CN117101743A - 改进还原或标记碳水化合物的方法、装置和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于改进还原碳水化合物，诸如从糖缀合物释放的聚糖或通过还原胺化来标记碳水化合物过程的方法、装置和试剂盒。

Description

改进还原或标记碳水化合物的方法、装置和试剂盒

本申请是2018年3月22日提交的申请号为201880034596.3，发明名称为“改进还原或标记碳水化合物的方法、装置和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求以下申请的权益和优先权：2017年3月23日提交的美国临时申请No.62/475,815、2018年2月28日提交的美国临时申请No.62/636,815，以及2018年3月17日提交的美国临时申请No.62/644,460，上述文件的全部内容通过引用并入本文而用于所有目的。

技术领域

本发明涉及改进通过还原胺化来标记碳水化合物(诸如寡糖)的效率、便利性和速度的领域。

背景技术

在各种商业和法规背景下，必须确定样品中所存在的碳水化合物的性质和含量。这对于连接至糖蛋白，且尤其是用作治疗剂的糖蛋白的聚糖的情况尤其如此。由于连接至糖蛋白的聚糖会影响糖蛋白功能的关键特性，包括其药代动力学、稳定性、生物活性和免疫原性，因此确定糖蛋白上存在哪些聚糖非常重要。食品和药物管理局(“FDA”)要求对连接至生物制剂(诸如治疗性糖蛋白和疫苗)的碳水化合物进行表征以表明物质组成和制造的相符性，从而需要对产品进行广泛的表征。分析碳水化合物的特征(profile)对于治疗性和非治疗性重组蛋白质生产中的质量控制也是重要的，其中碳水化合物分布的变化预示系统中的压力、信号条件可能需要丢弃商业规模发酵罐中的内容物。因此，生物化学家、临床化学家、药物制造商和蛋白质生产商对确定生物样品(诸如治疗性糖蛋白)中聚糖的分布特征具有相当大的兴趣。

分析碳水化合物，特别是分析通过酶消化从糖蛋白释放的聚糖的一种常用方法是使用适当的染料或标记物利用还原胺化进行标记。例如，通过常规去糖基化酶PNGase F对从糖蛋白释放的N-聚糖进行的还原胺化通常通过使聚糖的游离还原端与标记物(诸如荧光染料或带电部分)的游离氨基缀合来实现。用于还原胺化的一种常见标记物是2-氨基苯甲酰胺或“2-AB”。在共有的美国专利No.5,747,347中公开了用2-AB进行还原胺化和标记。然后，根据所使用的标记物，可以通过多种分析方法，诸如高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE，包括毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳和胶束电动色谱)或微流体分离中的任何一种来分析经标记的聚糖。N-聚糖的标记和分析进一步记载于例如共有的美国专利No.8,124,792和8,445,292。国际公开No.WO2015/166399公开了衍生有羧基的磁珠在去糖基化和标记过程中的用途。

在本领域中仍然需要对标记碳水化合物(诸如聚糖)的速度和效率进行改进的方法，特别对通过还原胺化来标记碳水化合物(诸如聚糖)的速度和效率进行改进的方法。令人惊讶地，本发明满足了这些和其他需求。

发明内容

本发明提供了一种用于改进还原或通过还原胺化来标记碳水化合物的方法、装置和试剂盒。

在一些实施方案中，本发明提供了还原或通过还原胺化标记水性溶液中提供的碳水化合物的体外方法，以及可选地，用于分析经还原或标记的所述碳水化合物的体外方法，该方法包括按以下下列顺序的以下步骤：(a)使碳水化合物和水性溶液与有机溶剂混合，以形成有机溶剂与碳水化合物的水性溶液的混合物，其中所述混合物具有约80％或以上的有机溶剂与约20％或以下水性溶液的比例；(b)将碳水化合物的混合物转移至反应容器，所述反应容器具有(1)允许试剂引入的第一开口，(2)主体，所述主体按以下顺序具有：具有一定区域的横截面的第一区段，设置为遍及所述第一区段的横截面的区域的第一多孔固体载体，具有一定区域的横截面的第二区段，以及在需要排出时允许试剂排出的第二开口；(c)在允许碳水化合物保留在第一多孔固体载体上的条件下，使混合物通过第一多孔固体载体，从而使碳水化合物固定在第一多孔固体载体上；(d)用有机溶剂或有机溶剂浓度高于95％的溶液清洗固定在第一多孔固体载体上的碳水化合物，以除去有机溶剂和水性溶液的混合物以及混合物中没有被保留在第一多孔固体载体上的任何化合物；以及(e)还原或者通过还原胺化来标记被固定在第一多孔固体载体上的碳水化合物，从而还原或通过还原胺化来标记所述碳水化合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括：步骤e’，在还原或标记之后，使用有机溶剂或有机溶剂浓度高于95％有机溶剂的溶液来清洗第一多孔固体载体中任何过量的还原剂或标记物。在一些实施方案中，该方法进一步包括：步骤e”，在清洗之后，使用包含至多20％有机溶剂的水性溶液来洗脱第一多孔固体载体中经清洗的且经还原或标记的碳水化合物。在一些实施方案中，包含至多20％有机溶剂的水性溶液包括水或缓冲溶液。在一些实施方案中，水性溶液不包含任何有机溶剂。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由亲水性材料制成或在其表面上具有亲水性材料，其中，所述亲水性材料不带有羧基。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由亲水性材料制成。在一些实施方案中，亲水性材料是纤维素；玻璃；氧化铝；具有二醇、氨基丙基、酰胺、氰基丙基、乙二胺-N-丙基的官能化表面；二氧化硅；衍生化有二醇、氨基丙基或酰胺(氨基甲酰基)的二氧化硅；多孔亲水性材料，但不带有一个或多个羧基；或这些中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，玻璃是玻璃纤维。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由非亲水性材料制成或具有非亲水性材料的表面，并且步骤(a)中所述有机溶剂与所述碳水化合物的水性溶液的混合物具有超过95％的有机溶剂浓度。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由非亲水性材料制成。在一些实施方案中，非亲水性材料具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口。在一些实施方案中，孔隙或开口的宽度为5微米或更小。在一些实施方案中，孔隙或开口的宽度为1微米或更小。在一些实施方案中，非亲水性材料是聚乙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯或聚丙烯。在一些实施方案中，非亲水性材料具有10微米或更小的孔隙或开口。在一些实施方案中，非亲水性材料是聚乙烯。在一些实施方案中，(1)：步骤(b)的反应容器进一步包含设置在第一多孔固体载体和第二开口之间的亲水性第二多孔固体载体；以及，(2)：步骤(e)中的还原或标记是通过不良溶于有机溶剂的还原剂或标记物来进行的。在一些实施方案中，该方法进一步包括：用包含约80％至90％有机溶剂且其余为水性溶液的清洗液来清洗不良溶于有机溶剂的还原剂或标记物，从而释放第一多孔固体载体中的经还原或标记的碳水化合物，从且通过亲水性第二多孔固体载体来捕获经还原或标记的碳水化合物。在一些实施方案中，在所述清洗液中，所述有机溶剂的浓度为约80％。在一些实施方案中，该方法进一步包括：用包含不超过20％有机溶剂的水性溶液洗脱被亲水性第二多孔固体载体捕获的释放的经标记的碳水化合物。在一些实施方案中，包含至多20％有机溶剂的水性溶液包括水或缓冲溶液。在一些实施方案中，水性溶液不包含任何有机溶剂。在一些实施方案中，亲水性第二多孔固体载体由以下材料制成：(a)纤维素；(b)玻璃；(c)氧化铝；(d)二氧化硅；(e)具有二醇、氨基丙基、酰胺(氨基甲酰基)、氰基丙基、乙二胺-N-丙基或两性离子基团的官能化表面；(f)共价结合有一个或多个氨基甲酰基的二氧化硅；或(g)这些中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，第二多孔固体载体由二氧化硅制成。在一些实施方案中，二氧化硅共价结合有一个或多个氨基甲酰基。在一些实施方案中，二氧化硅为珠或颗粒的形式。在一些实施方案中，二氧化硅的珠或颗粒具有3～60微米的尺寸。在一些实施方案中，二氧化硅的球或颗粒具有为约30微米的尺寸。在一些实施方案中，共价结合有氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒是Amide-80。在一些实施方案中，第一多孔固体载体为膜的形式。在一些实施方案中，第一多孔固体载体为整料(monolith)的形式。在一些实施方案中，在步骤(e)中，碳水化合物被还原剂还原。在这些实施方案的一些方案中，还原剂是氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷。在一些实施方案中，还原剂处于有机溶剂中。在一些实施方案中，在步骤(e)中，碳水化合物被标记物标记。在这些实施方案的一些方案中，标记物是2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、邻氨基苯甲酸(2-AA)、8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)或普鲁卡因酰胺盐酸盐。在一些实施方案中，该方法进一步包括：步骤(f)，洗脱第一多孔固体载体中的经还原或标记的碳水化合物，并且分离或分析经还原或标记的碳水化合物，或者分离并分析经还原或标记的碳水化合物。在一些实施方案中，将经还原或标记的碳水化合物提供至分离构件。在一些实施方案中，分离构件是这样的装置：该装置用于对经还原或标记的碳水化合物进行高效液相色谱法、毛细管电泳、微流体分离、亲水相互作用液相色谱法或质谱法，或这些中的两种或更多种的组合，从而分离经还原或标记的碳水化合物。在一些实施方案中，经还原或标记的碳水化合物是经还原的碳水化合物，并且该经还原的碳水化合物通过质谱法来进行分析。在一些实施方案中，经还原或标记的碳水化合物是经标记的碳水化合物，并且所述经标记的碳水化合物通过检测标记物的荧光来进行分析。在一些实施方案中，有机溶剂是乙腈、无水乙醇、无水甲醇、异丙醇、丁醇、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、乙醚、二氯甲烷、氯仿、叔丁基甲基醚、苯、四氯化碳、异辛烷、己烷，或这些中的任何两种或更多种的组合。在一些实施方案中，有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，碳水化合物是N-聚糖。在一些实施方案中，碳水化合物是O-聚糖。在一些实施方案中，碳水化合物是多糖、寡糖、二糖或单糖。在一些实施方案中，反应容器是孔(well)。在一些实施方案中，反应容器是微流体装置的腔室。在一些实施方案中，孔处于多孔板中，并且第一多孔固体载体由聚乙烯组成。在一些实施方案中，聚乙烯具有10微米或更小的孔隙。在一些实施方案中，容器进一步包括设置在第一多孔固体载体和第二开口之间的亲水性第二多孔固体载体。在一些实施方案中，亲水性第二多孔固体载体由结合有氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒组成。

在另一组实施方案中，本发明提供了还原通过还原胺化来标记水性溶液中提供的碳水化合物的装置。本发明的装置包括反应容器，该反应容器具有主体，该主体具有(a)第一开口，(b)具有第一腔室的第一区段，该第一腔室具有一定区域的第一横截面，其中该第一腔室与第一开口流体连接，(c)具有第二腔室的第二区段，该第二腔室具有一定区域的第二横截面，该第二腔室与第一区段的第一腔室流体连接，(d)与第二腔室流体连接的第二开口，(e)第一多孔固体载体，设置在第一开口和第二开口之间并且填充第一腔室的第一横截面的区域，以及(f)第二多孔固体载体，该第二多孔固体载体由亲水性材料组成或具有亲水性材料的表面，第二多孔固体载体设置在第一多孔固体载体和第二开口之间并且填充第一横截面或第二横截面的区域。在一些实施方案中，容器的主体的第一区段的直径大于第二区段的第二直径。在一些实施方案中，第一多孔固体载体设置在反应容器的第一区段中，并且第二多孔固体载体设置在所述反应容器的第二区段中。在一些实施方案中，反应容器是管或筒。在一些实施方案中，反应容器是多孔板中的孔。在这些实施方案的一些方案中，孔的第二区段是从孔的底部突出的尖嘴(nozzle)。在一些实施方案中，第二多孔固体载体设置在尖嘴中。在一些实施方案中，反应容器在微流体设备内。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由非亲水性材料制成或具有非亲水性材料的表面。在一些实施方案中，第一多孔固体载体的非亲水性材料具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口。在一些实施方案中，非亲水性材料是聚乙烯，并且具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由亲水性材料组成。在一些实施方案中，亲水性材料由以下材料制成：(a)玻璃纤维；(b)纤维素；(c)二氧化硅的珠或颗粒；或(d)共价连接有多个氨基丙基、二醇、氨基甲酰基、两性离子基团，或上述基团中的两种或更多种的组合的二氧化硅的珠或颗粒。在一些实施方案中，第一多孔固体载体由玻璃纤维组成。在一些实施方案中，第二多孔固体载体的亲水性材料由以下材料制成：(a)玻璃纤维；(b)纤维素；(c)二氧化硅；(d)共价连接有多个氨基丙基、二醇、氨基甲酰基、两性离子基团，或上述基团中的两种或更多种的组合的表面；或(e)共价连接有多个氨基丙基、二醇、氨基甲酰基，或上述基团中的两种或更多种的组合的二氧化硅。在一些实施方案中，第二多孔固体载体的亲水性材料由玻璃纤维组成。在一些实施方案中，二氧化硅为珠或颗粒的形式。在一些实施方案中，珠或颗粒共价连接有多个氨基甲酰基。在一些实施方案中，具有多个氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒是Amide-80。在一些实施方案中，第一多孔固体载体是具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口的聚乙烯，并且第二多孔固体载体由共价连接有多个氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒组成。在一些实施方案中，具有多个氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒是Amide-80。在一些实施方案中，第二开口具有可打开的盖，以将溶液保持在反应容器中，直到需要溶液离开反应容器为止。

在又一组实施方案中，本发明提供了用于还原碳水化合物或者通过还原胺化来标记碳水化合物的试剂盒。试剂盒包括：(a)具有主体的反应容器，该主体具有(a)第一开口，(b)具有第一腔室的第一区段，该第一腔室具有一定区域的第一横截面，该第一腔室与第一开口流体连接，(c)第二区段，所述第二区段具有第二直径和一定区域的第二横截面的第二区段以及第二腔室，其中第二腔室具有一定区域的横截面，该第二腔室与第一区段的第一腔室流体连接，(d)与第二腔室流体连接的第二开口，(e)第一多孔固体载体，设置在第一开口和第二开口之间并且填充第一腔室的第一横截面的区域，以及(f)第二多孔固体载体，该第二多孔固体载体由亲水性材料组成或具有亲水性材料的表面，其中第二多孔固体载体设置在第一多孔固体载体和第二开口之间并且填充第一横截面或第二横截面的区域；(b)还原剂或者适用于通过还原胺化来标记碳水化合物的标记物，或者上述还原剂和标记物，以及(c)用于还原碳水化合物的说明或通过还原胺化来标记碳水化合物的说明，或者用于还原碳水化合物的说明和通过还原胺化来标记碳水化合物的说明。在一些实施方案中，反应容器是管、筒或多孔板中的孔。在一些实施方案中，反应容器是多孔板中的孔。在一些实施方案中，所述孔的第二区段是从孔的底部突出的尖嘴。在一些实施方案中，第一多孔固体载体是具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口的聚乙烯，并且第二多孔固体载体由共价连接有多个氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒组成。在一些实施方案中，共价连接有多个氨基甲酰基的二氧化硅的珠或颗粒设置在从孔的底部突出的尖嘴中。在一些实施方案中，标记物是2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、邻氨基苯甲酸(2-AA)、8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)或普鲁卡因酰胺盐酸盐。在一些实施方案中，还原剂是氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷，或氰基硼氢化钠和甲基吡啶硼烷。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于使糖缀合物去糖基化的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一种或多种试剂是去糖基化酶。在一些实施方案中，去糖基化酶是PNGase F。

