CN102766186B - 富含蜕皮激素的植物标准提取物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种富含蜕皮激素的植物标准提取物的制备方法及应用。取富含蜕皮激素的植物原料，用乙醇回流提取，过滤，浓缩，离心。离心的上清液经脱色，大孔树脂柱层析纯化，浓缩，干燥，即得到标准提取物。该方法简单易行，生产周期短，质量稳定可控，易于规范化批量制备和工业化生产，应用该方法得到的提取物经HPLC指纹图谱检测相似度达99%以上。可应用于制备固定制剂作为降低血糖、抗风湿关节炎的药物，以及作为天然化妆品的原料，还可以用于动物养殖业。

Description

富含蜕皮激素的植物标准提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于天然产物化学和健康产品领域，具体地说是一种富含蜕皮激素的植物标准提取物的制备方法及应用。

背景技术

蜕皮激素(ecdysterone)为天然存在的甾酮类化合物，其结构图如图1所示，主要是β-蜕皮激素(β-ecdysone)。也包括具有同样的以6-酮-7-烯-27-甾体为基本骨架的天然产物。蜕皮激素具有特殊的生理功能，是天然药物、保健食品、天然化妆品的活性有效物质。植物中蜕皮激素及其类似物的发现，为蜕皮激素的大量制备提供了天然资源。

目前，从植物中提取蜕皮激素的方法，多以水加热提取后，用乙酸乙酯等有机溶剂萃取，硅胶柱层析纯化。不仅提取率较低，而且操作繁复，成本较高，不适用于工业化生产。且产品常伴有乙酸乙酯和正丁醇等有机溶剂残留，不容易除去，不利于环保。

已公开或授权的有关蜕皮激素提取和应用的专利，只提供一种植物提取蜕皮激素的方法，均采用多种有机溶剂提取，产品只提供蜕皮激素的含量，未能建立标准提取物的制备与分析检测技术。例如，中国专利201010039119.1公布了一种从露水草中提取蜕皮激素的方法。该方法以水或乙醇（或甲醇）提取露水草根，提取液浓缩后碱化，用正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，通过阴离子交换树脂纯化。该方法仅以露水草为原料，采用多种有机溶剂萃取，操作繁复，成本较高，不利于工业化生产和环保。

发明内容

本发明的目的是改变传统的用乙酸乙酯等有机溶剂萃取制备蜕皮激素的工艺，提供一种适于工业化生产的新方法，批量制备富含蜕皮激素的植物标准提取物以及它的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：

1、将富含蜕皮激素的植物原料加入10倍量的乙醇回流提取，共提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液得乙醇提取液；

2、将乙醇提取液放置，冷却至室温，过滤，将滤液以一定流速通过D941大孔树脂层析柱，树脂与提取液的重量比为1:10-20 , 柱径高比为1:8-10，以含水低级醇洗脱，洗脱量为2-3BV，同时，用薄层层析法TLC检测指导洗脱，TLC的条件，展开剂：乙酸乙酯；显色剂：10 %硫酸乙醇液，收集富含蜕皮激素部位的洗脱液，浓缩至小体积，通过大孔树脂HPD-100层析柱，大孔树脂与样品的重量比为10:1-0.5，柱径高比为1:8-10，以含水低级醇梯度洗脱，用TLC法检测指导洗脱，TLC的条件为，展开剂：乙酸乙酯；显色剂：10 %硫酸乙醇液，收集富含蜕皮激素部位的洗脱液；

3、将洗脱液减压浓缩，干燥，干燥方法可以冷冻干燥，也可采用真空干燥、加热干燥、喷雾干燥和减压干燥等。

按上述方法得到的产物为白色至类白色粉末，经HPLC（高效液相色谱）技术分析检测，为不同植物原料的不同规格的富含蜕皮激素的系列植物标准提取物。

富含蜕皮激素的植物原料来源于鸭跖草科植物珍珠露水草（Cyanotis arach-noidea C. B. Clarke）、苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata Blume)。菊科植物漏芦（Rhaponticum uni-florum（L.） DC.），唇形科植物筋骨草（Ajuganipponensis Makino）等，及其同属植物。

