CN102741284A - 针对人血管生成素样蛋白4的人类抗体 - Google Patents

针对人血管生成素样蛋白4的人类抗体 Download PDF

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Abstract

提供了特异性结合并抑制人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的完整的人类抗体或人类抗体的抗原结合片段。所述人的抗-hANGPTL4抗体在治疗与ANGPTL4相关的疾病或病症中是有用的，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症等等。此外，可以向有此需要的受试者施用抗-hANGPTL4抗体以预防或治疗疾病或病症，对于所述疾病或病症而言异常脂质代谢是风险因子。此类疾病或病症包括心血管疾病，例如动脉硬化症和冠状动脉疾病；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；糖尿病；肥胖症等。

Description

针对人血管生成素样蛋白4的人类抗体
技术领域
本发明涉及特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的人类抗体和人类抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗方法。
背景技术
脂蛋白脂酶(LPL)在脂蛋白代谢中具有关键作用，以维持血液中的脂蛋白的正常水平，通过其活性的组织特异性调控来确定何时以及在何种组织中卸载甘油三酯(TG)。已经有报道指出：在人类和啮齿类中，ANGPTL4抑制LPL并延迟脂蛋白的分解代谢。无ANGPTL4的小鼠显示出血清TG的显著下降。相反，将ANGPTL4注射进入小鼠后产生了循环脂质的迅速增加，其速率高于注射血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)(Yoshida et al.,2002,J Lipid Res 43:1770-1772)。已知ANGPTL4的N末端卷曲螺旋区域而非C末端的纤维蛋白原样结构域对于抑制LPL活性、并因此对于高甘油三酯血症指征具有重要意义。这些发现表明：抑制ANGPTL4对于治疗那些特征在于升高的脂质水平的疾病、包括原发性血脂异常和与肥胖相关的高甘油三酯血症、代谢综合征、II型糖尿病等可能具有有益方面。还指出ANGPTL4在血管生成和癌症中具有一定作用(Galaup et al.,2006,PNAS103(49):18721-18726;Kim et al.,2000,Biochem J346:603-610;and Itoet al.,2003,Cancer Res 63(20):6651-6657)。
人ANGPTL4的核酸和氨基酸序列已经分别显示于SEQ ID NO:475和476。针对ANGPTL4的抗体公开于例如WO 2006/074228和WO 2007/109307。
发明内容
在第一方面，本发明提供了特异性结合并中和人ANGPTL4(hANGPTL4)活性的完整的人单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段。
抗体(Ab)可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)，或者可以仅包含抗原结合部分(例如Fab,F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修饰以影响功能，例如，为了消除残余的效应子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
在一个实施方式中，本发明包括：包含选自SEQ ID NO:2,18,22,26,42,46,50,66,70,74,90,94,98,114,118,122,138,142,146,162,166,170,186,190,194,210,214,218,234,238,242,258,262,266,282,286,290,306,310,314,330,334,338,354,358,362,378,382,386,402,406,410,426,430,434,450,454,458,466,468和487或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链可变区(HCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO:26,42,46,487,74,90,94,122,138,142,146,162和166的氨基酸序列的HCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ IDNO:42,487,90,138或162的HCVR。
在一个实施方式中，本发明包括：包含选自SEQ ID NO:10,20,24,34,44,48,58,68,72,82,92,96,106,116,120,130,140,144,154,164,168,178,188,192,202,212,216,226,236,240,250,260,264,274,284,288,298,308,312,322,332,336,346,356,360,370,380,384,394,404,408,418,428,432,442,452和456或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段。在另一实施方式中，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO:34,44,48,82,92,96,130,140,144,154,164和168的氨基酸序列的LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:44,92,140或164的LCVR。
