KR880000359B1 - 물질의 분석방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

물질의 분석방법 및 장치
제1도는 본 발명의 분석 장치에 대한 횡단면도임.
제2도는 제1도에 나타낸 분석장치의 횡단면 분해도임.
제3도 및 제4도는 본 발명에 따른 분석방법의 개략도임.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
13 : 시험관 17 : 깔대기
19 : 원통형 용기 21 : 유리 모세관
23, 37 : 유리구슬 25, 27, 35 : 플러그
15, 29 : 립 39 : 캡
43 : 눈금
본 발명은 물질을 판정하기위한 방법 및 장치, 특히, 결합 또는 결합가능한 물질을 분석하기위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 결합 또는 결합 가능한 물질을 정량분석하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
과거에는 여러가지 형태의 결합 및 결합가능한 물질을 판정하기 위해 수많은 실험을 하였다. 이러한 결합 및 결합가능한 물질과 그 물질에 의해 결합되거나 거기에 결합된 물질은 항체-항원과 기타 결합 단백질류-단백질 결합가능한 물질이다.
과거에 이용된 입증 또는 검출 방법의 특정예는 미국특허 제3,654,090호에 기술되어 있다. 상기 특허에서는 항원 또는 항제를 판정하는 실험에 대해서 기술하고 있다. 상기 특허의 실시예에서, 항원의 양은 효소에 부착되고 항체의 양은 불용성 담체에 부착된 것으로 인해 불용성화된다. 효소 품명의 항원과 불용성화된 항체는 상표없는 항원(분석물질)과 혼합된다. 불용성화된 항체와 효소-상표 항원의 양을 조절함으로서, 상표없는 항원이 존재할때, 효소-상표 항원 모두 또는 약간의 항체에 부착된다. 효소-상표 항원의 모두 또는 일부가 부착되지 않는다. 혼합한후 불용성 물질은 어떤 부착되지 않은 효소-상표 항원을 함유하는 용해성물질로 부터 분리된다. 불용성 물질을 세척 또는 원심분리하면 상기 분리를 실시할 수 있다. 효소활성을 분석하기 위해서 효소 활성제를 불용성 또는 용해성 부분에 첨가한다. 이 방법에서, 상표 없는 항원(분석물질)이 존재한다는 것이 판명된다.
미국특허 제3,791,932호에서는, 특히 단백질에 의해 결합된 물질 또는 결합 단백질을 분석하기 위한 유사한 방법에 대해 기술하고 있다. 이 분석 방법에서, 이들 성분중 하나는 불용성화된 다음 판정될 성분과 혼합되고 단백질을 그 보충물에 결합시킨다. 그다음, 불용성 고체 형태는 분리되어, 효소로 판정될 물질의 결합 생성물과 반응된다. 즉, 효소-상표의 성분이 결합될 수 있도록 고체상과 혼합된다.
제1혼합 단계에서 판정될 성분이 존재하면, 적어도 약간의 불용성화 결합성분과 결합생성물(효소-성분)이 결합하는 것을 방지한다.
최종 혼합물로부터 형성된 고체 또는 액체상의 효소 활성이 판정되면 상기 성분이 존재한 다는 것을 나타낸다. 미국 재특허 29,169호는 미국 특허 제3,791,932호에 관련되어 있다.
결합 또는 결합가능한 물질을 판정하기 위한 유사한 방법을 나타내는 기타 다른 특허는 미국특허 제3,839,153 : 3,850,752 ; 그리고 4,016,043호가 있다. 이들 각 특허는, 한성분이 효소로 명명되고 다른 성분은 불용성으로 만들어지는데 있어서 유사하다. 명명된 성분, 불용성 성분과 명명되지 않고 판정될 성분을 혼합한후, 용해성 성분이 분리되고 용해성 또는 불용성 부분의 효소 활성으로 명명되지 않은 성분의 존재를 판정할 수 있다.
미국특허 제3,966,897호에 기술된 바와같이, 유사한 형태의 경합 및 비경합 생물학적 분석 방법은, 성분을 효소 명명하는 대신 성분을 방사선적으로 명명하므로 실시되었다. 이러한 형태의 분석에서 효소활성 대신에 방사능이 측정된다. 또한, 미국특허 제3,966,879호에 기술된 바와같이, 지시염료가 성분에 부착된 다음 외관실험, 형광, 분광광도법, 굴절법 등에 의해 직접 측정될 수 있다. 이들 실험의 대부분은 굴절률 또는 방사선 강도를 이용하거나 정량분석을 측정한다.
이들의 모든 분석 방법은 실험물질과 적당한 시약(예를들면, 홀몬-항체, 항원-항체, 효소-기제)과의 반응 또는 그 역반응을 포함하며, 동시에 색, 방사능, 또는 기타 물리적 성질과 같은 시약(또는 본시약과 반응되는 또 다른물질, 지시약)의 특성을 측정함으로서 반응된 시약의 양을 직접 또는 간접적으로 측정한다.
어떤 경우에, 미국특허 제3,966,897호에 나타난 바와같이, 시약은, 실험물질이 분산될 수 있는 매체에 부동화 또는 고정된다. 상기특허에서, 실험물질은, 시약이 분산에 대해 부동화되는 겔 매체에 분산된다. 겔에서 시약을 부동화시키는 한 방법은 시약을 활석, 다공성 유리 구슬, 수산화 인회석, 지르콘 인산염, 목탄폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 입자등에 흡수시키는 것이다. 시약을 상기와 같은 물질에 결합시킨후, 명명 물질을 이용한 종래의 분석이 실험 물질을 시약지대에 먼저 분산시킨 다음 나머지 부착되지 않은 시약과 반응시키기 위한 지시약을 이용함으로서 실시된다. 과잉의 지시약이 제거된후 부착된 지시약을 판정하여 분석을 종료시켰다.
미국특허 제3,527,712호와 3,975,162호에서는 미국특허 3,966,897호에 기술된 바와 같은 매체에 시약을 적용시킨 다음 상기 매체에 사용하기 위한 겔을 제조하는 방법을 기술하고 있다.
미국특허 제3,654,084호에서는 안정하고 수용성 효소 짝상을 제조하는 방법을 기술하고 있다.
종래에, 항원 및 항체에 결합될 수 없는 기타 성분에 항원과 항체를 결합시키기 위해 아비딘과 비오딘을 각종 항원과 항체에 결합하였다.
이렇게하여 둘 또는 그 이상의 관련되지 않는 성분에 대한 항원 또는 항체결합 생성물을 생성하였다.
종래에 이용된 분석방법 및 장치의 특별한 문제는 불용성화된 성분을 명명된 성분으로부터 분리하기 위한 세척, 원심분리 또는 기타 분리기술을 필요로 한다는 것이다. 이것은 시간과 노력을 많이 필요로 한다. 또한, 다량의 물질을 자동적으로 원심분리 및 세척하는 장치는 가격이 비싸다. 이들 종래의 분석방법에서 이용된 기타 실험 장치는 복잡할 뿐만아니라 가격이 비싸다.
종래에 이용된 분석 방법과 장치의 또 다른 문제점은 휴대할 수 없다는 것이다. 이와같이, 실제적인 실험을 쉽게 실시할 수 없었다.
게다가, 대부분의 분석 장치는 사용 또는 조립하기가 간단하지 않았다. 그러므로, 전문가만이 분석을 실시할 수 있다. 또한, 대부분의 분석 약품과 장치는 유효기간이 길지 않으며 전문적인 혼합 또는 제조기술을 필요로 한다.
