CN109224067A - 一种糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,包含对糖尿病模型啮齿动物给予一次以上胰岛素注射诱导其发生低血糖,直至其脑内的糖尿病性微小病灶不少于6个且无神经功能缺损的症状和体征的工序,首次给予胰岛素注射的时间是在所述糖尿病模型啮齿动物造模成功后,之后每次给予胰岛素注射与前一次给予胰岛素注射的间隔时间为14~16天。本发明的方法生产的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物可用于探究糖尿病性脑内微小病变的发病机制及治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,特别是涉及一种糖尿病性脑内微小病变动物模型的生产方法。
背景技术
脑内微小病变的提出源于扩大的血管周围间隙(Virchow-Robin Space,VRS),是指在头颅核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)的T2加权(T2WI)上见到的直径3mm以下的边缘整齐、境界清楚、不伴有周围信号改变的影像学表现。其病理改变包括脑梗塞灶、陈旧性出血病灶、血管周围间隙、脱髓鞘、神经胶质化、纤维化、细胞浸润等。一直以来,糖尿病作为脑卒中的危险因素及其特殊的卒中特点受到广泛关注。糖尿病伴发或并发脑卒中的发病率是正常人的2-3倍,且发病年龄较非糖尿病人群提前5年左右。其中以缺血性卒中多见,主要表现为多发的腔隙性脑梗塞。近年来,脑内微小病变作为脑梗塞的“预知因子”逐渐受到重视。在无症状的中老年人群及无脑梗塞病史的人群中,脑内<3mm的微小病变使其患脑梗塞及脑梗塞相关死亡的风险增加至少3倍。其中基底节上部和皮质下白质的微小病变与糖尿病相关,糖尿病被认为是脑卒中与脑内微小病变的共同危险因素。
因此建立一种糖尿病性脑内微小病变的动物模型,为相关的动物实验研究及今后的临床研究打下基础,是十分必要的。本领域目前已有2型糖尿病大鼠模型(赵宝珍,白秀平,荣青峰等,实验性2型糖尿病大鼠模型的研究[J],中国药物与临床,2005,5(9):40~45),但尚无脑内微小病变的动物模型。
发明内容
本发明提供了一种糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,包含对糖尿病模型啮齿动物给予一次以上胰岛素注射诱导其发生低血糖,直至其脑内的糖尿病性微小病灶不少于6个且无神经功能缺损的症状和体征的工序,首次给予胰岛素注射的时间是在所述糖尿病模型啮齿动物造模成功后,之后每次给予胰岛素注射与前一次给予胰岛素注射的间隔时间为14~16天。
在一优选例中,所述生产方法包含对糖尿病模型啮齿动物给予一次以上胰岛素诱导低血糖、终止低血糖、以及使用高脂高糖食物饲养的工序。
在另一优选例中,所述的糖尿病模型啮齿动物为大鼠。
在另一优选例中,所述的给予胰岛素注射的次数为12次。
在另一优选例中,所述的给予胰岛素注射的用法和用量为每次皮下注射胰岛素50U/kg~60U/kg。
在另一优选例中,所述的低血糖为血糖值2.0~2.64mmol/L。
在另一优选例中,所述的终止低血糖为血糖值大于3mmol/L。
在另一优选例中,所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物至少表现出下列一种病理变化:
(1)脑组织神经元细胞减少;
(2)脑组织神经胶质细胞增生肿胀。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述,本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1.糖尿病大鼠与正常大鼠每10g血红蛋白吸光度的组间比较:模型组为5.3585±0.1936,正常对照组为1.2687±0.1749,模型组显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t=-38.392,P=0.000)
图2.两例大鼠模型脑内微小病变头颅核磁表现:2例大鼠的糖尿病性脑内微小病变,均位于基底节部位,表现为T1WI等信号,T2WI低信号改变;
图3.各组大鼠HE染色剂免疫组化图片显示:A、B分别为正常对照组及模型组大鼠脑组织(200×),模型组存在神经元数目减少,神经胶质细胞增生现象;C、D分别为正常对照组及模型组大鼠免疫组化染色(200×),模型组HIF-1α阳性表达明显增多;