所述的柱层析用的填充剂为大孔树脂，包括但不限于DM-130, D-941, D-2026, D-101, DA-201, D-1400, AB-8, CAD-40, CAD-45, ADS-5, HPD-500, HPD-100, 以及XAD-2，XAD-4，Diaion型号的树脂。

所述的柱层析分离用的洗脱剂，可以是水和低级醇，包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等中的一种低级醇。采用不同比例的水和低级醇混合溶剂进行梯度洗脱。需要根据对植物标准提取物的不同标准要求，以及具体的植物原料和投样量，优选合适的工艺参数，并应用TLC和（或）HPLC技术进行在线质量监测。

本发明所述的方法具有如下优点：仅用水和低级醇提取制备富含蜕皮激素的植物标准提取物, 得率高、制备过程简单易行、生产周期短、质量稳定可控、无毒、无三废污染，适宜于批量制备和工业化生产，应用该方法得到的提取物经HPLC指纹图谱检测相似度达99%以上。本发明提取用的低级醇，可回收使用。本发明使用的柱层析填充剂材料可以重复使用，生产成本低。

本发明的富含蜕皮激素的植物标准提取物可按药品和保健食品生产的规范要求，作为生理活性天然物质，制成各种口服制剂，包括：片剂，胶囊剂，颗粒剂，口服液等。该植物标准提取物具有促进胶元蛋白的合成、促进细胞生长、诱导神经细胞分化、保护心脑血管、降低血糖、降低血脂、抗心律不齐、抗疲劳、促智、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、促进伤口愈合、美白保湿、强健肌肉，以及活血化瘀、通经活络，除湿镇痛等生理活性，可用于健康产品，作为药品、保健食品和功能性化妆品的天然原料，还可以用于养殖业。

本发明的富含蜕皮激素的植物标准提取物可以作为功能性天然产物，在化妆品或皮肤外用品中广泛使用。为达到局部施用的目的，可以含水的醇溶液形式、油状溶液形式、水包油或油包水或多相乳状液形式，以及含水或油状凝胶形式，制成软膏，奶液，泡沫，露，气溶胶等剂型，以及固体制剂等。

附图说明

图1蜕皮激素的化学结构图。

图2                                                -蜕皮激素对照品的HPLC图。

图3露水草标准提取物ECA65（66.8%）的HPLC图。

图4露水草标准提取物ECA80（84.7%）的HPLC图。

图5露水草标准提取物ECA95（98.5%）的HPLC图。

图6七批露水草标准提取物ECA80的HPLC指纹图谱。

图7露水草标准提取物ECA65，ECA80，ECA95及-蜕皮激素对照品的TLC图。

具体实施方式

实施例1：露水草标准提取物的制备：

（1）露水草根15 kg，加10倍量乙醇，回流提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，得乙醇提取液；

（2）乙醇提取液放置冷却，至室温，过滤，滤液通过D941大孔树脂层析柱。树脂与提取液的重量比为1:15 , 柱径高比为1:8；以乙醇洗脱；洗脱量为3BV，用薄层层析法TLC检测指导洗脱。薄层层析的条件，展开剂：乙酸乙酯；显色剂：10 %硫酸乙醇液；收集富含蜕皮激素洗脱部位，浓缩至小体积，通过HPD-100大孔树脂层析柱。大孔树脂与样品的重量比为10:1, 柱径高比为1: 8； 以含水乙醇梯度洗脱。用TLC检测指导洗脱。TLC的条件如上述；收集富含蜕皮激素部位的洗脱液；

（3）将洗脱液减压浓缩，干燥，得到白色至类白色粉末；即为富含蜕皮激素的露水草标准提取物；

（4）按上述方法的制备过程中，在TLC和HPLC指导下，收集得到不同规格的富含蜕皮激素的露水草标准提取物。经HPLC定量分析，分别为露水草标准提取物ECA65（蜕皮激素的含量不低于65%），ECA80（蜕皮激素的含量不低于80%）和ECA95（蜕皮激素的含量不低于95%）；

（5）按上述方法制备得到的富含蜕皮激素的露水草标准提取物，其蜕皮激素的含量按以下方法进行测定：

仪器与试剂：HPLC仪器为Agilent1200型高效液相色谱仪。色谱纯乙腈和甲醇，超纯水。

色谱条件及检测波长的选择：十八烷基键合硅胶填充的分析型层析柱（如：Agilent ZORBAX SB C18 (4.6×250 mm) ；流动相：乙腈-甲醇-水=1:2:4；柱温：30 ℃ ; 流速: 1 ml/min ; 波长: 242 nm 。