附图说明

图1：图1是显示本发明方法的示例性实施方案的图，其中聚糖用作为将要被还原或标记的示例性碳水化合物。左侧的步骤1表示容纳糖蛋白的水性溶液的容器。图例：折叠的实线：糖蛋白分子的蛋白质组分；明暗几何形状：糖蛋白上连接的聚糖；代表聚糖的形状和代表蛋白质组分的较粗的线之间的细直线：聚糖与蛋白质的共价连接；步骤1和步骤2之间的箭头表示向水性溶液中添加去糖基化酶，并随后发生糖蛋白的酶消化，从而产生起始水性溶液样品。步骤2右侧是指向工作流程1A、1B和1C的箭头。这三种工作流程示例性说明了对于亲水性(“H”)或非亲水性(“非H”)材料的第一多孔固体载体以及用于还原或标记聚糖的还原剂或染料在有机溶剂中的溶解度，实际工作者如何选择调整工作流程。工作流程1A示出了染料或还原剂良好地溶于有机溶剂的实施方案，并且无论第一多孔固体载体是亲水性还是非亲水性均能使用。工作流程1B示出了染料或还原剂不良溶于有机溶剂，并且第一多孔固体载体是非亲水性的实施方案。工作流程1C示出了染料或还原剂良好地溶于或者不良溶于有机溶剂，并且第一多孔固体载体为亲水性的实施方案。步骤2和步骤3之间的箭头表示向具有从糖蛋白中释放出来的聚糖的起始水性溶液中添加足够的有机溶剂，以形成具有在相应工作流程的步骤3中有机溶剂浓度的混合物。各个工作流程的步骤3示出了溶液中用于将聚糖固定在第一多孔固体载体上的有机溶剂的浓度，并且在步骤4和6中示出了用于从第一多孔固体载体清洗溶液中不需要组分的清洗液中的有机溶剂的浓度。在每个工作流程的步骤7中，用水性溶液洗脱聚糖，以进行分离、分析或进行分离和分析。未示出：用于引入试剂且在容器顶部的开口，以及用于在需要排出试剂时排出试剂且在容器底部的开口。

具体实施方式

介绍

如背景技术中所阐述的，对碳水化合物，并且尤其是连接至糖蛋白的聚糖的分析对于各种监管和质量控制目的是重要的。特别地，对连接至治疗性糖蛋白，诸如单克隆抗体的聚糖的类型以及每种类型聚糖的量进行分析已成为此类糖蛋白生产和证实它们将具有所需的药理活性的重要质量控制措施。

通常通过标记碳水化合物，然后使用合适的仪器分析经标记的碳水化合物来对该碳水化合物进行分析。例如，如共有的美国专利No.5,747,347(以下称为“347专利”)中所记载的，通过用合适的染料来使聚糖经受还原胺化能够标记通过酶消化从糖蛋白释放的聚糖，并且然后通过检测结合至经标记的聚糖上的染料的荧光来对聚糖进行分析(这些内容通过引用并入本文)。然而，聚糖通过酶消化的释放通常在水性溶液中发生，并且从糖蛋白释放的聚糖通常在水性溶剂中。此外，来自其他生物分子和其他生物来源的碳水化合物通常存在于水性环境中。而通过还原胺化来标记碳水化合物通常需要无水条件。因此，必须对碳水化合物，诸如从糖蛋白释放的聚糖进行干燥，以提供能够使还原胺化发生的无水条件。该干燥步骤通常会给碳水化合物的标记方案带来相当长的延迟，并且还经常带来处理和可变性方面的问题。

进一步地，用于还原胺化的方案通常需要将碳水化合物与样品混合物中可能存在的其他类型的分子分开。例如，自然界中的游离碳水化合物通常存在于可能含有盐、蛋白质、脂质和其他小代谢物的复杂的水性生物基质中，同时从糖蛋白或其他糖缀合物中释放聚糖的方案通常会导致所释放的聚糖与其他试剂(诸如缓冲盐、变性剂和还原剂)一起处于溶液中。因此，通常通过例如固相萃取、过滤或凝胶分离来使混合物中聚糖或感兴趣的其它碳水化合物经受纯化步骤，然后在合适的溶剂洗脱该聚糖和感兴趣的其它碳水化合物，随后通过蒸发除去溶剂。然而，这些纯化步骤通常会增加随后必须被干燥的溶剂的存在量，并增加了整个方案所需的时间。一旦干燥，通常将经纯化的聚糖或感兴趣的其它碳水化合物重构或重新溶解在合适的非水性溶剂中，并通过还原胺化进行标记。反应完成后，通常进行进一步纯化以除去任何过量的反应物，并且特别是任何过量的游离染料。该第二纯化通常利用固定相通过固相萃取进行，其中该固定相可以与用于纯化未标记的聚糖或碳水化合物所用的固定相相同或不同。

令人惊讶地，本发明的方法减少了通过还原胺化来标记碳水化合物并准备进行分析所需的时间和步骤，同时还减少了潜在的样品损失。更具体地，本发明的方法令人惊讶地消除了对分离步骤的需要，并且不需要将感兴趣的碳水化合物首先转移至固相萃取(“SPE”)筒且然后从固相萃取(“SPE”)筒中转移出，并且不再需要单独的干燥步骤以从碳水化合物通常最初存在的水性溶液中除去该碳水化合物以从而为还原胺化做准备。因此，在对感兴趣的碳水化合物进行的分析中，由本发明方法提供的特征的组合在速度、效率和简便性方面提供了显著的进步。这些特征的组合尤其用于对通过酶消化从糖蛋白释放的聚糖的标记。在另一方面，本发明提供了用标记物APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸，CASNo.196504-57-1)或不良溶于有机溶剂的其它还原胺化染料来标记碳水化合物的装置。类似地，本发明的装置利用本发明的方法以进行既增加标记速度又减少可能导致样品损失的容器之间转移次数的工作流程。

令人惊讶地，在一些实施方案中，当聚糖或其它碳水化合物固定在固体载体上时，本发明的方法可进一步用于还原该聚糖或其他碳水化合物，而不标记该聚糖或其他碳水化合物。如技术人员所知，聚糖和其他碳水化合物以两种差向异构体存在，分别命名为α和β。当被分析的样品中存在未还原的碳水化合物时，该碳水化合物的每种差向异构体会产生单独的信号(例如，通过质谱分析每种未还原碳水化合物的峰都有两个峰)，而经还原的碳水化合物只有一种差向异构体形式，并且因此每种碳水化合物只有一个信号或峰。因此，在碳水化合物被固定在第一多孔固体载体上被还原但未被标记的情况下的实施方案中，改善了检测样品中碳水化合物的存在的灵敏度，并且简化了对所存在的碳水化合物的分析。

本章节首先开始概述本发明方法的方面，随后将更特定地描述能够对例如不同的起始溶液、用于标记碳水化合物的不同还原剂或染料，和不同类型的容器进行处理的具体方面和变型。进一步地，本章节描述了用于进行使用不能良溶于有机溶剂的还原剂或标记染料(诸如APTS)的工作流程的发明性装置。

本发明方法的出发点在于样品含有一种或更多种碳水化合物，而实际工作者希望通过还原胺化来标记其中的碳水化合物以用于后续分析，例如通过测量所得被标记的碳水化合物的荧光来分析，或者实际工作者希望还原但不标记这些碳水化合物并且然后通过质谱进行分析。聚糖或其他碳水化合物通常存在于水性溶液中，尽管在某些情况下，它们可能存在于干样品中，而干样品随后会被再溶解在水性溶液中。例如，水性溶液可以是由去糖基化酶对糖蛋白进行酶消化而得到的溶液，并且包含(i)在其中进行酶消化的水性缓冲液、(ii)在酶的作用释放了聚糖之后残留的完全或部分去糖基化的蛋白质、(iii)通过酶消化释放的任何聚糖、(iv)去糖基化酶、(v)缓冲盐、(vi)还原剂，和(vii)其他变性剂。在其他实施方案中，碳水化合物可以在还包含脂质、蛋白质、盐和其他代谢物的生物样品或其他样品中。为了便于引用，有时将包含待标记碳水化合物以及溶液中存在的任何其他试剂的水性溶液称为“起始水性溶液样品”。根据所使用的设备，起始水性溶液样品通常被容纳在容器中，诸如孔、艾本德(Eppendorf)管或微流控装置的腔室中。提供起始水性溶液样品的容器在下文中有时被称为“初始容器”。

在目前的典型方案中，纯化步骤用于使碳水化合物与样品中存在的任何蛋白质、脂质或其他非碳水化合物分子相分离，从而产生经分离的碳水化合物，然后可以使该经分离的碳水化合物经受还原胺化处理。通常，通过将样品转移到固相萃取(“SPE”)筒中，从该柱中洗脱非碳水化合物组分，以及然后将现在被分离的碳水化合物洗脱到单独的孔或小瓶中以进行还原胺化来完成该纯化步骤，或使用保留在非碳水化合物组分而不保留碳水化合物的材料来使得碳水化合物能够流过并被收集以完成此纯化步骤。

令人惊讶地，本发明的方法不再需要在工作流程中设置单独的纯化步骤以及样品和碳水化合物的多次转移，从而减少了该过程的时间，并且减少了在样品从一个容器至另一个容器的多次转移期间导致样品损失的机会。进一步地，在许多实施方案中使用的材料是廉价的，并且易于自动化。因此，本发明的方法提供了本领域先前无法获得的优点的组合。

本发明的方法利用聚糖或其他碳水化合物在有机溶剂中的性质，诸如与在水性溶液中的溶解度相比，在有机溶剂中具有降低的溶解度。这使得能够将样品中的聚糖或其他碳水化合物固定在第一多孔固体载体上，同时洗去样品中溶于有机溶剂的分子并提供无水条件。然后可以在无水条件下通过还原胺化来还原或标记样品中的聚糖或其他碳水化合物，同时使它们保持固定在第一多孔固体载体上，然后可以通过将它们重新溶解在水性溶液中而从第一多孔固体载体上洗脱下来(通常在先洗掉任何还原剂之后，或者在还原胺化的情况下，洗掉未与聚糖或其他碳水化合物结合的任何标记物之后)。然后可以通过将经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物提供至分离设备、分析设备，或者优选地首先提供至分离设备，然后提供至分析设备来进行分离和分析。

在这些本发明方法的一些实例中，第一多孔固体载体是亲水性材料，并且将有机溶剂添加到含有聚糖或其他感兴趣的碳水化合物的起始水性溶液中，以产生如图1中工作流程1A中所示的有机溶剂的浓度为75％至95％浓度的混合物，或者产生如工作流程1C中所示的有机溶剂的浓度高于95％的混合物。不希望受理论的束缚，据认为，有机溶剂的浓度为75％至95％时，存在于样品中的聚糖或其他碳水化合物通过亲水性相互作用而保留在亲水性第一多孔固体载体上，而在有机溶剂浓度超过95％时，则认为样品中的聚糖或其他碳水化合物会沉淀或聚集，并且通过简单过滤便可由第一多孔固体载体中的孔隙或开口而被捕获并保留在第一多孔固体载体中，这无论与第一多孔固体载体是亲水性是非亲水性的。因此，与使用有机溶剂来产生有机溶剂浓度等于或低于95％的混合物相比，向起始水性溶液样品中添加有机溶剂以产生有机溶剂浓度高于95％的混合物所允许的用于第一多孔固体载体的材料范围更为广泛。

在本发明的方法中，含有聚糖或其他感兴趣的碳水化合物的起始水性溶液样品(并且其也可能含有蛋白质、变性剂、盐、酶或其他化合物)处于初始容器中。然后使起始水性溶液样品与有机溶剂混合，以使得当有机溶剂与起始水性溶液样品的混合物与第一多孔固体载体接触时，处于该选定浓度的有机溶剂中(即，与需要通过亲水相互作用来在第一多孔固体载体上进行捕获的亲水性第一多孔固体载体一起使用时，有机溶剂的浓度为75％至95％，或者需要通过简单过滤来在第一多孔固体载体进行捕获的亲水性或非亲水性的第一多孔固体载体一起使用时，有机溶剂的浓度大于95％)。本领域技术人员将理解，有许多方法可以实现这一点。例如，将有机溶剂以能够产生所需有机溶剂浓度加入最初容纳起始水性溶液样品的容器中。或者，可以将起始水性溶液样品转移到更大的容器中，并使之与有机溶剂混合以产生具有所需有机溶剂浓度的混合物，然后将该混合物添加到具有第一多孔固体载体的容器中。或者，在容纳第一多孔固体载体的容器中可以存在一定量的有机溶剂，使得当起始水性溶液样品被添加到容器中时，有机溶剂和起始水性溶液样品的混合物产生具有所需有机溶剂浓度的混合物。最后，可以开始将所需量的有机溶剂添加到容纳第一多孔固体载体的容器中，并开始将足够的起始水性溶液样品缓慢地添加到容器中，以使得容器中在第一多孔固体载体处的有机溶剂和起始水性溶液样品的混合物总是等于或高于起始水性溶液样品的所需的有机溶剂浓度。

在基于本发明的研究中，通常将一定量的有机溶剂添加到第二容器中以产生有机溶剂浓度为80％或以上的混合物，然后通过添加起始水性溶液样品来在有机溶剂中添加样品。例如，在这些研究中，80微升有机溶剂将被添加20微升起始水性溶液样品。然后将所得混合物转移到容纳第一多孔固体载体的容器中。

为了便于引用，在本文中有时将容纳第一多孔固体载体的容器称为“反应容器”。(在微流体装置中，起始水性溶液样品未转移到容纳第一多孔固体载体的单独容器中，而是从通道、管道等的第一区段转移到该通道、管道等的第二区段，该第二区段包含第一多孔固体载体。有时本文中使用短语“反应室”以表示配置为微流体装置中用于进行本发明方法的部分。为了便于引用，除非另有说明，下文中将针对其中起始水性溶液样品被转移到反应容器的相关实施方案进行一般性讨论，但是要理解的是，还涉及在微流体应用中，起始水性溶液样品被转移到具有足够大空间的部分中，以容纳有机溶剂和起始水性溶液样品的混合物以及第一多孔固体载体。反应容器具有：通常在顶部的第一开口，其中溶液和试剂可通过该第一开口引入；主体，该主体通常为柱形且容纳第一多孔固体载体；和第二开口，该第二开口通常设置在容器的底部，与第一开口相对。第二开口可以是可关闭的，以防止溶液离开反应容器，直到需要离开为止。容器的主体具有腔室，该腔室具有横截面(在柱形主体的情况下，横截面为圆形)，该横截面具有由该主体的尺寸所限定的面积。将第一多孔固体载体放置在反应容器中，填充反应室的横截面的区域，以使有机溶剂与包含聚糖或其他碳水化合物的起始水性溶液样品的混合物必须通过第一多孔固体载体中的孔隙或开口以到达第二开口。

由于聚糖和其他碳水化合物是亲水性的，因此当它们处于75％至95％有机溶剂的溶液中时，倾向于保留在亲水性表面上。在一些优选的实施方案中，有机溶剂的浓度为约80％，在本文中“约”是指±2％。在一些优选的实施方案中，有机溶剂的浓度为80％。不希望受到理论的束缚，认为聚糖或其他碳水化合物在这些条件下通过非共价亲水相互作用而不是通过过滤而保留在亲水性表面上。因此，在这些实施方案中，第一多孔固体载体的孔径不是关键，但应足够小以使聚糖或其他碳水化合物不与第一多孔固体载体的亲水性表面接触。例如，第一多孔固体载体中的孔隙或开口不应太大而导致起始水性溶液样品的液滴可以穿过该孔隙或其他开口而不接触亲水性表面。任何特定尺寸的孔隙或其他开口均可通过如下所述的测定法容易地测试其适用性。这些实施方案的优选材料包括玻璃纤维；纤维素；氧化铝；氨基丙基；天冬酰胺；环糊精；三唑；二乙基氨基乙基；二氧化硅或被化学基团，诸如二醇、氰基丙基、乙二胺-N-丙基、氨基丙基、酰胺(氨基甲酰基)、两性离子基团衍生或它们中的两种或更多种的组合衍生化的二氧化硅；其中，优选玻璃纤维和衍生化的二氧化硅，并且特别优选玻璃纤维。第一多孔固体载体是未用羧基衍生化或未使用羧基来捕获起始水性溶液样品中存在的碳水化合物的载体，并且不应由能够与还原胺化中所用的还原剂或标记物反应的材料或衍生化的材料制成。例如，该材料不应被多种醛衍生化。该材料可以被成形为填充容器的横截面的区域的膜的形式或整料的形式，使得溶液必须通过第一多孔固体载体。然而，在一些实施方案中，特别是在二氧化硅的情况下，用于固体载体的材料可以呈珠或颗粒的形式，其可以通过例如双向影线(cross hatching)小于珠或颗粒直径的塑料框架保持在反应容器内的适当位置，该塑料框架在容器的腔室内位于珠或颗粒的下方。在一些实施方案中，第一多孔固体载体可以由底层非亲水性且但是具有亲水性材料表面层的材料制成以允许使聚糖或其他碳水化合物保留在亲水性表面上。在优选的实施方案中，制备亲水性第一多孔固体载体的材料是亲水性的。

如果实际工作者选择提高有机溶剂的浓度并提高到95％以上，例如提高到99％或更高，从而将水性组分稀释至聚糖或其他碳水化合物几乎在纯有机溶剂中的程度，则在较低浓度下除了可以使用亲水性材料之外，也可使用非亲水性材料也可以用于第一多孔固体载体。这使得实际工作者能够使用较便宜且易于在其中形成第一多孔固体载体所需尺寸(例如，10微米或更小)的孔隙或开口的材料，诸如聚乙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯或聚丙烯。与上述所描述的亲水性材料一样，选择用作第一多孔固体载体的非亲水性材料不应为含有预期能够与还原胺化的还原剂或标记物反应的化学基团(诸如醛)的材料或被预期能够与还原胺化的还原剂或标记物反应的化学基团(诸如醛)衍生化的材料。不希望受理论的束缚，认为在高于95％的有机溶剂浓度下，聚糖或其他碳水化合物从起始水性溶液样品中聚集或沉淀出来，并且可以通过过滤使其穿过第一多孔固体载体中10微米或更小的孔隙或开口而捕获并保留在第一多孔固体载体上。

使用孔径为10微米或更小的亲水性材料以及浓度大于95％的有机溶剂，还使得能够保留单糖和不能良好沉淀并且具有弱亲水其它小聚糖或碳水化合物。因此，根据特定的感兴趣的聚糖或碳水化合物以及用于第一多孔固体载体的材料，将有机溶剂添加到起始水性溶液样品中，以产生80％到99％以上的有机溶剂的混合物，例如，通过以4:1至49:1的比例向起始水性溶液样品中添加有机溶剂。下面将更详细地讨论有机溶剂与起始水性溶液样品的合适比例以及用于第一多孔固体载体的合适材料。

如所指出的，包含第一固体载体的材料是多孔的，其孔隙或开口的大小适用于使起始水性溶液样品渗透或滤过第一多孔固体载体并且在存在的有机溶剂的浓度下保留聚糖或其他碳水化合物，同时使得诸如起始水性溶液样品的水性组分的液体，以及仍溶解在有机溶剂和起始水性溶液的混合物中的溶质，诸如去糖基化酶、蛋白质(糖基化或去糖基化)、缓冲盐、水和还原剂能够从第一多孔固体载体上洗脱下来并离开反应容器。在基于本发明的研究中，发现蛋白质与聚糖或其他碳水化合物一起从溶液中沉淀出来并沉淀在第一多孔固体载体上。沉淀的蛋白质的存在并不影响聚糖或其他碳水化合物的还原或标记。

第一多孔固体载体与碳水化合物之间的相互作用是非共价的，并因此不需要在碳水化合物与第一多孔固体载体之间形成共价相互作用所需要的时间或条件。在基于本发明的研究中，一系列的糖蛋白被去糖基化并按照本文所述方法通过还原胺化来标记所得的聚糖，其中，蛋白质，诸如在去糖基化反应后残留的任何无糖基化(aglycosylated)的蛋白质，以及可能结合在第一多孔固体载体的任何去糖基化酶并不干扰对碳水化合物的标记或后续分离和分析。

优选地，用有机溶剂，要么是纯的有机溶剂要么是其中有机溶剂浓度为95％或更高的混合物来清洗具有保留的聚糖或其他碳水化合物的第一多孔固体载体。该清洗通常非常快，但需要从起始水性溶液样品中除去仍然存在的任何水，或需要将其稀释到低于干扰碳水化合物还原或还原胺化的能力程度以下。因此，用有机溶剂或有机溶剂浓度为95％或更高的混合物清洗省略了单独的干燥步骤的需要。由于干燥步骤通常需要花费相当长的时间以使起始水性溶液样品中的水蒸发，或者需要提供真空以使水快速蒸发的设备，因此消除干燥步骤可显著减少制备还原胺化所需的碳水化合物所需的时间(简单蒸发的情况)或费用和设备(产生真空以加速蒸发的情况)。进一步地，由于碳水化合物与其他组分的分离以及水性溶液的除去不需要(a)转移到SPE筒，并且(b)将经纯化的碳水化合物从SPE筒洗脱到用于干燥的容器中，所以这些步骤的时间以及转移过程中碳水化合物的潜在损失都被消除了。

现在讨论本发明方法的各种实施方案的某些方面，以提供进一步的解释和指导。

第一多孔固体载体上进行的聚糖或其他碳水化合物的还原或还原胺化

在一些实施方案中，用还原剂来还原聚糖或其他碳水化合物，或者在能够发生还原胺化以标记碳水化合物的条件下(诸如pH、温度和时间)，用合适的标记物，诸如2-AB(2-氨基苯甲酰胺)、2-AA(邻氨基苯甲酸)、APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸，CAS No.196504-57-1)或普鲁卡因酰胺盐酸盐(CAS No.614-39-1)来使聚糖或其他碳水化合物经受还原胺化。当然，用于进行聚糖或其他碳水化合物的还原以及还原胺化的条件是本领域众所周知的。例如，1998年公布的美国专利No.5,747,347教导了用2-AB通过还原胺化来标记碳水化合物。因此，预期的是，本领域技术人员非常熟悉适合于使用诸如上文所列举的那些标记物进行还原胺化反应的反应条件(为清楚起见，请注意，在还原胺化反应中使用的标记物，诸如2-AB、2-AA或APTS有时被实际工作者称为染料。遵循本领域中的这种用法，两个术语可以在本文中互换使用)。在其他实施方案中，通过使用还原剂来还原聚糖或其他碳水化合物。

在优选的实施方案中，进行还原或还原胺化的同时，聚糖或其他碳水化合物被固定在第一多孔固体载体上。如实际工作者所理解的，分析方法中使用的试剂体积很小。一旦聚糖或其他碳水化合物被保留在第一多孔固体载体上(例如可为膜、整料或二氧化硅珠)，则通常以小至10到20微升的量添加还原剂或标记材料。不希望受理论所束缚，可以想到的是，如此少量的试剂将通过毛细作用或表面张力保留在第一多孔固体载体上。在典型的实施方案中，则可以在容器被设计成使液体从容器中流出的端部处打开容器(如果该容器被设计成使得液体从顶部垂直移动到底部，则通常是底部处，或者如果该容器被设计成使流体水平地移动，例如在一些微流体应用中，微流体管可能被设计成从一侧引入流体然后从另一侧流出，其中引入流体的开口与引出流体的开口不同)。但是，如果需要的话，容器可以具有手动或自动的方式来密封底部或出口区域，从而在需要试剂存在的步骤期间将试剂保留在容器中，并在需要时打开底部或出口区域以允许其排出或从容器中洗脱。例如，当在开口上方闭合时，底部可以具有片状物、盖状物或其他覆盖物，其能够使得流体保持在容器中，并且当打开时，其能够使得流体流出容器。在微流体应用中，还原胺化发生在可以垂直放置或水平放置的反应室中，例如，在反应室与通道或其它通路之间可存在例如一个或多个阀，通过其实际工作者希望通过打开隔开反应室与特定通道的阀，使反应物继续进行以使溶液和溶剂沿着所需的路径从反应室中洗脱出来。如果实际工作者希望以制备规模而不是分析规模使用的较大体积来还原聚糖或其他碳水化合物或通过还原胺化标记它们，则优选在容器底部具有可移动的盖子。

在还原聚糖或其他碳水化合物之后，可以对它们进行清洗以除去过量的还原剂。还原胺化后，可对现被标记的聚糖或其他碳水化合物进行清洗，以除去任何没有与碳水化合物结合的标记物(“过量”或“游离”的染料或标记物)。用于该清洗步骤的溶剂或溶液取决于还原剂或标记物在用于清洗聚糖或其他碳水化合物的有机溶剂中的溶解度，以及第一多孔固体载体的材料是否为亲水性。例如，染料2-AA和2-AB良溶于有机溶剂，而APTS则不然。对于良溶于水的经还原剂还原的碳水化合物或经染料标记的碳水化合物，实际工作者可以使用工作流程1A，或者如果实际工作者已使用亲水性的第一多孔固体载体，则可以使用工作流程1C。

在工作流程1A中，简单地用纯的有机溶剂或有机溶剂的浓度大于95％(相应地小于5％的水或水性溶液)的溶液来清洗亲水性或非亲水性固体载体，优选使用较高的有机溶剂与水或水性溶液的比例。在这些实施方案中，经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物将被保留在第一多孔固体载体上，而在用有机溶剂或高浓度的有机溶剂清洗时，还原剂或游离染料从容器中被洗脱至水或水性溶液中。然后通过用水性溶液清洗膜，将经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物从反应容器或反应室洗脱到接收容器中。然后可以将经还原或标记的碳水化合物提供给分析构件进行分析。

如果第一多孔固体载体是亲水性的，则实际工作者可以改用工作流程1C。如图1所示，在工作流程1C的步骤6中，用有机溶剂浓度为75％或更高的混合物的有机溶剂清洗第一多孔固体载体。在优选的实施方案中，有机溶剂的浓度为78％或更高，并且优选为约80％，在这种情况下“约”是指±2％。如前所述，在这些有机溶剂浓度下，聚糖将保持在亲水性第一多孔固体载体上，从而洗掉还原剂或过量的标记物。

与2-AA和2-AB相反，APTS不良溶于有机溶剂。在实际工作者选择的还原剂和染料不能良溶于有机溶剂并且所选的用于通过还原胺化进行还原或标记的第一多孔固体载体是非亲水性的实施方案中，工作流程将更改为如图1所示的工作流程1B。该工作流程在以下方面与工作流程1A有所不同。首先，由于还原剂或染料不良溶于有机溶剂，因此与工作流程1A中所用的溶液相比，使用具有相对于有机溶剂水浓度较高的溶液将还原剂或过量的染料从第一多孔固体载体上洗下来。通常，用于APTS或不良溶于有机溶剂的其他染料或还原剂的清洗液为约75％至90％的有机溶剂，优选约80％，术语“约”在此表示±2％(为方便引用，该清洗液在下文中有时会被称为“有机溶剂/水性清洗液”。对于任何具体的还原剂或染料，通过在分离碳水化合物的HILIC所用溶剂的指导浓度，可以确定用于除去还原剂或APTS或不良溶于有机溶剂的其它染料的有机溶剂相对于水性缓冲液的适当浓度。

其次，经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物在这些实施方案中使用的有机溶剂/水性清洗液的浓度下不会保持聚集或沉淀，并因此将重新溶解并脱离第一多孔固体载体。并且，由于这些实施方案中的第一多孔固体载体由非亲水性材料制成，因此经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物将不会通过亲水相互作用而保留在载体上。因此，在这些实施方案中，随着经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物由于有机溶剂/水性清洗而从第一多孔固体载体中释放，第二多孔固体载体可用于捕获这些经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物，由于该第二多孔固体载体由能够保留从第一多孔固体载体释放的聚糖(或在其他碳水化合物的实施方案中，为其他碳水化合物)的亲水性材料制成。不希望受理论的束缚，在有机溶剂/水性清洗液的存在下，从非亲水性第一多孔固体载体释放的聚糖将通过亲水相互作用而保留在亲水性第二多孔固体载体上。

在优选的实施方案中，第二多孔固体载体设置在沿溶剂和溶液移动通过容器的路径的第一固体载体的下游。在优选的实施方案中，第二多孔固体载体与第一多孔固体载体在相同容器(或微流体通道的区段、管等)中。像第一固体载体一样，第二固体载体是多孔的，其使得溶液和溶解的还原剂或过量的染料能够流过并从容器中洗脱出来，但是，如上所述，该第二固体材料由亲水性材料制成，其中该亲水性材料在用于从第一多孔固体载体上洗下还原剂或过量标记物的有机溶剂/水性清洗液的存在下能够保留经还原或标记的聚糖。这些实施方案中用于捕获从非亲水性第一多孔固体载体脱离的聚糖或其他碳水化合物的亲水性第二多孔固体载体由上文描述的用于适于制造亲水性第一多孔固体载体的任何亲水性材料制成(例如，玻璃；纤维素；氧化铝；氨基丙基；天冬酰胺；环糊精；三唑；二乙基氨基乙基；二氧化硅；或被化学基团，诸如二醇、氰基丙基、乙二胺-N-丙基、酰胺(氨基甲酰基)、一个或多个两性离子基团官能化或衍生化的二氧化硅，或者这些中的两种或更多种的组合)。在一些优选的实施方案中，二氧化硅或官能化的二氧化硅为珠或颗粒的形式。在一些优选的实施方案中，二氧化硅被氨基甲酰基官能化或衍生化。在一些实施方案中，衍生化有氨基甲酰基衍生的二氧化硅是Amide-80，并且在一些实施方案中由尺寸为30微米的珠组成。亲水性材料不能是含有预期会与还原剂或标记物进行还原胺化的化学基团(诸如醛)或衍生化有预期会与还原剂或标记物进行还原胺化的化学基团(诸如醛)衍生的材料。

可以容易地对任何特定材料或材料上的官能团进行测试，以确定其是否足够亲水以用作制备第二多孔固体载体或亲水性第一多孔固体载体的亲水性材料。例如，可以将感兴趣的材料或官能化的材料放入柱中，在选定的有机溶剂/水性清洗液中将已知量的经标记的碳水化合物引入柱中，从柱中流出的流体进入分析仪器(诸如荧光检测器)，以测量多少已知量的经标记的碳水化合物已离开柱。引入到柱中的经标记的碳水化合物的量与离开柱的量之间的差是被测试材料所保留的量。优选保留较高量的经标记的碳水化合物的材料。

返回到本发明方法的整体描述，一旦还原剂或过量的标记物已经被洗掉，则通过用水性溶液清洗第二多孔固体载体来从第二多孔固体载体上洗脱经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物。在图1所描绘的实施方案中，该步骤被示为各个工作流程的步骤7。通常，用于洗脱碳水化合物的溶液中至多20％可为有机溶剂，但至少80％为水性溶液，其中优选较高的水性溶液浓度。应当指出，“水性溶液”可以是水，但是优选是缓冲溶液，诸如HEPES(2-[4-(2-(羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水或甲酸铵缓冲液。缓冲溶液中盐的存在增加了水性溶液的极性，从而提高了洗脱过程中聚糖或其他碳水化合物从固体载体中的释放。当“聚糖或其他碳水化合物”是经标记的聚糖时，缓冲液有助于将聚糖保持在pH受控的溶液中，从而增加其稳定性。

然后收集洗脱的、经还原或标记的碳水化合物，并将其提供给分析仪器进行分析。例如，可以通过高效液相色谱法、毛细管电泳法、微流体分离法或亲水相互作用液相色谱法(“HILIC”)来分离该经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物。然后可以通过检测经标记的聚糖或其他碳水化合物的荧光并测量该荧光的强度或通过质谱来其进行分析，或通过检测荧光强度以及通过质谱的组合来分析该经标记的聚糖或其他碳水化合物，而经还原的聚糖或其他碳水化合物通常通过质谱来进行分析。

如本领域技术人员将理解的，确定任何具体染料是否被认为在任何特定有机溶剂中能够良好溶解或在该有机溶剂中不能良好溶解是容易的。例如，在透明容器中，如果还原剂或染料可以以10mg/ml的浓度溶解在有机溶剂中，则认为其达到了高度可溶的目的。如果所测试的标记物在选定的有机溶剂在没有可见沉淀物或保持未溶解的情况下不能达到该浓度，则说明该标记物在该溶剂中的溶解度不高，并且如果第一多孔固体载体是非亲水性或其表面是不亲水的，则应使用工作流程1B。

将参考图1更好地说明上文讨论的本发明方法的实施方案的一些实施方案，图1是示出本发明方法的几个示例性实施方案的图。图1的步骤1示出了容纳糖蛋白的水性溶液的小瓶。糖蛋白分子的蛋白质组分以折叠的实线来表示，而聚糖组分以明暗的几何形状来表示。聚糖与蛋白质成分的共价连接由代表聚糖的形状和代表蛋白质成分的粗线之间的细直线表示。箭头表示向水性溶液中添加去糖基化酶，并且步骤2描述了糖蛋白的酶消化的结果，从而糖蛋白释放出聚糖。步骤2的右侧是指向工作流程1A至1C的箭头。

在所有的工作流程中，步骤2和步骤3之间的箭头表示向已经进行了酶消化的水性溶液中添加有机溶剂，以产生具有一定有机溶剂浓度的混合物，如相应工作流程中所示，该有机溶液浓度在采用第一多孔固体载体为亲水性或具有亲水性材料表面的工作流程时是约为80％或更多；并且在采用第一多孔固体载体为是不亲水时的工作流程，有机溶剂浓度大于95％。在各个工作流程的步骤3中，将具有所需有机溶剂和起始水性溶液样品的浓度的混合物引入至容纳第一多孔固体载体的反应容器中。在各个示例性工作流程中，第一多孔固体载体均示为膜。在步骤3中，第一多孔固体载体(在这种情况下为膜)捕获并保留聚糖，如前文所述，聚糖由明暗几何形状表示。在该图中，所示出的工作流程中的反应容器具有柱形主体和倒锥形底部，其中溶液从容器的顶部引入并穿过膜，其中膜刚好设置在柱形主体的中部下方。在工作流程1B中，反应容器进一步具有设置在锥形部分中的亲水性材料的第二多孔固体载体(示出为容器的锥形部分内的阴影区域)。在所有三个工作流程中，聚糖均保留在膜上，而起始水性溶液和有机溶剂的混合物则通过膜。在各个工作流程的步骤4中，用有机溶剂或有机溶剂超过95％的溶液清洗膜，以除去盐、清洗剂和膜上可能存在的其他不需要的组分，同时聚糖保留在第一多孔固体载体上。在步骤5中，将用于还原但不标记聚糖，或通过还原胺化来标记聚糖的试剂(包括实际工作者选择的标记物，通常是还原剂)引入容器中，并且当聚糖固定在膜上时，发生还原或还原胺化。在图1所示的实施方案中，倒置锥形部分的尖端具有允许清洗溶液和洗脱的试剂离开容器的开口(未示出)。在其他实施方案中，容器的底部可具有开口，该开口由片、盖或其他覆盖物可释放地覆盖，从而实际工作者在需要时可通过手动或自动方式移除片、盖或其他覆盖物，以允许溶液或试剂从容器中排出。在工作流程1A的步骤6中，用有机溶剂或者有机溶剂大于95％且水性溶液小于5％的水性溶液的溶液来清洗膜，以除去还原剂或未与碳水化合物结合的任何标记物。在工作流程1B的步骤6中，用比在工作流程1A中所使用的溶液中有机溶剂相对于水性溶液的百分比低的溶液来清洗膜，因为该工作流程是在还原剂或染料不良溶于有机溶剂且第一多孔固体载体不亲水的情况下所采用的。工作流程1B中所示实例中的清洗溶液是约80％的有机溶剂且约20％的水性溶液(例如，水或水基缓冲液)。在清洗溶液中存在如此高的水含量的情况下，聚糖将不会保留在非亲水性固体载体上，并且会与过量的染料一起流入亲水性第二多孔固体载体中。然后，聚糖被捕获并保留在亲水性第二多孔固体载体上，而还原剂或过量的染料将流出倒置锥形部分的尖端处的开口。在所有工作流程的步骤7中，使用水性溶液来将聚糖从保留有它们的多孔固体载体(在工作流程1A和1C中，为第一多孔固体载体；在工作流程1B中，为第二多孔固体载体)上洗脱下来。通常将经还原或标记的聚糖被洗脱到孔、小瓶或其他收集容器中。

应当指出，工作流程1B中所示的带有两个多孔固体载体的容器当然也可以用在工作流程1A中所示的工作流程中。图1A的步骤3中使用有机溶剂(超过95％)与水性溶液起始样品的混合物以及步骤6使用有机溶剂超过95％的清洗溶液使聚糖保留在第一多孔固体载体，并且无论制备第一多孔固体载体的材料如何，第二多孔固体载体都将是不必要的。因此，具有两个载体的容器可以灵活地用于任一工作流程。

在一些优选的实施方案中，然后通过例如高效液相色谱法、毛细管电泳法、微流体分离法或亲水相互作用液相色谱分离法来分离被洗脱的经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物，并且然后通过将它们提供到选定的分析仪器进行分析。通常，上述分析通过将聚糖或其它碳水碳水化合物提供至荧光检测器或质谱仪之一或两者来进行。

还原而不标记聚糖或其他碳水化合物

如上所述，碳水化合物以两种差向异构体形式存在，从而在分析时对于每种碳水化合物会产生两种信号。对碳水化合物的还原端进行还原则使得样品中存在的每种碳水化合物仅以一种差向异构体形式存在，使分析信号更加容易，并提高了检测灵敏度。因此，在一些实施方案中，实际工作者可以选择对固定在第一多孔固体载体上的聚糖或其他碳水化合物进行还原而不对其进行标记。

在这些情况下，按照上文关于制备用于还原胺化的聚糖或其他碳水化合物的步骤，将聚糖或其他碳水化合物固定在第一多孔固体载体上。然后通常在有机溶剂中，使被固定的聚糖或其他碳水化合物与一种或多种还原剂接触，而不与在通过还原胺化来标记聚糖或其他碳水化合物中所使用的染料(诸如2-AA或2-AB)接触。合适的还原剂和过程将在下面的单独章节中进行讨论。

一旦聚糖或其他碳水化合物被还原，就可以如上文中涉及用高度可溶于有机溶剂的染料标记的聚糖或其他碳水化合物所进行的描述，从第一多孔固体载体上将它们洗脱下来。在一些优选的实施方案中，然后通过例如高效液相色谱法、毛细管电泳法、微流体分离法或亲水相互作用液相色谱法来分离经标记的聚糖或其他碳水化合物，然后通过将其提供给选定的分析仪器进行分析。通常，对经还原的但未标记的聚糖或其他碳水化合物的分析是通过将其提供给质谱仪来进行。

碳水化合物

对于具有还原端的任何碳水化合物，通常可以使用本发明的方法。在一些优选的实施方案中，碳水化合物是多糖；在一些实施方案中，碳水化合物是寡糖，而在其它的一些方案中，它们可以是二糖或单糖。非淀粉多糖(诸如纤维素和半纤维素)，以及果胶，和交联多糖(诸如)是次优选地。在一些优选的实施方案中，要进行还原胺化和标记的碳水化合物是通过酶消化从糖缀合物释放的聚糖。在一些优选的实施方案中，聚糖是O-聚糖。在一些优选的实施方案中，聚糖是N-聚糖。在一些优选的实施方案中，O-聚糖或N-聚糖已经通过酶消化从糖缀合物释放出来，如下所述。

糖蛋白以及释放聚糖的酶消化

糖蛋白是由真核细胞在蛋白质翻译后通过共价连接而加成直链或直链的碳水化合物而产生的。这些蛋白质-碳水化合物缀合物被称为糖蛋白；碳水化合物的连接点被称为糖基化位点。连接至蛋白质的多糖或寡糖被称为聚糖。在特定糖蛋白的不同糖基化位点上发现了广泛的聚糖。特定糖蛋白上的聚糖的特定模式取决于产生该蛋白的特定细胞系以及细胞生长的条件。

聚糖通常以两种方式之一连接至糖蛋白。第一种方式，其被称为N-聚糖，该聚糖在天冬酰胺残基处通过N-糖苷键来连接。第二种方式，其称为O-聚糖，该聚糖连接到氨基酸残基的氧原子上。例如，N-乙酰基-半乳糖胺可以酶促连接至丝氨酸或苏氨酸残基中的氧。

N-聚糖可以通过各种酶，诸如PNGase F(肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶，EC 3.5.1.52)经酶解反应从糖蛋白中酶促释放。通过酶活性从糖缀合物中除去聚糖通常被称为“酶消化”。N-聚糖的酶消化，诸如通过PNGase F的N-聚糖的酶消化通常在水性溶液中进行，并引起N-聚糖的以β-糖胺的最初释放，其中释放的聚糖的游离还原端与氨结合(参见，例如，Tarentino,et al.TIGG 1993,23,163-170；RasmussenJ.R.J.Am.Chem.Soc.1992,114,1124-1126；Risley,et al.J.Biol.Chem.1985,260,15488-15494,1985)。如背景技术部分所述，PNGase F释放的N-聚糖通常通过还原胺化进行标记，其中聚糖的游离还原端与标记物(诸如荧光染料或带有电荷的部分)的游离氨基缀合。取决于所使用的标记物，然后可以通过多种分析方法，诸如高效液相色谱法(“HPLC”)、毛细管电泳法(“CE”)、碳水化合物凝胶电泳法或微流体分离法中的任一种来分析经标记的聚糖。

有机溶剂

在本发明方法的实施方案中使用有机溶剂，以将起始水性溶液样品的浓度降低至或低于样品中的碳水化合物会聚集或沉淀或者聚集且沉淀于第一多孔固体载体上的点，以使得能够通过例如有机溶剂清洗第一多孔固体载体来除去样品中的其他化合物。在基于本发明的一些研究中，使用的有机溶剂是乙腈，特别优选使用乙腈。乙腈是疏水的且非质子的。预期的是，在本发明方法的实施方案中可以使用其他有机溶剂，并且优选疏水性且非质子的有机溶剂。认为，适用于本发明的实施方案的多种其它有机溶剂包括：无水乙醇、无水甲醇、异丙醇、丁醇、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、乙醚、二氯甲烷、氯仿、叔丁基-甲醚、苯、四氯化碳、异辛烷和己烷。也可以使用诸如上文所示出的有机溶剂中的两种或更多种的混合物。

二甲基亚砜(“DMSO”)和二甲基甲酰胺(“DMF”)不太优选用作本发明方法的实施方案中使用的主要有机溶剂或有机溶剂混合物的主要成分。据认为，DMSO或DMF可以以相对适量(诸如0.1％至2％)与前一段中提及的有机溶剂之一或上述有机溶剂的混合物混合，而不影响固体载体在有机溶剂或有机溶剂混合物存在下保留碳水化合物并使还原胺化反应能够进行的能力。

