CN109738537B - 一种环境水体中多种残留药物的同时提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环境水体中多种残留药物的同时提取方法。该方法首次采用甲醇的酸碱洗脱液分级洗脱与含甲醇的酸洗液和碱洗液的分级淋洗方式，简化并优化了水体样品抗生素和内分干扰素类药物的前处理提取条件，省去了内分泌干扰素类药物在传统的固相萃取方法后的硅胶柱净化步骤，提高了选择性和增强待测物质的出峰响应强度。同时，本发明的提取方法结合超高效液相色谱‑质谱联用技术可实现高选择性、高灵敏度的快速同时定量检测水环境中多种抗生素和内分泌干扰素类药物，可以满足各种环境水体中痕量药物的检测需求，具有很好的应用前景。

Description

一种环境水体中多种残留药物的同时提取方法

技术领域

本发明属于环境检测技术领域。更具体地，涉及一种环境水体中多种抗生素和内分泌干扰素类药物的同时前处理提取方法。

背景技术

环境水体的药物残留检测对于环境水体的监测及药物污染评估与防治工作具有重要的意义。抗生素和内分泌干扰素类药物是常见的水体药物残留物。抗生素种类多，使用范围广，因具有预防和治疗疾病、促进生长的作用，被广泛应用于人类和动物医疗和牲畜饲养业。抗生素进入人体或动物体后仅有一小部分被吸收，约有10%～90%以原药形式随着动物粪便排放到环境中。环境中抗生素残留会促进抗性基因(ARGs)的发生和传播，抗生素抗性基因通过水平转移等途径，造成致病菌获得多重耐药性，对人类健康和生态环境造成巨大威胁。而内分泌干扰素也称为环境激素，是一种外源性干扰内分泌系统的化学物质，能干扰人类或动物内分泌系统正常运作，其低剂量的持续性输入，也能让生物体的内分泌失衡，出现种种异常现象如动物体和人体生殖器障碍、行为异常、生殖能力下降、幼体死亡、甚至灭绝。

环境水体中抗生素和内分泌干扰素类污染物的种类繁多，成分复杂，药物浓度较低（通常低至ng/L）且受环境水体基质干扰影响较大。目前针对环境水体中抗生素和内分泌干扰素类药物的前处理以固相萃取方法为主，采取固相萃取为前处理方式可以去除部分杂质，降低基质效应。但是水样品经固相萃取后，其中不同类型的药物待测物需要不同的洗脱溶剂和洗脱条件提取，不同类别抗生素和内分泌干扰素需要各自对应的洗脱条件，无法满足多种抗生素或内分泌干扰素的同时前处理提取，而这两类药物通常同时出现在水环境中，且内分泌干扰素类药物在固相萃取步骤后还需要单独进行硅胶柱净化，以上技术的局限造成水体样品药物污染提取过程中多工序、多环节、多样品量等费时费力的操作，不利于环境水体污染的快速检测和风险评估。

随着人们对水质安全标准的要求日益提高，快速、灵敏、高效、准确地定量环境水体中同时存在的多种痕量药物污染的检测方法亟待突破。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中水体中多种药物残留无法同时提取的技术缺陷和不足，提供一种快速、高效的水环境多种抗生素和内分泌干扰素类药物的同时提取方法。

本发明的目的是提供一种环境水体中多种抗生素和内分泌干扰素类药物的同时前处理提取方法。

本发明另一目的是提供一种环境水体中多种抗生素和内分泌干扰素类药物的检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种环境水体中多种抗生素和内分泌干扰素类药物的同时前处理提取方法，包括如下步骤：

S1.环境水样品的预处理

将环境水样品过滤后加入金属螯合剂，同时加入色谱级甲醇；

S2.固相萃取富集浓缩过程

依次用甲醇和超纯水活化固相萃取小柱，将步骤S1中处理过的水样过固相萃取小柱进行富集，富集结束后用含色谱级甲醇的超纯水溶液淋洗，在真空条件下干燥固相萃取小柱；

S3.固相萃取洗脱收集过程

将步骤S2中抽干的固相萃取小柱采用不同洗脱液分级洗脱和酸碱分级淋洗方式，收集的洗脱液用氮气吹干，残渣加入色谱级甲醇溶解，涡旋后过滤，得到待测试样品。所得到的待测试样品-20℃保存，等待超高效液相色谱-质谱联用定量检测。