在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含选自下列的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对：SEQ ID NO:2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,487/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/82,90/92,94/96,98/106,114/116,118/120,122/130,138/140,142/144,146/154,162/164,166/168,170/178,186/188,190/192,194/202,210/212,214/216,218/226,234/236,238/240,242/250,258/260,262/264,266/274,282/284,286/288,290/298,306/308,310/312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360,362/370,378/380,382/384,386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432,434/442,450/452,454/456,458/394,466/404和468/408。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO:26/34,42/44,487/44,46/48,74/82,90/92,94/96,122/130,138/140,142/144,146/154,162/164和166/168的氨基酸序列对的HCVR和LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:42/44,487/44,90/92,138/140或162/164的HCVR/LCVR对。
在第二方面，本发明涉及抗体或抗体的抗原结合片段，其包含：选自SEQ ID NO:8,32,56,80,104,128,152,176,200,224,248,272,296,320,344,368,392,416,440和464或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链互补决定区3(HCDR3)氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:16,40,64,88,112,136,160,184,208,232,256,280,304,328,352,376,400,424和448或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:32/40,80/88,128/136或152/160的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:32/40或80/88的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
在另一实施方式中，所述抗体或其片段还包含：选自SEQ ID NO:4,28,52,76,100,124,148,172,196,220,244,268,292,316,340,364,388,412,436和460或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:6,30,54,78,102,126,150,174,198,222,246,270,294,318,342,366,390,414,438和462或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列；和可选地进一步包含选自SEQ IDNO:12,36,60,84,108,132,156,180,204,228,252,276,300,324,348,372,396,420和444或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列；和/或选自SEQ ID NO:14,38,62,86,110,134,158,182,206,230,254,278,302,326,350,374,398,422和446或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列。
或者，本发明涉及抗体或抗体的抗原结合片段，其包含选自SEQID NO:4/6/8,28/30/32,52/54/56,76/78/80,100/102/104,124/126/128,148/150/152,172/174/176,196/198/200,220/222/224,244/246/248,268/270/272,292/294/296,316/318/320,340/342/344,364/366/368,388/390/392,412/414/416,436/438/440和460/462/464的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合;和/或选自SEQ ID NO:12/14/16,36/38/40,60/62/64,84/86/88,108/110/112,132/134/136,156/158/160,180/182/184,204/206/208,228/230/232,252/254/256,276/278/280,300/302/304,324/326/328,348/350/352,372/374/376,396/398/400,420/422/424和444/446/448的LCDR1/LCDR2/LCDR3组合。
在一个实施方式中，HCDR1,HCDR2和HCDR3选自SEQ IDNO:28/30/32,76/78/80,124/126/128和148/150/152;和/或LCDR1,LCDR2和LCDR3选自SEQ ID NO:36/38/40,84/86/88,132/134/136和156/158/160。在另一实施方式中，重链和轻链CDR氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40,76/78/80/84/86/88,124/126/128/132/134/136和148/150/152/156/158/160的CDR序列组合。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40或76/78/80/84/86/88的重链和轻链CDR序列。
在相关的实施方式中，本发明包含特异性结合hANGPTL4的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含：包含于选自SEQ ID NO:2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,487/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/82,90/92,94/96,98/106,114/116,118/120,122/130,138/140,142/144,146/154,162/164,166/168,170/178,186/188,190/192,194/202,210/212,214/216,218/226,234/236,238/240,242/250,258/260,262/264,266/274,282/284,286/288,290/298,306/308,310/312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360,362/370,378/380,382/384,386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432,434/442,450/452,454/456,458/394,466/404和468/408的HCVR/LCVR对中的重链和轻链CDR结构域。