图4.各组大鼠脑组织免疫组化比较:免疫组化显示,与正常对照组相比,模型组大鼠脑组织HIF-1α阳性面积均大于50%(3+),有统计学意义(p<0.01);
图5.不同低糖诱导次数的大鼠脑细胞神经元细胞形态观察:与低糖诱导0次组相比,糖尿病大鼠低糖诱导6次组,大鼠脑细胞神经元细胞减少,细胞密度有所下降;糖尿病大鼠低糖诱导12次组时,可见少量凋亡细胞,大鼠脑细胞神经元细胞密度亦明显降低;糖尿病大鼠低糖诱导24次组时,大鼠脑细胞神经元细胞有大量凋亡,细胞密度降低最明显;
图6.不同低糖诱导间隔时间的大鼠脑细胞神经元细胞形态观察:与低糖诱导1组相比,低糖诱导2组可见细胞密度明显下降;低糖诱导3组细胞密度下降更明显;
图7.各组大鼠脑神经细胞凋亡率测定:由早期凋亡率结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组凋亡量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组凋亡都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组凋亡率所增加,但无明显统计学意义(P>0.05)。由晚期凋亡率结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组凋亡量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组凋亡都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组凋亡率所增加(P<0.05),说明该中药对晚期凋亡抑制较早期差;
图8.各组HIF-1αmRNA扩增动力学曲线及GAPDH mRNA扩增动力学曲线:由RealtimePCR结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组HIF-1αmRNA表达量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组、HIF-1αmRNA表达量都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组HIF-1αmRNA表达量有所增加(P<0.05);
图9.各组HIF-1α蛋白表达:与正常对照组相比高糖损伤组HIF-1α蛋白表达量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组、HIF-1α蛋白表达量都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组HIF-1α蛋白表达量有所增加(P<0.05)。
具体实施方式
本发明人研究发现:采用多次低血糖法诱导糖尿病模型大鼠,至低糖诱导12次可产生适用的糖尿病性脑内微小病变大鼠模型,模型组6只大鼠造模后出现脑内微小病变灶个数均≥6个,全部造模成功,提示在高血糖的基础上,反复给予低血糖损伤,在脑内微小病变的产生过程中起到了至关重要的作用。
具体地说,本发明提供了一种糖尿病性脑内微小病变模型大鼠的简便易行高效的生产方法,过程中无死亡大鼠,是安全适用的造模方法。造模成功后的病理结果显示:大鼠脑组织神经元数目减少,神经胶质细胞增生并肿胀,部分存在微出血。免疫组化结果提示:HIF-1α阳性面积均大于50%。说明HIF-1α可能在糖尿病并发脑内微小病变的发病过程中起着举足轻重的作用。
本发明人根据赵宝珍等改良的2型糖尿病动物模型的造模方法生产2型糖尿病模型大鼠。选用Wistar大鼠,先喂以由普通饲料加蔗糖、淀粉、猪油混制而成高脂高糖饲料,总热量为44.3KJ/kg(蛋白质5%、碳水化合物60%,其中蔗糖为30%,脂肪32%其中猪油为30%)。饲养大鼠4周诱导胰岛素抵抗,然后给予小剂量STZ(30mg/kg)腹腔注射,继续高脂高糖饲料喂养诱导成模。本研究是在高脂高糖饲料诱导胰岛素抵抗的基础上,以小剂量STZ进一步加重胰岛β细胞破坏、分泌功能障碍,诱发2型糖尿病。在高脂高糖饲料喂养的基础上给予小剂量STZ注射,是形成该模型大鼠的条件。该模型大鼠体质量下降不明显,无明显多饮多食现象,与人类2-型糖尿病的发病过程和临床表现相似,具有明显的胰岛素抵抗特征,是较合理的2型糖尿病模型。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所使用的试剂和原料均可通过商业途径购买获得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1 动物模型的造模方法
材料与方法
