CN102743417A - 红曲提取物在制备防治乳腺癌的保健食品和药品的应用 - Google Patents

Abstract

本发明采用天然红曲，先用8～12倍量的70％乙醇浸泡12～24小时，80℃回流提取，再用8～12倍量70％乙醇再80℃回流提取2次，每次2～4小时，合并3次提取液，回收乙醇，减压干燥后得到的红曲提取物。经人癌细胞实验研究，证明对乳腺癌有明显的抑制作用，可以用来制备防治乳腺癌的保健食品和药品。本发明提出可取这些天然红曲提取物按常规的药品生产规范制成可供临床应用的产品形式，如片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂。这些天然红曲提取物还可做成饼干、饮料等保健食品应用，其中这些天然红曲提取物作为保健食品饼干的添加量为5～30％；作为饮料的添加量为1～15％。

Description

红曲提取物在制备防治乳腺癌的保健食品和药品的应用

技术领域   本发明涉及以中药红曲提取物为原料制成的防治乳腺癌的保健食品和药品的应用。 

背景技术   乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤的首位。2011年美国CA：A Cancer Journal for Clinicians杂志(2010年影响因子94.262)公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30％，排名女性恶性肿瘤发病率第一位。全世界每年约有135万妇女被确诊患乳腺癌，约有50万妇女死于该肿瘤。其发病率在我国占恶性肿瘤的7％～10％，发病年龄以40～60岁居多。近年来，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，发病年龄也明显年轻化，严重威胁着妇女的健康。 

乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗和分子靶向治疗。乳腺癌的化疗药物包括从上世纪70年代的环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶，到80年代的蒽环类药物阿霉素、表阿霉素，再到90年代的紫杉类药物紫杉醇、多西紫杉醇等，为乳腺癌的治疗提供了许多可供化疗的药物，无论在乳腺癌的术前新辅助、术后的辅助治疗还是复发转移患者的解救治疗中都取得积极的作用，其他药物如长春瑞滨、吉西他滨、卡培他滨、铂类、烷化剂、氨甲喋呤等也常用于乳腺癌化疗并也取得积极的效果。但这些化疗药物在治疗过程中均有骨髓抑制等较为严重的不良反应，如临床治疗乳腺癌的最常用的药物阿霉素，其抗癌的主要机制是通过嵌入DNA的相邻碱基对之间，使DNA链裂解，阻碍DNA复制，并阻断RNA聚合酶，抑制RNA合成，此外，还具有影响拓扑异构酶II，改变细胞膜结构等作用，但在临床使用后可引起恶心、呕吐、脱发、高热、消瘦、静脉炎、骨髓抑制、肝毒性以及心脏毒性等不良反应。 

红曲源于中国，至今已有一千多年的应用历史，是我国传统的食药双效的发酵产品，古往今来一直被广泛应用于食品着色、酿酒、发酵食品生产、中药等各个领域。红曲最早的药用记录为元代的《日用本草》，“破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤损”。红曲味甘，性平，无毒，归脾、胃、肝、火肠经，明代李时珍在《本草纲目》评价它说：“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”。红曲为曲霉科真菌紫色红曲霉Monascus purpureus Went菌丝体及孢子，经人工培养使菌丝在粳米内部生长，最终整个米粒变为红色所得的制品。近年研究发现红曲中含有红曲色素、红曲多糖、洛伐他汀、麦角甾醇、γ-氨基丁酸、生物黄酮、皂苷、膳食纤维、氨基多糖、辅酶Q10等丰富的生理活性物质，这些成分是否有抗癌作用，至今没有报道，本课题在寻找具有抗乳腺癌作用的研究中，发现天然红曲70％乙醇提取物对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖有明显的作用，可以作为临床预防和治疗乳腺癌的保健食品和药品。 

发明内容  本发明采用天然红曲，先用8～12倍量的70％乙醇浸泡12～24小时，80℃回流提取，再 用8～12倍量70％乙醇再80℃回流提取2次，每次2～4小时，合并3次提取液，回收乙醇，减压干燥后得到的红曲提取物。经人癌细胞实验研究，证明对乳腺癌有明显的抑制作用，可以用来制备防治乳腺癌的保健食品和药品。本发明提出，可取这些天然红曲提取物按常规的药品生产规范制成可供临床应用的产品形式，如片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂。这些天然红曲提取物还可做成饼干、饮料等保健食品应用，其中这些天然红曲提取物作为保健食品饼干的添加量为5～30％；作为饮料的添加量为1～15％。 

具体实施方式：实施例一 

红曲70％乙醇提取物抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖实验研究 

1实验材料 

1.1实验试剂 

1.2实验仪器 

2实验方法 

2.1天然红曲70％乙醇提取物的制备及其指纹图谱 

天然红曲70％乙醇提取物的制备：取天然红曲30g，70％乙醇浸泡12h，8倍量70％乙醇80℃回流提取3次，每次2h，合并提取液，回收乙醇，减压干燥后得红曲70％乙醇提取物。 

红曲70％乙醇提取物HPLC图谱的测定： 

供试液的制备：取红曲70％乙醇提取物10.07mg，用甲醇溶解定容至5ml，过滤后备用用。 

标准液的制备：精密称取洛伐他汀对照品0.40mg，用甲醇溶解定容至5ml，超声，以此浓度用甲醇稀释成并定容至5ml，使终浓度为0.02mg/ml，过滤后待用。 

色谱条件：流动相：甲醇∶0.002％磷酸溶液(75∶25)；流速：1ml/min；色谱柱为kromasil C-18；柱温：30℃；检测波长：238nm；进样量：10μl。红曲70％乙醇提取物HPLC图谱的测定结果见附图1；洛伐他汀对照品HPLC图谱的测定结果见附图2.

2.2MCF-7细胞复苏、培养、传代和冻存 

2.2.1MCF-7细胞的复苏 

将冻存的一管MCF-7细胞，37℃水浴箱快速融化，融化后，在超净工作台用70％乙醇将冻存管的盖沿擦干净，加入10％FBS RPMI1640培养基，轻轻吹打混匀，1000rpm/min，离心3min，去上清，10％FBSRPMI1640培养基重悬，混匀，移至25mL培养瓶中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱培养。 

2.2.2MCF-7细胞的传代及培养 

待细胞长到80％汇合时，吸弃上清液，用PBS洗2-3遍，加入0.25％胰蛋白酶1ml，放入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及湿度条件进行消化，消化10min，然后在倒置显微镜下观察细胞形态，如果细胞呈圆形，则迅速加入2ml新鲜的10％FBS RPMI1640培养基终止消化，用巴氏吸管吹打制成单细胞悬液，1000rpm/min，离心3min，去上清，10％FBS RPMI1640培养基重悬细胞，吹打混匀，稀释细胞悬液，按1∶3的比例接种至新的25mL培养瓶中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱培养。 

2.2.3MCF-7细胞的冻存 

待细胞长到80％汇合时，吸弃上清液，用PBS洗2-3遍，加入0.25％胰蛋白酶1ml，放入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂及湿度条件进行消化10min，然后在倒置显微镜下观察细胞形态，如果细胞呈圆形，则迅速加入2ml新鲜的10％FBS RPMI1640培养基终止消化，用巴氏吸管吹打制成单细胞悬液，1000rpm/min，离心3min，去上清，加入适量的冻存液(10％FBS RPMI1640∶DMSO＝9∶1)用吸管吹打制成细胞悬液(1×10⁶～1×10⁷个/mL)，每冻存管加入1mL冻存液细胞，密封后标记。将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，放入液氮罐中冻存。 

2.3MCF-7细胞的细胞计数 

将血球计数板及盖玻片擦试干净，并将盖玻片盖在计数板上；吸取10μl已消化的细胞悬液沿盖玻片边缘缓缓滴入，使悬液充满盖玻片和计数板之间，注意盖玻片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，静置3min；镜下观察，统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中格)中的细胞数目。计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的，然后按下式计算：(细胞悬液的细胞数)/ml＝(四个大格子细胞数/4)×10⁴。(公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以10⁴因为计数板中每一个人格的体积为：1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)＝0.1mm³而1ml＝1000mm³)注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10％以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 

2.4MTT法测定药物对MCF-7细胞的细胞毒作用 

2.4.1实验原理 

MTT法是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小，从 而反映出细胞的存活及增殖情况。 

2.4.2红曲70％乙醇提取物对MCF-7的增殖影响 

将处于对数生长期的MCF-7细胞用胰蛋白酶消化后，以10％FBS RPMI1640培养液制成5×10⁴个/ml的细胞悬液，然后以每孔100μl接种到96孔板上，在37℃，5％CO₂孵箱中培养24h，然后换成无血清培养基培养24h，之后再更换培养液，实验组加入不同浓度的红曲70％乙醇提取物(用水溶解)100μl，终浓度分别为：1、10、50、100、150μg/ml；不同浓度的红曲70％乙醇提取物(用DMSO溶解)100μl，终浓度分别为：1、10、50、100、150μg/ml；DMSO溶剂组加入用DMSO溶解红曲70％乙醇提取物的浓度对应体积；对照组入等体积的培养液；空白对照组不加细胞，加入等体积的培养液，每一样品均设3个平行孔。继续培养24h，48h及72h后，吸弃原培养液，每孔以PBS洗1次，加入100μl新的无血清培养基和10μlMTT溶液(浓度为5mg/ml)，轻振培养板。放回培养箱内再孵育4h后，吸弃上清液，每孔中加二甲基亚砜100μl，置于暗处振荡10min，用酶标仪检测各孔吸光度(OD值)，测定波长＝490nm。存活率计算公式为：存活率(％)＝[(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％。本实验重复3次。 

2.4.3红曲70％乙醇提取物水溶液及对应洛伐他汀对MCF-7细胞的增殖影响 

将处于对数生长期的MCF-7细胞用胰蛋白酶消化后，以10％FBS RPMI1640培养液制成5×10⁴个/ml的细胞悬液，然后以每孔100μl接种到96孔板上，在37℃，5％CO₂孵箱中培养24h，然后换成无血清培养基培养24h，之后再更换培养液，实验组加入不同浓度的红曲70％乙醇提取物100μl，终浓度分别为：1、10、50、100、150μg/ml，每一样品均设4个平行孔，空白对照组加入等体积的培养液。继续培养24h，48h及72h后，吸弃原培养液，每孔以PBS洗1次，加入100μl新的无血清培养基和10μlMTT溶液(浓度为5mg/ml)，轻振培养板。放回培养箱内再孵育4h后，吸弃上清液，每孔中加二甲基亚砜100μl，置于暗处振荡10min，用酶标仪检测各孔吸光度(OD值)，测定波长＝490nm。存活率计算公式为：存活率(％)＝[(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％。洛伐他汀对照品的加入量为红曲70％乙醇提取物中的洛伐他汀含量的相同剂量，用无水乙醇溶解(无水乙醇最人体积为0.0078％，本实验已经证明此体积含量对MCF-7的增殖无影响)，即终深度为0.001、0.01、0.05、0.1、0.15μg/ml，每一样品均设4个平行孔，空白对照组加入等体积的培养液，按以上同样操作进行。本实验重复3次。 

2.4.4筛选阿霉素抑制人乳腺癌MCF-7细胞的最大无效量 

将处于对数生长期的MCF-7细胞用胰蛋白酶消化后，以10％FBS RPMI1640培养液制成5×10⁴个/rnl的细胞悬液，然后以每孔100μl按种到96孔板上，在37℃，5％CO₂孵箱中培养24h，然后换成无血清培养基培养24h，之后再更换培养液，实验组加入不同浓度的阿霉素100μl，终浓度分别为：0.0001、0.001、 0.01、0.1、1μmol/L；对照组入等体积的培养液；空白对照组不加细胞，加入等体积的培养液，每一样品均设6个平行孔。继续培养24h，48h及72h后，吸弃原培养液，每孔以PBS洗1次，加入100μl新的无血清培养基和10μl MTT溶液(浓度为5mg/ml)，轻振培养板。放回培养箱内再孵育4h后，吸弃上清液，每孔中加二甲基亚砜100μl，置于暗处振荡10min，用酶标仪检测各孔吸光度(OD值)，测定波长＝490nm。存活率计算公式为：存活率(％)＝[(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％。本实验重复3次。 

2.4统计学分析 

数据以 

表示，采用SPSS16.0软件进行统计学分析。数据分析采用单因素方差检验。 

3实验结果 

3.1细胞形态学观察药物对MCF-7细胞的抑制作用 

3.1.1红曲70％乙醇提取物水溶液及对应洛伐他汀对MCF-7细胞的抑制作用 

倒置显微镜下观察经过不同处理组中的MCF-7细胞形态变化。对照组细胞生长状况良好，透明度大，折光性强，细胞形态呈多边形且连成片，经不同浓度功能红曲70％乙醇提取物处理后的MCF-7，生长状况差，折光性弱，贴壁细胞皱缩，变圆，随着功能红曲乙醇提取物浓度的增加，皱缩，变圆的程度增加，有些甚至脱落，漂浮。而洛伐他汀组(0.001～0.1μg/ml)的细胞基本上跟对照组细胞差不多，只有0.15μg/ml细胞有一些细胞皱缩，变圆。 

3.1.2阿霉素对MCF-7细胞的抑制作用 

倒置显微镜下观察经过不同处理组中的MCF-7细胞形态变化(图3.2A-F)。对照组细胞生长状况良好，透明度大，折光性强，细胞形态呈多边形且连成片，经不同浓度阿霉素处理后的MCF-7，浓度为0.01～1μmol/L生长状况差，折光性弱，贴壁细胞皱缩，变圆，随着阿霉素浓度的增加，皱缩，变圆的程度增加，有些甚至脱落，漂浮。 

3.2药物对MCF-7增殖率的影响 

3.2.1红曲70％乙醇提取物对MCF-7增殖率的影响 

红曲70％乙醇提取物对MCF-7增殖率的影响见表3.1、图3.3、图3.4和图3.5，红曲70％乙醇提取物(用水溶解)处理MCF-7细胞24h、48h、72h后，在1μg/ml～150μg/ml之间，细胞存活率跟浓度呈反比，随着浓度的增大，细胞存活率降低，与对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；红曲70％乙醇提取物(用DMSO溶解)处理MCF-7细胞24h、48h、72h后，在1μg/ml～150μg/ml之间，细胞活力跟浓度 呈反比，随着浓度的增大，细胞存活率降低，与对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；DMSO溶剂组随着DMSO的体积增大，细胞存活力降低，当DMSO达到μL时，与对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。 

表3.1MTT法检测红曲70％乙醇提取物对MCF-7细胞增殖的影响(OD)(A， 

n＝3)

^*P＜0.05vs.Control and^**P＜0.01vs.Control 

3.2.2红曲70％乙醇提取物(水溶解)及对应洛伐他汀对MCF-7增殖率的影响 

从表3.2、图3.6和图3.7结果可见：与对照组相比，红曲70％乙醇提取物在1～150μg/ml对MCF-7均有抑制作用，50～150μg/ml对MCF-7的抑制作用尤其明显(P＜0.05，P＜0.01)。而经换算后加入相应量的洛伐他汀组，其对MCF-7的抑制作用不明显，跟空白对照组相比，只有浓度为0.15μg/ml这一组对MCF-7的抑制作用有显著性差异(P＜0.05)。 

表3.2MTT法检测红曲70％乙醇提取物(水溶解)及对应洛伐他汀对MCF-7细胞增殖的影响(OD)(A， 

n＝4)