其中，优选地，步骤S1中所述金属螯合剂为EDTA螯合剂。

优选地，步骤S1中金属螯合剂生物加入量为0.2-0.8 g/1000mL水样，色谱级甲醇加入量为30-60 mL/ 1000mL水样。

优选地，步骤S2中所述固相萃取小柱为HLB固相萃取小柱。

优选地，步骤S2中过柱的流速为8-12mL/min（最优选10 mL/min）。

优选地，步骤S2中含色谱级甲醇的超纯水溶液中甲醇的浓度为2%-10%。

优选地，步骤S2中所述干燥的时间为1-2 h。

优选地，步骤S3中所述涡旋的时间为15-40 s。

优选地，步骤S3中所述过滤是使用0.22 μm有机相尼龙滤膜过滤。

优选地，步骤S3中洗脱液包括甲醇酸性溶液和甲醇碱性溶液，所述分级淋洗所用的淋洗液包括甲醇酸洗液和甲醇碱洗液；所述采用不同洗脱液分级洗脱和酸碱分级淋洗方式的具体方法如下：

S31.先用甲醇酸性溶液进行第1次洗脱，洗脱液收集转移至玻璃管；

S32.再用甲醇酸洗液进行第1次淋洗；

S33.再用甲醇碱洗液进行第2次淋洗；

S34.最后用甲醇碱性溶液进行第2次洗脱；

S35.洗脱液收集转移至玻璃管，所有洗脱液样品最终通过氮气流吹干浓缩，近干时加入色谱纯甲醇定容，过0.22μm有机相尼龙滤膜，并转移至2 mL棕色进样小瓶中。

，优选地，S31中所述甲醇酸性溶液的甲醇浓度为5%-20%。

更优选地，S31中所述甲醇酸性溶液为甲醇-醋酸溶液。

更优选地，S32中所述甲醇酸洗液为5%甲醇-2%醋酸。

更优选地，S33中所述甲醇碱洗液为5%甲醇-2%氢氧化铵。

更优选地，S34中所述甲醇碱性溶液为甲醇-氢氧化铵溶液。

更优选地，S34中所述甲醇碱性溶液的浓度为80%-100%（最优选90%）。

另外，基于上述提取方法，本发明还提供一种环境水体中多种抗生素同时检测和多种内分泌干扰素类药物的同时检测方法，是利用上述提取方法对待测样品处理后，进行超高效液相色谱-质谱联用检测。

优选地，抗生素检测的色谱条件如下：

色谱柱为Agilent C18柱（2.1×100 mm，2.7 μm，120A），柱温35℃；流动相包括0.1%甲酸-水（A）水相溶液和0.1%甲酸-乙腈（B）有机相溶液，采用梯度洗脱程序：2% B（0min）、80% B（5 min）、80% B（8 min）、20% B（8.1 min）、20% B（10 min）；流速为0.5 mL/min；进样量2 μL；

优选地，抗生素检测的质谱条件如下：

离子源为ESI 源正离子模式；气帘气压力35 psi，离子源电压为5500 V，干燥气温度550℃，压力50 psi；雾化气压力50 psi，检测方式为多反应离子检测（MRM）。

优选地，内分泌干扰素检测的色谱条件如下：

色谱柱为Agilent C18柱（2.1×100 mm，2.7 μm，120A），柱温35℃；流动相包括超纯水（A）水相溶液，甲醇（B）有机相溶液，采取梯度洗脱程序：0 min 50% B，5 min 100% B，7min 100% B，7.1 min 50% B，10 min 50% B；流速0.5 mL/min；进样量5μL；

优选地，内分泌干扰素检测的质谱条件如下：

离子源为ESI 源负离子模式；气帘气压力35 psi，离子源电压为-4500V，干燥气温度500℃，压力50 psi；雾化气压力55 psi，检测方式为多反应离子检测（MRM）。