종래의 분석방법 및 장치의 또 다른 문제점은, 양적으로 정확하지 않거나, 또는 양적으로 정확할지라도, 과정이 복잡하고 값비싼 검출 장치를 필요로 한다는 것이다. 그 이유는 대부분의 정량분석이 방사선 강도 또는 굴절률을 측정함으로서 실시된다.
본 발명의 분석 방법 및 장치는 종래보다 현저하게 개발되었으며 본 발명의 목적은, 상기 문제와 관련하여 개량된 분석 방법 및 장치를 제공하는데 있다.
본 발명은 실험물질을 분석하기 위한 장치를 제공한다. 이 실험 물질은 1차 흡수 물질에 의해 결합될 수 있어야 한다. 또한, 1차 흡수물질은, 1차 흡수물질과 분석 시약의 선정된 양과 함께 실험물질의 존재하거나 존재하지 않음으로서 약간의 분석 시약이 1차 흡수물질에 의해 결합 되지 않도록, 분석시약을 선택적으로 흡수할 수 있어야 한다. 분석시약은 분석용 흡수물질에 의해 결합될 수 있어야 한다. 또한, 분석시약은 분석용 흡수 물질에 의해 이미 결합된 것을 검출할 수 있어야 한다. 실험물질, 1차 흡수물질, 분석시약, 그리고 분석용 흡수물질의 예로는 하기에 나타낸다.
본 발명에 따라서, 실험물질을 분석하기 위한 장치는 액체를 수용하기 위한 제1구멍을 갖는 제1유체 유도수단으로 구성되어 있다.
1차 흡수물질의 선결된 양은 제1유체 유도수단에 위치한 지지수단에 고정되며 제1유체 유도 수단을 통과하는 유체를 접촉시키기 위해 존재하는 1차 흡수 물질을 보유하고 있다. 제2유체 유도수단은 제1유체 유도수단으로부터 유체를 수용하기 위해 연결되어 있다.
분석용 흡수물질은 제2유체유도 수단에 존재하는 제2지지 수단에 의해 지지된다. 제2지지 수단은 제2유체유도 수단내에서 분석용 흡수 물질을 유지한다. 분석용 흡수 물질에 의해 흡수된 분석시약을 검출하는 수단이 제공된다.
양호하게, 제2지지 수단은 일련의 연속 또는 불연속 지대에서 분석용 흡수 물질을 지지하는데, 상기 지대를 통해 유체가 연속적으로 통과하므로, 분석 시약이 통과하므로서 연속적으로 거기에 결합된다.
분석흡수체의 선결된 양은, 분석 시약의 선결된 양만을 결합하기 위해서 각지대에 분산된다. 이 방법에서, 분석 시약이 결합되는 마지막 지대를 검출하는 것은 제2지지 수단에서 흡수된 분석시약의 양을 나타낸다. 1차 흡수물질과 접촉되는 분석 시약의 양과 관련하여 제1유체 유도 수단에 존재하는 1차 흡수물질의 선결된 양을 조절(역으로도 성립)하므로서, 제2유체 유도 수단에서 연속적으로 흡수된 분석 시약의 양은 1차흡수물질에 접촉되는 실험물질의 양과 비례한다. 이 방법에 의해, 실험물질을 정량분석하기 위한 장치가 제공된다.
본 발명의 방법에서, 실험물질의 분석단계는 상기 물질들을 이용하는 단계로 구성되어있다. 첫째, 분석시약과 실험물질의 선결된 양이 도입되어 1차 흡수물질의 선결된 양과 접촉되어 실험 물질이 존재하든가 존재하지 않든가에 상관없이 분석시약의 선결된 양이 1차 흡수물질에 의해 결합되지 않도록 한다. 둘째, 1차 흡수물질에 의해 결합되지 않은 어떠한 분석시약은 수용된후, 분석시약을 분석용 흡수 물질에 결합하는 분석흡수물질과 접촉된다. 분석흡수 물질에 결합된 분석시약이 존재한다는 것이 결정된다.
양호하게, 분석시약은 분석용 흡수물질의 선결된 양을 함유하는 일련의 지대를 통해 연속적으로 도입되며, 결합된 분석시약의 양은 분석시약이 결합되는 마지막 지대를 검출하므로서 결정된다. 상기한 바와 같이, 이 방법은 실험물질에 대한 정량분석을 제공할 수 있다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해서, 첨부도면을 참고로 목적, 특징 및 장점을 하기와 같이 설명한다.
실험물질에 대한 분석에 있어서, 본 발명에서는 1차 흡수물질, 분석시약물질과 분석 흡수물질을 이용한다. 이들 각 물질은 특히 서로 및 실험물질에 관련된다. 더우기, 각 물질은 분석 및 분석장치를 위해 특정성질을 가져야 한다.
실험물질은 1차 흡수체에 의해 특별히 결합될 수 있어야 한다. 또한, 실험물질은, 1차 흡수물질과 분석시약의 특정양과 혼합될때 약간의 분석시약이 결합되거나 결합되지 않도록, 1차 흡수체에 의해 결합될 수 있어야 한다. 결합되거나 결합되지 않은 분석 시약의 양은 1차 흡수체 및 분석시약과 혼합된 실험물질의 양에 비례하여야 한다.
분석시약은, 1차 흡수체 또는 실험 물질이 결합되는 1차 흡수체에 의해 특별히 결합될 수 있어야 한다. 또한, 분석 시약은 분석 흡수체에 의해 특히 결합될 수 있어야 한다. 분석 시약은, 분석 시약의 특정량이 1차 흡수체의 특정양과 적어도 약간의 실험 물질과 혼합될때 약간의 분석 흡수체가 1차 흡수체에 의해 결합되거나 결합되지 않도록 1차 흡수체에 의해 결합될 수 있어야 한다. 또한, 분석시약은 분석 흡수체에 의해 결합된 것을 검출할 수 있어야 한다. 양호하게는, 분석시약이 매우 빠른 반응으로 분석 흡수체에 의해 결합되어 결합후에 명백하고도 뚜렷한 연속 지대가 측정될 수 있다. 분석 흡수체의 연속지대 측정은 하기에서 자세히 설명된다.
1차 흡수체는 상기한 바와같이 실험물질을 특별히 결합할 수 있어야 한다. 또한, 1차 흡수체는, 실험물질이 부착될때 분석시약을 결합하거나 분석시약을 결합할 수 있어야 한다. 결합되거나 결합되지 않은 분석시약의 양은 1차 흡수체와 혼합된 실험물질의 양에 비례하여야 한다.
본 발명의 분석장치에서, 1차 흡수체는, 분석시약과 실험물질이 통과하고 1차 흡수체와 접촉될 수 있도록 특정 위치에 고정되어야 한다.
분석 흡수체는 분석시약을 특별히 결합할 수 있어야 한다. 그리고, 분석장치에 있어서, 분석시약은 특정위치에 고정되어야 한다. 분석시약의 양호하게 선결된 양은, 분석시약이 지대에서 연속적으로 결합되도록 유체가 연속적으로 통과하는 일련의 지대에서 고정되어야 한다.
상기 요구조건을 만족하는 물질은 여러가지가 있다. 또한 상기 물질들을 제조하는 공지방법도 여러가지가 있다.