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术是本领域已知的并且可用于鉴定本文公开的指定的HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR的边界的常规定义包括：Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义是基于序列差异性，Chothia定义是基于结构环区的定位，AbM定义是Kabat和Chothia方法的折衷。见，例如Kabat,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);和Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。用于鉴定抗体内的CDR序列的公共数据库也是可获得的。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含：包含于选自SEQ ID NO:26/34,42/44,487/44,46/48,74/82,90/92,94/96,122/130,138/140,142/144,146/154,162/164和166/168的HCVR和LCVR对中的CDR序列。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含：包含于SEQ ID NO:42/44,487/44,90/92,138/140或162/164的HCVR和LCVR对中的CDR序列。
在另一个相关实施方式中，本发明提供了与包含SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40,76/78/80/84/86/88,124/126/128/132/134/136或148/150/152/156/158/160的重链和轻链CDR序列的抗体或抗原结合片段竞争与hANGPTL4的特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段与包含SEQ IDNO:42/44,487/44,90/92,138/140或162/164的HCVR/LCVR序列对的抗体竞争与hANGPTL4的特异性结合。
在另一个相关实施方式中，本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段：其结合至被包含SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40,76/78/80/84/86/88,124/126/128/132/134/136或148/150/152/156/158/160的重链和轻链CDR序列的抗体或其片段识别的hANGPTL4上的表位。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段识别被包含SEQ ID NO:42/44,487/44,90/92,138/140或162/164的HCVR/LCVR序列对的抗体识别的hANGPTL4上的表位。
在第三方面，本发明提供了编码抗ANGPTL4抗体或其片段、特别是上文描述的那些抗体或其片段的核酸分子。本发明还包括：携带本发明的核酸的重组表达载体和宿主细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌或哺乳动物细胞，例如CHO细胞，其中导入了此类载体；还包括通过在允许产生抗体的条件下培养所述宿主细胞并回收所产生的抗体而生产抗体的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了包含由选自SEQ ID NO:1,17,21,25,41,45,49,65,69,73,89,93,97,113,117,121,137,141,145,161,165,169,185,189,193,209,213,217,233,237,241,257,261,265,281,285,289,305,309,313,329,333,337,353,357,361,377,381,385,401,405,409,425,429,433,449,453,457,465,467和486的核酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCVR的抗体或其片段。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO:25,41,45,73,89,93,121,137,141,145,161,165和486的核酸序列编码的HCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:41,89,137,161或486的核酸序列编码的HCVR。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含由选自SEQ IDNO:9,19,23,33,43,47,57,67,71,81,91,95,105,115,119,129,139,143,153,163,167,177,187,191,201,211,215,225,235,239,249,259,263,273,283,287,297,307,311,321,331,335,345,355,359,369,379,383,393,403,407,417,427,431,441,451和455的核酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO:33,43,47,81,91,95,129,139,143,153,163和167的核酸序列编码的LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:43,91,139或163的核酸序列编码的LCVR。