1.1 实验动物与分组
健康雄性1月龄Wistar大鼠共12只,由上海中医药大学实验动物中心提供,体质量80-90g。随机分为正常对照组(n=6)和模型组(n=6)。
1.2 造模
1.2.1 2型糖尿病大鼠造模方法
参照赵宝珍等改良的2型糖尿病模型建立方法,模型组大鼠给予高脂高糖,具体实施方法如下:先喂以由普通饲料加蔗糖、淀粉、猪油混制而成高脂高糖饲料,总热量为44.3KJ/kg,(蛋白质5%、碳水化合物60%其中蔗糖为30%,脂肪32%其中猪油为30%)。饮食饲养后,禁食12小时(不禁水),应用电子称称取大鼠体质量,根据体质量临时配用所需1%链脲佐菌素(STZ)(STZ溶于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,冰浴中新鲜配制),并置于冰盒中避光保存,按30mg/kg腹腔注射。每周断尾取血测定一次非空腹血糖值,连续2次测量血糖值均>13.5mmol/L,定义为糖尿病模型成功。
1.2.2 糖尿病性脑内微小病变模型大鼠造模方法
第一次注射胰岛素诱导糖尿病模型大鼠发生低血糖的时间是在糖尿病大鼠模型造模成功后,以后每隔14~16天给予胰岛素注射再次诱导低血糖,优选间隔15天。
采用胰岛素皮下注射诱导大鼠低血糖的方法,皮下注射短效胰岛素(生物合成人胰岛素,诺和诺德公司)50U/kg~60U/kg,具体剂量以每只大鼠每次称量体重为准。以微型血糖仪断尾法测量血糖,并记录所有大鼠皮下注射胰岛素后每隔30min的血糖值,直至达到目标血糖(2.0~2.64mmol/L)。达到目标血糖后半小时再次监测血糖,并给予50%葡萄糖水5ml~10ml皮下注射来终止低血糖,半小时后再次监测血糖(以血糖大于3mmol/L为低血糖终止的标准)。持续给予高脂高糖饮食(蛋白质5%、碳水化合物60%其中蔗糖为30%,脂肪32%其中猪油为30%)饲养。
1.3 头颅MRI筛查
研究证实,微小病变灶≥6个比微小病变灶≤5个的研究对象的脑梗塞发病率高,差异有统计学意义。本发明人遂以“大鼠脑内微小病灶数不少于6个且无神经功能缺损的症状和体征”作为造模成功的标准(曲紅,西丸雄也,从脑内微小病变探讨中风“治未病”客观依据的研究[J].天津中医药.2008,25(4):292-295.)。
大鼠经多次低糖诱导后,对大鼠进行头颅MRI检查。以大鼠头颅MRI发现“脑内微小病变灶数不少于6个且无神经功能缺损的症状和体征”作为造模成功的标准。根据MRI结果及大鼠的神经功能评分结果排除造模不成功的大鼠(脑内出现直径大于或等于3mm的脑梗塞病灶的大鼠,或脑内的脑梗塞病灶直径小于3mm但神经功能评分大于或等于1分的大鼠,或脑内微小病灶(直径≤3mm)数少于6个的大鼠)。根据各组糖尿病大鼠脑内微小病灶的发生率进行对比研究。
本发明人参照文献Bederson(Bederson J B,Pitts L H,Tsuji M,et al.Ratmiddle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of aneurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.)的5分制方法对处于清醒状态的大鼠进行神经功能评分,其分值标准为:0分,无神经功能损伤症状、正常;1分,不能完全伸展右侧前爪、神经功能轻度损伤;2分,行走时向右侧转圈、神经功能中度损伤;3分,行走时向右侧倾倒、神经功能重度损伤;4分,不能自发行走,意识丧失。进而,神经功能评分为0~1分的大鼠被选入本实验,2~4分以及死亡大鼠不选入本实验,不足动物再随机补充。
MRI机器型号:3T imaging system(MAGNETOM Verio;Siemens Healthcare)and acom-mercially available mice coil(Chenguang Medical Technologies Co,Ltd)。采用4通道相控大鼠线圈,线圈型号:CG-MUC18-H300-AS。
1.4 脑组织准备及组织病理学评价
给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛,过量麻醉后处死,在无菌下取大鼠脑组织。切取2-3mm厚脑组织,投入多聚甲醛中固定48小时,石蜡包埋。冠状面连续切片(片厚4-7μm)。
1.4.1 HE染色
石蜡切片脱腊后梯度乙醇水化,染苏木素5min,伊红1-2min,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜观察脑组织形态。
1.4.2 免疫组化