실험물질에 대한 요구조건을 만족하는 물질은 항원, 항체, 및 기타 여러가지 유기물질을 포함한다. 가장 중요한 실험물질의 조건은 1차 흡수체에 의해 특별히 결합될 수 있어야 하기 때문에, 본 기술의 전문가들은 대부분의 물질을 특별히 결합할 수 있는 1차 흡수체가 제조될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
상기 성질을 갖는 1차 흡수체는 여러가지가 있다. 물론, 1차 흡수체는, 1차 흡수체에 의해 결합되어야 하는 실험 물질에 따라 달라진다. 이와같이, 항원에 대한 1차 흡수체 또는 유기분자 분석물은 분자가 분석될 특정렉틴과 항체를 포함한다. 예를들면, 특정 미생물 항원에 대한 항체, 단백질, 홀몬, 다당류, 항체 옥소등은 1차 흡수체로 사용될 수 있다. 또한, 설탕, 효소 공통인자, 다당류 등에 대해 특정 결합 작용을 갖는 렉틴이 사용될 수 있다. 항체 분석을 위한 1차 흡수체는 항체가 특수한 유기 성분 또는 항원을 포함할 수 있다. 예를들면, 분석될 항체와 함께 특정 결합작용을 갖는 미생물 항원, 단백질, 홀몬, 다당류, 항체, 독성등을 사용할 수 있다. 분석시약을 위해 여러가지 화학물질이 사용될 수 있다. 분석시약을 제조하는 한가지 단순한 방법은 분석흡수체에 특별히 결합할 수 있는 그룹과 검출가능한 기굽으로 실험 물질을 명명함으로서 실험될 물질을 이용하는 것이다. 예를들면, 실험 물질이 항체이라면, 항체는 검출을 위해 효소에 결합될 수 있으며 또한 아비딘 분석 흡수체에 특별히 결합하기 위해 비오틴에 결합될 수 있다.
물론, 여러가지 검출 가능한 그룹은 분석시약을 제조하는데 있어 특정화합물에 결합될 수 있다. 이들의 검출가능하거나 지시약 그룹은 착색된 염료, 효소, 형광화합물, 방사성 동위원소 등을 포함한다.
특정 효소는 고추냉이 과산화효소, 알카리 인산염, B-갈락토시다제 등을 포함한다. 착색된 염료의 예로는 아미도 블랙과 에오신이다. 형광 화합물은 플루오레스세인 이소티오시아네이트, 단실 등이 있다.
방사성 동이원소는 탄소 14와 요오드 125등이 있다. 물론, 대부분 바람직한 검출가능한 그룹은 분석에 이용되는 특정 장치 및 특정 분석에 따라 다르다.
분석 흡수체에 특별히 결합할 수 있는 분석 시약에 결합된 그룹은 분석흡수체에 따라 다르다. 분석 흡수체에 특별히 결합할 수 있는 결합 그룹의 예로는 비오틴 ; 아비딘 ; 항원 ; 효소 물질동족체 ; 항체 ; 2, 4-디네트로페놀(MOPC-315 마우스미엘로마 단백질) ; 그리고 효소가 있다. 상기 화합물이 결합된 혼합물은 항체, 항원, 유기분자 및 렉틴을 포함할 수 있다. 항체는 종래의 것을 사용할 수 있으며 또는 미생물 항원에 대한 특정 모노클로날 항체, 단백질, 다당류, 항생제, 독소, 홀몬등을 사용할 수 있다. 항원은 미생물 항원, 단백질, 다당류, 항생제, 독소, 홀몬등이 있다. 유기분자는 렉틴에 특별히 결합할 수 있는 모든 분자를 포함한다.
분석시약을 제조하기 위한 양호한 방법은 1차 흡수체와 관련하여 분석될 물질과 똑같은 특성을 갖는 화힙물에 그룹을 결합시킴과 동시에, 이는 무수조건이 아니다. 하기에서 더 자세히 설명하는 바와같이, 분석 시약은 1차 흡수체 만 아니라 실험물질과 특별 결합작용을 가질 수 있다. 이 경우에, 실험물질이 결합되지 않는다면, 분석시약은 1차 흡수체를 통과할 것이다.
검출가능한 그룹과 분석 흡수체 그룹을 여러 화합물에 결합하기 위한 방법은 본 기술에서 잘 알려져 있다. 분석 시약의 제조방법은 다음과 같다 :
Ⅰ. 베타-갈락토시다제를 항원 또는 항체에 결합하는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르 :
a. 이 방법에서, 항원이 효소에 결합된다면, 항체는 불용성 지지체에 공유결합된다. (화학물질을 지지체에 결합시키는 방법 참조). 이 방법에서는 시약의교차결합을 방지하고 단향결합을 위한 기제로서 이용되는 1차 흡수체를 형성한다.
b. 1차 흡수체가 제조된후, 1차 흡수체는 글리신 도는 pH7.2, 0.1몰의 삼중 완충용액으로 완전세척하였다.
c. 결합될 항원 또는 항체는 1차 흡수체에 첨가되고 항원-항체 반응이 일어날 수 있도록 철야 배양시켰다.
d. 1차 흡수체를 상기(b)에서 처럼 완충용액으로 세척한 다음 0.01몰 염화 마그네슘(PBS-M)을 함유하고 pH7.2, 0.1몰 인산염을 세척하였다.
e. 충분량의 요도아세트아마이드를 1차 흡수체에 첨가하여 최종 농도를 0.01몰로 만들고(이 단계는 1차흡수체 또는 결합된 항원 또는 항체에 존재하는 어떠한 유리설프히드릴기를 차단함), 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하면서 배양한다.
f. 1차 흡수체를 PBS-M으로 다시 세척한다.
g. m-알레이미도벤조일 -N-히드록시석신이미드 에스테르를 1차 흡수체에 첨가하여 최종 농도를 0.01몰로 만든다음 2시간동안 교반하면서 실온에서 배양시킨다.
h. 1차 흡수체를 PBS-M으로 다시 세척한다.
i. 1차 흡수체의 각 20ml에 대한 베타-갈락토시다제 500iu를 첨가하고 4℃에서 주기적으로 교반하면서 철야 배양하였다.
j. 1차 흡수체를 PBS-M으로 다시 세척한다.
k. 베타-갈락토시다제에 결합된 항원 또는 항체는 0.005M MgCl2를 함유하는 0.01몰, pH2.5인 글리신에서 3시간 동안, 10ma에서 3cm 수직 컬럼에서 전기 이동하여 1차 흡수체로부터 용리된다. (용리된 물질을 포함할 수 있도록 음극을 향해 디스크에서 3cm 아래의 투석막과 1차 흡수체를 지지하기 위해서 다공성 디스크를 전기이동 컬럼에 설치한다.)
Ⅱ. 항원 또는 항체에 과산화제를 결합하는 글루타르알데히드 :
a. pH7.2, 0.1몰 인산염 완충용액(PB)에 현탁된 항체 또는 항원 각 10mg에 대해 과산화제 500iu를 첨가한다.
b. 새로 제조된 0.25% 글루타르알데하이드 용액 5ml를 첨가한후 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 교반한다.
c. 혼합물을 4℃에서 12-18시간동안 PB 2000부피에 대해 투석한다.
d. 다량의 집합체를 제거하기 위해서 30분동안 5000kg으로 혼합물을 원심분리한다.