保留时间：9种抗生素（磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星）和5种内分泌干扰素（雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生）保留时间依次分别为0.98、0.92、0.60、2.84、1.78、1.04、0.88、0.86、0.43、3.19、4.89、2.68、4.43、4.48min。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种涉及环境水体中14种抗生素和内分泌干扰素类药物的同时提取方法，具体是采用不同洗脱液分级洗脱和酸碱洗液分级淋洗方式作为环境水样品中药物污染检测的前处理提取方法。本发明首次采用甲醇的酸碱洗脱液分级洗脱与含甲醇的酸洗液和碱洗液的分级淋洗方式，简化并优化了水体样品抗生素和内分干扰素类药物的前处理提取条件，省去了内分泌干扰素类药物在传统的固相萃取方法后的硅胶柱净化步骤，提高了选择性和增强待测物质的出峰响应强度。本方法为固相萃取前处理技术的开发应用提供了新思路，也为对环境水体中多种痕量药物残留的快速同时提取优化了方法。

同时，本发明上述的提取方法结合超高效液相色谱-质谱联用技术可快速同时定量检测水环境中14种抗生素和内分泌干扰素类药物。污水中9种抗生素的检出限低至3 ng/L，5种内分泌干扰素类药物的检出限低至2 ng/L，实现对多种抗生素和内分泌干扰素类药物的高选择性和高灵敏度的快速定量检测，可以满足各种环境水体中痕量药物的检测需求。

本发明克服了现有方法有机试剂消耗大、过程繁琐及水体样品中多种不同药物待测物不能同时提取的普遍问题，能够快速、准确检测水环境中14种抗生素和内分泌干扰素类药物的污染水平，测定结果灵敏、准确、快速，属于环境检测技术领域，可用于环境水体的药物污染评估。

附图说明

图1为最优提取方案处理的14种药物回收率；注：磺胺砒啶（SPD）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ2）、磺胺甲恶唑（SMX）、罗红霉素（ROX）、四环素（TC）、氧氟沙星（OTC）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、雌酮（E1）、壬基酚（t-NP）、双酚A（BPA）、三氯卡班（TCC）、三氯生（TCS）。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用实验材料如下：

实验仪器：超高效液相色谱-质谱联用仪（AB sciex QTRAP5500, US）、涡旋仪、氮吹仪、电子天平。

试剂：甲醇（HPLC）、超纯水、醋酸、盐酸、氢氧化铵、Na₂-EDTA。

药物标准品包括9种抗生素（磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星）和5种内分泌干扰素（雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生）均购置于Sigma公司。

实施例1 固相萃取洗脱条件的优化

选择针对环境中常见的9种抗生素（磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星）和5种内分泌干扰素（雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生）残留药物，采用单因素影响试验，考察HLB固相萃取柱中富集的抗生素和内分泌干扰素类药物的不同洗脱条件，通过最佳回收率和标准偏差数据来选择最优洗脱条件。

结果显示，最佳固相萃取洗脱收集过程如下：

洗脱方式为先用5mL 10%的甲醇-醋酸溶液进行第1次洗脱，洗脱液收集转移至玻璃管，再用10mL 5%甲醇-2%醋酸的酸洗液进行第1次淋洗，再用10mL 5%甲醇-2%氢氧化铵的碱洗液进行第2次淋洗，最后用5mL 90%的甲醇-氢氧化铵溶液进行第2次洗脱，洗脱液收集转移至玻璃管，所有洗脱液样品最终通过氮气流吹干浓缩，近干时加入1 mL色谱纯甲醇定容，过0.22 μm有机相尼龙滤膜，并转移至2 mL棕色进样小瓶中。

