CN102746416A - 一种连钱草多糖的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及连钱草多糖的制备方法及应用，可有效解决这方面的研究空白，解决的技术方案是，称取连钱草粉末和酶，在酶中加水，溶解，水浴活化成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末与水混合，水浴浸泡，冷却，用盐酸调pH，摇匀水浴加热，加上述活化的酶溶液，混匀，酶解，提取，过滤，药渣加乙醇，提取，合并提取液，真空浓缩，离心，得上清液，上清液通过大孔吸附树脂柱，收集流出液，大孔吸附树脂柱用蒸馏水冲洗，冲洗液和流出液合并，减压浓缩，得浓缩液，浓缩液加乙醇，滤取沉淀物，无水乙醇洗去沉淀物中的水分，丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，减压干燥，即得，本发明可有效用于抗氧化和抗菌的药物或保健品的开发。
Description
技术领域
本发明涉及植物成分分离，特别是一种连钱草多糖的制备方法及应用。
背景技术
连钱草为唇形科植物活血丹Glechoma longituba(Nakai) Kupr.的干燥地上部分，味辛、微苦，微寒，具有利湿通淋，清热解毒，散瘀消肿的功效，用于热淋，石淋，湿热黄疸，疮痈肿痛，跌打损伤。目前，对于中药连钱草的研究仍止步于其所含有的萜类、黄酮和黄酮苷类、有机酸类、挥发油类、甾体类、醇类等成分，但有关连钱草多糖的研究尚未见报道。多糖作为一种免疫促进和调节剂，是许多天然药物的主要免疫活性物质，普遍具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老且对正常细胞无毒副作用的优点，因而基于各种药用植物中多糖类成分活性的报道屡见不鲜，本发明首次涉及连钱草中多糖成分的研究，因此，本发明的研制成功具有统计学上的意义，有利于连钱草药材的开发，经济效益和社会效益巨大，是中药提取物上的一大创举。
发明内容
针对上述情况，为进一步开发连钱草药材的药用、经济价值，填补这方面的研究空白，本发明之目的就是提供一种连钱草多糖的制备方法及应用，可有效解决这方面的研究空白。
本发明解决的技术方案是，将连钱草粉碎，称取连钱草粉末，再称取连钱草粉末重量的0.5%～2.5%的酶，在酶中加入酶重量的15～20倍的35～60℃的水，溶解，35～60℃水浴活化15～30min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末与水以1：8～15的重量比混合，60～90℃水浴浸泡30～90min，冷却至18～25℃，用盐酸调pH至4.0～5.5，摇匀水浴加热至40～55℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解2～6小时，在微波功率300～500W、温度60～90℃时提取10～15min，过滤，药渣再加入连钱草粉末重量的8～15倍量体积浓度为5～15%的乙醇，在微波功率300～500W、温度60～90℃时提取10～15min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过大孔吸附树脂柱，收集流出液，大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的2～4倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为70～80%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20～50℃下减压干燥，即得。
所述的酶为纤维素酶、果胶酶、蛋白酶中的一种或两种以上的混合，所述的大孔吸附树脂柱为D101型或AB-8型大孔吸附树脂柱。
本发明连钱草多糖可用于抗氧化、抗菌药物和保健品的开发，以此开辟连钱草药材的应用新前景，具有巨大的社会、经济效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
取连钱草50g，粉碎，再称取0.25g的纤维素酶，在纤维素酶中加入4g的35℃的水，溶解，在35℃下，水浴活化15min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水400g，60℃水浴浸泡30min，冷却至18℃，用盐酸调pH至4.0，摇匀水浴加热至40℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解2小时，微波功率300W、温度60℃提取10min，过滤，药渣再加入400g体积浓度为5%的乙醇，微波功率300W、温度60℃时提取10min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，D101型大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的2倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为80%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20℃下减压干燥，即得连钱草多糖。
实施例2
取连钱草50g，粉碎，再称取1.25g的果胶酶，在果胶酶中加入25g的35℃的水，溶解，在35℃下，水浴活化30min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水750g，70℃水浴浸泡40min，冷却至20℃，用盐酸调pH至4.5，摇匀水浴加热至45℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解6小时，微波功率500W、温度90℃时提取15min，过滤，药渣再加入750g体积浓度为15%的乙醇，微波功率500W、温度90℃提取15min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过AB-8大孔吸附树脂柱，收集流出液，AB-8大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的4倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为70%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，即得连钱草多糖。
