可见新骨附近部分破骨细胞聚积及溶骨现象。免疫组织化学I型胶原染色下，100mg/Kg.day和150mg/Kg.day剂量于骨内膜、骨小梁和骨小梁连接处着色仍然明显高于50mg/Kg.day剂量组。
总之，本发明通过化学合成一种新的化合物：依替二膦酸锶，一种具有高度骨靶向性的既能抑制骨吸收又能促进骨形成的治疗骨质疏松症的新药，为临床治疗骨质疏松症提供了一种疗效明确，性能优良的新药，大大改善单独使用依替二膦酸盐后所致的成骨活性的不足和单独使用锶起效慢、用药剂量大的问题。
Claims (6)
1.具有下式结构的化合物：
其中，R1为C1-C4的低分子烃基、伯胺基、仲胺基或叔胺基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：R1为甲基，所述化合物为依替二膦酸锶。
3.权利要求1所述化合物的制备方法，它是由锶的盐与下式化合物的钠盐化学反应而成
其中，R1为C1-C4的低分子烃基、伯胺基、仲胺基或叔胺基。
4.权利要求2所述化合物的制备方法：依替二膦酸二钠溶于水，加入二氯化锶，充分搅拌生成沉淀，过滤、干燥即得。
5.权利要求1所述化合物在制备靶向抗骨质疏松药物中的用途。
6.一种靶向抗骨质疏松的药物，它是由权利要求1所述化合物为有效成分，加上药学上可接受的辅料制备而成。
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