使用2-甲基吡啶硼烷作为还原剂还原胺化和分析糖类
本发明涉及糖类(carbohydrate)的还原胺化。
蛋白偶联聚糖涉及到重要的生物过程,例如细胞间相互作用、受体活化和分子运输(Ohtsubo等人,Cell2006,126,855-67)。最近的关于聚糖在药物治疗中的作用的研究和聚糖作为特异性疾病中的生物标志物的研究引起了对快速和灵敏的高通量糖分析方法(glycoanalyticalmethod)的需求(Packer等人,Proteomics2008,8,8-20;和Wuhrer,M.Expert.Rev.Proteomics2007,4,135-36)。
这些方法包括HPLC(Royle等人,Anal.Biochem.2008,376,1-12;和Ruhaak等人,Anal.Chem.2008,80,6119-26)和与UV检测、荧光检测或质谱检测相结合的毛细管电泳(CE)(Kamoda等人,J.Chromatogr.A2006,1133,332-39)。可供选择地,质谱分析法可以用作独立的技术(Qian等人,Anal.Biochem.2007,364,8-18;和Jang-Lee等人,MethodsEnzymol.2006,415,59-86)。许多方法涉及用于引进紫外吸收或荧光标签的聚糖衍生化(Anumula,K.R.Anal.Biochem.2006,350,1-23;和Shilova等人,Bioorg.Khim.2003,29,339-55)。
在说明书中列出或讨论的先前公布的文件或任何背景不应必然地被认为是承认文件或背景是现有技术的部分或者是公知常识。
广泛使用的标记技术涉及通过还原胺化使寡糖与胺取代的发色团或荧光团偶联。在可逆反应中,开环形式的糖类与胺基反应并消除水,形成希夫碱。在第二不可逆反应中,希夫碱被还原形成仲胺。在该反应中最广泛使用的还原剂是氰基硼氢化钠(NaBH3CN)。该试剂的主要缺点是,水解时其容易形成有毒的挥发性化合物氰化氢。该试剂另一个缺点是,其被认为是过于强烈的还原剂,导致寡糖的至少一些直接还原而不是还原胺化。
对于糖类与4-氨基-N-[2-(二乙氨基)乙基]苯甲酰胺(DEAEAB)的还原胺化,引入了可选的还原剂三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)并且假定该方法适合于所有的胺标记(Dalpathado等人,Anal.Bioanal.Chem.2005,381,1130-37)。然而,该还原剂没有广泛地应用于聚糖分析。这被认为是由于其反应不足。
本发明通过提供2-甲基吡啶硼烷(2-picolineborane,2-PB)用于糖类的还原胺化的用途论述了以上和其他的缺点。出人意料地,发明人发现2-PB作为糖类标记的还原胺化试剂特别有效和有用。因此,本发明还提供了标记糖类的工艺,所述工艺包括:在2-PB的存在下,将糖类与标记剂接触,生成标记的糖类。
在不受理论束缚的情况下,认为2-PB用于糖类的还原胺化(例如,标记)的用途具有以下意想不到的优点:
(i)与NaBH3CN相比,糖类的还原胺化如果没有改进,则具有可比较的转化和/或选择性;和/或
(ii)与NaBH(OAc)3相比,糖类的还原胺化具有改进的转化和选择性;和/或
(iii)与NaBH3CN相比降低的毒性。
在优选的实施方案中,将糖类与标记剂在2-PB的存在下反应。任何适合的标记剂均可以用于本发明。通常,标记剂将包括可以与开环形式的糖类还原末端反应的胺基。实例包括:胺取代的发色团或荧光团和其他含有标记剂的胺,例如丙氨酸和[13C6]-丙氨酸。目前胺取代的发色团或荧光团是优选的标记剂。