对照品溶液的配制：对照品蜕皮激素置于五氧化二磷干燥器中，减压干燥4小时，精密称取15mg，放入50ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度线，摇匀，0.45μm滤膜过滤，即得。

样品溶液的配制：精密称取富含蜕皮激素的植物标准提取物样品约20-50mg，置于50ml的容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，即得。

标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液1μl，2μl，4μl，8μl，10μl，14μl，注入HPLC仪，以对照品溶液的量（μlg）为横坐标（X）,相应的峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得：Y=1290X+1.5137，r=0.9999；进样量在0.3048μl g---4.2672μl g之间，线性关系良好。按标准曲线法计算样品中蜕皮激素的含量。

实施例2：牛膝、漏芦、筋骨草等标准提取物的制备

（1） 取牛膝、漏芦、筋骨草等植物原料各15 kg，分别加10倍量乙醇，回流提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，得到各种植物原料的乙醇提取液；

（2）乙醇提取液分别放置冷却，至室温，过滤，滤液分别通过D941大孔树脂层析柱，树脂与提取液的重量比为1: 12 , 柱径高比为1: 9。以乙醇洗脱，洗脱量为2BV，用TLC法检测指导洗脱，TLC的条件，展开剂：乙酸乙酯；显色剂：10 %硫酸乙醇液，收集富含蜕皮激素洗脱部位，浓缩至小体积，通过HPD-100大孔树脂层析柱，大孔树脂与样品的重量比为10:0.8, 柱径高比为1: 10。 以含水乙醇梯度洗脱，用TLC检测指导洗脱，TLC的条件如上述，收集富含蜕皮激素部位的洗脱液；

（3）分别将洗脱液减压浓缩，干燥，得到白色至类白色粉末，即分别为富含蜕皮激素的牛膝、漏芦、筋骨草等植物标准提取物；

（4）按上述方法的制备过程中，在TLC和HPLC指导下，收集得到不同规格的富含蜕皮激素的植物标准提取物，经HPLC定量分析，分别为牛膝标准提取物EAB65（蜕皮激素的含量不低于65%），EAB80（蜕皮激素的含量不低于80%）和EAB95（蜕皮激素的含量不低于95%）；漏芦标准提取物ERU65（蜕皮激素的含量不低于65%），ERU80（蜕皮激素的含量不低于80%）和ERU95（蜕皮激素的含量不低于95%）；筋骨草标准提取物EAN65（蜕皮激素的含量不低于65%），EAN80（蜕皮激素的含量不低于80%）（蜕皮激素的含量不低于80%）和EAN95（蜕皮激素的含量不低于95%）等；

（5）按上述方法制备得到的富含蜕皮激素的植物标准提取物，其蜕皮激素的含量按实施例1所述的方法进行测定。

上述富含蜕皮激素的植物标准提取物的应用：

应用实施例1：

制备固定制剂片剂：将植物标准提取物ECA95或EAB95，或ERU95，或EAN95的任一种，与乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250 mg。原料的投料比例为：植物标准提取物50 mg，乳糖140 mg，淀粉55 mg，硬脂酸镁5 mg。

应用实施例2：

制备固定制胶囊剂：将植物标准提取物ECA95或EAB95，或ERU95，或EAN95的任一种，与助剂混合，过筛，混匀；原料与助剂的比例为：植物标准提取物50 mg，乳糖147 mg，硬脂酸镁3 mg。将混匀的原料装入硬明胶胶囊，每粒重200mg。

上述固定制剂可作为降低血糖的制剂：

      临床方案：非胰岛素依赖型糖尿病患者100例，男性55例，女性45例。口服胶囊剂1日3次，每次2粒，2周为1个疗程。

      疗效标准：显效：病症基本消失，空腹血糖〈7.2 mmol/L，24小时尿量〈10.0g；有效：病症明显改善，空腹血糖〈8.3 mmol/L，24小时尿量〈25.0g；无效：病症无明显改善，空腹血糖和24小时尿量未达到有效标准。