实施例3
取连钱草50g，粉碎，再称取纤维素酶与果胶酶各0.25g，在酶中加入10g的38℃的水，溶解，在39℃下，水浴活化25min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水400g，80℃水浴浸泡50min，冷却至18℃，用盐酸调pH至5.0，摇匀水浴加热至50℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解2小时，微波功率400W、温度75℃提取10min，过滤，药渣再加入400g体积浓度为10%的乙醇，微波功率400W、温度75℃提取12min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，D101型大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的3倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为75%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，35℃下减压干燥，即得连钱草多糖。
实施例4
取连钱草50g，粉碎，再称取纤维素酶、果胶酶与蛋白酶各0.25g，在酶中加入15g的48℃的水，溶解，在39℃下，水浴活化18min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水500g，90℃水浴浸泡70min，冷却至24℃，用盐酸调pH至5.5，摇匀水浴加热至55℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解5小时，微波功率400W、温度67℃提取14min，过滤，药渣再加入500g体积浓度为12%的乙醇，微波功率400W、温度67℃提取12min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，收集流出液，AB-8型大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的2倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为75%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，45℃下减压干燥，即得连钱草多糖。
连钱草多糖的抗氧化及抗菌活性实验
1．连钱草多糖的体内抗氧化试验情况如下：
取体重18—22g的昆明种小鼠48只，适应性饲养1周后，随机分成4组，每组12只。分别为空白对照组，多糖低剂量组（100mg·kg-1），多糖中剂量组（200mg·kg-1），多糖高剂量组（300mg·kg-1）。每天灌胃给药1次（0.2ml/10g），连续给药15天（空白对照组给等量蒸馏水）。末次给药后24h，眼球取血，离心得小鼠血清，按照SOD、GSH-Px试剂盒的操作过程，测定连钱草多糖对小鼠血清中的SOD及GSH-Px的影响，结果见表1：
表1 连钱草多糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响
| 指标 | 空白对照 | 低剂量 | 中剂量 | 高剂量 |
| GSH-Px | 673.62±25.94 | 709.61±35.13* | 716.06±51.28** | 729.23±34.87** |
| SOD | 124.26±16.13 | 143.60±29.17* | 171.42±23.52** | 186.26±36.29** |
*表示与空白组相比P＜0.05，**表示与空白组相比P＜0.01
由表1可以看出，与空白组比较，低剂量组连钱草多糖可显著提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力，中剂量和高剂量组的作用具有极显著意义（P＜0.01），显示出连钱草多糖具有较好的抗氧化作用。
2．连钱草多糖的抗菌活性试验情况如下：
最低抑菌浓度（MIC）的确定： 取12×8的96孔微量稀释板，每孔容量0.25—0.3ml，U型孔底，从1号孔到12号孔（“＋”“－”孔除外），用微量加液器加入一系列2倍稀释的连钱草多糖溶液0.05ml，“＋”孔加培养基0.05ml，“－”孔加培养基0.1ml。菌液（浓度3.2×108个/ ml，1:5000稀释度）各孔均加入0.05ml。用微量搅拌器震荡混匀后，置垫有湿纱布的有盖方盒内37℃培养18h。在黑色背景的光源下观察结果，有菌生长孔呈弥散样浑浊，或底部呈扣子样沉淀。无菌生长孔所含最低抗菌药物浓度即为MIC。
表2 连钱草多糖抗菌作用
表2显示，连钱草多糖对大肠杆菌、变形杆菌、金葡萄菌和绿脓杆菌均有一定的抑制作用，MIC分别是17.45，8.72，4.36，34.89 g/L。抑菌作用是连钱草治疗腹泻的一个重要原因。
本发明利用生物酶制剂将连钱草药材酶解后进行提取，并结合微波萃取法，首次对连钱草药材中所含的多糖成分进行研究，大大提高了连钱草药材的利用率，提取溶剂稀乙醇和大孔吸附树脂的应用，使连钱草多糖制备时减少了大量的色素和蛋白质等杂质，有利于连钱草多糖药效的发挥，为抗氧化、抗菌药物和保健品的开发提供了一种新型有效原料，经济效益和社会效益巨大，是中药提取物上的一大创举。
Claims (7)
1. 一种从连钱草中分离多糖的制备方法，其特征在于，将连钱草粉碎，称取连钱草粉末，再称取连钱草粉末重量的0.5%～2.5%的酶，在酶中加入酶重量的15～20倍的35～60℃的水，溶解，35～60℃水浴活化15～30min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末与水以1：8～15的重量比混合，60～90℃水浴浸泡30～90min，冷却至18～25℃，用盐酸调pH至4.0～5.5，摇匀水浴加热至40～55℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解2～6小时，在微波功率300～500W、温度60～90℃时提取10～15min，过滤，药渣再加入连钱草粉末重量的8～15倍量体积浓度为5～15%的乙醇，在微波功率300～500W、温度60～90℃时提取10～15min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过大孔吸附树脂柱，收集流出液，大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的2～4倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为70～80%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20～50℃下减压干燥，即得。