在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ IDNO:1/9,17/19,21/23,25/33,41/43,486/43,45/47,49/57,65/67,69/71,73/81,89/91,93/95,97/105,113/115,117/119,121/129,137/139,141/143,145/153,161/163,165/167,169/177,185/187,189/191,193/201,209/211,213/215,217/225,233/235,237/239,241/249,257/259,261/263,265/273,281/283,285/287,289/297,305/307,309/311,313/321,329/331,333/335,337/345,353/355,357/359,361/369,377/379,381/383,385/393,401/403,405/407,409/417,425/427,429/431,433/441,449/451,453/455,457/393,465/403和467/407的核酸序列对编码的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO:25/33,41/43,486/43,45/47,73/81,89/91,93/95,121/129,137/139,141/143,145/153,161/163和165/167的核酸序列对编码的HCVR/LCVR序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:41/43,486/43,89/91,137/139或161/163的核酸序列对编码的HCVR/LCVR对。
在一个实施方式中，本发明涉及这样的抗体或抗体的抗原结合片段：其包含由选自SEQ ID NO:7,31,55,79,103,127,151,175,199,223,247,271,295,319,343,367,391,415,439和463的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCDR3结构域；和由选自SEQ ID NO:15,39,63,87,111,135,159,183,207,231,255,279,303,327,351,375,399,423和447的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的LCDR3结构域。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:31/39,79/87,127/135或151/159的核酸序列对编码的HCDR3和LCDR3序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:31/39或79/87的核酸序列对编码的HCDR3和LCDR3序列对。
在另一实施方式中，所述抗体或其片段还包含由选自SEQ ID NO:3,27,51,75,99,123,147,171,195,219,243,267,291,315,339,363,387,411,435和459的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCDR1结构域；和由选自SEQ ID NO:5,29,53,77,101,125,149,173,197,221,245,269,293,317,341,365,389,413,437和461的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCDR2结构域；可选地还包含由选自SEQ ID NO:11,35,59,83,107,131,155,179,203,227,251,275,299,323,347,371,395,419和443的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的LCDR1结构域；和/或由选自SEQ ID NO:13,37,61,85,109,133,157,181,205,229,253,277,301,325,349,373,397,421和445的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的LCDR2结构域。
或者，本发明涉及这样的抗体或其抗原结合片段，其包含：由选自SEQ ID NO:3/5/7,27/29/31,51/53/55,75/77/79,99/101/103,123/125/127,147/149/151,171/173/175,195/197/199,219/221/223,243/245/247,267/269/271,291/293/295,315/317/319,339/341/343,363/365/367,387/389/391,411/413/415,435/437/439和459/461/463的核苷酸序列组合编码的HCDR1/HCDR2/HCDR3组合；和/或由选自SEQ ID NO:11/13/15,35/37/39,59/61/63,83/85/87,107/109/111,131/133/135,155/157/159,179/181/183,203/205/207,227/229/231,251/253/255,275/277/279,299/301/303,323/325/327,347/349/351,371/373/375,395/397/399,419/421/423和443/445/447的核苷酸序列组合编码的LCDR1/LCDR2/LCDR3组合。
在一个实施方式中，HCDR1，HCDR2和HCDR3由选自SEQ IDNO:27/29/31,75/77/79,123/125/127和147/149/151的核苷酸序列组合编码；和/或LCDR1,LCDR2和LCDR3由选自SEQ ID NO:35/37/39,83/85/87,131/133/135和155/157/159的核苷酸序列组合编码。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含：由选自SEQ ID NO:27/29/31/35/37/39;75/77/79/83/85/87;123/125/127/131/133/135；和147/149/151/155/157/159的核苷酸序列组合编码的重链和轻链CDR序列。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分包含由SEQ IDNO:27/29/31/35/37/39或75/77/79/83/85/87的核苷酸序列组合编码的重链和轻链CDR序列。
在第四方面，本发明涉及特异性结合hANGPTL4的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR3和LCDR3，其中HCDR3包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20(SEQ ID NO:471)的氨基酸序列，其中X1是Ala，X2是Arg或Lys，X3是Gly或Glu，X4是Gly，Asp或不存在，X5是Asp或不存在，X6是Leu，Arg或不存在，X7是Arg或Ser，X8是Phe，Gly或Arg，X9是Leu，His或Asn，X10是Asp，Pro或Tyr，X11是Trp，Tyr或Phe，X12是Leu，Phe，Val或Asp，X13是Ser，Tyr或Gly，X14是Ser，Tyr或Asp，X15是Tyr，X16是Phe或Gly，X17是Leu或不存在，X18是Asp，X19是Tyr，Val或Phe，X20是Trp；并且LCDR3包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:474)的氨基酸序列，其中X1是Gln，X2是Asn或Gln，X3是Tyr或Leu，X4是Asn，His，Ser或Asp，X5是Thr或Ser，X6是Ala或Tyr，X7是Pro，Ser或Phe，X8是Leu或Arg，X9是Thr，X10是Phe。