Ⅲ. 항원 또는 항체를 부동화 시키기 위해 파괴가능한 결합을 이용한 항원 또는 항체에 베타-갈락토시다제를 결합하는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르.
a. 이 과정에서, 항원 또는 항체는, 실온에서 2시간동안 시트라콘산 무수물로 지지체를 처리함으로서 유리 아미노기를 함유하는 불용성지지체에 결합된다.
b. pH7.2, 0.1몰의 인산염, 완충용액(PB)으로 완전 세척된다.
c. 결합될 항원 또는 항체는 활성화된 지지체에 첨가된후 4℃에서 밤새동안 배양시킨다.
d. 지지체를(b)에서 처럼 완충용액으로 다시 세척한다.
e. 충분한 양의 요도아세트아마이드를 지지체에 첨가하여 최종 농도를 0.01몰로 만들고(이 단계는 1차 흡수체 또는 결합된 항원 또는 항체에 존재하는 유리 설프히드롤기를 차단시킴), 그 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하면서 배양시킨다.
f. 지지체를 다시 PB로 세척한다.
g. m-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르(MBS)을 지지체에 첨가하여 최종 농도를 0.01몰로 만든다음 실온에서 2시간 동안 교반하면서 배양시켰다.
h. 지지체를 PBS-M으로 세척한다.
i. 지지체 각 20ml의 충전된 부피에 대해 베타-갈락토시다 제500iu를 첨가한후 그 혼합물을 주기적으로 혼합하면서 4℃에서 밤새동안 배양시켰다.
j. 지지체를 다시 PBS-M으로 세척한다.
k. 베타-갈락토시다제에 결합된 항원 또는 항체를, 0.01몰의 MgCl12를 함유하고 pH가 10이며 0.01몰인 인산염으로 지지체로부터 용리시킨다(시트라콘산 무수물은 pH10에서 쪼개진다.)
Ⅳ. 비오틴 이소티오시아네이트(FITC)에 항체-엔짐 컴플스 또는 항원을 결합 :
a. N, N-디메틸 포름아마이드 10ml에 d-비오틴 10mg에 현탁한다.
b. 디시콜로헥실카르보디이미드 10mg을 첨가하고 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다.
c. 항원/항체 효소를 함유하는 수용액(PB)에 활성화된 C-COOH기로 활성화된) d-비오틴 혼합물을 첨가한다. (디시클로헥실카르보디이미드는 물에 불용성이며 교차 결합하지 않는다).
d. 교반과 동시 4℃에서 12-18시간동안 혼합물을 배양시킨다.
e. 혼합물을 4℃에서 12-18시간동안 PB2000부피에 대해 혼합물을 투석한다.
화합물에 바람직한 기를 결합시키는 다른 방법은 본 기술에서 잘 알려져 있으며 같거나 또 다른 분석시약을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
Ⅴ. 항원 또는 항체를 플루오레스세인 이소티오시아네이트에 결합(FITC).
a. FITC를 pH가 9.0이고 0.15몰의 인산나트륨 완충용액에 용해시킨다(1mg/ml).
b. 항원 또는 항체 100mg을 함유하는 각 4ml에 FITC 용액 1ml를 첨가한다.
c. pH를 9.5로 조절하고 혼합과 동시에 실온에서 1시간 동안 배양시킨다.
d. 세파덱스 G-25를 통해 크로마토그라피하여 과잉의 FITC를 제거한다.
분석 흡수체로서 적당한 화합물은 아비딘, 비오틴, 항원, 항체, 효소, 효소기질 동족체, 미엘로마 단백질과 다른 결합 단백질을 포함한다. 특히 유용한 분석 흡수체는 아비딘 또는 비오틴으로 구성되어 있다.
아비딘은 매우 빠른 속도로 비오틴에 결합한다. 또한, 아비딘과 비오틴은 다방면으로 유용하며 비교적 값이 싸다. 또한, 아비딘과 비오틴은 여러가지 형태의 지지체와 기타 수많은 성분에 쉽게 결합될 수 있다.
제1도 및 제2도를 참고로 할때, 본 발명에 따른 장치는 일반적으로 11로 나타냈다. 장치 11은 상단부에 구멍을 갖는 투명 유리 시험관 13으로 구성되어있다. 시험관 13의 상부는 깔대기 17의 상부 림으로부터 하향으로 연장되어 있는 립으로 압축고정되어 있다.
깔대기 17은 시험관 13은 하향 연장되고 그 하단부에 원통형 용기를 갖는다. 원통형 용기 19는 압축 고정된 투명 유리 모세관 21을 수용한다. 모세관 21은 다수의 유리 구슬 21로 채워져있다.
이들 유리구슬은 모세관 21을 통과하는 유체를 접촉시키기 위해 모세관 21내에서 분석 흡수체를 지지한다. 플러그 25는 튜브 21 내에서 구슬 23을 유지하기 위해서 모세관 21의 하단부로 압축 고정된다.
플러그 27은, 전환될때 튜브 21내에서 구슬 23을 유지 하기 위해 모세관 21의 상단부에 압축고정된다.
모세관 21은 깔대기 17에 의해 시험관 13 내에서 현탁 유지된다. 모세관 21을 통과하는 유체는 시험관 13에 의해 보유될 수 있다. 구슬 23과 모세관 21의 내부는 시험관 13과 모세관 21의 벽을 통해 볼 수 있다.
하부 원통형 립 15와 상부 원통형 립 29는 깔대기 17의 상부림으로부터 연장되어 있다. 이들 립은 축방향으로 연장되어있다. 하부 립 15는 유리튜브 13의 상단부를 수용하며 압축고정된 튜브 13과 함께 외부 시험관 13을 연장시킨다. 바람직하다면, 글루 등은 시험관 13을 깔대기 17에 영구적으로 결합시킬 수 있다. 상부 립 29는 컵 31을 수용한다. 컵31은, 시험관 13이 하부 원통형 립 15에 압축고정되는 것과 똑같은 방법으로 상부 원통형 립 29에 압축고정 된다.
컵31은, 립25와 27사이에서 안쪽으로 연장되어 있는 깔대기 17의 쇼울더 림33위에 위치한다. 컵 31은 상단부 및 하단부에 구멍을 갖고 있다. 플러그 27 및 35사이에서 깔대기 17의 내부는 다수의 유리 구슬 37로 채워져 있다. 구슬 37은 깔대기 17을 통과하는 유체를 접촉시키기 위해서 1차 흡수체를 지지한다.
플러그 25, 27 및 35는, 유체가 쉽게 통과하지만 깔대기 17과 모세관 21 내에서 구슬을 확고하게 유지할수 있는 폴리프로필렌과 같은 다공성 물질로 만들어졌다. 플러그 27은 구슬 37과 23을 분리한다. 바람직하다면, 컵 31과 플러그 35는 깔대기에 용융 및 교착되어 그들을 정위치에 영원히 유지시킬 수 있다.
나선형 캡 39는 컵 31의 상단부에서 나선 41에 의해 수용된다. 캡 39는 컵 31의 상단부와 밀착되어 있어 외부물질이 분석장치에 역으로 도입되는 것을 방지한다.
장치 11의 구조물은, 유체가 컵 31의 상부로 도입되고, 플러그 35를 통과하여 구슬 37과 접촉하고, 플러그 27을 통해 구슬 23과 접촉하는 모세관 21로 통과한 다음 플러그 25를 거쳐 시험관 13으로 통과할 수 있도록, 특정 유체 유도 통로를 제공한다. 하기 설명하는 바와같이, 유체가 먼저 치밀하게 접촉되고 모세관 21을 통해 도입되기 전에 구슬 37을 통과하는 것이 중요하다. 모세관 21의 통로는 비교적 좁아야한다. 이것은 구슬 23과 분석 흡수체에 연속적으로 결합시킨다. 구슬을 지역에 배열시키고 선결된 양의 분석 흡수체로 이들 지역에 채움으로써, 결합이 발생하는 마지막지역에 의해 분석 시약의 연속 결합이 정량적으로 결정될 수 있다.
바람직하다면, 눈금 43은 모세관 21에 새겨져 있어 튜브내에서 선상 반응의 길이를 육안으로 실험 및 결정한다. 또한, 바람직하다면, 액체가 모세관 21을 통해 시험 13으로 도입될때, 공기가 배출할 수 있도록 깔대기 17 또는 시험관 13을 통해 조그만 구멍을 마련할 수 있다.