用以上优化的固相萃取洗脱方式提取的污水中抗生素回收率为76.3%～112.7%，内分泌干扰素类药物回收率为93.2%～116.6%。

实施例2 污水中多种抗生素和环境激素的同时提取与定量检测试验

利用实施例1优化的固相萃取洗脱条件，结合超高液相色谱-质谱联用定量检测环境水体样品中9种抗生素和5种内分泌干扰素类药物。同时对色谱与质谱条件进行优化研究。

一种污水中多种抗生素和环境激素的同时提取与定量检测方法，具体步骤如下：

（1）污水样品的预处理

采集1000 mL污水样品，经过Whaterman的Φ = 0.7μm的玻璃纤维滤膜过滤后，加入0.6 g EDTA钠盐螯合剂，同时加入50 mL色谱级甲醇，充分混匀。

（2）固相萃取富集浓缩过程

将以上14种待测物质的对应内标物质（各100 ng）加入已过滤的水样品中。固相萃取富集浓缩开始时每个小柱先后用约10 mL甲醇和10 mL 超纯水活化，然后加载水样品，流速大约为10 mL/min，当样品加载完毕后，用50 mL含5%甲醇的超纯水洗溶液涤样品瓶2次后，在抽真空条件下干燥2 h。

（3）固相萃取洗脱收集过程

洗脱方式为先用5mL 10%的甲醇-醋酸溶液进行第1次洗脱，洗脱液收集转移至玻璃管，再用10mL 5%甲醇-2%醋酸的酸洗液进行第1次淋洗，再用10mL 5%甲醇-2%氢氧化铵的碱洗液进行第2次淋洗，最后用5mL 90%的甲醇-氢氧化铵溶液进行第2次洗脱，洗脱液收集转移至玻璃管，所有洗脱液样品最终通过氮气流吹干浓缩，近干时加入1 mL色谱纯甲醇定容，过0.22 μm有机相尼龙滤膜，并转移至2 mL棕色进样小瓶中。

（4）超高液相色谱-串联质谱定量检测抗生素

色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱（2.1×100 mm，2.7μm，120A），柱温：35℃；流动相：0.1%甲酸-水（A）； 0.1%甲酸-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0min 20%B，5min 80% B，8min 80% B，8.1min 20% B，10min 20% B；流速0.5 mL/min；进样量：2 μL。

离子源：电喷雾离子化源（ESI 源正离子模式），气帘气压力35 psi，离子源电压为5500 V，干燥气温度550 °C，压力50 psi；雾化气压力50 psi。检测方式：多反应离子检测（MRM）。

（5）超高液相色谱-串联质谱定量检测环境激素

色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱（2.1×100 mm，2.7μm，120A），柱温：35℃；流动相：超纯水（A）、甲醇（B）；梯度洗脱程序：0 min 50% B，5 min 100%B，7 min 100% B，7.1 min 50% B，10 min 50% B；流速0.5 mL/min；进样量：5μL。

离子源：电喷雾离子化源（ESI 源负离子模式），气帘气压力35 psi，离子源电压为-4500V，干燥气温度500 °C，压力50 psi；雾化气压力55 psi。检测方式：多反应离子检测（MRM）。

保留时间：磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生保留时间依次分别为0.98、0.92、0.60、2.84、1.78、1.04、0.88、0.86、0.43、3.19、4.89、2.68、4.43、4.48min。

实施例3 校园污水中14种抗生素和环境激素的提取与定量检测试验

1、实验方法

采集1000 mL校园生活污水，按照实施例2中的方法对校园生活污水样品进行处理检测。

3、实验结果

（1）检测方法的线性关系与灵敏度

在上述色谱和质谱分析条件下，磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生的标准曲线的相关系数高达0.9984，仪器检测限为 0.005-0.326 µg/L, 定量限为0.018-0.416 µg/L。

（2）提取回收率

校园生活污水样品中加入100 μg/L的各待测物质，按上述步骤固相萃取富集浓缩、多级洗脱和淋洗、氮气吹干、甲醇溶解后，利用超高效液相-质谱串联检测目标测试物质的浓度，计算磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生的回收率分别为84.7%、87.0%、112.7%、111.4%、103.4%、114.5%、76.3%、96.7%、80.1%、93.2%、116.6%、106.2%、94.2%、110.2%；标准偏差在1.2%~10.8%之间。