在另一实施方式中，所述抗体或其片段还包含：包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:469)的氨基酸序列的HCDR1序列，其中X1是Gly，X2是Gly或Phe，X3是Ser或Thr，X4是Phe，X5是Ser，X6是Ile，Ser或Thr，X7是His或Tyr，X8是His，Gly或Asp；包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:470)的氨基酸序列的HCDR2序列，其中X1是Ile，X2是Asn，Ser或Gly，X3是His，Phe，Ser或Val，X4是Arg，Asp或Ala，X5是Gly，X6是Gly或不存在，X7是Ser，Asn或Asp，X8是Thr或Lys；包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO:472)的氨基酸序列的LCDR1序列，其中X1是Gln，X2是Gly或Ser，X3是Ile，X4是Ser或Asn，X5是Asp，Ser或Arg，X6是Tyr或Trp；和包含式X1-X2-X3(SEQID NO:473)的氨基酸序列的LCDR2序列，其中X1是Ala或Lys，X2是Ala，X3是Ser。H1H268P，H1H284P，H1H291P和H1H292P单克隆抗体的序列比对显示于图1(HCVR)和图2(LCVR)。
在第五方面，本发明涉及人的抗ANGPTL4抗体或其抗原结合片段，其包含由衍生自VH，DH和JH种系序列的核苷酸序列区段编码的重链可变区(HCVR)和由衍生自VK和JK种系序列的核苷酸序列区段编码的轻链可变区(LCVR)，其中HCVR和LCVR由衍生自选自(i)VH3-30，DH5-12，JH6，VK1-9和JK4;(ii)VH4-34，DH3-3，JH4，VK1-27和JK4；和(iii)VH3-13，DH1-26，JH4，VK1-5和JK1的种系基因组合的核苷酸序列区段编码。
在第六方面，本发明涉及以大约1nM或更低的平衡解离常数(KD)特异性结合hANGPTL4的抗体或其抗原结合片段，如通过表面等离子共振测定法(例如BIACORETM)所测定。在一些实施方式中，本发明的抗体显示出大约500pM或更低、大约400pM或更低、大约300pM或更低、大约200pM或更低、大约150pM或更低、大约100pM或更低，或大约50pM或更低的KD。
在第七方面，本发明提供了结合SEQ ID NO:476的hANGPTL4蛋白但不与相关蛋白、例如人血管生成素样蛋白3(hANGPTL3；SEQID NO:485)交叉反应[如通过例如ELISA、表面等离子共振测定法或
Figure BDA00001958829200101
Technology所测定，如本文所描述]的抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合片段。ANGPTL3是已知的另一种降低LPL活性并且具有N末端卷曲螺旋和C末端纤维蛋白原样结构域的分泌的蛋白(Ono et al.,2003,J Biol Chem 43:41804-41809)。在相关的实施方式中，本发明提供了结合hANGPTL4蛋白并且与hANGPTL3蛋白交叉反应的抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，hANGPTL4抗体或其片段与hANGPTL3蛋白的结合亲和性是该抗体或片段与hANGPTL4蛋白的结合亲和性的大约75%或更低，或大约50%或更低。在另一个相关实施方式中，本发明提供了不与小鼠ANGPTL4(mANGPTL4:SEQ ID NO:478)交叉反应但是与猕猴(Macaca fascicularis;N末端的1-148残基的氨基酸序列和编码DNA序列分别显示于SEQ ID NO:490和489)和/或恒河猴(Macaca mulatta;N末端的1-148残基的氨基酸序列和编码DNA序列分别显示于SEQ ID NO:492和491)的ANGPTL4交叉反应的抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合片段。
本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗-hANGPTL4抗体。在一些应用中，旨在除去不希望的糖基化位点的修饰可能是有用的，或者，例如，除去岩藻糖部分以增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能(见Shield et al.(2002)JBC 277:26733)。在其它应用中，除去N末端糖基化位点可以减少不希望的针对治疗抗体的免疫反应，或增加抗体的亲和性。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在第八方面，本发明涉及包含特异性结合hANGPTL4的重组人类抗体或其片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方式中，本发明涉及这样的组合物：其为本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂的组合。所述第二治疗剂可以是下列任意试剂的一种或多种：例如，(1)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，例如西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、罗舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等；(2)胆固醇摄取和/或胆汁酸重吸收的抑制剂；(3)烟酸(niacin)，其增加脂蛋白分解代谢；(4)贝特类或两亲性羧酸类，其降低低密度脂蛋白(LDL)水平，改善高密度脂蛋白(HDL)和TG水平，并减少非致命性心脏病发作数目；和(5)LXR转录因子的激活剂，该转录因子在胆固醇、例如22-羟基胆固醇的消除中具有重要作用，或固定的组合，例如依泽替米贝+辛伐他汀;抑制素(statin)与胆汁树脂(例如考来烯胺、考来替泊、考来维仑)，尼克酸+抑制素的固定的组合(例如尼克酸+洛伐他汀)；或与其它降脂试剂，例如ω-3-脂肪酸乙基酯(例如omacor)。此外，第二治疗剂可以是一种或多种其它的ANGPTL4抑制剂，以及其它分子的抑制剂，其它分子是例如ANGPTL3、ANGPTL5、ANGPTL6和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)，其参与在脂质代谢尤其是胆固醇和/或甘油三酯平衡。这些分子的抑制剂包括小分子和特异性结合这些分子并阻断它们的活性的抗体。
在相关的实施方式中，第二治疗剂可以是一种或多种抗癌剂，例如化疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、细胞毒性试剂、细胞凋亡试剂和本领域熟知的用于治疗癌症或其它增殖疾病或病症的其它试剂，以及其它治疗剂，例如镇痛剂、抗炎剂，包括非甾体抗炎药物(NSAIDS)，例如Cox-2抑制剂等，以缓解和/或减少伴随癌症/肿瘤的症状。
在第九方面，本发明涉及使用本发明的抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合部分抑制hANGPTL4活性的方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段和任选包含一种或多种另外的上文描述的治疗剂的药物组合物。所治疗的疾病或病症是：通过消除、抑制或减少ANGPTL4活性而被改善、缓解、抑制或预防的任何疾病或病况，或者相对于不以抗-hANGPTL4抗体治疗其发生率降低的疾病或病况(例如，ANGPTL4介导的疾病或病症)。可通过本发明的方法治疗的疾病或病症的实例包括但不限于：涉及脂质代谢的疾病或病症，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括导致动脉粥样化的血脂异常、糖尿病性血脂异常、高甘油三酯血症，包括具有>1000mg/dL的TG的严重高甘油三酯血症，高胆固醇血症，乳糜微粒血症，混合的血脂异常(肥胖、代谢综合征、糖尿病等)，脂肪代谢障碍，脂肪营养不良等，其是由下列引起的，例如降低的LPL活性和/或LPL缺乏、降低的LDL受体活性和/或LDL受体缺乏、改变的ApoC2、ApoE缺乏、增加的ApoB、极低密度脂蛋白(VLDL)的增加的产生和/或减少的消除、某些药物治疗(例如，糖皮质激素治疗诱导的血脂异常)，任何遗传体质，膳食，生活方式等。本发明的方法还预防或治疗与高脂血症、高脂蛋白血症和/或血脂异常相关或由其引起的疾病或病症，包括但不限于：心血管疾病或病症，例如动脉硬化症、动脉瘤、高血压、绞痛、中风、脑血管疾病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、外周血管疾病等；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；血糖异常，例如糖尿病；肥胖症等。
可通过本发明的方法治疗的疾病或病症的其它实例包括癌症/肿瘤，以及非肿瘤性血管形成相关性疾病或病症，包括眼睛血管形成性疾病或病症，例如老年性黄斑变性、视网膜中央静脉阻塞或视网膜分支静脉阻塞，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变等，炎性疾病或病症，例如关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣等。
其它实施方式将通过阅读下面的详细描述而变得明显。
附图说明
图1显示了抗体H1H268P、H1H284P、H1H291P和H1H292P的重链可变区(HCVR)的序列比对。
图2显示了抗体H1H268P、H1H284P、H1H291P和H1H292P的轻链可变区(LCVR)的序列比对。
图3A和3B显示了野生型小鼠(图3A)和表达人ANGPTL4的转基因小鼠[hAngptl4(+/+)小鼠；或“人源化的ANGPTL4小鼠”](图3B)中的抗-ANGPTL4抗体的药代动力学清除。H4H268P2(□);H4H284P(▲);hIgG4对照(●)。
图4显示了抗-ANGPTL4抗体H4H268P2对于与ApoE空小鼠杂交的人源化ANGPTL4小鼠中的血清甘油三酯(TG)水平的影响。显示了H4H268P2引起的血清TG水平的百分率变化，与具有不相关特异性的对照抗体相比较。对照Ab(○)；H4H268P2(■)。
图5显示了抗-ANGPTL4抗体H4H268P2和降低TG的药物非诺贝特(单独或组合)对于人源化ANGPTL4小鼠中的血清TG水平的影响。
图6显示了关于抗-ANGPTL4抗体对于肥胖恒河猴(Macacamulatta)的空腹血清TG水平的影响的I期初步研究的结果。所有的猴子在第-5天接受介质(10mM组氨酸,pH6)静脉内(IV)输注，在第0天接受10mg/kg IV的H4H268P2(n=3)(●)或H4H284P(n=3)(□)。从基线期直至给药后第35天收集血清样品。在第-7、-5和0天获取的样品确定每只动物的平均基线，并测定相对于所测的基线的血清TG水平的百分率变化并对每个抗体组取平均值。
图7显示了关于抗-ANGPTL4抗体H4H268P2对于肥胖猴子的空腹血清TG水平的影响的II期初步研究的结果，如针对图6所描述，区别在于不进行介质输注的步骤。基于在第-7、-3和0天获取的样品获得每只猴子的平均基线。根据它们的基线将猴子分组：A.TG<150mg/dL(n=3;□);B.150mg/dL<TG<500mg/dL(n=4;●);C.TG>1000mg/dL
Figure BDA00001958829200141
测定每只猴子的相对于基线的空腹TG水平的百分率变化并对每个组取平均值。
所有图形中的误差线表示平均值±SEM。
详细描述
在详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式，不是为了限制，因为本发明的范围将仅由随附的权利要求限制。
除非另有指明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。虽然与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可用于实施或测试本发明，但是现在描述优选方法和材料。
定义
如本文使用的术语“人血管生成素样蛋白4”或"hANGPTL4"是指具有如SEQ ID NO:475所示的核酸序列和SEQ ID NO:476的氨基酸序列的hANGPTL4，或其生物活性片段。
如本文使用的术语“抗体”是指由4个多肽链组成的免疫球蛋白分子，即通过二硫键连接的2个重链（H）和2个轻链（L）。每个重链由重链可变区(HCVR)和重链恒定区(CH;由结构域CH1,CH2和CH3组成)组成。每个轻链由轻链可变区(LCVR)和轻链恒定区(CL)组成。HCVR和LCVR可进一步细分为高变区，其被称作互补决定区(CDR)，散布于更加保守的、被称作框架区(FR)的区域之间。每个HCVR和LCVR由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。
置换一个或多个CDR残基或删除一个或多个CDR也是可能的。在科学文献中已经描述了这样的抗体，其中可以删除一个或两个CDR以进行结合。Padlan et al.(1995FASEB J.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区域，并得出结论：实际上，仅有大约1/5至1/3的CDR残基与抗原接触。Padlan还发现很多这样的抗体：其中一个或两个CDR不具有与抗原接触的氨基酸(另见，Vajdoset al.2002J Mol Biol 320:415-428)。
可以基于之前的研究(例如，CDRH2中的残基H60-H65通常是不需要的)，通过分子模拟和/或经验，从Chothia CDR之外的KabatCDR的区域鉴定不接触抗原的CDR残基。如果一个CDR或其残基被删除，其通常是被另一个人类抗体序列或此类序列的共有序列中的对应位置上的氨基酸置换。也可以通过经验选择CDR内的置换位置和待置换的氨基酸。经验置换可以是保守性的或非保守性置换。
如本文使用的术语“人类抗体”意在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类单克隆抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或位点特异性诱变在体外导入的突变，或通过体细胞突变在体内导入的突变)，例如，在CDR中，尤其是CDR3中的残基。然而，如本文使用的术语“人类抗体”不包括这样的单克隆抗体：源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人FR序列上。
相对于对应的种系序列，如本文公开的全长人抗-hANGPTL4抗体可以在重链和轻链可变域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或删除。此类突变可以通过将本文公开的氨基酸序列与可以从例如公开的抗体序列数据库获得的种系序列进行比较而容易地确定。本发明包括抗体及其抗原结合片段，所述片段源自本文公开的任意氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被突变为该抗体所衍生自的种系序列的对应的残基，或突变为另一人类种系序列的对应残基，或突变为对应的种系残基的保守性氨基酸置换(此类序列变化在本文中合称“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发，能够容易地产生包含一个或多个单一种系回复突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基都回复突变为该抗体所衍生自的原始种系序列中存在的残基。在其它实施方式中，仅有某些残基回复突变为原始种系序列，例如，仅有FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅有CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其它实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列的对应残基(即，不同于该抗体最初所衍生自的种系序列的种系序列)。此外，本发明的抗体可以在框架和/或CDR区内包含两个或更多个种系突变的任意组合，例如，其中一些单一残基突变为特定种系序列的对应残基，而一些不同于原始种系序列的其它残基被保持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得后，可以就一种或多种希望的性质、例如改善的结合特异性、增加的结合亲和性、改善或增强的拮抗性或激动性生物性质(视情况而定)、降低的免疫原性等来容易地测试包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段。通过这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包括在本发明内。
本发明还包括：包含具有一个或多个保守性置换的本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体的抗-ANGPTL4抗体。例如，本发明包括：相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，具有含有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、2个或1个保守性氨基酸置换的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗-ANGPTL4抗体。在一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ IDNO:487的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列，其中具有2个或1个保守性氨基酸置换。在一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其中具有2个或1个保守性氨基酸置换。
除非另有明确指明，否则如本文使用的术语“抗体”应该被理解为包括：包含2个免疫球蛋白重链和个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“完整抗体分子”)及其抗原结合片段。如本文使用的术语“抗体的抗原结合部分”、“抗体的抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然产生的、酶促可获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以衍生自例如完整抗体分子，使用任何合适的标准技术，例如蛋白水解消化或重组遗传工程技术，其涉及编码抗体可变域和(任选)恒定域的DNA的操作和表达。此类DNA是已知的，和/或可以容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体显示抗体库)获得，或者可以被合成。可以对DNA进行测序并化学地操作或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，以将一个或多个可变域和/或恒定域排列为合适的构型，或导入密码子、产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的超变区的氨基酸残基组成的最简识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR))。其它工程化的分子，例如diabody、triabody、tetrabody和minibody，也包括在如本文中使用的词语"抗原结合片段"内。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变域。可变域可以是任何大小或氨基酸组成，一般将包含邻近一个或多个框架序列或与一个或多个框架序列同框的至少一个CDR。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体的VH或VL结构域。