技术人员将理解，对于可适合用于本发明方法的实施方案的所有固体载体，没有哪一种溶剂能够用于所有的情况。进一步地，对从糖蛋白释放的聚糖进行标记的本领域技术人员知道通常必须测试试剂的组合以确定该组合是否可用于存在于多种糖蛋白上的聚糖的释放、标记和分析，并且此类测试在本领域中被认为是常规的。实际工作者可以容易地测试任何具体的有机溶剂对于任何具体样品以及任何的具体的固体载体的适用性，其中该任何具体样品含有实际工作者希望通过具体的还原剂来还原或通过还原胺化用具体的标记物来标记的碳水化合物，该固体载体为实际工作者希望在其上保留碳水化合物以便进行还原或标记，上述测试为：将过量的待测试的有机溶剂添加到含有已知量的选定碳水化合物的起始水性溶液样品中；使溶剂/溶液混合物与所选的固体载体接触(无论是否已知可用于通过还原胺化来标记碳水化合物的方案或正在测试其用于此目的的固体载体)；通过用2-AB进行还原胺化来还原碳水化合物或标记碳水化合物；用有机溶剂清洗固体载体以除去没有与碳水化合物结合的标记物；用水性缓冲液从固体载体中洗脱碳水化合物；然后对洗脱的溶液进行分析，以确定碳水化合物是否已被还原或标记，以及如果已经被还原或标记，则确定是否以预期的量存在。如果在分析的洗脱物中确定出经还原或标记的碳水化合物分别未以预期的量存在，则表明有机溶剂、还原剂或标记物、以及固体载体的具体组合不适合利用所选定的还原剂或标记物来还原或通过还原胺化来标记所选的碳水化合物。

用有机溶剂接触起始水性溶液样品

可以通过多种方式来获得待标记的聚糖或其它碳水化合物或者获得待还原而不标记的聚糖或其他碳水化合物。在一些实施方案中，感兴趣的碳水化合物是与糖蛋白连接的聚糖，通过用去糖基化酶，诸如示例性去糖基化酶PNGase F孵育糖蛋白可使聚糖被释放到水性溶液中。在其他实施方案中，聚糖或感兴趣的其他碳水化合物已经存在于水性溶液中。在任一实施方案中，包含聚糖或感兴趣的其他碳水化合物的水性溶液存在于第一容器(为了方便起见，在本文中有时将其称为“样品容器”)。将水性溶液从样品容器转移至第二容器，诸如管、筒、多孔板的孔或微流控设备的独立部分(discrete section)。第二容器中可以已经在其内布置有第一多孔固体载体，或者在水性溶液已经转移到第二容器中之后，第一多孔固体载体可被布置在第二容器中。为了便于引用，第二容器有时在本文中称为“第二容器”或“反应容器”。当将水性溶液引入第二容器中时，第二容器可能已经存在有足够量的有机溶剂以使水性样品中的聚糖或其他碳水化合物保留在第一多孔固体载体，或者在将含有聚糖或其他碳水化合物的水性溶液转移到第二容器后，将足够量的有机溶剂引入第二容器中，以使水性样品中的聚糖或其他碳水化合物保留在第一多孔固体载体上。

如所指出的，在一些实施方案中，可在微流体装置中进行对聚糖或感兴趣的碳水化合物的还原或标记。一些微流体装置已经用于通过酶消化从糖蛋白释放聚糖。通常，这种装置中进行酶消化的区域为了方便起见可被称为“第一腔室”，其中这些区域没有设计成具有足够的空间来用于第一固体载体和待引入至水性溶液中的足够量有机溶剂以使水性溶液样品中的聚糖或其他碳水化合物保留在第一多孔固体载体。方便地，该装置可以被设计成使含有被释放聚糖的水性溶液从第一腔室流到微流体装置内的较大的第二腔室中，该较大的第二腔室包含第一固体载体并且还具有足够的空间以引入足够的量的有机溶剂以使聚糖聚集或沉淀或者聚集且沉淀在第一固体载体上。一旦聚糖已经结合到第一固体载体上，则立即使用有机溶剂洗去任何残留的水性溶液以来提供无水条件，以使得能够在第二腔室中对聚糖进行还原或者通过还原胺化对聚糖进行标记。

在一些实施方案中，碳水化合物可以存在于混合物或样品中。例如，实际工作者可能希望通过还原胺化细胞裂解物或经超声处理的组织样品中存在的碳水化合物来进行还原或标记。可以将裂解物或经超声处理的组织放置在具有固体载体的孔、管、筒或其他容器中；或者，在将裂解物或超声处理的组织放置在容器中之后，将固体载体添加到容器中。当添加裂解物或经超声处理的组织时，有机溶剂可以存在于容器中；或者，有机溶剂可以随后添加，以使裂解物或组织中的碳水化合物或者使水性样品中的聚糖或其他碳水化合物保留在第一多孔固体载体上。将有机溶剂和裂解物或经超声处理的组织放入容器中，以使裂解物或经超声处理的组织完全浸没在溶剂中。还应注意的是，不管用于使碳水化合物或水性样品中的聚糖或其他碳水化合物能够保留在第一多孔固体载体上的有机溶剂与水性溶液的比例如何，一旦碳水化合物被保留在固体载体上，便使用有机溶剂洗去任何残留的水性溶液以提供有利于还原碳水化合物或者通过还原胺化标记碳水化合物的无水条件。

降低水性溶液浓度的有机溶剂的体积

如前述章节所述，用于还原聚糖或其他碳水化合物或通过还原胺化对它们进行标记的标准方案依赖于在还原胺化之前对聚糖或碳水化合物的干燥，因为这些过程通常需要无水条件。同样如上所述，通过酶消化从糖蛋白释放的聚糖和裂解物或其他生物样品中的碳水化合物通常存在于水性溶液中，并且通常必须进行干燥步骤以提供用于进行还原或还原胺化所必需的无水条件。

在本发明方法的实施方案中，通过将过量的有机溶剂引入到含有聚糖或其他碳水化合物的水性溶液中而消除了干燥步骤以及因此进行干燥所需的时间。如本文所用，短语“过量的有机溶剂”是指将水性溶液与有机溶剂的比例降低至或低于这样的点的有机溶剂的量：样品中的碳水化合物保留在亲水表面上或使它们聚集或沉淀或者聚集且沉淀，从而可以通过第一多孔固体载体过量聚集或沉淀的聚糖或碳水化合物来将它们保留在第一多孔固体载体上。

在基于本发明的研究中，采用标准的去糖基化方案，其中使糖蛋白在水性溶液中经由酶消化，从而将聚糖释放到该水性溶液中。通常，该方案产生25μl至50μl的水性溶液，其包含完全或部分去糖基化的糖蛋白、去糖基化酶、从糖蛋白释放的聚糖、缓冲盐、还原剂和其他变性剂(与本发明中其他地方使用的一致，该部分在本章节中被称为“起始水性溶液样品”)。然后将大大过量的有机溶剂，675μl的有机溶剂添加到起始水性溶液样品中，从而得到大约19份有机溶剂相对于1份起始水性溶液样品的溶剂/溶液混合物(假设起始水性溶液样品平均为35μl)。然后使多孔玻璃纤维固体载体与溶剂/溶液混合物接触，从而样品中的聚糖能够保留在第一多孔固体载体上。不希望受到理论的束缚，由于有机溶剂的平均浓度超过95％，因此可以认为聚糖会发生沉淀或聚集并通过过滤(尽管亲水相互作用也可能发挥了一定的作用)被保留在玻璃纤维上。然后通过还原胺化对固定在固体载体上的聚糖进行标记，同时保持它们在第一多孔固体载体上的固定，然后从第一多孔固体载体中洗脱下来经标记的聚糖以进行分析。

在这些初始研究中选择95％或更多的有机溶剂与5％或更少的水性溶液的比例来测试在相对于起始水性溶液样品存在大大过量有机溶剂的情况下，碳水化合物在第一多孔固体载体上的保留率；而在进行的其它研究中，使用不同的有机溶剂与水性溶液的比例以及不同的材料(衍生有氨基丙基的二氧化硅颗粒)作为第一多孔固体载体。这些研究表明，在有机溶剂与起始水性溶液样品的比例为1:1的情况下，至少有一些碳水化合物保留在固体载体上；而在有机溶剂与水性溶液的比例更高时，样品中存在的碳水化合物会以更高的比例保留在固体载体上。有机溶剂与水性溶液的比例将引起对具体样品中存在的碳水化合物的更完全或完全捕获，可预期的是，有机溶剂与水性溶液的比例根据使用的具体有机溶剂和用作第一多孔固体载体的具有材料而有所不同。本领域技术人员熟悉用于捕获碳水化合物的固相萃取材料和程序，并且可预期的是，对于碳水化合物的固相萃取程序中有用的溶剂和材料的知识为实际工作者选择在本发明方法的实施方案中有用的合适的溶剂和材料提供所需的指导。

鉴于这些结果，认为70％至100％的有机溶剂浓度可用于使碳水化合物能够保留在固体载体上，其中超过75％的每个百分比浓度依次是更优选的，并且相比75％至79％的浓度，80％或更高的浓度是更优选的。如上所述，可预期的是，使碳水化合物得以保留或保留在在任何具体的固体载体上的有机溶剂与水性溶液的具体最小比例取决于所选择的具体有机溶剂和具体固体载体。可以容易地相对于具体有机溶剂和任何具体材料的固体载体来测试有机溶剂与水性溶液的任何具体比例或者有机溶剂浓度，上述测试例如为：按照实施例中所述的方案进行两组平行测定，其中第一测定中使用的有机溶剂与水性溶液的比例或浓度为19:1(“已知比例”或“已知浓度”)，而第二测定中使用待测试的具体比例或浓度(“测试比例”或“测试浓度”)。如果在使用测试比例或浓度下，分析的经还原或标记的聚糖的量和类型在使用已知比例或浓度下，经还原或标记的聚糖的量和类型的测量结果的可接受范围内，则该测试比例或浓度对于使用被测试的具体固体载体在聚糖的还原和标记中是可以接受的。由于不同的碳水化合物和不同的固体载体可能需要较高比例或浓度的有机溶剂与水性溶液，或也可能在较低比例或浓度下良好地运行，因此可以使用类似的平行测定来确定适用于待标记的碳水化合物和待测试的用于捕获溶液中的碳水化合物的固体载体的任何组合的有机溶剂与水性溶液的比例。如本领域技术人员将理解的，对糖蛋白上连接的聚糖的分析通常需要进行测试以确定，例如如何最佳地对感兴趣的具体糖蛋白进行去糖基化，其中，该感兴趣的具体糖蛋白由于诸如蛋白质的三级结构、去糖基化酶是否能够接触糖基，以及糖蛋白对能够获得聚糖的变性的抗性如何在内的多种因素而可能多少地对去糖基化具有抗性。因此，上述对量和类型的测试在本领域中被认为是常规的。

尽管上文中的讨论集中于确定与水性溶液的量相比有机溶剂的较低比例，但是还可预期的是，有机溶剂与水性溶液的比例高于19:1，诸如20:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1和29:1、30:1至39:1或40:1至49:1的混合物也是有用的。然而，高于约25:1的比例增加了所用试剂的量和成本，以及增加了混合试剂所需的容器的尺寸，而不必然增加碳水化合物在固体载体上的保留。进一步地，更高的比例可以将碳水化合物稀释到需要更长的孵育时间方能使它们与固体载体接触并保留在固体载体上的程度。因此，有机溶剂与水性溶液的比例高于49:1是较不优选的。认为，优选使用的有机溶剂与水性溶液的比例足以使起始水性溶液样品中的聚糖或其他碳水化合物保留在固体载体上，然后用有机溶剂清洗固体载体以除去任何残留的水性溶液，从而能够进行还原或还原胺化。

容纳固体载体的容器

如上所述，在典型的实施方案中，待还原或待通过还原胺化来标记的聚糖或其他碳水化合物最初处于水性溶液中，然后通过水性溶液添加到较大量的有机溶剂中来稀释(或者相反地，通过向含聚糖或其他碳水化合物的水性溶液中添加大量有机溶剂来对该水性溶液进行稀释)。方便地，将所得的含有待还原或标记的聚糖或其他碳水化合物的有机溶剂/水性溶液置于为此目的而设计的第二容器中。在典型的实施方案中，容器具有一段长度的主体以及两个端部。在一些实施方案中，两个端部沿容器主体的长度彼此相对设置。这两个端部各自独立地打开或能够独立地打开以使得能够在第一端部引入溶液和试剂，在第二端部排出溶液和试剂。在一些实施方案中，容器是柱形的。在一些实施方案中，容器是柱形的，但是在第二端部变窄形成管口，以在洗脱时促进对被洗脱的经标记的碳水化合物的捕获，以用于分析。在一些实施方案中，容器可以是Eppendorf管、微量离心管或离心管。通常，这样的管具有：第一区段，其具有开口或者能够打开的第一开口端；柱形主体，其与和第一端部相对的第二区段相连接，该第二区段具有锥形形状，其随着远离柱形第一部分而变窄，直到到达第二端部。第二端部可以打开，但是在一些实施方案中是能够闭合的，从而当底端关闭时使得容器中的溶液能够在容器中孵育，而当第二端部打开时使得溶液能够从容器中流出。例如，底端可以装配有盖或可移除的覆盖物，以使得使用者或自动装置能够打开底端并使得容器中的溶液流出。在其他实施方案中，容器可通常为柱形、锥形、四面体或立方形的形状。容器可以被成形为被容纳在被设计为容纳它们的设备中，在这种情况下，它们可以被称为“筒(cartidge)”。

在一些实施方案中，第二容器是多孔板中的孔，并且在优选的实施方案中，多孔板的每个孔是适于捕获和保留如上所述的碳水化合物(诸如聚糖)的容器。这样的孔通常具有到底部段变窄的柱形主体，该底部段包括开口以使得溶液能够离开孔。位于孔的底部处的出口优选具有比孔窄的直径，并且尤其是在需要使用自动收集样品的系统中的板的情况下，可以是从孔的底部突出的尖嘴。

无论第二容器是管、筒或者孔，它都具有设置在容器的顶部和出口之间的第一多孔固体载体。在一些实施方案中，第二容器进一步具有设置在第一多孔固体载体和出口之间的第二多孔固体载体。在一些优选的实施方案中，第一多孔固体载体是膜或整料的形式。在优选的实施方案中，第一多孔固体载体刚刚被设置在容器底部的上方。在具有尖嘴的孔中，第一多孔固体载体优选刚刚设置在尖嘴上方。在另一个优选的实施方案中，第二多孔固体载体是设置在第一多孔固体载体和出口之间的亲水性材料。在第二多孔固体载体例如由珠，诸如裸二氧化硅珠或衍生的二氧化硅珠组成的实施方案中，其中，珠的直径可以小于容器的出口的直径，通过常规方法可以将珠或其他第二多孔固体载体保持在适当的位置(诸如通过使用一个或更多个多孔压缩玻璃块，或通过在珠或其他第二多孔固体载体(内部的交叉构件)下方具有塑料保持器)将其固定在适当的位置。

用于保留碳水化合物的固相萃取(SPE)筒和包括亲水性聚合物用于保留碳水化合物的其它装置通常具有用于将聚合物保留在装置内的构件。通常选择这些构件以使其与预期将要暴露于其中的碳水化合物或试剂不发生反应，并允许诸如清洗液之类的流体通过预定的出口(诸如尖嘴)离开设备。这些常规手段中的任何一种都可以用于或适于将第一或第二多孔固体载体保持在本发明的装置中。

反应容器本身由与在其中使用的试剂和溶液无反应性的材料制成。通常，反应容器是塑料的。用于碳水化合物的SPE的筒和容器在本领域中是众所周知的，并且可以从许多供应商处获得。用于从其他类型的化合物(诸如蛋白质)中分离碳水化合物的SPE筒的塑料或其他材料，适用于本发明的方法和装置。

无论形状如何，容器都包括腔室，该腔室包含第一多孔固体载体，并且在使用APTS或其他不易溶于有机溶剂的标记物的实施方案中，第二多孔亲水性固体载体沿着制造商希望试剂从其进入容器直至其出口通过试剂的路径设置在第一固体多孔载体的下游。第一和第二多孔固体载体在下面进一步描述。

在一些实施方案中，反应容器被设计成使得在方法中使用的溶液垂直地行进通过容器，从而使得重力帮助溶液移动通过第一多孔固体载体，并且在具有第二多孔固体载体的实施方案中，也通过该载体。在一些实施方案中，容器被设计成使得溶液在压力下使试剂移动通过容器。例如，该方法通过以下方式可用在具有腔室的微流体管或通道中：通过将第一固体载体设置在该管或通道的部分腔室中(从而用作反应容器)，并且将第二多孔固体载体置于相同的部分腔室内或与反应室水平或垂直放置的另一段管或通道的部分腔室中，其中溶液通过管或通道中的压力梯度从反应室流向第二固体载体。在其中第二多孔固体载体在管或通道的第二段的实施方案中，其内设置反应室的腔室与其中布置有第二多孔固体载的管或通道的腔室流体连接；在其他情况下，两个腔室可以通过阀或其他构件隔开，其中该阀或其他构件使两个腔室在需要时流体连接。

第一多孔固体载体和第二多孔固体载体以及孔隙尺寸

本发明的方法使用第一多孔固体载体来捕获和保留存在于溶液中的碳水化合物，其中该溶液为纯有机溶剂或高有机溶剂与水性溶液比例的混合物。在一些实施方案中，本发明的方法进一步使用能够在较低有机溶剂与水性溶液的比例的溶液存在下捕获并保留从第一固体载体释放的经标记的碳水化合物的第二多孔固体载体。

术语“固体载体”是指载体具有固体表面，但是固体载体不必制成其的材料的单块来制成。“固体载体”可以例如由多种衍生化的二氧化硅珠组成，这些二氧化硅珠在组合在一起并布置遍及第二容器设置时提供在其上能够保留聚糖或其他碳水化合物的该亲水性表面。如果固体载体由珠或类似的材料颗粒制成，则可以将珠压紧或保持在例如塑料保持器中，以使珠在第二容器保持在期望的位置。在这样的实施方案中，塑料保持器可以由塑料环组成，该塑料环的尺寸设置成恰好适合于第二容器的腔室，并附接到从该环伸出的塑料交叉件，就像网球拍一样，其中伸出的交叉塑料件之间具有比珠的直径小的洞，从而将珠保持在适当的位置，同时使得液体能够流过。类似地，固体载体可以由玻璃纤维制成，该玻璃纤维可以彼此叠置设置以提供聚糖或其他碳水化合物可以保留在其上的表面。如果需要的话，玻璃纤维可以通过如上所述的塑料保持器保持在适当的位置。在不使用第二多孔固体载体的实施方案中，可以将珠、玻璃纤维或固体载体不是单一结构的其他实例包装到第二容器底部的床中。可以通过例如将容器的壁变窄以使得直径小于珠或颗粒直径来保留珠和其他颗粒，或者通过将合适的带有伸出的交叉件的保持器，该交叉件的孔隙或开口对于珠或颗粒而言太小而不能通过。

在一些实施方案中，亲水性材料被成形为刚性且多孔的膜或整料。然后膜或整料可被成形为精确地适合第二容器的腔室并在所需位置填充腔室的横截面的形状。

无论第一多孔固体载体是珠、颗粒、膜还是整料，它都遍及容器腔室的整个横截面定位在容器中的所需位置，使得容器中的溶液或溶剂在离开之前必须先通过第一多孔固体载体。如果第二容器从柱形部分至锥形部分变窄(例如在典型的Eppendorf管)，则珠、颗粒、膜或整料的大小可设置为完全覆盖柱形部分的底部的区域，并且通过在容器壁的下方变窄以形成锥形部分而将其保持在适当位置。类似地，如果第二容器是多孔板中孔的柱形部分，并且该孔在底部具有带有开口的尖嘴，使得溶液能够在需要时离开该孔，那么可以对珠、颗粒、膜或整料的尺寸设为完全覆盖孔的柱形部分的底部区域并通过使孔的壁变窄通过使使孔的壁变窄至膜或整料以下而形成尖嘴部分，从而将其保持在适当位置。

在亲水性材料用于第一多孔固体载体并且聚糖或碳水化合物不是单糖或非常小的实施方案中，孔隙或开口的尺寸可以大于下面讨论的实施方案，只要孔隙或开口能够在有机溶剂/起始水性溶液样品流过第一多孔固体载体时，迫使聚糖或其他碳水化合物与亲水性材料接触即可。当有机溶剂中有机溶剂的浓度为80％或更多且水性溶液为20％或更少时，聚糖或其他碳水化合物将倾向于与固体载体的亲水性材料相互作用并保留在其上。

如本文所用，在描述固体载体时使用的术语“多孔”和“可渗透的”旨在表示固体载体使得在溶剂和溶液通过该固体载体逐渐被过滤。除非上下文另外指定或要求，否则本发明中描述的所有固体载体均为多孔固体载体。应当注意的是，在一些实施方案中，多孔固体载体可以通过例如匹配件、容器壁的变窄或放置它们的容器的内部结构而搁置或保持在适当位置。这样的匹配件、变窄部或内部结构是固体的，并且可以保持或支撑第一和第二多孔固体载体，但是它们通常由与反应容器相同的材料制成，并且不应因在上述公开中使用了这些术语而将其视为第一或第二多孔固体载体。

第一多孔固体载体的材料

如介绍部分中所述，当将有机溶剂添加到起始水性溶液样品中使其中的有机溶剂浓度为80％至95％时，除单糖和其他仅具有弱亲水性的碳水化合物外，大多数聚糖和其他碳水化合物将保留在固体亲水性表面上。因此，在许多实施方案中，第一多孔固体载体可以是与要使用的试剂不发生化学反应的任何亲水性材料，其呈现固体表面并且可以被做成使得液体能够透过其渗透。当前在筒和柱中使用多种材料以在SPE过程中保留碳水化合物，并且可以在本发明方法的实施方案中使用。例如，固体载体可以由纤维素；玻璃(诸如玻璃纤维)；氧化铝；包含二醇、氨基丙基、酰胺、氰基丙基、乙二胺-N-丙基的官能化表面；或已知能够保留有机溶剂的碳水化合物的多孔亲水性材料制成。在一些实施方案中，固体载体由二氧化硅珠制成，并且在一些实施方案中，二氧化硅珠衍生化有氨基丙基、二醇或氨基甲酰基。第一多孔固体载体优选在表面上不具有可用的羧基。如本文所用，术语“官能化的”和“衍生化的”是等同的，并且是指形成固体载体主体的材料的表面共价键合至被列出的官能团之一(例如，氨基丙基、二醇、氨基甲酰基)的分子上，或者在一些实施方案中，键合至两种或更多种这些官能团的分子上(例如，二醇分子和氨基甲酰基分子都共价连接至第一多孔固体载体的材料表面)。在一些优选的实施方案中，该材料是二氧化硅。当在使得能够相互作用的条件(诸如温度和pH)下与碳水化合物接触时，官能团的分子可与碳水化合物产生非共价相互作用。碳水化合物与其他极性且亲水性分子的固相萃取已经在本领域中进行了多年，并且进行SPE的条件通常适合用于实施本发明方法的实施方案。可预期的是，技术人员熟悉进行SPE的条件。

在一些实施方案中，有机溶剂将以高于95％的浓度存在。这些实施方案允许捕获单糖或仅具有弱亲水性并且当水以高于5％的浓度存在时不能在有机溶剂中良好沉淀的其他聚糖或碳水化合物。或者，实际工作者可能希望捕获和分析样品中存在的较大的聚糖或碳水化合物，这些较大的聚糖或碳水化合物可能被上述亲水性材料捕获，并且他们也希望捕获在使用95％或更低浓度的有机溶剂时无法保留在固体载体上的单糖。对于这些实施方案，较大范围的材料可用于第一多孔固体载体，包括在前段中命名的材料和其它不具有亲水性的材料，因为预期的是，聚糖或其他碳水化合物将从溶液中析出并且聚集或沉淀或这聚集且沉淀，从而使得它们能够通过物理过滤，而不是依靠聚糖或其他碳水化合物与固体载体材料之间的亲水相互作用来被捕获在第一多孔固体载体上。因此，在这些实施方案中，第一多孔固体载体可以是具有以下特点的任何材料：(a)固体，(b)不与要使用的试剂反应，(b)能够成形为停留在第二容器内并填充容器腔室的横截面，以便溶液或溶剂必须通过材料中的孔隙或开口过滤，并且(d)可以有10微米至0.05微米的孔隙或其他开口或者(d')可以以珠或其他颗粒的形式生产，而珠或颗粒可以包装到床或保持器中并具有在该尺寸范围内的孔隙或开口。因此，可以使用上文所述的亲水性材料，但是例如也可以使用具有适当孔隙尺寸的陶瓷过滤器。通过在测试有机溶剂和用于固体载体的材料的组合部分中所教导的测定法能够测试任何具体的材料对于实施这些实施方案的适用性。

在使用聚乙烯(“PE”)作为第一多孔固体载体的基于本发明的研究中，证实了如果第一多孔固体载体的孔径为10微米或更小，则能够有效地捕获聚糖。在使用孔径约为0.7微米的玻璃纤维的基于本发明的研究中，发现其运行良好。可以预期的是，只要孔隙不是那么小，以至于溶剂和溶液过慢地过滤从而过分地减慢了操作速度，甚至阻止了溶剂或溶液从容器中流出，便可以使用较小的孔隙尺寸。可以容易地测试任何具体的孔隙或开口尺寸，以确定溶剂和不需要的试剂是否在实际工作者认为合理的时间内分别过滤通过第一或第二多孔固体载体。技术人员将进一步知晓的是，固体载体应具有大量的孔隙或开口以促进溶剂和不需要的试剂流过固体载体，因为仅具有几个孔隙或开口将减慢其通过固体载体的速度而不提供分离并将聚糖或其他碳水化合物固定在固体载体方面的任何好处。由于用于分离碳水化合物的SPE筒已经可用了多年，因此可预期的是，技术人员可以使用这种筒的孔径和组成作为指导，以确定在本发明的方法和装置中用作多孔固体载体的合适的材料和孔径。

在一些特别优选的实施方案中，用于第一多孔固体载体的材料是PE，这是因为它便宜且可以以合适的厚度生产并具有合适大小的孔，并且可以容易地成形为保留在容器、筒、孔或柱内，并填充容器腔室的横截面的形状。在优选的实施方案中，PE的孔径为10微米至0.25微米。在优选的实施方案中，PE可以具有10、9、8、7、6、5、4、3或2微米，1微米或0.5微米，或在该范围内的任何尺寸的孔隙或开口。在一些优选的实施方案中，PE是整料。在一些实施方案中，PE是膜。

对于分析用途，所用溶液的总体积通常为1mL。对于制备规模的用途，所用溶液的体积可能为1升或更多，并且材料的厚度可能是相当大的。第一多孔固体载体优选具有多个孔隙，这些孔隙足够小以防止聚集的或沉淀的聚糖或其他碳水化合物通过，但是还应足够大以使得液体和溶解的试剂能够通过(在前面的部分中讨论了合适的孔径)。技术人员应该能够选择适合于第一多孔固体载体的材料。

最初认为，聚糖或其他碳水化合物在有机溶剂或高比例的有机溶剂与水性溶液的混合物的存在下结合至第一固体载体，而水性溶液中，碳水化合物被提供至第一固体载体。不希望受理论所束缚，现在认为，在使用亲水性材料作为第一多孔固体载体且有机溶剂浓度为80％至95％的实施方案中，聚糖或其他碳水化合物通过亲水作用被保留在载体上；而在有机溶剂浓度较高时，聚糖或其他碳水化合物会从溶液中析出并发生聚集或沉淀。进一步认为，这些聚集体或沉淀物中的一者或两者主要是由于过滤而被收集在第一多孔固体载体上。然而，取决于多孔固体载体的化学性质，在溶剂/溶液混合物的存在下，碳水化合物与第一多孔固体载体之间的其他相互作用也可能起作用。例如，在pH、温度和盐浓度下可能存在离子相互作用或氢键的条件下，将溶剂/溶液混合物提供至第一固体载体，并且在本发明方法的后续步骤期间固体载体和碳水化合物将进一步经受该相互作用。无论作用机理如何，结果都是在有机溶剂或高比例的有机溶剂与水性溶液的混合物下，大部分或全部聚糖或其他碳水化合物非共价地保留在第一多孔固体载体上，而不是当在该溶剂或高比例的有机溶剂与水性溶液的混合物下通过该第一多孔固体载体。不希望受理论的束缚，认为按照工作流程1A的实施方案在步骤3中通过过滤使碳水化合物保留在第一多孔固体载体上，并且在步骤6的清洗过程中通过过滤将其保留，按照工作流程1B的实施方案在步骤3中通过过滤使碳水化合物保留在第一多孔固体载体并在步骤6的清洗过程中通过亲水相互作用将其捕获并保留在第二多孔固体载体上，而按照工作流程1C的实施方案在步骤3中通过亲水相互作用使碳水化合物保留在第一多孔固体载体上并在步骤6的清洗过程中通过亲水相互作用保留它们。