상기한 바와같이, 구슬 23과 37은 1차 흡수체와 분석 흡수체를 각각 지지한다. 구슬들은, 액체를 통과하는 유체가 흡수체와 치밀하게 접촉시키기 때문에 이용된다. 또한, 흡수체를 구슬에 부착시키기가 비교적 쉬워서 각 흡수체 물질은 깔대기 17과 모세관 21을 떠나지 않는다.
제1도와 제2도에서는, 1차 흡수체 물질과 분석 흡수체가 유리 구슬에 지지되고 다른 물질은 이들 물질에 대한 지지체로서 사용될 수 있다. 이들 지지체는 셀룰로오스 아세테이트, 또는 셀룰로오스 아세테이트-질산염과 같은 막필터 ; 유리섬유필터 ; 또는 아가로스, 셀룰로오스 덱스트란, 폴리아크릴 아마이드 등으로 만들어진 구슬을 포함할 수 있다. 사실상, 충분히 좁은 튜브가 이용되고 흡수체가 튜브의 내부벽에 부착될 때, 분리 지지체가 필요하지 않다. 지지물질의 주요 특징은 흡수체와 유체 통로를 통과하는 유체 사이에서 치밀하게 접촉 시키는 것이다.
제1도 및 제2도에서 나타낸 바와 같이, 모세관 21은 약간 크게 만든다. 보통, 모세관의 내경은 약 0.5-2mm이다. 유리 구슬 23과 37의 내경은 각각 약 0.01-5mm이다. 모세관 21의 내경과 유리 구슬의 내경은 흡수체밀도, 양측정의 바람직한 정확도와 모세관 21을 통한 유체의 바람직한 유량에 따라 좌우된다.
화합물질을 지지체에 결합시키기 위한 수개의 방법은 지지체에 부착될 지지체와 화학물질의 조성에 따라 각각 다르게 이용될 수 있다. 이들 방법은 시아노겐 브로마이드 결합, 실라화, 디아조결합, 카르보디이미드 결합과 글루테르알데히드 결합을 포함한다.
시아노겐 브로마이드 결합에서, 단백질과 다당류는 셀룰로오스 필터, 셀룰로오스 아세테이트/질산염 필터, 나일론 필터, 아가로스구슬, 셀룰로오스 구슬과 폴리아크릴아마이드 구슬과 같은 지지체에 결합될 수 있다. 또한, 그것은 디아미노 알킬 또는 아릴, 또는 감마 아미노알킬 또는 아릴 카르복실산과 같은 스페이서 그룹을 도입하는데 사용될 수 있다. 일련의 반응은 다음과 같다 :
a. 4N짜리 NaOH를 첨가함으로써 pH를 10-11로 유지하고 온도는 4-6℃로 유지하면서, 물 50ml에 지지체 20g을 첨가하고, 물 100ml에 CNBr10g을 용해한 후 지지체에 서서히 첨가한다. 10분 내에 완전 활성화된다.
b. pH가 9이고 차가운 0.1몰 중탄산염 완충용액을 이용한 여과로 지지체를 세척한다.
c. 활성화된 지지체는 pH가 9인 0.1몰 중탄산염 완충용액에 용해된(단백질, 다당류, 디아민, 감마-아미노 카르복실산등)을 결합시키기 위해 물질에 첨가된다.
d. 결합된 지지체는 0.1몰 글리신 완충액 또는 pH가 9인 0.1몰 트리스 완충액으로 여과함으로써 세척된다(이들 완충액은 어떠한 나머지 잔류 CNBr위치를 차단한다).
유리 섬유 필터, 유리 구슬, 유리 모세관등과 같은 유리 지지체를 실라화하기 위해, 여러가지 트리에톡시실란류와 트리메톡시실란을 사용할 수 있다. 예를들면, 감마-아미노프로필트리에톡시실란 또는 N-(B-아미노에틸-감마-아미노프로필)트리메톡시실란은 스페이서 그룹으로서 다음과 같이 유리에 부착된다 :
a. 트리에톡시-또는 트리메톡시-실란에 대한 10%용액이 물에서 제조된다. pH4.
b. 지지체는 용액에 첨가되어 60-70℃에서 3시간 동안 반응된다.
c. 용액은 여과에 의해 제거되고 지지체는 12-18시간 동안 125℃에서 배양된다.
d. 과량의 실란을 제거하기 위해서 아세톤으로 여과한 다음 물로 여과하여 세척한다.
유기 분자를 함유하는 기타 아민과 단백질을 지지체의 스페이서 그룹에 디아조 결합시키는 것은 다음과 같이 이루어진다 :
a. 스페이서의 아민(아릴 아민과의 스페이서만이 디아조화될 수 있음)은, 15-16℃에서 12시간동안 0.1몰 NaNo2와 0.1몰 HCl을 함유하는 용액으로 처리함으로써 염화 디아조늄기에 전환된다.
b. 여과에 의해 지지체를 물로 세척한다.
c. 단백질 또는 아민(티로신)함유 분자를 0.05몰 인산염 완충용액에 첨가하여 pH 8-9로 만든 다음 지지체에 첨가한다.
d. 4℃에서 12-18시간동안 배양한다.
e. 0.15몰 NaCl을 함유하는 차거운 0.5몰 글리신 완충용액으로 여과 세척한다. pH 7.2.
기타 단백질 및 기타 아민 함유 유기 분자를 지지체의 스페이서 그룹에 카르보이미드 결합시키는 것은 다음과 같이 이루어진다 :
a. pH를 7-8로 유지하면서, 25℃에서 12-18시간동안 배양하므로써 9.5몰 무수 호박산을 함유하는 용액으로 처리하여 지지체 결합이 스페이서의 말단 아민을 카르복실산에 전환시킨다.
b. 물로 여과하여 세척한다.
c. 지지체에 결합된 카르복실산 스페이서를 pH5 및 4℃에서 4시간동안 0.1몰 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드로 처리한다.
d. 물로 여과하여 세척한다.
e. 0.15몰의 NaCl을 함유하는 0.1몰 인산염 완충용액에 단백질 또는 아민 함유 분자를 용해하여 pH5로 만든 다음 지지체에 첨가한다.
f. 4℃에서 12-18시간동안 배양한다.
g. 0.15몰 NaCl을 함유하는 0.1몰 글리신 완충용액으로 여과 세척한다.
카르복실 또는 알데히드기를 함유하는 유기분자를 지지체의 스페이서기에 카르보디이미드 결합시키는 것은 다음과 같이 이루어 질수 있다 :
a. 0.1몰 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드를 함유하는 용액에 지지체 결합 스페이서를 현탁한다.
b. 0.15몰의 NaCl에 유기 분자를 용해시켜 pH5로 만든다음 지지체 혼합물을 첨가한다.
c. 4℃에서 12-18시간동안 배양한다.
d. 차거운 0.5몰 글리신 완충액으로 여과하여 세척하여 pH7.2로 만든다.
단백질 및 기타 아민-함유 분자를 지지체의 스페이서 그룹에 글루타르알데히드 결합시키는 것은 다음과 같이 이루어질 수 있다.
a. 물과 0.5% 글루타르알데히드를 함유하는 새로 제조된 용액으로 지지체 결합 스페이서 그룹을 실온에서 20분동안 처리한다.
b. 물로 여과하여 세척한다.
c. 0.15몰 NaCl에 결합시키기 위해 단백질 또는 분자를 함유하는 용액에 지지체 결합 스페이서에 첨가한다.
d. 실온에서 2시간동안 배양한다.
e. 0.5몰 글리신과 0.15몰 NaCl을 함유하는 차거운 용액으로 여과세척한다. pH7.2.