取石蜡切片进行免疫组化检测,一抗为缺氧诱导因子-1α(Hypoxia InducibleFactor-1 α,HIF-1α)抗体(1:100,Abcam),4度孵育16小时,加入广谱二抗,室温放置30min,随后DAB显色及苏木素染核,65℃烘箱烘干,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.5 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行处理。大鼠血糖水平、每10g血红蛋白吸光度水平、脑内微小病变数目使用均数±标准差表示。数据符合正态分布且方差齐时采用t检验进行组间比较。HIF-1α阳性面积采用百分比表示,数据采用非参数检验,检验水准α=0.05。
2 实验结果:在糖尿病大鼠模型的基础上通过给予一次以上低血糖法诱导,至低血糖诱导12次时可产生适用的糖尿病性脑内微小病变大鼠模型,可用于探究糖尿病性脑内微小病变的发病机制及治疗靶点。
2.1 血糖
糖尿病大鼠模型造模成功后,继续饲养至低糖诱导12次时。至该时间截点模型组的血糖水平为20.75±3.42mmol/L,正常对照组为5.13±0.32mmol/L,模型组较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(t=-11.141,P=0.000)。
2.2 每10g血红蛋白吸光度
模型组为5.3585±0.1936,正常对照组为1.2687±0.1749,模型组显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t=-38.392,P=0.000)(图1)。
2.3 脑内微小病变灶数量
正常对照组及模型组大鼠均无脑梗塞病灶。脑内微小病变较集中的部位为基底节和大脑皮层,两组大鼠的脑内微小病变数量见表1。
表1 脑内微小病变的组间比较
注:与正常对照组相比,模型组脑内微小病变灶数量增多,*p<0.01
模型组脑内微小病变10±2.76个,最少6个,最多14个,6只大鼠脑内微小病变个数均≥6个。正常对照组大鼠脑内微小病变2.33±1.37个,最少0个,最多4个。模型组脑内微小病变数目多于正常组,组间比较有统计学意义(P<0.01)(图2)。
2.4 病理学改变
HE染色结果:与正常对照组大鼠相比,模型组大鼠脑组织神经元数目减少,神经胶质细胞增生并肿胀,部分有微出血(图3)。免疫组化显示,与正常对照组相比,模型组大鼠脑组织HIF-1α阳性面积均大于50%(3+),有统计学意义(p<0.01)(图4)。
实施例2 不同低血糖诱导次数、不同低血糖诱导间隔时间对糖尿病大鼠脑内微小病变个数的影响。
1 糖尿病大鼠不同低血糖诱导次数对糖尿病大鼠脑内微小病变个数的影响。
1.1 实验分组:
低糖诱导0次组:正常糖尿病大鼠。n=6。
低糖诱导6次组:糖尿病大鼠低糖诱导6次。n=6。
低糖诱导12次组:糖尿病大鼠低糖诱导12次。n=6。
低糖诱导24次组:糖尿病大鼠低糖诱导24次。n=6。
1.2 观察指标
1.2.1 形态学观察
在倒置相差显微镜下观察各组大鼠大脑细胞形态并拍照记录。
1.2.2 细胞存活率
造模后低糖诱导6次,低糖诱导12次,低糖诱导24次,用10%水合氯醛将大鼠麻醉,在无菌下取大鼠脑组织,然后用过量麻醉将大鼠处死。采用MTT法,上述各组织加MTT溶液,使之终浓度为5mg/ml,加DMSO150μl/孔,震荡10min,使结晶物充分溶解,用酶标仪检测OD570nm吸光值,以不加组织液孔作为空白对照孔调零。按照公式细胞存活率=试验组光吸收值/对照组光吸收值×100%进行计算并作图比较分析。
2 不同的低糖诱导间隔时间对糖尿病大鼠脑内微小病变个数的影响。
2.1 实验分组
选取造模成功的糖尿病大鼠,给予不同时间间隔的低糖诱导,第一次注射胰岛素诱导糖尿病模型大鼠发生低血糖的时间是在糖尿病大鼠模型造模成功后,以后分别间隔30天,15天,7天给予胰岛素注射再次诱导低血糖,具体分组如下:
低糖诱导1组:每隔30天给予低糖诱导。n=6。
低糖诱导2组:每隔15天给予低糖诱导。n=6。
低糖诱导3组:每隔7天给予低糖诱导。n=6。
2.2 观察指标:
2.2.1 形态学观察
在倒置相差显微镜下观察各组大鼠大脑细胞形态并拍照记录。
2.2.2 细胞存活率
采用MTT法,方法同前。
3.统计处理
所得数据均用SPSS13.0软件进行统计处理。计量资料采用“均数±标准差”表示,结果符合正态分布,组间均数差异用方差分析,P<0.05认为有统计学差异。
4.结果
4.1.1 不同低糖诱导次数对糖尿病大鼠脑内微小病变个数的影响。
