CN105963306A - 一种具有协同抗肿瘤转移活性的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有协同抗肿瘤转移的药物组合物，通过将具有强水溶性的二甲双胍与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果酸及其衍生物进行联合用药，表明其联合具有增效作用，可望获得较为安全可靠新型防治肿瘤转移的候选药物。该药物组合物，其特征在于包含如式I所示的化合物和二甲双胍I；其中式I中的R为羟基或者乙酰氧基；其中式I所示的化合物与二甲双胍的物质的量比为10:500-4000。

Description

一种具有协同抗肿瘤转移活性的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种具有协同抗肿瘤转移的药物组合物及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用，属于抗肿瘤转移药物组合物领域。

背景技术

癌症（恶性肿瘤）是指由于调控细胞增殖机制的失常而引发的疾病。癌症严重威胁人类健康，是当今人类中最严重的疾病之一。癌症的患病风险逐年增加，在中国每年超过160万人被诊断为癌症，120万人死于癌症。癌症已成为我国居民健康的主要慢性病之一，列城市死因的第一位，农村死因的第二位。到目前为止尚无彻底治疗癌症的办法，约80%的肿瘤患者主要的死亡原因是局部复发和远处转移近。肿瘤转移的过程涉及到细胞从原发灶点脱落、浸润相邻组织、降解细胞外基质、迁移运动以及新生血管生成等过程。从理论上来说，只要能够有效干预以上这些环节中的某个或某些过程，就有望对肿瘤转移产生显著的抑制作用。随着对肿瘤转移过程的了解和深入,近年来人们一直致力于新型抗肿瘤药物的研究，其中有效抑制肿瘤细胞转移的药物是一个新的药物开发方向。相对于传统化学合成药物,开发天然药物具有资金投入少、研究周期短、筛选效率高等优点。因此越来越多的新的化学实体和各种天然化合物被广大科研工作者所发现，并应用到抑制肿瘤细胞转移的发生发展过程中。

MMPs是一类参与细胞外基质和基底膜降解的蛋白水解酶，目前发现的家族成员共26个，其在乳腺癌、胃癌、宫颈癌、食管癌等多种实体瘤的肿瘤血管生成、肿瘤生长、浸润转移等病理生理学过程中发挥了重要作用。研究证实，MMP-2和MMP-9在多种实体瘤中存在异常高表达对肿瘤的侵袭和转移具有明显的促进作用;因此可以通过抑制MMP-2/9的表达进而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。

联合用药（Drug combination）是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用。联合用药往往会发生体内或体外药物的相互影响。对于某些药物组合，联合治疗还允许产生最佳组合剂量来使副作用最小化;两种化合物的联合治疗可揭示未预料到的协同作用和引发非由单一化合物诱导的效应。

熊果酸即3β-羟基-熊果-12-烯-28-酸(3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid，简称UA)，又名乌索酸、属于a-香树脂醇(a-amyrin)型五环三萜类化合物，结构如式Ⅱ所示，其相对分子量为456.68，分子式为C₃₀H₄₈O₃，是自然界中分布较广的天然活性化合物，主要以游离或糖苷的形式存在其广泛分布于枇杷叶、熊果、山楂、白花蛇舌草等多种天然植物中，也是许多传统中药的主要活性成分之一, 具有广泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等其中以抗癌活性最为显著，不仅对多种致癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞在体内、外均有抑制作用。因其副作用小，毒性低，显示出较大的临床应用潜力。近年来国内外对UA的抗肿瘤研究日趋深入，并发现其在肿瘤预防、治疗以及防止晚期复发转移等方面有着独特的优势及潜在的应用前景。熊果酸及其衍生物的抗癌谱广，专利N201510466210.4首次公开了熊果酸衍生物ASP-UA对乳腺癌细胞的粘附、迁移、侵袭等具有显著的抑制作用。专利N201410189256.1首次公开了熊果酸衍生物US597能有效减少小鼠B16-F10黑色素瘤的实验性肺转移，但目前将抗熊果酸及其衍生物和二甲双胍联合给药用于抗癌转移尚未见报道。

UA1，结构如式Ⅲ所示，该化合物可明显改善UA的溶解度，理化性质更加稳定；此外跟UA对比，其对不同种类肿瘤细胞均具有更显著的增殖抑制作用，且对正常细胞毒性较低，提示其具有安全、高效和低毒的特点，可望将其应用于肿瘤转移的早期预防和治疗中。

二甲双胍（Metformin，简称Met），其相对分子量为129.10，分子式为C₄H₁₁N₅，被认为是胰岛素增敏剂之一，结构如式Ⅳ所示。二甲双胍作为治疗2型糖尿病经典而有效的药物，已有近50年的临床应用历史，还用于治疗多囊卵巢综合症、假性黑棘病等。二甲双胍为强水溶性性药物，口服后主要在小肠吸收，生物利用度为50-60%左右。目前二甲双胍在各国的糖尿病治疗指南中均被推荐为首选用药，且无禁忌症，它的作用机理不同于其他类型的口服抗血糖药，它可减少肝糖的产生，降低小肠对糖的吸收，并且还可增加外周糖的摄取和利用，从而提高胰岛素的敏感性，它在糖尿病治疗中的威望也与日俱增，成为全球抗击糖尿病的核心药物。专利N201310069025.2首先公开了一种二甲双胍的新用途，证明了二甲双胍能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖。专利N201080048060.0也公开了二甲双胍在癌症治疗和预防中的用途。