^*P＜0.05vs.Control and^**P＜0.01vs.Control 

3.2.3阿霉素对MCF-7增殖率的影响 

从表3.3、图3.7结果可见：与对照组相比，阿霉素在0.001～1μmol/L对MCF-7均有抑制作用，0.01～1μmol/L对MCF-7的抑制作用尤其明显(P＜0.05，P＜0.01)。而阿霉素浓度为0.0001μmol/L时，与对照组相比，无显著性差异，此浓度为阿霉素的最大无效量。 

表3.3MTT法检测阿霉素对MCF-7细胞增殖的影响(OD)(A， 

n＝6)

*P＜0.05vs.Control and**P＜0.001vs.Control 

4讨论 

4.1红曲70％乙醇提取物对人乳腺癌MCF-7有抑制作用 

本实验采用MTT法对不同浓度红曲70％乙醇提取物作用于人乳腺癌MCF-7细胞24h、48h、72h的生长情况进行了观察。结果表明红曲70％乙醇提取物无论用水溶解，或者用DMSO溶解对人乳腺癌MCF-7细胞有抑制增殖影响。特别在50～150μg/ml对MCF-7的抑制作用尤其明显(P＜0.05，P＜0.01)。细胞形态观察也表明随着红曲70％乙醇提取物浓度的增加，皱缩，变圆的程度增加，甚至出现细胞脱落，漂浮。有研究者报道，红曲黄色素Ankaflavin对人肝癌细胞Hep G2和人肺癌细胞A549具有诱导凋亡作用。也有人报告]红曲橙色素OR能有效地抑制人胃癌细胞AGS的增殖，与常用的腺癌临床治疗药物紫杉醇相比，橙色素OR对人胃癌细胞株AGS生长的抑制效果更为显著，且对人正常胃上皮细胞(GES-1)的毒性作用较小。还有人观察到]红曲多糖对小鼠S180肉瘤生长有明显的抑制作用，且高剂量组免疫器官脾脏质量显著增加，表明红曲多糖有抗肿瘤作用。但红曲对人乳腺癌MCF-7的抑制作用至今没有报告，我们研究证明，红曲70％乙醇提取物对乳腺癌细胞有明显的抑制作用。这种作用可能与其含有丰富的红曲橙色素、红色素、黄色素、多糖等成分有关，具体抑制癌细胞的增殖的成分，还有待进一步深入研究。 

结果表明，红曲70％乙醇提取物对人乳腺癌MCF-7有抑制作用。红曲70％乙醇提取物可以作为一种预防乳腺癌的保健食品，也可以进一步通过现代药剂学的生产方法，把红曲70％乙醇提取物按传统的生产工艺分别制备成丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂等可供临床应用的药物制剂，作为预防利治疗乳腺癌的药品。

附图说明：

图1是：红曲70％乙醇提取物高效液相色谱图； 

图2是：洛伐他汀对照品0.02mg/ml的高效液相色谱图。 

Claims (6)

1.红曲提取物在制备预防乳腺癌保健食品和药品的应用，其中红曲提取物的制备方法为：取天然红曲，先用8～12倍量的70％乙醇浸泡12～24小时，80℃回流提取，再用8～12倍量70％乙醇再80℃回流提取2次，每次2～4小时，合并3次提取液，回收乙醇，减压干燥后即得。

2.如权利要求1所述的红曲提取物在制备预防乳腺癌保健食品和药品的应用，其中红曲提取物最佳的制备方法为：取天然红曲，70％乙醇浸泡12h，8倍量70％乙醇80℃回流提取3次，每次2h，合并提取液，回收乙醇，减压干燥后即得。

3.如权利要求1所述的红曲提取物在制备预防乳腺癌保健食品方面的应用，产品形式为片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂。

4.如权利要求1所述的红曲提取物在制备预防乳腺癌保健食品方面的应用，其中保健食品是指饼干、饮料。

5.如权利要求4所述的红曲提取物在制备预防乳腺癌保健食品方面的应用，红曲提取物在饼干的添加量为5～30％。

6.如权利要求6所述的红曲菌丝体提取物在制备预防乳腺癌保健食品方面的应用，红曲提取物在饮料的添加量为1～15％。 

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