4.1.1.1 形态学观察
与低糖诱导0次组相比,糖尿病大鼠低糖诱导6次组,大鼠脑细胞神经元细胞减少,细胞密度有所下降;糖尿病大鼠低糖诱导12次组时,可见少量凋亡细胞,大鼠脑细胞神经元细胞密度亦明显降低;糖尿病大鼠低糖诱导24次组时,大鼠脑细胞神经元细胞有大量凋亡,细胞密度降低最明显(但大鼠存活率降低,存活率为50%)(如图5)。
4.1.1.2 神经元细胞存活率
我们以低糖诱导0次组大鼠脑细胞神经元细胞作为对照,发现糖尿病大鼠低糖诱导6次组,细胞活力有所下降,但与低糖诱导0次组比较无统计学意义(P>0.05);糖尿病大鼠低糖诱导12次组,大鼠脑细胞神经元细胞活力下降与低糖诱导0次组比较亦无统计学意义(P>0.05);糖尿病大鼠低糖诱导24次组,大鼠脑细胞神经元细胞活力下降最明显,且与低糖诱导0次,低糖诱导16次,低糖诱导12次时显著差异(P<0.05)(如表2)。
表2 不同低糖诱导次数大鼠脑细胞神经元细胞存活率
注:vs低糖诱导0次组★P>0.05,vs低糖诱导0次组*P<0.05,vs低糖诱导24次组△P<0.05
4.1.2 不同低糖诱导间隔时间对糖尿病大鼠脑内微小病变个数的影响。
4.1.2.1 形态学观察
与低糖诱导1组相比,低糖诱导2组可见细胞密度明显下降;低糖诱导3组细胞密度下降更明显。(如图6)
4.2 细胞存活率
我们以正常低糖诱导1组作为对照,发现低糖诱导2组,大鼠脑细胞神经元细胞活力即明显下降(P<0.05);低糖诱导3组,大鼠脑细胞神经元细胞活力下降更明显,但与低糖诱导2组时相比无显著差异(P>0.05)(如表3)。
表3 不同低糖诱导间隔时间对糖尿病大鼠细胞存活率影响
注:vs 25mM ▲P>0.05;vs5.5m M △P<0.05
5.结果:本研究发现同时比较了糖尿病大鼠不同的低血糖诱导次数、不同的低糖诱导间隔时间对糖尿病大鼠脑内微小病变的影响。糖尿病大鼠不同的低血糖诱导次数、不同的低糖诱导间隔时间对大鼠脑内微小病变影响明显。本发明人研究得出造模最佳时间及低糖诱导次数,成功率高,避免重复劳动造成的负担。
实施例3 桂枝茯苓丸加地龙对糖尿病性脑内微小病变模型大鼠治疗效果的实验研究
1 材料与方法
1.1 实验动物造模
健康雄性1月龄Wistar大鼠共24只,由上海中医药大学实验动物中心提供,体质量80-90g。
参照赵宝珍改良的2型糖尿病模型建立方法先建立糖尿病大鼠模型,采用反复低血糖法诱导大鼠脑内微小病变的发生,低糖诱导12次后进行大鼠头颅磁共振检查,筛选脑内微小病变个数≥6个且无神经功能缺损症状和体征的大鼠,定义为造模成功。
1.2 实验分组与药物制备:
各组动物随机分为正常对照组(normal control,NC组)(n=6);高糖损伤组(diabetes mellitus,DM组)(n=6);阿司匹林对照组(aspirin control,AC组)(n=6);中药组(tradit ional Chinese medicine,TCM)(n=6)。每组n=20。
中药组:桂枝茯苓丸加地龙(地龙、桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、赤芍)各10克,加10倍水煎煮1h,过滤,药渣加5倍水煎煮1h,过滤,合并滤液,水浴浓缩至2g生药/ml药液。
剂量计算:成人用药55g/d,以成人体重60kg估算,剂量为0.929/kg,大鼠剂量按成人用量的10倍计算,即9.2g/kg,药物用蒸馏水配成920g/l,大鼠灌肠给药体积为10ml/kg(前期预试验的有效剂量)。
阿司匹林组:阿司匹林肠溶片,拜耳制药,剂量计算:成人用量每天0.3g,以成人体重60kg估算,成人用量约0.005g/kg,大鼠取10倍成人用量即0.05g/kg,药物用蒸馏水配成5g/l,大鼠灌胃给药体积为1ml/kg(前期预试验的有效剂量)。
1.3 实验试剂:
一抗HIF-1α,abcam公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,Beyotime公司;GAPDH抗体,CST公司。
1.4 实验方法:
NC组、DM组造模完成后分别以生理盐水灌肠;AC组,TCM组造模完成后分别以阿司匹林片及中药灌肠。四组大鼠均在灌肠开始后第6月处死取材。试验过程中根据下文时间点分别检测血生化及头颅MRI。
1.5 检测指标:
1.5.1 生化检测
每组大鼠按月抽取血液进行血生化检测。
1.5.2 头颅MRI检测
在造模完成时分别进行头颅MRI检测。
1.5.3 分子生物学检测
1.5.3.1 标本处理
分别于相应的观察时间点给大鼠腹腔注射10%水合氯醛,过量麻醉后后处死,在无菌条件下取大鼠脑组织,参照Paxinos-Watson图谱,切取脑组织,投入多聚甲醛中固定后用石蜡包埋。迅速放入液氮,继而转至-70℃冰箱冻存。
1.5.3.2 标本检测
各组均以RT-PCR荧光定量检测大鼠脑内组织HIF-1αmRNA的表达;Western blot及免疫组化方法检测HIF-1α蛋白表达;流式细胞术观察细胞凋亡情况;采用电镜或光镜观察大鼠脑组织形态学改变。
2 统计分析
所得数据均用SPSS20.0软件进行统计处理。计量资料采用“均数±标准差”表示,符合正态分布者,各组间均数差异用方差分析,双侧检验,P<0.05认为有统计学差异;非正态分布者,用秩和检验,P<0.05认为有统计学差异。
3 结果
3.1 生化检测:每组大鼠按月抽取血液进行血生化检测。结果提示高糖损伤组为5.3585±0.1936,正常对照组为1.2687±0.1749,高糖损伤组组显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t=-38.392,P=0.000)。与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组每10g血红蛋白吸光度表达量都有所减少,且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组每10g血红蛋白吸光度表达量有所增加(P<0.05)(见表4)。
表4 每10g血红蛋白吸光度的组间比较
注:vs正常对照组▲P<0.05,vs高糖损伤组△P<0.05,*vs阿司匹林组P<0.05
3.2 头颅MRI检测:在造模完成时分别进行头颅MRI检测。结果提示模型组脑内微小病变10±2.76个,最少6个,最多14个,6只大鼠脑内微小病变个数均≥6个。正常对照组大鼠脑内微小病变2.33±1.37个,最少0个,最多4个。模型组脑内微小病变数目多于正常组,组间比较有统计学意义(P<0.05)。阿司匹林组与中药组与高糖损伤组相比,脑内微小病变数目降低,组间比较有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比脑内微小病变数目升高,但组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。中药组与阿司匹林组相比,脑内微小病变个数有所降低,但组间比较无明显统计学意义(P>0.05)(见表5)。
表5 脑内微小病变的组间比较
注:vs正常对照组▲P<0.05,●P>0.05,vs高糖损伤组△P<0.05,*vs阿司匹林组P>0.05
3.3 分子生物学检测
3.3.1 大鼠脑神经细胞凋亡率测定用碘化丙锭(propidium iodide,PI)流式细胞仪检测雪旺细胞凋亡率(见图7)
3.3.1.1 由早期凋亡率结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组凋亡量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组凋亡都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组凋亡率所增加,但无明显统计学意义(P>0.05)(见表6)。
表6 大鼠脑神经细胞早期凋亡率测定
注:vs正常对照组▲P<0.05,vs高糖损伤组△P<0.05,*vs阿司匹林组P>0.05
3.3.1.2 由晚期凋亡率结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组凋亡量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组凋亡都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组凋亡率所增加(P<0.05),说明该中药对晚期凋亡抑制较早期差(见表7)。
表7 大鼠脑神经细胞晚期凋亡率测定
注:vs正常对照组▲P<0.05,vs高糖损伤组△P<0.05,*vs阿司匹林组P<0.05
3.3.2 HIF-1αmRNA表达
由Realtime PCR结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组HIF-1αmRNA表达量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组、HIF-1αmRNA表达量都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组HIF-1αmRNA表达量有所增加(P<0.05)(见表8,图8)。