以HepG2、SCL-1、MCF-7和A549细胞作为研究对象，通过熊果酸及其衍生物和二甲双胍进行联合用药，对HepG2、SCL-1、MCF-7、A549细胞进行体外抗癌活性测试，结果表明，熊果酸及其衍生物和二甲双胍的联合使用对癌细胞的增殖迁移、侵袭等具有显著的抑制作用。

发明内容

本发明的目的就是提供一种具有协同抗肿瘤转移的药物组合物，通过将具有强水溶性的二甲双胍与高效低毒的抗肿瘤天然产物熊果酸及其衍生物进行联合用药，考察其联合增效作用，可望获得较为安全可靠新型防治肿瘤转移的候选药物。

一种具有协同抗肿瘤转移的药物组合物及其在制备抗肿瘤转移药物中的应用，其特征在于包含如式I所示的化合物和二甲双胍

I ；

其中式I中的R为羟基或者乙酰氧基；

其中式I所示的化合物与二甲双胍的物质的量比为10:500-4000。

附图说明

图1.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对SCL-1细胞增殖的抑制结果；

图2.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对MCF-7细胞增殖的抑制结果；

图3.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对HepG2细胞增殖的抑制结果；

图4.熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对A549细胞增殖的抑制结果；

图5.UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对SCL-1细胞增殖的抑制结果；

图6.UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对MCF-7细胞增殖的抑制结果；

图7.UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对HepG2细胞增殖的抑制结果；

图8.UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对A549细胞增殖的抑制结果；

图9.UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h后对SCL-1迁移能力的抑制结果；

图10. UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h后对SCL-1迁移能力的抑制率；

图11. 熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24、48、72 h后对SCL-1细胞迁移能力的抑制结果；

图12. 熊果酸和二甲双胍联合使用作用24 h对SCL-1细胞迁移的抑制率；

图13. 熊果酸和二甲双胍联合使用作用48 h对SCL-1细胞迁移的抑制率；

图14. 熊果酸和二甲双胍联合使用作用72 h对SCL-1细胞迁移的抑制率；

图15. 熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用后对MMP-2蛋白表达水平的影响；

图16. 熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用后对MMP-9蛋白表达水平的影响。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

UA1的合成

①250 mL 圆底烧瓶，加入二氯甲烷20 ml，吡啶20 ml，熊果酸1 g，醋酸酐3.5 mL。加少量DMAP，室温磁力搅拌过夜；

②向①瓶中补充加入100 ml二氯甲烷，分别用100 mL 1 N HCl 溶液萃取②得到的有机层2次，收集有机层；

③与②步骤相同，分别用饱和NaHCO₃ 溶液萃取②得到的有机层2次，每次用量100 mL，最后分出有机层；

④向③中得到的有机层中加入无水硫酸钠充分搅拌干燥（约4勺），过滤；

⑤旋转蒸发仪蒸除溶剂，得粗品；

⑥柱层析纯化得纯白色UA1；

实施例2

熊果酸和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对SCL-1、MCF-7、HepG2及A549细胞的增殖抑制作用：采用标准MTT比色法测定了熊果酸和二甲双胍不同联合比例对SCL-1、MCF-7、HepG2及A549细胞的增殖抑制活性,结果如图1-4所示。

如图1-4所示，当熊果酸（10μM）和二甲双胍（1-4 mM）在低浓度范围内联合用药24h后，其对癌细胞无明显增殖抑制作用。因此后续我们选择将安全有效的低剂量浓度（无明显细胞杀伤作用）的熊果酸和二甲双胍联用，继续研究其对癌细胞侵袭及转移的抑制能力，以探索其在抗肿瘤转移领域应用的潜力。

实施例3

UA1和二甲双胍单独使用及联合使用24 h对SCL-1、MCF-7、HepG2及A549细胞的增殖抑制作用：采用标准MTT 比色法测定了UA1和二甲双胍不同联合比例对SCL-1、MCF-7、HepG2及A549细胞的增殖抑制活性,结果如图5-8所示。

如图5-8所示，当UA1（10 μM）和二甲双胍（1-4 mM）在低浓度范围内联合用药24 h后，其对癌细胞无明显增殖抑制作用。因此后续我们选择将安全有效的低剂量浓度（无明显细胞杀伤作用）的UA1和二甲双胍联用，继续研究其对癌细胞侵袭及转移的抑制能力，以探索其在抗肿瘤转移领域应用的潜力。