2. 根据权利要求1所述的从连钱草中分离多糖的制备方法，其特征在于，所述的酶为纤维素酶、果胶酶、蛋白酶中的一种或两种以上的混合，所述的大孔吸附树脂柱为D101型或AB-8型大孔吸附树脂柱。
3.根据权利要求2所述的从连钱草中分离多糖的制备方法，其特征在于，取连钱草50g，粉碎，再称取0.25g的纤维素酶，在纤维素酶中加入4g的35℃的水，溶解，在35℃下，水浴活化15min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水400g，60℃水浴浸泡30min，冷却至18℃，用盐酸调pH至4.0，摇匀水浴加热至40℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解2小时，微波功率300W、温度60℃提取10min，过滤，药渣再加入400g体积浓度为5%的乙醇，微波功率300W、温度60℃时提取10min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，D101型大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的2倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为80%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20℃下减压干燥，即得。
4.根据权利要求2所述的从连钱草中分离多糖的制备方法，其特征在于，取连钱草50g，粉碎，再称取1.25g的果胶酶，在果胶酶中加入25g的35℃的水，溶解，在35℃下，水浴活化30min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水750g，70℃水浴浸泡40min，冷却至20℃，用盐酸调pH至4.5，摇匀水浴加热至45℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解6小时，微波功率500W、温度90℃时提取15min，过滤，药渣再加入750g体积浓度为15%的乙醇，微波功率500W、温度90℃提取15min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过AB-8大孔吸附树脂柱，收集流出液，AB-8大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的4倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为70%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50℃下减压干燥，即得。
5. 根据权利要求2所述的从连钱草中分离多糖的制备方法，其特征在于，取连钱草50g，粉碎，再称取纤维素酶与果胶酶各0.25g，在酶中加入10g的38℃的水，溶解，在39℃下，水浴活化25min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水400g，80℃水浴浸泡50min，冷却至18℃，用盐酸调pH至5.0，摇匀水浴加热至50℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解2小时，微波功率400W、温度75℃提取10min，过滤，药渣再加入400g体积浓度为10%的乙醇，微波功率400W、温度75℃提取12min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过D101型大孔吸附树脂柱，收集流出液，D101型大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的3倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为75%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，35℃下减压干燥，即得。
6.根据权利要求2所述的从连钱草中分离多糖的制备方法，其特征在于，取连钱草50g，粉碎，再称取纤维素酶、果胶酶与蛋白酶各0.25g，在酶中加入15g的48℃的水，溶解，在39℃下，水浴活化18min，成活化的酶溶液，备用；连钱草粉末加水500g，90℃水浴浸泡70min，冷却至24℃，用盐酸调pH至5.5，摇匀水浴加热至55℃，加入上述活化的酶溶液，混匀，酶解5小时，微波功率400W、温度67℃提取14min，过滤，药渣再加入500g体积浓度为12%的乙醇，微波功率400W、温度67℃提取12min，合并提取液，真空浓缩至连钱草重量的3倍，经3000转/分离心10min，得上清液，上清液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，收集流出液，AB-8型大孔吸附树脂柱再用连钱草重量的2倍的蒸馏水冲洗，冲洗液和上述收集的流出液合并，减压浓缩至连钱草重量的2倍，得浓缩液，再边搅拌边加体积浓度为95%的乙醇，使浓缩液中含醇量为75%，静置12小时，滤去上部液体，得底部沉淀物，用无水乙醇先洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的无水乙醇，最后用无水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，45℃下减压干燥，即得。
7.权利要求1或3-6任何一项所述方法制备的连钱草多糖在抗氧化和抑制金葡萄菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌药物中的应用。
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