（3）校园生活污水抗生素和环境激素的污染水平

校园生活污水样品中除磺胺嘧啶未检出外，磺胺砒啶、、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班、三氯生的浓度分别为337.8、4.6、10.6、147.6、14.5、96.6、54.9、14.1、25.9、1095.7、81.0、3.1、12.9 μg/L，说明以上水样品的提取和检测方法能满足实际环境水样品药物污染的定量检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种环境水体中多种抗生素和内分泌干扰素类药物的同时前处理提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.环境水样品的预处理

将环境水样品过滤后加入金属螯合剂，同时加入色谱级甲醇；

S2.固相萃取富集浓缩过程

依次用甲醇和超纯水活化固相萃取小柱，将步骤S1中处理过的水样过固相萃取小柱进行富集，富集结束后用含色谱级甲醇的超纯水溶液淋洗，在真空条件下干燥固相萃取小柱；

S3.固相萃取洗脱收集过程

将步骤S2中抽干的固相萃取小柱采用不同洗脱液分级洗脱和酸碱分级淋洗方式，收集的洗脱液用氮气吹干，残渣加入色谱级甲醇溶解，涡旋后过滤，得到待测试样品；

步骤S3中洗脱液包括甲醇酸性溶液和甲醇碱性溶液，所述分级淋洗所用的淋洗液包括甲醇酸洗液和甲醇碱洗液；所述采用不同洗脱液分级洗脱和酸碱分级淋洗方式的具体方法如下：

S31.先用甲醇酸性溶液进行第1次洗脱，洗脱液收集转移至玻璃管；

S32.再用甲醇酸洗液进行第1次淋洗；

S33.再用甲醇碱洗液进行第2次淋洗；

S34.最后用甲醇碱性溶液进行第2次洗脱；

S35.洗脱液收集转移至玻璃管，所有洗脱液样品最终通过氮气流吹干浓缩，近干时加入色谱纯甲醇定容，过0.22μm有机相尼龙滤膜，并转移至2 mL棕色进样小瓶中；

步骤S31中所述甲醇酸性溶液为甲醇-醋酸溶液；

步骤S31中所述甲醇酸性溶液的甲醇浓度为5%-20%；

步骤S32中所述甲醇酸洗液为5%甲醇-2%醋酸；

步骤S33中所述甲醇碱洗液为5%甲醇-2%氢氧化铵；

步骤S34中所述甲醇碱性溶液为甲醇-氢氧化铵溶液；

步骤S34中所述甲醇碱性溶液的甲醇浓度为80%-100%；

所述抗生素为磺胺砒啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、罗红霉素、四环素、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星，内分泌干扰素为雌酮、壬基酚、双酚A、三氯卡班和三氯生。

2.一种环境水体中多种抗生素和内分泌干扰素类药物的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述方法对待测样品处理后，进行超高效液相色谱-质谱联用检测。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，

抗生素检测的色谱条件如下：

色谱柱为Agilent C18柱，2.1×100 mm，2.7 μm，120A；柱温35℃；

流动相为A相：0.1%甲酸-水水相溶液和B相：0.1%甲酸-乙腈有机相溶液；

采用梯度洗脱程序：0 min 20% B相、5 min 80% B相、8 min80% B相、8.1 min 20% B相、10 min 20% B相；流速为0.5 mL/min；进样量2 μL；

抗生素检测的质谱条件如下：

离子源为ESI 源正离子模式；气帘气压力35 psi，离子源电压为5500 V，干燥气温度550℃，压力50 psi；雾化气压力50 psi，检测方式为多反应离子检测；

内分泌干扰素检测的色谱条件如下：

色谱柱为Agilent C18柱，2.1×100 mm，2.7 μm，120A；柱温35℃；

流动相为A相：超纯水水相溶液，B相：甲醇有机相溶液；

采取梯度洗脱程序：0 min 50% B相，5 min 100% B相，7 min 100% B相，7.1 min 50%B相，10min 50% B相；流速0.5 mL/min；进样量5μL；

内分泌干扰素检测的质谱条件如下：

离子源为ESI 源负离子模式；气帘气压力35 psi，离子源电压为-4500V，干燥气温度500℃，压力50 psi；雾化气压力55 psi，检测方式为多反应离子检测。

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