      治疗结果：显效29例（29%），有效55例（55%），无效16例（16%）。总有效率84%。能有效缓解气短乏力，口渴心烦，怕热出汗，疲倦酸麻等症状。

上述固定制剂作为抗风湿关节炎的制剂：

      临床方案：风湿关节炎病患者260例，男性141例，女性119例。口服片剂1日3次，每次2粒，4周为1个疗程。

 疗效标准：显效：疼痛和炎症基本消失；有效：病症明显改善，无效：病症无明显改善。

治疗结果：显效81例（31.1%），有效152例（58.4%），无效27例（10.5%）。总有效率89.5%。能有效缓炎症反应，镇痛消炎。

应用实施例3：

富含蜕皮激素的植物标准提取物制备昆虫生长发育调节剂：将植物标准提取物ECA65或EAB65，或ERU65，或EAN65的任一种，按溶质与溶液的比例为1:10，溶解于工业乙醇中，缓缓加入50倍水，充分搅拌混匀，制成水剂，喷施，或加入养殖池中。

富含蜕皮激素的植物标准提取物是昆虫类（如：家蚕）和水生甲壳类（如：虾、蟹）生长发育、脱壳变态必须的物质，可用于家蚕、地憋虫、虾、蟹等的养殖。

应用实施例4：

富含蜕皮激素的植物标准提取物可作为天然化妆品的原料，能增强细胞新陈代谢，对皮肤具有去角质、去斑增白和保湿的作用，对面部黄褐斑、粉刺、黑斑、雀斑、黑色素沉着等有功效。且具有渗透性，在液态状态下能快速被皮肤吸收，对皮肤无过敏反应，是功能化妆品的天然原料。

例如：

美白霜的制备（W%）

植物标准提取物ECA80或EAB65，或ERU65，或EAN65的任一种              0.05

硬脂酸                                8.0

      C16醇                                2.0

      自乳化单甘酯                     2.0

      氢化羊毛脂                          2.0

      液体石蜡                             12.0

      甘油                                  7.0

      乳化剂                                1.5

      防腐剂                                0.2

      香精                                  0.2

      去离子水                            加至100

按常规制作化妆品的方法制得本发明上述配方的化妆品。

保湿水包油乳剂的制备（W%）

植物标准提取物ECA80或EAB65，或ERU65，或EAN65的任一种      0.05

硬脂酸                                  1.4

鲸蜡醇                                  0.1

      2-乙基醇鲸蜡基硬脂酸酯                  1.8

      肉豆蔻酸异丙酯                          0.2

      2-己基-1-癸醇                            1.0

      液体石蜡                                7.5

      甘油                                    3.0

      丙二醇                                  8.0

      三乙醇胺                                1.0

      羧乙烯基聚合物                          0.35

      Arlacel 165                               2.0

防腐剂                                  0.2

      香精                                    0.2

去离子水                              加至100

按常规制作化妆品的方法制得本发明上述配方的化妆品。

Claims (1)

1.一种富含蜕皮激素的植物标准提取物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

1）将富含蜕皮激素的植物原料加入10倍量的乙醇回流提取，共提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液得乙醇提取液；

2）将乙醇提取液放置，冷却至室温，过滤，将滤液以一定流速通过D941大孔树脂层析柱，树脂与提取液的重量比为1:10-20 , 柱径高比为1:8-10，以含水低级醇洗脱，洗脱量为2-3BV，同时，用薄层层析法TLC检测指导洗脱，TLC的条件，展开剂：乙酸乙酯；显色剂：10 %硫酸乙醇液，收集富含蜕皮激素部位的洗脱液，浓缩至小体积，通过大孔树脂HPD-100层析柱，大孔树脂与样品的重量比为10:1-0.5，柱径高比为1:8-10，以含水低级醇梯度洗脱，用TLC法检测指导洗脱，TLC的条件为，展开剂：乙酸乙酯；显色剂：10 %硫酸乙醇液，收集富含蜕皮激素部位的洗脱液；

3）将洗脱液减压浓缩，干燥，得到富含蜕皮激素的植物标准提取物；

所述的富含蜕皮激素的植物为：露水草、牛膝、漏芦、筋骨草；

所述的低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇。