CN102050789B - 从紫山药中提取纯化尿囊素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种尿囊素的提取方法，具体是从紫山药中提取纯化尿囊素的方法，步骤如下：对紫山药进行水提，过滤浓缩提取液，絮凝剂除杂、树脂除杂，最后通过活性炭进行吸附纯化。

Description

从紫山药中提取纯化尿囊素的方法

技术领域

本发明涉及一种尿囊素的提取纯化方法，具体涉及一种从紫山药中提取纯化得到尿囊素纯品的方法。

背景技术

尿囊素(Allantoin)又名5-脲基乙内酰尿，是一种重要的尿素深加工产品，属咪唑类杂环化合物，分子量158.12。

尿囊素外观为白色或类白色结晶粉末，无毒、无味、无刺激性、无过敏性，能溶于热水、热醇和稀氢氧化钠溶液，微溶于冷水和冷乙醇，几乎不溶于醚和氯仿等有机溶剂。其熔点为228～235℃(取决于结晶条件和测定方法)；其饱和水溶液(浓度为0.6)呈微碱性，pH值为5.5。在pH为4～9的水溶液，尿囊素能保持稳定，在非水溶剂及干燥空气中也稳定。

尿囊素在医药、化妆品和农业领域都具有广泛的应用：

在医药领域，尿囊素经常作为一种普遍使用的外用药，具有促进细胞生长，加快伤口愈合，软化角质层蛋白质等生理功能，是皮肤创伤的良好愈合剂；作为一种药物添加剂，可用来缓解和治疗皮肤干燥症，治疗鳞屑性皮肤疾患、皮肤溃疡、消化道溃疡及炎症。此外，对骨髓炎、糖尿病、肝硬化、痤疮均有较好疗效。

在化妆品领域，尿囊素因其具有避光、杀菌、防腐、止痛、抗氧化作用，被广泛用作美容美发等高档化妆品的特效添加剂，如雀斑霜、粉刺霜、香波、香皂、唇膏、牙膏、刮脸洗剂、护发剂收敛剂、抗汗除臭剂等。添加了尿囊素的化妆品，具有润肤、保护组织、亲水、吸水和防止水分散发等作用。它能使蛋白角质软化，防止头发分又、断裂，使头发柔软和富有弹性、光泽。

在农业领域，尿囊素是优良的植物生长调节剂，可刺激植物生长，对小麦、柑橘、水稻、蔬菜、大豆等均有显著增长效果，并有催熟作用。此外，尿囊素还是生产各种复合肥、缓效肥、微量肥不可缺少的原料。

尿囊素广泛存在于自然界中，但其含量较低，提取工艺复杂，成本较高，较难在生产实际中应用，通常采用化学合成法。

尿囊素化学合成的工艺路线较多，主要有尿素乙醛酸直接缩合法、尿酸高锰酸钾氧化法、乙醛酸钙盐盐酸溶解法三种，其中以乙醛酸和尿素直接缩合法为原料的常用生产方法，较为简单实用。大多的合成方法都有流程长、操作费用大以及有废气产生等缺点，虽然在不断研究发展中这些缺点在不断的改进，但是作为医药、化妆品领域的常用原料，开发出天然产品还是具有其重要的意义和迫切的需要。

如专利200810138689.9、“一种尿囊素合成新工艺”，这类合成方法造价较高且副产物较多，在后续产品开发中存在安全风险；关于天然尿囊素的提取工艺，有一些实验室的研究尝试，如王洪伦等《正交实验研究白刺种子尿囊素提取工艺》，但工艺设计上还未能实现工业化。

200610069598.5公开了从山药中提取尿囊素的方法，具体为将山药洗净、切片、磨粉、过滤后装入萃取釜，CO₂冷萃取山药多糖粗提液和滤液I，将山药多糖粗提液静置离心分离，得山药多糖提取液和滤液II，合并滤液I、滤液II，将合并滤液在60-70℃下进行超声波提取，并进行抽滤，将滤液静置沉淀，再进行高速离心分离、过滤，得滤液III，然后采用反相色谱法进行尿囊素的分离，用非极性固定相色谱柱，流动相为水、甲醇、氯仿的混合液，得尿囊素提取液。该提取方法过于简单，仅仅涉及到提取工艺，不适合于生产实现，如最后纯化一步应用的反相高效液相手段在生产中会限制产量，无法实现规模化生产，采用了甲醇、氯仿等作为纯化步骤中的试剂，具有一定的毒性。

因此需要提供一种适用于工业化生产的工艺，同时，提供尿囊素的纯化工艺，使得提取的尿囊素无毒，可适用于食品、医药、化妆品等用途。

紫山药(purple D.alata L)因其整体为紫色而得名，又名参薯、紫人参、大薯、毛薯，地方上也有脚板薯、薯莨、黎洞薯等叫法。紫山药属薯蓣科薯蓣属多年生藤本植物，与怀山药同科同属不同种，目前主要为江西、湖南及浙江等山区栽培的地方品种，以其肥大的块根或圆柱状根供食用。

紫山药块茎为不规则的扁块形，状似脚板，富含黏液质、维生素、淀粉酶等多种营养物质。紫山药有较高的食用和药用价值主要体现如下：

1)营养丰富，含有多种人体必须的营养物质，如含有大量的花青素。

2)能供给人体大量的黏质蛋白，这是一种多糖蛋白质的混合物，对人体有特殊的保护作用，它能预防心血管系统的脂肪沉积，保持动脉血管的弹性，阻止动脉粥样硬化过早发生。

3)紫山药的黏液多糖类物质如与无机盐相结合，可以形成骨质并使骨具有一定的弹性。

4)紫山药具有补脾养胃、补肺益肾的功效，对肺虚咳喘、脾虚久泻、慢性肠胃炎、糖尿病、遗精带下等症都有疗效。

紫山药作为怀山药的同科植物，具有一定的优于其它普通食物的营养价值，且紫山药作为近年来新兴的品种，还未被市场所认识，所有具有不可忽视的保健原料潜质，有可能成为未来一种突出的保健品主要配料，具有很高的科研价值。

关于紫山药的提取物，仅在中国专利申请200910055121.5中提到，主要是采用醇提，超声波或微波辅助，混合离心、收集上清液，再加入乙醇，浓缩、大孔吸附树脂层析柱中纯化，乙醇依托，制得液状紫山药花色甙。

目前没有从紫山药中提取尿囊素的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从紫山药中提取纯化尿囊素的方法。

本发明提供的一种从紫山药中提取纯化尿囊素的方法，包含如下步骤：对紫山药进行水提，过滤浓缩提取液，絮凝剂除杂、树脂除杂，最后通过活性炭进行吸附纯化。

本发明提供的一种从紫山药中提取纯化尿囊素的方法，其包含如下步骤：将紫山药制备成干粉，通过常温常压搅拌对紫山药干粉进行水提，高速离心过滤浓缩提取液，浓缩液通过絮凝剂除杂、树脂除杂，最后通过活性炭进行吸附纯化。

本发明提供了一种从紫山药中提取纯化尿囊素的方法，其包含如下步骤：

1)将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉；

2)称取紫山药粉，加入7-20倍蒸馏水(重量)，常温常压搅拌2-6小时，得提取液；

3)4000rpm-8000rpm转速下高速离心提取液并过滤，得到滤液；

4)向滤液中依次加入絮凝剂B和A，B剂在恒温40-80℃边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入A剂，静置过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

5)絮凝后样品高速离心10-20min，速率为4000rpm-8000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

6)层析液过活性炭柱，乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到尿囊素浓缩液；

7)浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品。

本发明提供了一种从紫山药中提取纯化尿囊素的方法，包含如下步骤：

1)将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉；

2)称取紫山药粉，加入8-10倍蒸馏水(重量)，常温常压搅拌2-4小时，得提取液；

3)6000rpm-8000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

4)向滤液中依次加入絮凝剂B和A，絮凝剂B在恒温60-80℃边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入絮凝剂A，静置过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

5)絮凝后样品高速离心10-20min，速率为6000-8000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

6)层析液过活性炭柱，以50％-80％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

7)浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品。

所述絮凝剂A选自壳聚糖、干酪素或皂土中的一种或多种。

所述絮凝剂B选自变性淀粉、滑石粉、丙烯酰胺、苯乙烯磺酸盐、木质磺酸盐、丙烯酸或甲基丙烯酸中的一种或多种。

本发明提供的从紫山药中尿囊素纯化方法，步骤6)中活性炭柱纯化方法包括：

1)活性炭分别经100％乙醇进行醇洗和水洗以除去杂质，烘箱干燥，以水为流动相进行湿法装柱；

2)以水通柱，流动加入样品溶液；

3)以乙醇溶液洗脱，每50ml取样一次，收集100ml-500ml样品。

本发明的从紫山药中提取纯化尿囊素的方法的技术进步效果表现在：

1、本发明中所采用的技术手段如絮凝沉淀、树脂吸附、活性炭吸附、浓缩结晶等都操作简单，易于扩大化，可方便实现工业化生产；

2、本发明中所采用的纯化介质如絮凝剂、树脂、活性炭以及所采用的溶剂如水、乙醇等都属于食品生产中常用的无毒介质及试剂，为尿囊素产品在应用到后续的医药、食品、化妆品产品开发中提供安全保障；

3、本发明采用的纯化介质皆造价便宜、方便易得，可大大降低生产成本，使天然尿囊素的大批量生产提供可能。

4、本发明较传统醇沉更加先进，工艺化简单易行。

5、采用本发明获得的尿囊素纯品，具有纯度高的特点。

6、本发明所获得产品已经小鼠喂养试验证明属无毒产品(小鼠喂养两周后无死亡及明显中毒现象发生)。

与200610069598.5中的方法比较，本专利方案具有如下优势：

1、专利200610069598.5技术手段过于简单，仅仅涉及到提取工艺，本专利侧重于尿囊素的纯化技术；

2、专利200610069598.5技术手段不适合于生产实现，工艺扩大化比较困难。如最后纯化一步应用的反相高效液相手段在生产中会限制产量，无法实现规模化生产。本专利应用树脂吸附手段去除杂质，应用活性炭吸附柱进行尿囊素纯化，应用结晶手段获取纯品，这些手段在生产中都是常用的易于扩大化的工艺技术。

3、专利200610069598.5仅是与本专利相对比较接近的技术，事实上不论从原料、技术手段比较相距还都比较遥远。

4、本发明通过上述6个步骤对紫山药进行提取纯化处理以后，可以得到纯度为80％以上的尿囊素产品。

名词解释：

收率：是提取得到的尿囊素与紫山药含有的尿囊素的重量比。

恒温40-80摄氏度：是指在40-80摄氏度中某一温度点保持恒温。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但是不应作为对本发明的限制。

实施例1：

1、紫山药中尿囊素的提取

将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉，称取一定量的紫山药粉，加入8倍蒸馏水，常温常压搅拌2小时，于8000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

2、紫山药中尿囊素的初步纯化

向滤液中加入变性淀粉在恒温80摄氏度下边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入壳聚糖，静止过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

絮凝后样品高速离心20min，速率为8000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

3、活性炭吸附纯化

树脂层析液过活性炭柱，以50％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

4、结晶

浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，重结晶并干燥获得尿囊素纯品，收率为85.2％，纯度为96.15％。

实施例2：

1、紫山药中尿囊素的提取

将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉，称取一定量的紫山药粉，加入8倍蒸馏水，常温常压搅拌2小时，于6000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

2、紫山药中尿囊素的初步纯化

向滤液中加入变性淀粉在恒温60摄氏度下边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入干酪素，静止过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

絮凝后样品高速离心20min，速率为6000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

3、活性炭吸附纯化

树脂层析液过活性炭柱，以80％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

4、结晶

浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品，收率为69.5％，纯度为86.32％。

实施例3：

1、紫山药中尿囊素的提取

将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉，称取一定量的紫山药粉，加入8倍蒸馏水，常温常压搅拌2小时，于6000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

2、紫山药中尿囊素的初步纯化

向滤液中加入变性淀粉、滑石粉在恒温60摄氏度下边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入壳聚糖，静止过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

絮凝后样品高速离心20min，速率为6000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

3、活性炭吸附纯化

树脂层析液过活性炭柱，以50％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

4、结晶

浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品，收率为81.6％，纯度为95.61％。

实施例4：

1、紫山药中尿囊素的提取

将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉，称取一定量的紫山药粉，加入10倍蒸馏水，常温常压搅拌4小时，于6000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

2、紫山药中尿囊素的初步纯化

向滤液中加入变性淀粉在恒温60摄氏度下边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次，然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入皂土，静止过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

絮凝后样品高速离心10min，速率为6000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

3、活性炭吸附纯化

树脂层析液过活性炭柱，以80％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

4、结晶

浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品，收率为62.7％，纯度为80.16％。

实施例5：

1、紫山药中尿囊素的提取

将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉，称取一定量的紫山药粉，加入10倍蒸馏水，常温常压搅拌4小时，于6000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

2、紫山药中尿囊素的初步纯化

向滤液中加入丙烯酰胺在恒温60摄氏度下边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入壳聚糖，静止过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

絮凝后样品高速离心10min，速率为6000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

3、活性炭吸附纯化

树脂层析液过活性炭柱，以65％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

4、结晶

浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品，收率为65.9％，纯度为96.43％。

试验例1：

对不同种类山药及不同产地紫山药中尿囊素进行检测，得到紫山药中尿囊素含量最高，是天然尿囊素的良好原料来源。如下为尿囊素含量：

种类	尿囊素含量
		铁杆山药(河南淮山药)：	1.39％

铁杆山药(北京)：	0.96％
		紫山药：	3.43％
菜山药	1.14％

试验例2：

依据GB15193.1-2003＜食品安全性毒理学评价程序和方法＞，对依据实施例1制备的紫山药尿囊素食品安全性进行急性毒性试验(给药量200mg/kg)、三项遗传毒性试验和30天喂养试验研究(30mg/kg)。结果表明：小鼠在两周内未见明显中毒症状及死亡，按急性毒性分级标准规定，该受试物属无毒级。三项遗传毒性试验结果均为阴性。30天喂养试验结果表明：尿囊素喂养30天后，大鼠的血液学、生化学、脏器重量和系数以及病理组织多样指标无明显影响，未发现该受试物有明显的毒性作用。

Claims (5)

1.一种从紫山药中提取纯化尿囊素的方法，其特征在于包括如下步骤：对紫山药进行水提，过滤浓缩提取液，絮凝剂除杂、树脂除杂，最后通过活性炭进行吸附纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：将紫山药制备成干粉，通过常温常压搅拌对紫山药干粉进行水提，高速离心过滤浓缩提取液，浓缩液通过絮凝剂除杂、树脂除杂，最后通过活性炭进行吸附纯化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉；

2)称取紫山药粉，加入7-20倍蒸馏水，常温常压搅拌2-6小时，得提取液；

3)4000rpm-8000rpm转速下高速离心提取液并过滤，得到滤液；

4)向滤液中依次加入絮凝剂B和A，B剂在恒温40-80℃边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入A剂，静置过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；所述絮凝剂A选自壳聚糖、干酪素或皂土中的一种或多种；所述絮凝剂B选自变性淀粉、滑石粉、丙烯酰胺、苯乙烯磺酸盐、木质磺酸盐、丙烯酸或甲基丙烯酸中的一种或多种；

5)絮凝后样品高速离心10-20min，速率为4000rpm-8000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

6)层析液过活性炭柱，乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到尿囊素浓缩液；

7)浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将紫山药洗净，切片，干燥后磨成细粉；

2)称取紫山药粉，加入8-10倍蒸馏水，常温常压搅拌2-4小时，得提取液；

3)6000rpm-8000rpm转速下离心提取液并过滤，得到滤液；

4)向滤液中依次加入絮凝剂B和A，絮凝剂B在恒温60-80℃边搅拌边加入，恒温下保持2小时，每隔半个小时搅拌一次；然后常温下将滤液冷却，边搅拌边加入絮凝剂A，静置过夜，去除部分大分子蛋白质与多糖；

5)絮凝后样品高速离心10-20min，速率为6000-8000rpm，得纯净上清液，过AB-21树脂层析柱，去除色素，收集层析液；

6)层析液过活性炭柱，以50％-80％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液旋转蒸发进行浓缩，得到浓缩液；

7)浓缩液进行低温下放置12h以上，得到尿囊素结晶，进一步干燥获得尿囊素纯品。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤6)中活性炭柱纯化方法包括：

1)活性炭分别经100％乙醇进行醇洗和水洗以除去杂质，烘箱干燥，以水为流动相进行湿法装柱；

2)以水通柱，流动加入样品溶液；

3)以乙醇溶液洗脱，每50ml取样一次，收集100ml-500ml样品。