适合的胺取代的发色团或荧光团的实例包括2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)、2-氨基吡啶(2-AP)、[D6]-AP和[D4]-2-AA。氨基取代的发色团或荧光团可以携带进一步的反应性官能团。此种多官能标签的实例包括2,5-二氨基吡啶和2-氨基-6-酰氨基生物素基吡啶(BAP)。目前,2-AA、2-AB和APTS是优选的胺取代的发色团或荧光团(例如APTS)。其他适合的胺取代的发色团或荧光团对于技术人员来说是明显的,例如来自Anumula,K.R.Anal.Biochem.2006,350,1-23,将其引入本文作为参考。
所谓术语“糖类”,我们包括一种或多种通常含有1至40个组分糖的单糖、寡糖和多糖,或这些糖的混合物。
适合的糖类可以得自人、动物或植物源,或者得自重组表达的蛋白质或生物技术表达的蛋白质。
用于制备糖类的适合的合成方法包括有机合成以及多糖的完全或部分的水解或者降解。实例包括已经通过葡聚糖的部分酸水解制备的寡糖(本文也称之为葡萄糖梯(glucoseladder))。用于合成寡糖的其他方法对于技术人员来说是已知的(参见,例如Seeberger,P.H.,CarbohydrateResearch2008,343,1889-1896,和Seeberger,P.H.,ChemSocRev.2008,37,19-28.将其引入本文作为参考)。
包括那些得自糖蛋白和糖脂的聚糖(例如N-聚糖)是可以用于本发明的糖类的进一步实例,例如由人血浆制备的N-聚糖。
图1描述了得自葡聚糖的低聚葡萄糖与2-AA标记的还原胺化的反应机理。还显示了没有标记的低聚葡萄糖的直接还原。
如图1所示,还原胺化分两步进行:第一(可逆的)反应,其中糖类与伯胺反应生成希夫碱;接着是第二(不可逆的)反应,其中还原希夫碱以生成仲胺。本发明可以采用相当于这两个反应的两个分离的步骤进行。然而,优选地,两个反应用一锅法(one-pot)(即用一个步骤,而不是两个分离的步骤)进行。这具有加速过程和减少操作时间的优点。
与现有的还原胺化剂例如NaBH3CN和/或NaBH(OAc)3相比,在糖类的还原胺化(例如标记)中2-PB的使用被认为导致对需要的糖类胺产物(通过希夫碱亚胺)比不想要的糖类的直接还原产物具有更大的选择性。
与现有的还原胺化剂例如NaBH3CN和/或NaBH(OAc)3相比,还认为2-PB导致了更多的糖类转化为需要的胺产物(通过希夫碱亚胺)。
由于与已知试剂例如NaBH(OAc)3和NaBH3CN相比,2-PB在糖类的还原胺化(例如标记)中的改进的活性和/或选择性,相对于这些试剂,可以使用减少量的2-PB。这进一步降低了相对于NaBH3CN,2-PB的超过和在固有还原毒性以上的糖类还原胺化(例如标记)的毒性(和对研究者的健康风险)和环境影响。
在一个实施方案中,在本发明的工艺中2-PB的浓度小于用于获得可比较的糖类转化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN(优选NaBH3CN)的浓度。例如,为了获得基本上相同的糖类转化,与NaBH(OAc)3或NaBH3CN(优选NaBH3CN)相比,可以使用小于90%,例如小于70%,优选小于50%,例如摩尔量小于30%的2-PB。
通常,在本发明的工艺中使用的2-PB的浓度为约0.017M至约1M,优选约0.033M至约0.33M,例如约0.067M至约0.25M。也可以使用这些范围值的组合,例如约0.017M至约0.33M,或约0.033M至约0.25M。
技术人员还将理解,使用的2-PB的浓度可以取决于诸如使用的标记剂等因素。例如,当标记剂是APTS时,2-PB的浓度通常为约0.017M至约0.333M,例如约0.033M至约0.067M(或这些范围的组合)。
与已知的试剂例如NaBH(OAc)3和NaBH3CN相比,2-PB在糖类的还原胺化(例如标记)中的进一步的优点是2-PB可以导致更加稳健的标记图谱(参见,例如实施例2)。在不受理论束缚的情况下,据认为与已知的试剂例如NaBH(OAc)3和NaBH3CN相比,2-PB表现出标记效力对于结构特征例如电荷的降低的依赖性。
本发明允许容易且安全地检测样品中的糖类。因此,本发明提供了用于检测样品中的糖类的方法,该方法包括:
(i)在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下,使样品中的糖类与标记剂接触,生成如本文所定义的标记的糖类;和
(ii)检测标记的糖类。
对于步骤(ii),可以使用任何适合的检测方法,例如与荧光检测、UV吸收检测和/或通过质谱分析法的检测结合的液相色谱法。优选的方法是亲水相互作用色谱法及荧光检测(HILIC-HPLC-FL)。
(与现有技术相比)本发明的缓和、有效、降低的毒性和/或降低的费用是指其可适用于高通量分析。因此,本发明可以对潜在地含有糖类的多个样品同时进行。例如,以上所述的检测糖类的方法可以同时应用于多个样品。
糖类与标记剂和2-PB的反应可以在任何适合的反应温度下进行任何适合的时间长度。通常的反应时间是约1分钟至约10小时,例如约5分钟至约5小时。通常的反应温度为约0℃至约100℃,例如约20℃至约80℃。优选地,反应通过一锅法进行。
所述反应可以在任何适合的溶剂中进行,所述溶剂包括水、DMSO、(冰)醋酸、乙腈、乙醇或者一种或多种前述溶剂的混合物。所述反应可以在含水或无水的条件下进行。
在含水条件下,存在于本发明工艺中的水的量通常为约1%v/v至约90%v/v,例如约10%v/v至约80%v/v,优选约50%v/v至约67%v/v。
出人意料地发现与通常用于还原胺化的其他还原剂(例如NaBH(OAc)3或NaBH3CN)相比,在本发明的工艺中在含水条件下2-PB是更加有效的还原剂。
在优选的实施方案中,使用酸帮助还原胺化。可以使用任何适合的酸,例如有机酸(例如乙酸)。在不受理论束缚的情况下,认为酸增加了还原胺化的效力。
在一个实施方案中,所使用的酸选自乙酸、柠檬酸、丙二酸、三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸以及它们的混合物。优选地,所述酸选自柠檬酸和乙酸。
现将通过以下非限制性实例来举例说明本发明。
实施例1:使用NaBH3CN、NaBH(OAc)3和2-PB用2-AA和2-AB标记来自人血浆的葡萄糖梯和N-聚糖
材料
二甲亚砜(DMSO)、氢氧化铵、甲酸、NonidetP-40(乙基苯基聚乙二醇)(NP-40)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、NaBH3CN、NaBH(OAc)3和2-甲基吡啶硼烷(2-PB)得自Sigma-Aldrich(Zwijndrecht,TheNetherlands)。十二烷基硫酸钠(SDS)购自UnitedStatesBiochemicals(Cleveland,OH)。肽N-糖苷酶F(PNGaseF)得自RocheDiagnostics(Mannheim,Germany)。冰醋酸购自Merck(Darmstadt,Germany)。乙腈购自Biosolve(Valkenswaard,TheNetherlands)。葡聚糖10.000得自Pharmacia/GEHealthcare(Uppsala,Sweden)。
寡糖的制备
葡萄糖梯通过10mg葡聚糖10.000在1ml1MTFA溶液中的部分酸水解(在80℃下1小时)生成。随后使用4ml的水稀释样品。来自人血浆的N-聚糖采用如Ruhaak等人,Anal.Chem.2008,80,6119-26中所描述的进行制备,将其引入本文作为参考。概括地说,在添加20μl2%SDS之后,通过在60℃下孵育10min使来自10μl血浆的蛋白质变性。然后,将10μl4%NP-40和0.5mUPNGaseF的10μl5×PBS溶液加入到样品中。将样品在37℃下孵育过夜,用于N-聚糖的释放。
寡糖的标记
将50μl寡糖溶液(没有预先纯化的葡萄糖梯或血浆N-聚糖)与25μl新鲜制备的标记溶液(2-AA或2-AB,在含有15%冰醋酸的DMSO中48mg/ml)混合。加入25μl等份的新鲜制备的还原剂溶液(1MNaBH3CN、2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAc)3的DMSO溶液),接着震摇5min并在65℃下孵育2小时。由于用寡糖溶液和标记溶液稀释还原剂溶液,在本发明的以上工艺中还原剂的终浓度为括号中所显示的四分之一(即约0.25M)。这些水标记实验包含约50%的水(v/v)。
为了允许与其他研究比较,同样在无水条件下进行2-AB标记,如Bigge等人,Anal.Biochem.1995,230,229-38中所描述的,将其引入本文作为参考。总的来说,使用真空离心将50μl的葡萄糖梯样品干燥。然后,将寡糖样品与25μl新鲜制备的96mg/ml2-AB的含有15%冰醋酸的DMSO的溶液混合。加入25μl等份的新鲜制备的还原剂溶液(2MNaBH3CN、2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAc)3的DMSO溶液),接着震摇5min并在65℃下孵育2小时。由于25μl还原剂溶液与25μl的2-AB溶液的组合,在本发明的以上工艺中每种还原剂的终浓度为1M。
使反应混合物冷却至室温。在通过亲水相互作用色谱法及荧光检测(HILIC-HPLC-FL)进行分析之前,将样品用乙腈以1:3(v/v)的比例稀释。
通过石墨化碳固相提取(PGC-SPE)纯化
使用多孔石墨化碳SPE从样品中去除游离的标记和还原剂。石墨化碳黑SPE柱体(carbographSPEcartridge)(Grace,Breda,TheNetherlands)以2ml80%的乙腈水溶液为条件,随后用3ml的水平衡。将样品与300μl的水混合,然后装载在柱体上。用4ml水冲洗后,使用1ml含有0.1%TFA的50%的乙腈洗脱寡糖。在通过亲水相互作用色谱法结合电喷射离子化和离子陷阱MS检测(HILIC-ESI-IT-MS(/MS))进行分析之前,将洗脱液用乙腈以1:1(v/v)的比例稀释。
HILIC-HPLC-FL
使用HILIC-HPLC及荧光检测分析标记的N-聚糖。UltimateLC系统(Dionex,Sunnyvale,CA)由Famos自动进样器、具有装载泵的Switchos模块和Ultimate泵模块组成。该系统与荧光检测器(FP-2020plus;Jasco,Easton,MD)连接,所述荧光检测器在激发波长360nm和发射波长420nm下操作。该系统由Chromeleon软件控制并配备有2.0mmx10mmTSKgel-Amide80捕获柱和2.0mmx250mmTSKgel-Amide80分析柱(TosohBiosciences,Stuttgart,Germany)。
将800μl、v形底的聚丙烯96孔板(Westburg,Leusden,TheNetherlands)中含有样品的孔用液体硅胶保鲜盖(siliconlid)(Labservices,Breda,TheNetherlands)密封并置于自动进样器中。使用全循环(fullloop)注射程序注射20μl等份。将标记的寡糖转移到捕获柱并使用乙腈:50mM甲酸铵(pH4.4;按体积计80:20)以150μl/min的流速冲洗3min。然后,与分析柱一致转换捕获柱,所述分析柱是使用70%乙腈(溶剂A)、30%甲酸铵(50mM,pH4.4(溶剂B))以150μl/min的流速平衡的。应用了线性梯度,将溶剂B由30%(0min)增加至60%(87min),然后在60%溶剂B下进行5min的等度洗脱并在30%溶剂B下重新平衡柱15min。
HILIC-ESI-IT-MS(/MS)
HILIC-nanoLC-ESI-离子陷阱(IT)-MS/MS使用配备有保护柱(5μmAmide-80170μmx10mm)的Ultimate3000nanoLC系统(Dionex)在Amide-80柱(3μm粒子;75μmx150mm;TosohBiosciences)上进行。使样品的乙腈含量为75%,并将10μl样品转移至保护柱中,所述保护柱使用乙腈:50mM甲酸铵(pH4.4,90:10,v/v)冲洗5分钟。然后,将保护柱与在400nl/min的流速下操作并用17.5%溶剂A(50mM甲酸铵,pH4.4)和82.5%溶剂B(乙腈:50mM甲酸铵,pH4.4,80:20,v/v)平衡的nano柱一致。在25%溶剂A的直接步骤后,应用线性梯度在30min内达到40%溶剂A,接着是以100%溶剂A冲洗4min和以17.5%溶剂A再平衡另外25min。将nanoLC系统与配备有在阳离子模式中操作的在线nano喷射源的EsquireHighCapacityTrap(HCTultra)ESI-IT-MS(BrukerDaltonics)直接连接。
对于电喷射(900-1200V),使用了来自NewObjective(Cambridge,MA,USA)的毛细管(360μmOD,具有10μm开口的20μmID)。在165℃下,使用6l/min的氮气流蒸发溶剂。记录了m/z400至m/z2000的离子。自动化碎片离子分析对于m/z1170至m/z1180的前体是可行的,导致降低的Glc7-物种(species)的串联质谱。
数据处理
对于HILIC-HPLC-FL数据,确定了来自葡萄糖标准品的5个峰的峰强度,mV。平均来自重复分析的结果。重复之间的差异小于10%。使用数据分析4.0版本软件(BrukerDaltonics)分析了HILIC-ESI-IT-MS数据。对于标记的和未标记的物种两者,均测定了来自Glc4至Glc8的质子、铵离子、钠离子和钾离子的峰强度。考虑了单电荷离子和双电荷离子两者。概括所有加合物的强度并计算标记的聚糖对未标记的聚糖的相对丰度。
结果
通过还原胺化,比较了还原剂三乙酰氧基硼氢化钠、2-甲基吡啶硼烷和氰基硼氢化钠的N-聚糖的标记。使用前述的三种还原剂来标记来自葡聚糖的低聚葡萄糖和来自人血浆的N-聚糖。使用胺2-AA和2-AB两者来标记低聚葡萄糖,而来自血浆的N-聚糖仅使用2-AA来标记。所有样品均使用HILIC-HPLC-FL分析。通过石墨化碳-SPE额外纯化低聚葡萄糖梯并使用HILIC-LC-ESI-IT-MS进行分析。
在使用不同的还原剂和标记进行标记之后的葡萄糖梯的HILIC-HPLC-FL色谱图描述于图2A、2B和2C中。由这些数据测定了Glc4至Glc8的低聚体的平均峰高度(参见下表1)。
表1:在不同的还原剂的帮助下标记的来自葡聚糖的低聚葡萄糖化合物的强度和它们的标记效率。强度用mV显示。n.d.=未测定的
对于2-甲基吡啶硼烷和NaBH3CN,所观察到的荧光标记的葡萄糖低聚体的强度相似(尽管除了15个标记的葡萄糖低聚体之一外,2-PB显著较高),而NaBH(OAc)3的使用导致了低很多的强度。这适用于在含水和无水条件下的2-AA标记以及2-AB标记。
对于氰基硼氢化钠和2-甲基吡啶硼烷两者,在含水条件下用2-AB标记低聚葡萄糖正如与在无水条件下用2-AB标记低聚葡萄糖一样有效。
为了确定标记的效力,通过石墨化碳固相提取来纯化样品并通过HILIC-ESI-IT-MS进行分析,所述HILIC-ESI-IT-MS分析使得标记的葡萄糖低聚体、未标记的物种以及标记反应的副产物能够平行记录。作为所获得的数据的实例,2-AA标记的Glc7以及剩余的Glc7的质谱描述于图3中。
NaBH3CN和2-甲基吡啶硼烷显示了几乎完全的标记,具有2-AA标记的Glc7的质子加合物(m/z1274.3)以及钠加合物(m/z1296.3)的高强度信号(图3B和3D),而仅检测到了少量的未标记的Glc7(图3A和3C中的m/z1170.3的铵加合物和m/z1175.3的钠加合物)。相反,对于NaBH(OAc)3(图3F),几乎没有观察到任何标记的Glc7,且大部分Glc7以未标记形式存在(图3E)。根据HILIC-HPLC-FL数据,汇总于表1中的标记的和未标记的Glc4、Glc5、Glc6和Glc7的LC-MS数据表明氰基硼氢化钠和2-甲基吡啶硼烷两者的有效标记,而NaBH(OAc)3似乎是非常无效的还原剂。
来自人血浆的N-聚糖使用NaBH3CN、2-甲基吡啶硼烷和NaBH(OAc)3进行标记。如图2D中所描述的HILIC-HPLC-FLU色谱图显示了NaBH3CN和2-甲基吡啶硼烷的相似的标记性质。而且,NaBH(OAc)3似乎效率低很多。
实施例2:使用NaBH3CN和2-PB用APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸)标记来自人血浆的N-聚糖
材料
二甲亚砜(DMSO)、NonidetP-40(乙基苯基聚乙二醇)(NP-40)、三乙胺(TEA)、APTS、NaBH3CN和2-甲基吡啶硼烷得自Sigma-Aldrich(Zwijndrecht,TheNetherlands)。十二烷基硫酸钠(SDS)购自UnitedStatesBiochemicals(Cleveland,OH)。肽N-糖苷酶F(PNGaseF)得自RocheDiagnostics(Mannheim,Germany)。冰醋酸购自Merck(Darmstadt,Germany)。生物胶(Biogel)P-10得自Bio-Rad(Veenendaal,TheNetherlands),而柠檬酸和乙醇来自Merck(Darmstadt,Germany)。乙腈购自Biosolve(Valkenswaard,TheNetherlands)。
寡糖的制备
来自人血浆的N-聚糖如Ruhaak等人,Anal.Chem.2008,80,6119-26所述进行制备,将其引入本文作为参考。在添加20μl2%SDS之后,通过在60℃下孵育10min使来自10μl血浆的蛋白质变性。然后,将10μl4%NP-40和0.5mUPNGaseF的10μl5×磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液加入到样品中。将样品在37℃下孵育过夜,用于N-聚糖的释放。
寡糖的标记
将2μlN-聚糖溶液与2μl新鲜制备的标记溶液(APTS;3.6M柠檬酸中20mM)在v形底96孔板中混合。加入2μl等份的新鲜制备的还原剂溶液(不同摩尔浓度的NaBH3CN或2-甲基吡啶硼烷的DMSO溶液),接着震摇5min并在37℃下孵育16小时。为了终止反应,加入50μl的乙腈:水(80:20v/v)并将样品混合5min。这些含水的标记实验包含约67%的水(v/v)。
HILIC-SPE
使用HILIC-SPE从样品中去除游离的标记和还原剂。将100μL量的100mg/mLBiogelP-10在水:EtOH:乙腈(70:20:10v/v)中的悬液应用于0.45μmGHP滤板(PallCorporation,AnnArbor,MI)的每个孔中。使用vacuummanifold(Millipore,Billerica,MA),通过运用真空去除溶剂。所有的孔使用5×200μL的水进行预清洗,接着使用3×200μL的ACN/水(80:20v/v)平衡。将样品上装填于孔中并在振荡器上震荡平板5分钟以增强聚糖结合。随后使用含有100mM的TEA的5×200μL的ACN/水(80:20v/v)进行清洗,接着使用3×200μL的ACN/水(80:20v/v)进行清洗。随后使用100μL(用于使生物胶颗粒膨胀)、200μL和200μL的水洗脱标记的N-聚糖并将洗脱液收集在96孔V-形底深孔板中。
使用ABI-3730DNA测序设备的毛细管凝胶电泳及激光诱导的荧光(CGE-LIF)
使用HILIC-HPLC及荧光检测来分析标记的N-聚糖。将60μL的DMSO分配于PCR板中(ThermoFischerScientificviaWestburg,Leusden,TheNetherlands)。将6μL的N-聚糖洗脱液加入到DMSO中并使用ABI-3730DNA测序仪分析样品。进样电压设置为7.5kV,而运行电压设置为10kV。所述系统配备有48个通道阵列及50cm的毛细管,并且所述毛细管充满了POP-7缓冲液(AppliedBiosystems)。电泳缓冲液购自AppliedBiosystems。
数据处理
将数据文件转换为.xml文件,然后装载于Matlabversion2007a(TheMathworks,Inc.,Natick,MA)中。在背景减除后,测定15个最丰富峰的峰高度。
结果
对于通过CE-LIF或CE-MS的聚糖分析,使用APTS标记使聚糖衍生化是有利的,因为APTS具有三个磺酸,所述磺酸产生三个负电荷。最近,开发了在DNA-测序仪(LaroyW,ContrerasR,CallewaertN(2006)GlycomemappingonDNAsequencingequipment,NatProtoc1:397-405,将其引入本文作为参考)帮助下的快速描述N-聚糖模式的方法。使用该应用,目前我们在约1小时的一个运转中可以扫描48个样品。
血浆N-聚糖使用DNA测序仪,用APTS-标记的形式分析。具有峰编号注释的特征电泳图和一些聚糖结构包括在图4中。
比较NaBH3CN和2-甲基吡啶硼烷在使用APTS还原胺化标记血浆N-聚糖方面它们的效力。比较了APTS标记的N-聚糖图谱以及使用5个不同浓度的NaBH3CN(2M、1M、0.2M、0.1M和0.05M)和四个不同浓度的2-甲基吡啶硼烷(1M、0.2M、0.1M和0.05M)所获得的收率,并且测定了在确定的位置13个峰迁移的强度。图5显示了具有变化浓度的氰基硼氢化钠的13个峰的相对强度。显著地,图谱(profile)显示了伴随增加还原剂的浓度的显著变化。相反,使用2-甲基吡啶硼烷进行的相似实验显示了具有不同浓度的还原剂的APTS-聚糖图谱只有少许的变化(图6)。
在上段和图5和图6中涉及的NaBH3CN和2-PB的浓度为2μl还原剂溶液的浓度。如上所述,当然将这些溶液添加至2μl的N-聚糖溶液和2μl的APTS标记中。因此,在本发明的示例的工艺中最终的2-PB和NaBH3CN的浓度为上段和图5和图6(还有图7和图8)中的三分之一。例如,最终的2-PB浓度为约0.017M、约0.033M、约0.067M或约0.333M。
为了阐明具有变化浓度的还原剂的单个峰的相对强度变化,生成了相同数据的其他图(图7)。对于氰基硼氢化钠和2-甲基吡啶硼烷两者,使用变化浓度的还原剂描述单个峰的相对强度。峰1和3显示了伴随氰基硼氢化钠浓度的增加而增加的相对丰度。峰6、7、8、9、10、11、12和13显示了伴随氰基硼氢化钠浓度的增加而降低的相对强度。相反,2-甲基吡啶硼烷获得的数据几乎没有显示相对峰强度对于还原剂浓度的任何依赖性。
与比较所获得的图谱的稳健性(相对标记效力)一样,还比较了伴随两种还原剂的浓度变化的峰2获得的绝对标记效力(图8)。观察到了浓度为0.1M和0.2M的还原剂的最大差异。在0.1M的还原剂浓度下,使用2-甲基吡啶硼烷所获得的峰2的收率是采用氰基硼氢化钠所获得的收率的2倍高。在0.2M还原剂浓度下,效力方面的差异甚至更高。
还通过峰2/峰12比率(非岩藻糖基化(non-fucosylated)双唾液酸化的(bisialylated)聚糖2(H5N4S2)与非岩藻糖基化非唾液酸化聚糖12(H5N4)的比率)的改变示出了伴随改变的氰基硼氰化钠浓度的某些聚糖的有偏(biased)标记。如图9所示出的,与改变的氰基硼氢化钠浓度相反,使用1、0.5、0.2、0.1和0.05M的2-甲基吡啶硼烷作为还原剂没有观察到选择性标记。
图9还显示了当使用五种不同的酸作为APTS标记N-聚糖的催化剂时的结果,所述五种不同的酸:乙酸(pKa=4.74)、柠檬酸(pKa=3.13、4.76、6.40)、丙二酸(pKa=2.83、5.13)、三氯乙酸(TCA,pKa=0.70)和三氟乙酸(TFA,pKa=0.30),所有酸的浓度均为1.2M。观察到柠檬酸导致了最高的收率。如通过唾液酸化聚糖和非唾液酸化聚糖之间的比率(峰2/峰12)所监测的柠檬酸的使用还导致了仅唾液酸的非常适度的丢失。然后,应用四个不同浓度的柠檬酸(参见图9)。观察到在更高的酸浓度下,酸水解更加显著。然而,标记的聚糖的收率(峰2的强度)也伴随酸浓度的增加而增加。
为了评估本发明工艺的重复性,将含有48等份的来自健康供体的单个血浆样品的96孔板在不同天制备的三个批次中,进行N-聚糖释放、APTS标记和HILIC纯化(如上所述)。
为了确定每个毛细管测量的重复性,通过CGF-LIF连续三天对批次1进行了分析。为此,在HILIC纯化后,将样品冷冻储存并且在对于第二和第三个CGE-LIF运行的两天解冻。对于每个连续的分析,从其中取新鲜的等份。特别地,对于三天的分析,每个样品使用相同的毛细管。
对数据进行对准(aligned)并测定了12个主峰的峰高度(图10A)。通过比较从对特定的板位置的连续三天的CGE-LIF分析所获得的信号,确定了相对标准偏差(RSD),从而排除了毛细管之间的可变性的影响。在所有48个样品中对特定孔位置的RSD求平均值,提供了每个毛细管的批次内重复性,并作图于图10b中。对于7个早期洗脱峰,RSD值为大约2%,而对于5个晚期洗脱峰RSD值为大约5%,导致了对于所分析的12个峰,平均RSD为3.2%。
为了评估所有批次内和批次间的重复性,在不同的天分析了两个批次含有48个重复的相同的单个血浆样品,涉及聚糖释放、APTS标记、HILIC和多复合CGE-LIF。对于批次内重复性,确定了从一个运行中获得的48个CGE-LIF电泳图谱的每个峰的RSD。对三个批次进行了该操作并且对结果取平均值。对于7个早期洗脱峰,RSD值为大约4%,而对于5个晚期洗脱峰RSD值为大约9%(图10B),导致了对于所分析的12个峰,平均RSD为6.2%。
对于批次间重复性,计算了三个不同批次所获得的3×48个电泳图谱的每个峰的RSD。此外,早期洗脱峰相对于晚期洗脱峰,显示了更低的批次间RSD。发现12个选择的峰的平均批次间RSD为15.8%。
这些结果证明了本发明的工艺可以在潜在地含有糖类的多个样品中同时进行(例如对于高通量筛选)。整个过程可以采用亲自动手2.5小时的时间进行。该方案适合于自动化,并且平行进行2个板使净劳动分配时间降低了至少每板30min。由于两个过夜孵育步骤是必要的,一个用于N-聚糖释放,而另一个用于N-聚糖的标记,因此总过程花费2.5天。
总之,实施例2显示了2-甲基吡啶硼烷在标记N-聚糖(例如用APTS标记)方面比氰基硼氢化钠更加有效。此外,使用2-甲基吡啶硼烷比使用氰基硼氢化钠所获得的APTS标记的N-聚糖图谱更加稳健。在次佳浓度0.1M和0.2M下,氰基硼氢化钠产生快速迁移ATPS标记的N-聚糖物种(峰1至3)似乎不如产生晚期洗脱物种(峰6至13)的效率高。在氰基硼氢化钠的情况下,标记的效力似乎受到N-聚糖的电荷的影响:在该还原剂的较低浓度下标记已知相当于唾液酸化的N-聚糖的快速迁移峰的效率相当低下,而相当于中性N-聚糖的慢速迁移物种(峰6-13),使用较低浓度的氰基硼氢化钠不太容易不完全标记。此外,对于2-甲基吡啶硼烷,没有观察到标记效力对于结构特征例如电荷的此种依赖性。
与NaBH3CN的常规使用相比,本发明中2-甲基吡啶硼烷的使用具有两个主要优点。第一,2-甲基吡啶硼烷的应用没有导致HCN气体的释放并且因此对研究者和环境伤害较小,尤其是当使用高通量形式时。第二,使用NaBH3CN标记N-聚糖(例如用APTS标记)导致了特定聚糖的有偏标记以及对于还原剂浓度的较强依赖性。对于2-甲基吡啶硼烷,没有观察到此种有偏标记。因此,本发明的工艺在糖基化模式中不太容易由于试剂浓度的差异而改变,因而更加稳健。
本发明由以下权利要求限定。