实施例 4

UA1和二甲双胍单独使用以及联合使用对非小细胞肺癌SCL-1侵袭能力的影响。

A549细胞先加无血清无酚红培养基饥饿过夜，消化、离心收集的细胞用空白培养基悬浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 μL用空白的培养基配制好的不同浓度样品的细胞悬浮液 (约5×10⁵/孔)，下室加500 μL含10%小牛血清的培养基，药物作用24 h后，取出小室，用4%的多聚甲醛固定20 min，用棉签擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3次，用0.1％结晶紫染色30 min，用PBS洗三次，将小室的底膜取下，用甘油封片保存，倒置显微镜下随机5个视野下拍照，结果见下图9、10。

结果如图9、10所示，0 h的时候给药干预组与空白对照组对比迁移距离无明显影响，经给药24 h后，空白对照组细胞发生了很明显的迁移，划痕宽带变窄；当UA1浓度为10 μM的时候，细胞也明显的发生了迁移；二甲双胍在10 mM的条件下，细胞也明显的发生了迁移，划痕宽带变窄；但当两者联合使用后，在二甲双胍在1 mM)的情况下，细胞的迁移能力明显的受到了抑制。划痕宽度与空白对照组相比差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。

实施例 5

熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用对SCL-1细胞株迁移能力的影响

取对数生长期的细胞(约3×10⁶/孔)接种于该板中，置于37℃,5% CO₂ 的培养箱中培养24 h,待细胞接近融合后，用白色枪头在孔板的1/4、1/2、3/4处垂直的划三条平行线，用PBS清洗细胞3次，在荧光显微镜下拍划痕宽度，记录下所拍图片的坐标轴。加入含不同药物浓度的培养基，置于37℃,5% CO₂ 的培养箱中培养24、48、72 h，在同一部位再次拍照，测定迁移距离，对比各组两次拍照的迁移距离，结果如图11-14所示。

实验结果如图11-14所示，熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用24、48、72 h后对SCL-1细胞株细胞迁移抑制率检测，结果表明：在0 h，给药干预组与空白对照组对比迁移距离无明显影响，经给药24 h后，空白对照组细胞发生了很明显的迁移，划痕宽带变窄；当UA浓度为10 μM的时候，细胞也明显的发生了迁移；二甲双胍在20 mM的条件下，细胞的迁移能力受到了抑制，划痕愈合速度减慢；但当两者联合使用后，在二甲双胍在1 mM)的情况下，就能明显的抑制细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性的抑制细胞的迁移能力。经给药48 h后，空白对照组细胞的划痕已经闭合；当UA浓度为10 μM的时候，细胞很明显的发生了迁移，划痕宽带变小；二甲双胍在高浓度20 mM的条件下才能明显的抑制细胞的迁移能力；但当两者联合使用后，在二甲双胍在较低浓度1 mM)的情况下，就能较明显的抑制细胞的迁移能力，随着二甲双胍药物浓度的增大，细胞的迁移能力也会变小。经给药72 h后，空白对照组细胞的划痕已经闭合；当UA浓度为10 μM的时候，细胞的划痕也已经闭合；二甲双胍在20 mM的条件下能够明显的抑制细胞的迁移能力；但当两者联合使用后，在二甲双胍在1 mM的情况下，就能较明显的抑制细胞的迁移能力。因此两者联合用药，能呈浓度依赖性和时间依赖性的抑制细胞的迁移能力，划痕宽度与空白对照组相比差异明显且具有统计学意义（P<0.01）。

实施例 6

熊果酸和二甲双胍单独使用以及联合使用对MMP-2/9蛋白表达水平的影响

将细胞接种至6孔板，待细胞达80％以上加不同药物干预细胞24 h后，弃去培养液，用预冷的PBS漂洗细胞2次，向6孔板中的每孔加入新鲜配制的细胞裂解液 RIPA(radioimmunopre-cipitation assay)200 μL[1 mL RIPA中加入10 μL蛋白酶抑制剂、10 μL磷酸酶抑制剂和5μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)]，冰上放置30 min，每5 min摇晃一次，12000×g 4℃离心15 min，取上清液，制备总蛋白；采用二喹啉甲酸(bicincho-ninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以β-actin水平作为等量蛋白质上样，取20 μg蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，然后将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene,PVDF)膜上，室温下用含5％脱脂奶粉的TBST封闭1 h，加入一抗4℃反应过夜，次日用TBST室温下洗膜3次(10 min/次)，再加入HRP标记的二抗（1:5000稀释）在室温下孵育1 h，用TBST在室温下再次洗膜3次（10 min次），最后电化学发光显影。采用图像分析软件Image J对条带进行灰度值分析，结果如图15、16所示。

实验结果如图15、16所示，空白对照组不影响MMP2/9蛋白水平的表达；当UA浓度为10 μM的时，对MMP-2/9蛋白表达水平的影响不大；当Met在20 mM条件下，可以抑制MMP-2/9蛋白表达水平；但当两者联合用药的时候（10 μM UA和1 mM Met联用）能够起到联合增效的作用，显著的抑制MMP-2/9蛋白表达水平。

Claims (2)

1.一种具有协同抗肿瘤转移的药物组合物，其特征在于包含如式I所示的化合物和二甲双胍

I ；

其中式I中的R为羟基或者乙酰氧基；

其中式I所示的化合物与二甲双胍的物质的量比为10:500-4000。

2.如权利要求1所述的药物组合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。