最初认为石墨化碳适合用作本发明方法和试剂盒中的第一固体载体。然而，出于多种原因，石墨化碳不适合于第一多孔固体载体。首先，如上所述，第一多孔固体载体不应是使聚糖或其他碳水化合物保留在有机溶剂或主要由有机溶剂组成的溶剂混合物中的载体。当碳水化合物处于含有高比例的有机溶剂与水性溶液的溶液中时，石墨化碳将不会保留聚糖或其他碳水化合物。其次，本发明方法的一些实施方案采用的聚糖或其他碳水化合物处于还包含无糖基化蛋白质的溶液，其中具有通过酶促消化被释放的聚糖或其他碳水化合物并且还可以包含去糖基化酶(其也是一种蛋白质)。据认为，石墨化的碳将保留溶液中存在的无糖基化蛋白质和酶，并且所保留的蛋白质将阻塞固体载体的孔隙。因此，石墨化碳不能用于第一或第二多孔固体载体。

在一些实施方案中，第一多孔固体载体由玻璃制成。优选地，玻璃是具有高表面积的形式以促进对溶剂/溶液混合物中的碳水化合物的保留，并且优选地该玻璃为可以使混合物流过以促进这种捕获的形式。例如，玻璃可以具有使流体流过以对其进行过滤的多个小孔隙，或者为珠或颗粒的形式。在一些优选的实施方案中，玻璃为玻璃纤维的形式。在一些实施方案中，玻璃纤维可以是疏松的。在一些实施方案中，玻璃纤维可以是被编织的。在玻璃纤维是疏松的实施方案中，其通常与下层结构性载体结合使用，其中该下层结构性载体将纤维保持在容器中，同时使溶剂、溶液和不需要的试剂流过。在这些实施方案中，结构性载体设置在玻璃纤维与通过其使溶剂、溶液和不需要的组分离开容器的开口之间。

在一些实施方案中，第一多孔固体载体由氨基丙基的形式制成。用于分离碳水化合物的多种形式的氨基丙基是本领域所已知的，并且若干种是可商购的。例如，用于分离碳水化合物的氨基丙基AP(NH2)HPLC柱可购自于Separation Methods Technologies,Inc.(Newark，DE)。APHERA^TMNH2 HPLC柱由Sigma-Aldrich Co.(密苏里州圣路易斯)出售。本领域中使用氨基丙基硅烷来用于糖的HILIC分离。可以预期的是，本领域技术人员熟悉在诸如HPLC和HILIC的过程中使用氨基丙基来分离碳水化合物的各种方式，并且可以在本发明使用氨基丙基的方法的实施方案中选择合适形式的氨基丙基来结合碳水化合物，诸如N-聚糖。

在一些实施方案中，第一多孔固体载体由纤维素制成。纤维素以片状物使用，但通常在固相萃取中以微晶粉末的形式使用，该形式由于为结合碳水化合物提供了更大的表面积而是优选的。如实际工作者将理解的，粉末、纳米颗粒或其他小颗粒形式使用的固相载体通常与在洗脱时允许溶剂、溶液和不需要的试剂流过而粉末或纳米颗粒或其他小颗粒则保留在容器中的过滤器或其他结构结合使用。在这些实施方案中，过滤器或其他结构设置在粉末、纳米颗粒或其他小颗粒与通过其使溶剂、溶液和不需要的组分离开容器的开口之间。

在一些实施方案中，第一固体载体可以是多孔亲水性材料，其优先于在待分离碳水化合物的具体混合物中已知存在的蛋白质、缓冲盐、还原剂或其他试剂来保留碳水化合物。

用于第二固体载体的材料

如上所述，当第一多孔固体载体上的碳水化合物被不良溶于有机溶剂的还原剂还原，或者被APTS或其他不良溶于有机溶剂的标记物通过还原胺化标记时，则需要使用混合有一些水的有机溶剂的溶液来除去还原剂或过量的标记物，其中水的浓度会使得经还原或标记的碳水化合物从第一多孔固体载体上脱离。这种清洗液通常是60％至90％有机溶剂且40％至10％水性溶液，优选约75％至85％有机溶剂且25％至15％的水性溶液是优选的，并且80％至85％有机溶剂且20％至15％水性溶液是优选的(当然，实际工作者选择的任何具体百分比的有机溶剂将与使混合物达到总计100％所需的水性溶液的百分比相匹配)。在这些情况下，所使用的第二多孔固体载体使得在这种溶液存在下能够捕获并保留经标记的碳水化合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的具有第一多孔固体载体和第二多孔固体载体的容器，其中第二多孔固体沿着溶液流动路径布置在第一多孔固体载体和通过其还原剂或标记物离开容器的开口之间。

顾名思义，第二多孔固体载体是多孔的，并且优选地是亲水性材料，诸如通常用于碳水化合物的HILIC分离或用于碳水化合物的固相萃取(SPE)的树脂。预期的是，用于碳水化合物的HILIC分离和碳水化合物的SPE萃取中的材料通常适用于第二多孔固体载体。SPE在本领域中广泛使用，并且存在许多关于其的相关教导，例如Thurman and Mills,SOLID-PHASE EXTRACTION:PRINCIPLES AND PRACTICE,John Wiley&Sons Inc.(New York,NY,1998)，N.Simpson,Solid-Phase Extraction:Principles,Techniques,andApplications,Marcel Dekker Inc.(New York,NY,2000)，以及Waters Corp.,BEGINNER'SGUIDE TO SPE:SOLID-PHASE EXTRACTION,John Wiley&Sons Inc.(New York,NY,2014)。因此，可预期的是，技术人员能够容易地选择适合于作为第二多孔固体载体的材料。

适用于第二多孔固体载体的多孔亲水性材料的实例包括：纤维素；玻璃；氧化铝；氨基丙基；或经二醇、氰基丙基、乙二胺-N-丙基、酰胺(氨基甲酰基)、天冬酰胺、环糊精、三唑、二乙基氨基乙基改性的二氧化硅；或这些材料中两种或更多种的组合。

在一些优选的实施方案中，第二多孔固体载体是与氨基甲酰基共价键合的二氧化硅珠或颗粒。在一些特别优选的实施方案中，共价键合有氨基甲酰基的球状二氧化硅珠或颗粒是Amide-80。在优选的实施方案中，Amide-80珠或颗粒的尺寸为3微米至60微米，更优选为5微米至50微米，更优选为约30微米，其中“约”意味着±2微米。第二多孔固体载体在前段中所述的有机溶剂/水清洗液的存在下，捕获从第一多孔固体载体中脱离的任何经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物。

进一步预期的是，用于第二多孔固体载体的材料在用诸如磷酸盐缓冲盐水的水性溶液清洗时，将释放被保留的经还原或标记的碳水化合物(为清楚起见，应注意的是，在此步骤用于从第二多孔固体载体中洗脱经还原或标记的碳水化合物的水性溶液，与用于从第一多孔固体载体中洗去过量还原剂或过量标记物的有机溶剂/水性溶液的混合物不同，因为它不包含约80％有机溶剂浓度的清洗液)。通常，该步骤所用的清洗液中不存在有机溶剂。

第一固体载体和第二固体载体的材料配置

如上所述，第一固体载体和第二固体载体是多孔的，以能够通过该载体来过滤溶液，从而使得溶液中的碳水化合物能够被捕获和保留。所选择的用于第一多孔固体载体和第二多孔固体载体的材料要么为诸如被编织为允许溶剂/溶液接触的具有大表面积配置，要么是具有多个孔隙或开口以实现相同功能的配置。优选地，固体载体都不是磁珠的形式。由于本发明的方法考虑到将第一固体载体和第二固体载体设置在第二容器内的固定位置并且不移动或不需要移动，因此使用磁珠会增加成本而不能带来优点。因此，在本发明的方法或装置中并不优选使用它们。

在一些实施方案中，第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者为膜。在一些实施方案中，第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者为整料。在一些实施方案中，第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者可以呈树脂、颗粒或粉末的形式。在这些实施方案中，树脂、颗粒或粉末通常将通过结构性载体被保持在第二容器中以防止树脂、颗粒或粉末随着流过它们的溶液和溶剂而离开第二容器。在一些实施方案中，第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者为填充床的形式，其通过容器的设计或其他结构性载体被保持在容器中。在优选的实施方案中，第一多孔固体载体或第二多孔固体载体既是多孔的又是刚性的。在一些实施方案中，第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者可设置在微流体通道中。在其中第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者未处于容器中恰当位置的实施方案中，容器可进一步具有使第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者保持在容器内的所需位置的结构或插件。例如，容器可以形成有内部部件，该内部部件在容器的整个宽度上延伸且具有孔隙或其他开口，这些孔隙或其他开口的尺寸设置成不允许第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者的材料移动出预期的位置，但是足够大以允许溶剂、溶液和试剂流动。或者，容器可包括设置在第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者之间的一个或多个结构(诸如封装件)，以使第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者保持在预期的位置。该结构或封装件(frit)自身被成形且尺寸设置为匹配容器的侧面的环形圈或其他结构布置，并且该环形圈或其他结构可以例如在尺寸和形状上设置成与容器内部的凸缘配合。在一些实施方案中，可将环或其他结构固定至容器内部的凸缘或结构，以将环形圈或其他结构(以及连接至环或其他结构的过滤器)保持在所需位置。环或其他结构的尺寸例如可以设置为匹配例如围绕容器内部的匹配槽或凹口，或者可以具有从环或其他结构伸出的刺状物或其他突起部以匹配设置在内部的匹配槽。在一些实施方案中，环或其他结构可以通过扣合的方式固定到容器。例如，环或其他结构可以具有多个突起部，这些突起部与容器壁上的匹配凹口相扣合。或者，可以将环或其他结构放入容器中，然后通过粘合剂或超声波焊接将其固定在壁上的所需位置。

溶液流过第一多孔固体载体和(如果适用)还流过第二多孔固体载体

预期的是，在溶剂/溶液混合物(其进一步包括不需要的试剂，诸如缓冲盐、去糖基化酶、去糖基化糖蛋白等)流经固体载体时，碳水化合物被保留在第一多孔固体载体上。然后，用有机溶剂(与在水性溶液的混合物中使用的有机溶剂相同或不同)清洗第一固体载体上的碳水化合物，以除去任何残留的水性溶液，并进行还原胺化。技术人员将理解的是，碳水化合物可以在几秒钟内保留在第一固体载体上，但是不希望的是，碳水化合物太快速地流过第一固体载体(例如，少于1秒)以至于没有时间发生保留，也不能太慢(例如，超过15分钟)以至于在方案中增加了不必要的时间。因此，通过容器的流速应足够慢，以使碳水化合物有机会保留在固体载体上，但应足够快以避免延迟而导致给工作流程增加不必要的时间。技术人员将熟知对诸如在固相萃取方案的筒中所用的材料，孔径和会引起所需的流速的其它特性，以及各种条件的使用，诸如正压、离心，或真空歧管的使用的选择，以增加液体流过或穿过固体载体的流速。预期的是，实际工作者将熟知通过选择萃取中所用的材料、孔径和流速来对用固相萃取程序从样品中萃取碳水化合物，并且这种熟悉程度在本发明方法的各种实施方案中可为关于在溶剂/溶液混合物流过固体载体中，选择第一固体载体的材料、孔径和流速提供充分的指导。在存在第二多孔固体载体的实施方案中，可以使用类似的考虑来确定第二多孔固体载体中的孔隙或开口的合适尺寸。

标记物

如背景技术中所描述，在1998年公布的共有的美国专利No.5,747,347中公开了用2-AB的还原胺化和标记。自347专利公布以来，这20年间还原胺化已广泛用于标记聚糖和其他碳水化合物，并且假定实际工作者熟知通过还原胺化来标记碳水化合物的过程和条件。

总体来说，在本发明的方法中，适用于通过还原胺化来标记碳水化合物的任何标记物或染料都可以用于标记聚糖或其他碳水化合物。方便地，标记物是荧光团，诸如2-AA(邻氨基苯甲酸)或2-AB(2-氨基苯甲酰胺)。在一些优选的实施方案中，标记物是2-AB。在一些优选的实施方案中，标记物是2-AA。在一些优选的实施方案中，标记物是APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸，CAS No.196504-57-1)。在一些优选的实施方案中，标记物是普鲁卡因酰胺盐酸盐(CAS No.614-39-1)。在一些实施方案中，标记物包含会通过还原胺化与碳水化合物的还原端反应的伯胺基团以及具有荧光性质、发色部分或可检测电荷。在一些实施方案中，标记物是具有可检测电荷的化学部分。

还原剂

当希望对聚糖或其他碳水化合物进行还原而不标记，以及通过还原胺化对聚糖或其它碳水化合物进行标记的实施方案中，使用还原剂。还原剂在还原聚糖或其他碳水化合物中以及在还原胺化中的用途在本领域中是众所周知的且因此在本文中仅做简要描述。适用于聚糖的还原胺化的还原剂包括氰基硼氢化钠和甲基吡啶硼烷。还原剂通常在有机溶剂，诸如DMSO中。有时用作还原剂的有机溶剂的四氢呋喃(THF)与塑料不相容，因此四氢呋喃在反应容器或反应容器中使用的任何组件(诸如用于将第二多孔固体载体保持在适当位置的内部载体)由塑料制成的实施方案不能作为还原剂的有机溶剂。通常将包含溶剂和还原剂的溶液添加到包含标记物的溶液中。最终混合物中还原剂的浓度通常为0.5M至2M。

还原但不标记聚糖或其他碳水化合物

在没有标记物的情况下，前段所述的还原剂和浓度可用于还原聚糖或其他碳水化合物。根据本发明的常规进行聚糖或其他碳水化合物的还原，并且预期的是，实际工作者熟知适当的溶剂和浓度。上一章节讨论了适当的还原剂和浓度。一旦聚糖或其他碳水化合物已经被还原，则就可以通过下一章节所述的方法清洗载体，从第一多孔固体载体(或者在使用第二多孔固体载体的实施方案中，从第二多孔固体载体)中将它们洗脱下来。

从第一多孔固体载体洗脱被保留的碳水化合物

一旦从保留在第一多孔固体载体上的经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物中除去了任何过量的还原剂或过量标记物，便可以通过用水性溶液清洗载体以从第一多孔固体载体中洗脱被保留的经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物，其中水性溶液使聚集或沉淀的聚糖或其他碳水化合物重新溶解。优选已添加有盐的水性溶液。也可以使用溶液的组合。水性溶液可包含至多20％的有机溶剂或仅是水或缓冲溶液。如上所述，通过进行平行测定法能够容易地测试任何具体溶液或组合在从由任何具体材料制成的固体载体中洗脱碳水化合物中的适用性。

从第二多孔固体载体中洗脱碳水化合物

如前一章节所述，如果选择的第一多孔固体载体是非亲水性的，并且聚糖或其他碳水化合物已被不良溶于有机溶剂的还原剂还原，或已被APTS或被不良溶于有机溶剂的另一染料标记，则聚糖或其他碳水化合物将从第一多孔固体载体上脱离进入用于除去过量还原剂或标记物的有机溶剂/水性溶液清洗液中。从第一多孔固体载体上脱离的聚糖或其他碳水化合物将被亲水性第二多孔固体载体捕获。一旦从反应容器中洗去了过量的还原剂或过量的标记物，就可以使用前一章节所述的一种或更多种水性溶液从第二多孔固体载体上洗脱经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物。