본 발명의 방법에 따라 분석을 실시하기 위해서 상기한 바와 같은 장치를 이용할 수 있다. 1차 흡수체의 선결된 양은 구슬 37에 부착된다. 또한, 선결된 밀도를 갖는 분석 흡수체는 모세관 21에서 유리구슬 23의 컬럼을 통해 제조된다. 1차 흡수체와 분석 흡수체는 특정 실험 물질과 분석 시약을 위해 특별히 제조된다. 선결된 양의 분석 시약은 본 장치에서 사용하기 위해 제조된다. 분석 시약은 1차 흡수체에 의해 특별히 결합된 형태이어서 분석 시약은, 1차 흡수체에 의해 결합하기 위해서 실험물질과 비교된다.
제1도 및 제2도 뿐만 아니라 제3도 및 제4도를 참고로 하여 본 분석 방법을 명백히 이해할 수 있다. 먼저, 실험물질을 분석할 유체의 특정량을 분석시약의 선결된 양과 혼합한다. 이 혼합물을 컵 31에 첨가한다.
실험 물질과 분석 시약을 통과시켜 구슬 37에 유지된 1차 흡수 물질과 접촉시킨다. 실험 물질이 분석 유체에 존재한다면, 약 분석 시약은 1차 흡수체에 의해 결합되지 않으며, 구슬 37을 통하여 모세관 21을 통과한다. 구슬 37을 거쳐 모세관 21을 통과하는 분석시약의 양은 1차 흡수체에 의해 결합된 실험물질의 양과 비례한다. 물론, 구슬 37에서의 1차 흡수체의 특정량과 분석 유체와 혼합된 분석시약의 양을 주의깊게 보충하여, 실험물질 존재하지 않는다면, 분석시약을 통과시키지 않도록하고 동시에 실험물질이 분석유체에 존재한다면, 적어도 약간의 분석시약을 구슬 37에 통과시킨다.
분석시약이 구슬 37과 1차 흡수체를 통과한다면, 모세관 21에 도입되고 구슬 23에 존재하는 분석 흡수체물질에 의해 결합된다. 분석시약과 분석 흡수체사이의 결합반응이 충분히 빠르다면, 분석시약의 결합은 분석흡수체의 컬럼아래로 이루어진다. 예를들면, 충분한 분석시약만이 모세관 21에서 모세관 분석 흡수체 1/3을 결합시키기 위해 존재한다면, 모세관 21상부 1/3에서 모두 결합한다. 모세관 바닥 2/3는 거기에 결합된 어떤 분석 시약을 갖지 않는다. 분석 시약이 아미도블랙과 같은 염료를 갖는다면, 결합된 분석 시약의 양과 분석 유체내의 실험물질의양은 모세관 21의 육안 관찰로 결정될 수 있다. 물론, 염료로 착색된 눈금 모세관의 길이는, 실험물질의 존재때문에 결합되지 않는 분석시약의 비율과 분석흡수체의 밀도와 비교되어야 한다. 이 관계는 실험적 또는 분석적으로 결정된다.
상기한 바와같이, 분석 흡수체의 컬럼에서 결합된 분석 시약의 존재를 검출하는 또 다른 방법이 가능하다. 예를들면, 분석시약이 효소를 함유한다면, 효소 활성을 분석하기 위해서 분석 흡수체 튜브를 통과시킬 수 있다. 효소 반응물질과 효소의 생성물은 유리구슬 23 사이에서 구멍의 물리적 성질 때문에 컬럼에 고정된다. 형광 화합물이 분석 시약에 이용된다면, 분석 흡수체의 컬럼은, 분석시약이 결합된후, 형광실험이 실시된다. 최종적으로, 방사성 동위원소가 분석시약에 이용된다면, 분석흡수체의 컬럼은, 분석시약이 결합된후 방사성 동위원소의 존재에 대해 관찰될 수 있다.
수많은 경우에, 효소 활성 분석이 대부분의 다른 분석 형태보다 더 민감하기 때문에, 분석시약에 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에서는 유체를 컵 31에 첨가하기전 분석 시약을 분석유체와 혼합되는 반면, 유체는 혼합될 필요가 없으며 필요한 1차 흡수체와 접촉될 필요가 없다. 또한, 분석은 역순으로 실시될 수 있다 : 먼저 유체를 분석하고 두번째는 분석시약을 분석한다.
순서는 대부분의 경우에 중요하지 않은데, 그 이유는, 분석시약이 먼저 결합된다면 일반적으로 실험물질이 1차 흡수체에 의해 결합된 분석시약을 대체시키기 때문이다. 반대로, 실험물질이 먼저 결합된다면 실험물질은 분석시약에 의해 대체될 수 없다.
어떤경우에, 분석시약과 분석유체의 첨가순서는 중요할 때가 있다. 예를들면, 분석시약이 1차 흡수 체만으로 특별히 결합되지 않고 실험물질이 결합된 1차 흡수체에 의해 결합된다면, 분석 유체는 먼저 분석 시약다음에 첨가되어야 한다. 더우기, 이러한 형태의 분석에서, 실험물질의 양과 비례하는 구슬 23에 결합된 양은 구슬 37에 의해 결합된 분석 시약의 양이다. 이러한 분석의 예로는 특정 항체에 대한 분석이며, 여기서, 1차 흡수체는 이 항체에 특별한 항원이고 분석시약은 항원에 대한 것이 아니고 특정 항체에 특별한 항체이다. 이 경우에, 항체를 함유하는 분석유체는 1차 흡수체(항원)와 접촉되어야 하며 분석 시약(앤티 항체-검출가능한 물질-분석 흡수체에 의해 결합된 물질)은 1차 흡수체와 접촉되어야 한다. 분석시약은 먼저 1차 흡수체와 유일하게 접촉될 수 없다.
실험물질에 직접 결합된 분석시약을 결합시키는 방법은 약간 다른 형태의 분석법을 제공하는데 이용될 수 있다. 이 분석법에서, 분석시약은 1차 흡수체만으로 결합될 필요가 없기 때문에, 1차 흡수체는 실험물질에만 특성을 갖는다. 실험물질이 결합되지 않는다면 분석시약을 통과시키는 반면 실험물질이 결합될 수 있다면, 상기 특성은 필터와 같은 비화학적 1차 흡수체를 허용한다.
본 발명의 방법 및 장치는 색 또는 강도 판정을 필요로하는 분석을 개량시킨 정량 분석을 제공한다. 본 발명은 분석시약에 대한 검출 방법의 민감성 뿐만 아니라 분석 흡수체의 선밀도를 조절함으로써 바람직할 정도로 민감하게 만들어질 수 있다. 극도로 민감한 정량분석은 분석 흡수체의 미세한 선밀도와 효소-명명의 분석시약으로 실시될 수 있다.
실험물질의 양을 분석할때, 분석 흡수체의 대수 선밀도를 이용하는 것이 때때로 바람직하다. 이러한 것은 미지의 양이 광범위하게 변할 수 있는 경우에 특히 적용된다. 컬럼의 입구를 낮게하고 컬럼의 출구쪽으로 점차 더크게 분석흡수체의 밀도를 만들므로서, 상기와 같은 대수 스케일은 더 넓은 범위로 정량 측정을 연장한다. 이와같이 여러밀도를 제공하는 한 방법은 상부에서 좁고 그 하단부를 향해 점차적으로 넓어지는 모세관(모세관 21 대신에)을 제공하는 것이다.
직선 밀도를 이용하는 감을 실험을 제공하는 또다른 방법은 분석시약과 혼합되는 분석 유체를 점점 소량으로 사용하여 실험을 실시하는 것이다. 예를들면, 첫번째 분석실험에서 분석 흡수체가 분석시약과 완전 결합되는 컬럼을 형성시킨다면, 제2실험은 분석유체 양의 1/10을 이용하여 실시될 수 있다. 분석 흡수체의 일부만이 분석시약과 결합될때까지 분석 유체를 서서히 감소시키면서 첨가한다. 분석 유체중 실험물질의 양적밀도는 측정될 수 있다.
상기 방법중 하나는 분석유체와 함께 1차 흡수체에 분석 시약을 첨가하는 것을 설명할지라도, 먼저 분석시약을 첨가할 수 있다. 그러나, 수많은 경우에, 분석시약을 접촉 건조시킬 수 없으며 1차 흡수체에 의해 결합시킬 수 없는데, 그 이유는, 실험물질은 한번 건조되면 1차 흡수체로 부터 분석 시약을 즉시 대체하지 못하기 때문이다.
상기에서 나타낸 바와같이, 본 발명의 분석 방법은 공칭 성분으로 부터 불용화된 성분을 분리하기위한 세척을 필요로하지 않는다. 그 이유는 1차 흡수체가 침투가능한 지지체에 고정되기 때문이다. 분석시약은, 1차 흡수체가 단순히 중력에 의해 지지물질을 통과함으로써, 결합되지 않는다. 물론, 유체의 흐름을 더 빠르게 하기 위해서 흡입시킬 수 있다.
세척을 필요로하지 않는 또다른 이유는 분석 흡수체가 분리지역에서 결합되며, 강도 또는 굴절률에 의해 분석을 하기 위해 유체 매개물에 다시 혼합될 필요가 없기 때문이다.
본 발명은 최근에 생성된 히브리도마 또는 모노클로날 항체와 함께 특히 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 항체의 제조는 미국 특허 제4,196,265호에 기술되어 있다. 모노클로날항체의 특징은 특정 비루스 및 항원 결정인자에 대해 쉽게 제조될 수 있다는 것이다. 본 발명에서 결합 또는 결합가능한 물질로서 모노클로날 항체를이용함으로써, 특정 결정인자에 대해 정확하고 양적으로 정확한 방법 및 장치가 제공될 수 있다.
본 발명의 또다른 장점은 장치가 휴대용이며 수명이 길다는 것이다. 그러므로 양적으로 정확하게 분석할 수 있으며 분석장치를 장기간동안 저장할 수 있다. 휴대할 수 있고 수명이 긴것은 지지체로서 사용된 구슬과 막에 분석흡수체와 1차 흡수체를 화학적으로 안정하게 결합시킴으로 이루어진다. 일반적으로, 이들 화학물질은 악영향을 미치지 않고 건조될 수 있다. 더우기, 분석시약은 별도로 저장될 수 있으며 수명이 길다.
그러므로, 본 발명의 분석 방법과 장치는 상기 목적과 장점을 얻는데 적용된다. 본 발명의 양호한 실시예를 상세히 기술하였을지라도, 청구범위에 규정된 본 발명의 범위내에서 부품의 구조 및 배열을 여러가지로 변경시킬 수 있다. 다음 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 설명하기 위해 제공된다.
[실시예]
Ⅰ. 1차 흡수체-1차 흡수체(콕시디오데스 이뮤노디퓨젼 항원)를 다음과 같이 유리 구슬에 접착되었다 :
a. 0.25mm 유리구슬(30g)을 N(β-아미노에틸) γ-아미노프로필트리메톡시실란으로 126℃에서 18시간동안 처리하여 유리 아미노기를 얻었다.
b. 구슬을 아세톤으로 2번 세척하였다.
c. 구슬을 끓는 물로 3번 세척하였다.
d. 구슬을 1% 글루타르알데히드로 30분동안 처리하였다.
e. 구슬을 차거운 증류수로 3번 세척하였다.
f. 형성된 쉬프 염기 구슬을 실온에서 4시간동안 콕시디오데스 이뮤노디퓨젼 항원 5ml와 결합시켰다.
g. 결합된 구슬을 pH7.2인 글리신 완충용액으로 4번 세척하였다.
Ⅱ. 분석 시약-분석 시약(항콕시-갈락토시다제-비오틴)은 다음과 같이 1차 흡수체를 이용하여 제조되었다 :
a. 항-콕시디오데스(염소)10ml를 구슬에 첨가한다음 4℃에서 18시간동안 교반시켰다.(감응화).
b. 결합-감응된 구슬(CSB)을 PBS(인산염 완충염수)로 4번 세척하였다.
c. pH가 7.2인 PBS 15ml에 용해된 CSB를 실온에서 2시간동안 0.1g의 요도아세트아마이드로 처리하였다(SH기를 차단). d. CSB를 PBS로 3번 세척하였다. pH7.2.
e. pH가 7.2인 PBS15ml에 용해된 CSB를 실온에서 2시간 동안 m-말레이미디벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르 0.1g으로 처리하였다.
f. CSB를 pH7.2인 PBS로 3번 세척하였다.
g. pH가 7.2인 PBS15ml에 용해된 CSB를 실온에서 4시간동안 B-갈락토시다제(E coli)의 1000 단위체로 처리하였다(B-갈락토시다제를 항체에 결합).
h. 구슬을 pH7.2인 PBS로 3번 세척하였다.
i. 구슬을 pH7.2인 PBS로 15ml에 현탁시킨다음 실온에서 4시간 동안 0.1g의 d-비오틴-N-히드록시석신이미드 에스테르로 처리하였다.
j. 구슬을 pH7.2인 PBS로 4번 세척하였다.
k. pH7.2인 PBS에 0.1몰 %의 MgCl로 포화된 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-B-D-갈락토시드를 첨가함으로써 B-갈락토시다제의활성에 대한 유리구슬의 시료를 실험하였다. 2분내에 색이 변화되었다.
l. 항-콕시-B-갈락토시다제-비오틴 복합체는, 필터 지지체 아래의 투석막과 구슬에 대한 필터 지지체를 이용한 장치에서 구슬로 부터 전기적으로 용출되었다. pH3.0인 0.01몰 글리신 완충용액은 전기 용출에 사용되었다 ; 400V, 80mA, 3시간, 4℃ 액체 20ml가 투석막위에 존재하였다. 이것은 1ml할당액에 분산된 다음 동결(-20℃)되었다.
Ⅲ. 분석 흡수체-분석흡수체는 다음과 같이 유리 구슬에 결합되었다.
a. 0.25mm 유리구슬 30g을 125℃에서 18시간동안 N(β-아미노엘틸)γ-아미노프로필 트리메톡시실란으로 처리하였다.
b. 구슬을 아세톤으로 2번, 끓는 물로 3번 세척하였다.
c. 구슬을 0.1% 글루타르알데히드 50ml에 1시간동안 현탁시켰다.
d. 구슬을 차거운 증류수로 3번 세척하였다.
e. 구슬을 15ml 염수에 현탁시킨후 0.1g의 아비딘을 첨가한 다음 실온에서 4시간 동안 교반하면서 배양하였다.
f. 구슬을 pH가 7.2인 글리신 완충용액으로 3번 세척하였다.
Ⅳ. 분석 흡수체 구슬과 상기한 1차 흡수체를 사용하여 수개의 장치를 제조하였다. 각 장치는 1ml 피펫을 수용하기위해 그 하단부에 구멍을 갖는 15ml 원심분리튜브로 구성되었다. 분석 흡수체 구슬은 피펫에 느슨하게 충전되었고 1차 흡수체 구슬을 피펫위의 원심분리 튜브에 넣었다. 분석 흡수체의 밀도를 결정하기 위해 다음과 같이 먼저 실험을 하였다 :
a. 컬럼을 분리하기위해, 0.1, 0.25와 0.5ml의 분석시약(AR)을 1차 흡수체에 첨가한후 실온에서 15분동안 배양하였다.
b. 0.1보빈 혈청 알부민(BSA)와 0.01몰의 MgCl2를 함유하는 pH7.2인 PBS 5ml를 각 컬럼에 첨가하였다.
c. 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-B-d-갈락토시드(효소기질)로 포화된 PBS-A 5ml를 각 컬럼에 첨가한 다음, 모든 액체를 상(床)에 도입했을 때 상부를 밀봉하여 실온에서 배양하였다.
d. 착색된 지역의 길이는 다음과 같다 : 1. 0.1ml AR-0mm지역 2. 0.25ml AR-4mm지역 3. 0.5ml AR-7mm
Ⅴ. 지역 길이의양적인 비율을 실험하는 것은 다음과 같이 실시되었다 :
a. 각 AR 0.2ml를 8개의 튜브에 분산시킨다음 콕시항체를 함유하는 것으로 알려진 다음 혈청의 양을 각 튜브에 첨가하였다 :
Figure kpo00001
b. 각 튜브의 내용물을 별도의 컬럼에 옮긴뒤 실온에서 30분동안 배양하였다.
c. PBS-A 5ml를 각 컬럼에 첨가한 다음 컬럼을 통과시켰다.
d. 효소 기질 2ml를 각 컬럼에 첨가한 다음 그 컬럼을 통과시킨 후 컬럼을 밀봉하였다. 실온에서 1시간동안 배양하였다.
e. 착색된 지역의 측정은 다음과 같았다 :
Figure kpo00002
상기에서 알 수 있는 바와같이, 지역 길이는 약간 변화되었다. 이들 변화는, 분석시약의 밀도를 변화시키는 구슬의 충전을 다르게 하였기 때문에 발생하였다. 한편, 지역 길이는 분석 시약과 실험 물질에 선상 비율을 갖는 경향이 있다.
상기 설명과 도면을 참고로 설명한 것은 본 발명의 원리를 단순히 예증하는 것이며 그 한계를 규정하는 것은 아니다.

Claims (7)

  1. 유체를 수용 및 유도하기 위한 유체유도수단 : 분석될 실험물질과, 1차 흡수체의 상의 포화흡수능력에 대응하는 양의 분석시약이, 도입될 때 실험물질의 양에 비례하는 분석시약의 양이 유체유도수단으로 통과할 수 있도록 실험물질과 분석시약 양자를 선택적으로 결합할 수 있는 1차 흡수체의 상 : 분석 시약과 견고하게 결합할 수 있는 분석흡수체 : 그리고 분석시약의 선결된 양이 각 지역에서 포착될 수 있도록 하고 분석시약이 유체 유도수단을 통과함으로써 분석시약이 지역내에 연속적으로 포착될 수 있도록 하기 위해 일련의 연속 또는 단속지역에서 분석 흡수체의 선결된 양을 유체유도 수단내에 유지하기 위한 유체 유도수단에 위치하고 긴 통로를 형성하는 지지수단으로 구성된 실험물질의 분석장치.
  2. 제1항에 있어서, 유체를 수용하기 위한 제1구멍을 갖는 제1유도수단 : 1차 흡수체 물질의 선결된 양 : 제1 유체 유도수단을 통과하는 유체를 접촉시킬 수 있도록 배치된 1차 흡수체 물질을 유지하기 위해 1차 흡수체 물질이 부착되는 제1유체 유도수단에 위치한 제1 지지수단 : 제1유체 유도수단으로부터 유체를 수용하도록 연결된 제2 유체 유도수단 : 그리고 분석시약과 견고하게 결합할 수 있는 분석 흡수체 : 분석 시약이 제2 유체 유도수단을 통과함으로써 지역내에서 연속적으로 흡수될 수 있도록 하는 제2 유체 유도수단내에서 일련의 연속 또는 단속지역에서 분석 흡수체 물질의 선결된 양을 지지하기 위해 분석 시약이 부착되어 있는 제2 유체 유도수단에 위치한 제2 지지수단 : 분석 시약이 흡수되는 제2 유체 유도수단에서 최종 지역을 검출하는 수단과 조합되어 구성된 실험물질의 분석장치.
  3. 제12항에 있어서, 제1 유체 유도수단으로서, 유체를 깔대기의 조그만 구멍 아래쪽으로 내려가게 하는 깔대기 : 깔대기를 통해 흐르는 유체를 접촉시키기 위해 깔대기내에 포함된 선결된 양의 1차 흡수체 물질 : 제2 유체 유도수단으로서, 깔대기의 작은 구멍으로부터 아래로 흐르는 유체를 수용하도록 연결된 좁고 투명한 튜브 : 분석시약이 흡수되는 튜브의 길이가 흡수되는 분석시약의 양에 비례하도록 하고 분석시약이 튜브에 도입될 때 분석시약이 튜브내에 연속적으로 흡수되도록 하기 위해 분석시약을 결합하는 튜브내에 함유되고 선결된 밀도를 갖는 분석 흡수체로 구성된 실험물질의 분석장치.
  4. 제1항에 있어서, 유체 유도수단으로 들어가는 유체가 접촉될 수 있도록 위치한 항체, 항원, 결합 단백질, 결합 가능한 단백질, 다당류, 항생제, 홀몬 또는 독소인 선결된 양의 1차 흡수체 물질을 포함하고 : 분석 흡수체가 아비딘 또는 비오틴을 포함하고 : 그리고 지지수단은 분석흡수체가 결합된 구슬을 포함하는 장치.
  5. 실험물질과 분석시약을 제1항에 따른 장치 또는 1차 흡수체 물질에 통과시킨 후 제2항에 따른 장치의 분석 흡수체 물질에 통과시킨 다음 분석 시약이 결합되는 제2 유체 유도수단에서 최종 지역을 검출하는것으로 구성되는 실험물질의 분석방법.
  6. 분석될 실험물질과, 1차 흡수체의 상의 포화흡수능력에 대응하는 양의 분석시약이, 도입될 때 실험물질의 양에 비례하는 분석시약의 양이 제1 지역을 통과할 수 있도록 실험물질과 분석시약 양자를 선택적으로 결합할 수 있는 선결된 양의 1차 흡수체 물질을 제1 유체-도입지역에 제공하고 : 선결된 양의 분석시약과 실험물질을 제1 지역에 도입하고 : 분석시약을 견고히 결합할 수 있는 분석 흡수체를 함유하는 일련의 유체-유도지역을 제공하고 : 모든 분석시약이 결합될 때까지 제1 지역으로부터 나온 분석시약의 결합되지 않은 부분을 일련의 지역으로 연속적으로 도입한 다음 : 분석시약이 결합되는 일련의 지역중 최종 지역을 검출하는 것으로 구성된 실험물질의 분석방법.
  7. 제5항에 있어서, 1차 흡수체 물질이 항체, 항원, 결합 단백질, 결합 가능한 단백질, 다당류, 항생제, 홀몬 또는 독소이고 : 분석 흡수체 물질이 아비딘 또는 비오틴 또는 항원, 항체, 효소, 효소기질 동족체 또는 미엘로마 단백질이고 : 분석시약이 1차 흡수물질 또는 실험물질에 의해 결합될 수 있는 제1 물질, 분석흡수체 물질에 의해 특별히 결합될 수 있는 제2 물질과 검출 가능한 그룹을 혼합한 화합물인 방법.
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