表8 各组HIF-1αmRNA表达
注:vs正常对照组▲P<0.05,vs高糖损伤组△P<0.05,*vs阿司匹林组P<0.05
3.3.3 由Western blot结果可以看出,与正常对照组相比高糖损伤组HIF-1α蛋白表达量明显增加(P<0.05),与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组、HIF-1α蛋白表达量都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组HIF-1α蛋白表达量有所增加(P<0.05)(见表9,图9)。
表9:各组HIF-1α蛋白表达
注:vs正常对照组▲P<0.05,vs高糖损伤组△P<0.05,*vs阿司匹林组P<0.05
4 结果讨论:生化、头颅核磁、流式细胞仪(PI)测定检测发现,与高糖损伤组相比,阿司匹林组、中药组每10g血红蛋白吸光度、头颅核磁显示脑内微小病变数目、凋亡率都有所减少,且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05)。与阿司匹林组相比,中药组每10g血红蛋白吸光度表达量有所增加(P<0.05);脑内微小病变个数有所降低,但组间比较无明显统计学意义(P>0.05)。与阿司匹林组相比,中药组早期凋亡率所增加,但无明显统计学意义(P>0.05);中药组晚期凋亡率所增加且有统计学意义(P<0.05);与阿司匹林组相比,中药组HIF-1αmRNA及蛋白表达量有所增加(P<0.05)。Realtime PCR、Western blot测定HIF-1α的变化发现,与高糖损伤组相比,阿司匹林、中药组、HIF-1αmRNA及蛋白表达量都有所减少(P<0.05),且各组之间相比有明显统计学差异(P<0.05),与阿司匹林组相比,中药组HIF-1αmRNA及蛋白表达量有所增加(P<0.05)。
5 结论:本发明人将本发明的糖尿病性脑内微小病变模型大鼠应用于临床研究得出结论,桂枝茯苓丸加地龙对糖尿病性脑内微小病变的治疗具有一定的作用,可改善糖尿病大鼠脑内微小病变的数目,降低每10g血红蛋白吸光度,降低脑神经细胞凋亡率,降低HIF-1α的表达。但相对于阿司匹林的治疗作用有一定差别。
Claims (8)
1.一种糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,包含对糖尿病模型啮齿动物给予一次以上胰岛素注射诱导其发生低血糖,直至其脑内的糖尿病性微小病灶不少于6个且无神经功能缺损的症状和体征的工序,首次给予胰岛素注射的时间是在所述糖尿病模型啮齿动物造模成功后,之后每次给予胰岛素注射与前一次给予胰岛素注射的间隔时间为14~16天。
2.如权利要求1所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,包含对糖尿病模型啮齿动物给予一次以上胰岛素诱导低血糖、终止低血糖、以及使用高脂高糖食物饲养的工序。
3.如权利要求1或2所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,所述的糖尿病模型啮齿动物为大鼠。
4.如权利要求3所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,所述的给予胰岛素注射的次数为12次。
5.如权利要求3所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,所述的给予胰岛素注射的用法和用量为每次皮下注射胰岛素50U/kg~60U/kg。
6.如权利要求3所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,所述的低血糖为血糖值2.0~2.64mmol/L。
7.如权利要求3所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,所述的终止低血糖为血糖值大于3mmol/L。
8.如权利要求3所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物的生产方法,所述的糖尿病性脑内微小病变模型啮齿动物至少表现出下列一种病理变化:
(1)脑组织神经元细胞减少;
(2)脑组织神经胶质细胞增生肿胀。
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