试剂盒

在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，用于将聚糖或其他碳水化合物固定在第一多孔固体载体上，并且在使聚糖或其他碳水化合物保持在第一多孔固体载体上的固定时对它们进行还原或通过还原胺化来进行标记。在一些实施方案中，试剂盒提供容器，该容器依次包含：用于引入溶液的第一开口；用于接收混合物的第一区段，该混合物包含聚糖或感兴趣的碳水化合物；第一多孔固体载体；第二区段，在该第二区段中设置有亲水性第二多孔固体载体；以及第二开口，通过第二开口，溶液可离开容器。

方便地，第一开口和第一多孔固体载体之间的第一区段的尺寸被设置为接收在预期的分析或制备规模的还原或标记程序中使用的有机溶剂和起始水性溶液样品的混合物的体积。在优选的实施方案中，第一多孔固体载体是非亲水性的。在这些实施方案的一些方案中，非亲水性第一多孔固体载体由聚乙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯或聚丙烯制成。在优选的实施方案中，第一多孔固体载体具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口，从而使得有机溶剂和起始水性溶液样品的混合物能够通过第一多孔固体载体来过滤。在一些优选的实施方案中，第一多孔固体载体是遍及并填充容器的横截面布置的整料或膜，使得流入容器的第一区段的混合物必须过滤通过第一多孔固体载体。在其他实施方案中，它可以不是由单个固体块组成，而是由诸如纤维，珠或颗粒之类的块状物集合组成。由诸如玻璃纤维或二氧化硅珠的块状物集合组成的第一多孔固体载体可以通过标准手段保持在容器中的所需位置，诸如将这些块状物布置在保持器，诸如塑料插件上，或者布置在其中交叉件的尺寸小于该块状物的尺寸的容器内部交叉件上。

在一些实施方案中，容器是筒或管。在一些实施方案中，特别是对于自动化分析，容器是多孔板中的孔。孔的底部处的出口可以是尖嘴，或者孔的底部可以变窄以利于将溶液从孔中洗脱出来并进入所需的容器中。为了清楚起见，应注意，试剂盒中提供的容器用作本发明方法中所述的“反应容器”，因为包含将要被还原或标记的聚糖或其他碳水化合物的样品通常在使用试剂盒前与有机溶剂在单独的容器中混合。

如所指出的，本发明的试剂盒中的容器进一步包含设置在第一多孔固体载体和第二开口之间的亲水性第二多孔固体载体。与第一多孔固体载体一样，第二多孔固体载体遍及并填充容器第二区段的横截面设置，使得从第一多孔固体载体脱离的含有聚糖或其他碳水化合物的流体必须接触该第二多孔载体并通过该第二多孔固体载体过滤。在一些实施方案中，第二多孔固体载体是整料或膜。在其他实施方案中，第二多孔固体载体不是由单个固体块组成，而是由诸如纤维、珠或颗粒的块状物的集合组成。第二多孔固体载体通过布置在保持器、膜或过滤器上来防止其向第二开口移动。在一些实施方案中，第一多孔固体载体和第二多孔固体载体均具有保持器、膜或过滤器以使在容器内将它们保持在各自的位置。在一些第二多孔固体载体由珠或颗粒组成的实施方案中，容器的壁随着其靠近第二开口时而变窄(例如，在孔的底部形成尖嘴)至使其尺寸小于珠或颗粒的直径，防止珠或颗粒通过第二开口离开容器。也可以使用本领域中已知的用于将珠或其他材料保持在SPE筒或其他分离装置内的其他手段。保持第一多孔固体载体或第二多孔固体载体之一或两者的具体方法的选择不是关键的，只要它允许溶液在需要时离开容器并且在使用过程中不与预期的试剂反应即可。第一开口或第二开口之一或两者均可具有可移除的盖。

试剂盒可包含一种或多种去糖基化酶，一种或多种变性剂(诸如十二烷基硫酸钠)，并且优选地包含一种或更多种用于还原胺化的标记物。标记物可以是例如2-AA、2-AB、APTS、普鲁卡因酰胺盐酸盐或这些中的两种或更多种。该试剂盒可以包含还原剂，该还原剂可以是粉末形式或可以溶解在有机溶剂中。还原剂可以是例如氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷。该试剂盒可能进一步包含印刷的说明书，其有关如何将聚糖或其他碳水化合物固定在第一多孔固体载体上；并且如何还原它们或通过还原胺化对其进行标记，同时仍将其固定在容器中的第一多孔固体载体上；以及根据程序中使用的还原剂或标记物，如何从容器中洗脱该经还原或标记的聚糖或其他碳水化合物。

实施例

实施例1

该实施例列出了在以下实施例中描述的去糖基化和标记过程的示例性工作流程中使用的一些试剂的缩写。

“PNGase F混合物”：PNGase F(～1mg/ml)和750mM碳酸氢铵pH 8.0缓冲液的1:1混合物。

“2-AB”：2-氨基苯甲酰胺。

“2-AB标记混合物”：在90:10乙腈:DMSO中的2mg/ml 2-氨基苯甲酰胺、40mM氰基硼氢化物、200mM乙酸。

“DTT”：二硫苏糖醇。

“APTS”：8-氨基芘-1,3,6-三磺酸。

“APTS标记混合物”：在90:10乙腈:DMSO中的2mg/ml的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸、40mM的氰基硼氢化物、200mM的乙酸。

实施例2

该实施例阐述了通过酶消化来释放N-聚糖以及利用示例性固体载体用2-AB进行标记的示例性工作流程。

N-聚糖释放和制备步骤

在DTT(1μL，550mM)存在下，将20μl的2mg/ml糖蛋白在90℃下变性半小时。冷却溶液，加入2μl的PNGase F混合物，并在37℃下孵育16小时，以从糖蛋白中释放N-聚糖。

N-聚糖沉淀和纯化步骤

将该混合物(约23μl)与600μl乙腈混合，并加样到安装在1mL柱中的玻璃纤维膜上。在这些条件下，N-聚糖沉淀在玻璃纤维膜上，而污染物，诸如变性剂则被溶剂冲走。可以用乙腈进行额外的清洗，以减少不希望残留在玻璃纤维膜上的污染物。

N-聚糖标记

将25μL的2-AB标记混合物添加到玻璃纤维膜中。使标记反应在70℃下进行一小时。

反应物过量的清洗和洗脱步骤：

如果需要，可以用乙腈清洗固体载体以除去任何过量的染料。然后可以用水从固体载体洗脱经纯化的经标记聚糖。

分析步骤

然后对从膜上洗脱的经标记N-聚糖进行分析。例如，通过将1μl洗脱的N-聚糖提供给高效液相色谱(HPLC)仪器以分离聚糖，并然后将其提供至检测和测量被分离的聚糖的荧光的装置来进行分析。

实施例3

该实施例阐述了使用示例性纤维素固体载体用APTS对游离寡糖进行标记的示例性工作流程。

N-聚糖释放和制备步骤

将20μl的0.5mg/ml麦芽糖糊精水性溶液与600μl的乙腈(一种有机溶剂)混合，并加样到安装在1mL柱中的纤维素膜上。在这些条件下，游离聚糖在固体载体上聚集或沉淀，而其他组分和水则被有机溶剂洗掉。用乙腈进行清洗，以进一步减少起始乙腈/水性溶液从容器中排出后残留在载体上的水的存在。

N-聚糖标记

将15μL的APTS标记混合物添加到纤维素膜上。使标记反应在70℃下进行一小时。

反应物过量的清洗和洗脱步骤：

如果需要的话，可以用85％乙腈/15％水清洗固体载体以除去任何过量的染料。然后可以用水从多孔固体载体上洗脱纯化的经标记的寡糖。

分析步骤

洗脱后，对经标记的寡糖进行分析。例如，可以通过将1μl洗脱样品提供给高效液相色谱(HPLC)仪器以分离经标记的寡糖，并然后提供给检测和测量荧光以测量经标记的寡糖的荧光的设备来进行分析。

应当理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其目的本领域技术人员可提出各种修改或改动，并且这些修改或改动均包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文而用于所有目的。

Claims (34)

1.一种用于还原或通过还原胺化来标记水性溶液中提供的碳水化合物的装置，所述装置包括：反应容器，所述反应容器具有主体，所述主体具有(a)第一开口，(b)具有第一腔室的第一区段，所述第一腔室具有第一横截面，所述第一横截面具有一定区域和第一直径，其中所述第一腔室与所述第一开口流体连接，(c)具有第二腔室的第二区段，所述第二腔室具有第二横截面，所述第二横截面具有一定区域和第二直径，其中所述第二腔室与所述第一区段的所述第一腔室流体连接，(d)第二开口，所述第二开口与所述第二腔室流体连接，(e)第一多孔固体载体，用于捕获所述水性溶液中原本提供的所述碳水化合物，所述第一多孔固体载体设置在所述第一开口和所述第二开口之间，填充所述第一腔室的所述第一横截面的所述区域，并且遍及所述第一横截面的全部区域与所述第一腔室和所述第二腔室流体连接；所述第一多孔固体载体(1)由非亲水性材料组成或者具有非亲水性材料的表面，或者(2)由亲水性材料组成；以及(f)第二多孔固体载体，用于捕获通过还原胺化被标记或还原的所述碳水化合物，所述第二多孔固体载体由亲水性材料组成或具有亲水性材料的表面，其中所述第二多孔固体载体设置在所述第一多孔固体载体和所述第二开口之间并且填充所述第一横截面或所述第二横截面的所述区域。

2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器的所述主体的所述第一区段的所述直径宽于所述第二区段的所述第二直径。

3.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体设置在所述反应容器的所述第一区段中，并且所述第二多孔固体载体设置在所述反应容器的所述第二区段中。

4.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器是管或筒。

5.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器是多孔板中的孔。

6.根据权利要求5所述的装置，其中，所述孔的所述第二区段是从所述孔的底部突出的尖嘴。

7.根据权利要求6所述的装置，其中，所述第二多孔固体载体设置在所述尖嘴中。

8.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器在微流体设备内。

9.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体由非亲水性材料制成或具有非亲水性材料的表面。

10.根据权利要求9所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体的非亲水性材料具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口。

11.根据权利要求9所述的装置，其中，所述非亲水性材料是聚乙烯，并且具有宽度10微米或更小的孔隙或开口。

12.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体由亲水性材料组成。

13.根据权利要求12所述的装置，其中，所述亲水性材料由以下材料制成：(a)玻璃；(b)纤维素；(c)二氧化硅；(d)共价连接有多个氨基丙基、二醇、氨基甲酰基、两性离子基团，或所述基团中的两种或更多种的组合的表面；(e)共价连接有多个氨基丙基、二醇、或氨基甲酰基，或所述基团中的两种或更多种的组合的二氧化硅。

14.根据权利要求13所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体由玻璃纤维组成。

15.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第二多孔固体载体的亲水性材料由以下材料制成：(a)玻璃；(b)纤维素；(c)二氧化硅；(d)共价连接有多个氨基丙基、二醇、氨基甲酰基、两性离子基团，或所述基团中的两种或更多种的组合的表面；(e)共价连接有多个氨基丙基、二醇、或氨基甲酰基，或所述基团中的两种或更多种的组合的二氧化硅。

16.根据权利要求15所述的装置，其中，所述第二多孔固体载体的亲水性材料由玻璃纤维组成。

17.根据权利要求15所述的装置，其中，所述二氧化硅为珠或颗粒的形式。

18.根据权利要求17所述的装置，其中，所述珠或颗粒共价连接有多个氨基甲酰基。

19.根据权利要求18所述的装置，其中，所述具有多个氨基甲酰基的二氧化硅珠或颗粒是Amide-80。

20.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体是具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口的聚乙烯，并且所述第二多孔固体载体由共价连接有多个氨基甲酰基的二氧化硅珠或颗粒组成。

21.根据权利要求20所述的装置，其中，所述具有多个氨基甲酰基的二氧化硅珠或颗粒是Amide-80。

22.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第二开口具有可打开的盖，以将溶液保持在所述反应容器中，直到需要所述溶液离开所述反应容器为止。

23.一种用于还原碳水化合物或者通过还原胺化来标记碳水化合物的试剂盒，包括：

(a)，具有主体的反应容器，所述主体具有：(a)第一开口，(b)具有第一腔室的第一区段，所述第一腔室具有第一横截面，所述第一横截面具有一定区域，其中所述第一腔室与所述第一开口流体连接，(c)第二区段，所述第二区段具有第二直径和具有一定区域的第二横截面以及第二腔室，所述第二腔室具有一定区域的横截面，其中所述第二腔室与所述第一区段的第一腔室流体连接，(d)第二开口，所述第二开口与所述第二腔室流体连接，(e)第一多孔固体载体，用于捕获在含≥95％有机溶剂的溶液中提供的碳水化合物，所述第一多孔固体载体设置在所述第一开口和所述第二开口之间并且填充所述第一腔室的所述第一横截面的所述区域，所述第一多孔固体载体(1)由非亲水性材料组成或者具有非亲水性材料的表面，或者(2)由亲水性材料组成或具有亲水性材料的表面；以及(f)第二多孔固体载体，用于捕获所述被还原的碳水化合物或者通过还原胺化被标记的碳水化合物，所述第二多孔固体载体由亲水性材料组成，其中所述第二多孔固体载体设置在所述第一多孔固体载体和所述第二开口之间并且填充所述第一横截面或所述第二横截面的所述区域，

(b)，还原剂或适用于通过还原胺化来标记碳水化合物的标记物，或者还原剂和适于通过还原胺化来标记碳水化合物的标记物，以及，

(c)，用于还原碳水化合物的说明或通过还原胺化来标记碳水化合物的说明，或者用于还原碳水化合物的说明和通过还原胺化来标记碳水化合物的说明。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，进一步地，其中，所述反应容器是：多孔板中的孔；管；或筒。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述反应容器是多孔板中的孔。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述孔的第二区段是从所述孔的底部突出的尖嘴。

27.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述第一多孔固体载体是具有宽度为10微米或更小的孔隙或开口的聚乙烯。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，所述第二多孔固体载体由共价连接有多个氨基甲酰基的二氧化硅珠或颗粒组成。

29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述反应容器是多孔板中的孔，且其中所述共价连接有多个氨基甲酰基的二氧化硅珠或颗粒设置在从所述孔的底部突出的尖嘴中。

30.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述标记物是2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、邻氨基苯甲酸(2-AA)、8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)或普鲁卡因酰胺盐酸盐。

31.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述还原剂是氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷，或者氰基硼氢化钠和甲基吡啶硼烷。

32.根据权利要求23所述的试剂盒，进一步包括用于使糖缀合物去糖基化的一种或多种试剂。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述一种或多种试剂是去糖基化酶。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，所述去糖基化酶是PNGase F。