在一些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以包含与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以存在于本发明的抗体的抗原结合片段中的可变域和恒定域的非限制性的示例性构型包括：(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任何构型中，包括上述的示例性构型中的任一项，可变域和恒定域可以直接彼此相连，或可以通过完整或部分铰链或连接区而彼此连接。铰链区可以由至少2个(例如5,10,15,20,40,60或更多个)氨基酸组成，其产生单一多肽分子内的邻近的可变域和/或恒定域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含以非共价方式彼此结合和/或与一个或多个单体的VH或VL结构域结合(例如，通过二硫键)的上述任意可变域和恒定域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。
如完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少2个不同的可变域，其中每个可变域能够特异性结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括如本文公开的示例性的双特异性抗体形式，可以使用本领域可获得的常规技术适用于本发明的抗体的抗原结合片段的情景下。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体片段可以缀合于治疗部分(“免疫缀合物”)，例如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。
术语“特异性结合”意思是抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可以通过大约1x10-6M或更低的平衡解离常数来表征(即，较小的KD代表更紧密的结合)。用于测定两个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。但是，特异性结合hANGPTL4的分离的抗体可以显示出与其它抗原的交叉反应性，例如来自其它物种的ANGPTL4分子，例如，猕猴ANGPTL4，和/或具有SEQ ID NO:485的氨基酸序列的hANGPTL3。此外，结合hANGPTL4和一种或多种另外的抗原的多特异性抗体(例如双特异性的)被认为是如本文使用的“特异性结合”hANGPTL4的抗体。
术语“高亲和性”抗体是指具有大约1x10-9M或更低、大约0.5x10-9M或更低、大约0.25x10-9M或更低、大约1x10-10M或更低、大约0.5x10-10M或更低的KD的与hANGPTL4的结合亲和性的抗体，所述KD是通过表面等离子共振测定的，例如BIACORETM或溶液亲和ELISA。
如本文使用的术语"KD"是指特定的抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“缓慢解离速率”、“Koff”或“kd”意思是，抗体以1x10-3s-1或更低、优选1x10-4s-1或更低的速率常数从hANGPTL4分离，如通过表面等离子共振例如BIACORETM所测定。
术语“内在亲和常数”或“ka”意思是以大约1x103M-1s-1或更高的速率常数与hANGPTL4结合的抗体，如通过表面等离子共振例如BIACORETM所测定。
如本文使用的“分离的抗体”是指实质上不含具有不同的抗原特异性的其它单克隆抗体的抗体(例如，特异性结合hANGPTL4的分离的抗体实质上不含特异性结合除了hANGPTL4以外的抗原的单克隆抗体)。但是，特异性结合hANGPTL4的分离的抗体可以与其它抗原具有交叉反应性，例如来自其它物种、例如猕猴的ANGPTL4分子，和/或其它相关蛋白，例如人ANGPTL3。
如本文使用的"中和抗体"(或"中和ANGPTL4活性的抗体")是指这样的抗体：其与ANGPTL4的结合导致ANGPTL4的至少一种生物活性被抑制。ANGPTL4的生物活性的这种抑制可以通过以一种或多种本领域已知的标准的体外或体内测定法测定ANGPTL4生物活性的一个或多个指示物来测定(另外见以下实施例)。
如本文使用的术语"表面等离子共振"是指允许通过例如，使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden andPiscataway,N.J.)检测生物传感器基质内的蛋白浓度的变化来实时分析生物特异性相互作用的光学现象。
术语“表位”是抗体所结合的抗原的区域。表位可以定义为结构性的或功能性的。功能性表位一般是结构性表位的子集，并且具有直接影响相互作用的亲和性的残基。表位也可以是构象型的，即，由非线性氨基酸构成。在一些实施方式中，表位可以包括决定簇，其为分子的化学活性表面聚集，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在一些实施方式中，可以具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特征。
当指称核酸或其片段时，术语"实质上同一性"或"实质上相同"表示：当具有合适的核苷酸插入或删除的核酸与另一核酸(或其互补链)优化比对时，在至少大约90%，更优选至少大约95%,96%,97%,98%或99%的核苷酸碱基中有核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法例如FASTA、BLAST或GAP所测定，如下文所讨论。
就适用于多肽而言，术语"实质上相似性"或"实质上相似"意思是：当例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省空隙权重进行优化比对时，两个肽序列具有至少90%的序列同一性，更优选为至少95%,98%或99%序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差异为保守性氨基酸置换。"保守性氨基酸置换"是这样的置换：其中一个氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基置换。一般地，保守性氨基酸置换将不会实质性改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此差别为保守性置换的情况下，可以上调相似性的百分率或程度，以校正置换的保守性性质。进行该调整的方法是本领域技术人员熟知的。见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含巯基侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换是在如Gonnet et al.(1992)Science 256:144345公开的PAM250对数可能性基质中具有正值的任何改变。“中等保守性”替代是在PAM250对数可能性基质中具有非负值的任何改变。
通常使用序列分析软件来测定多肽的序列相似性。蛋白分析软件使用分配给各个置换、删除和其它修饰(包括保守性氨基酸置换)的相似性测量值而匹配相似序列。例如，GCG软件含有程序，例如GAP和BESTFIT，其可以以缺省参数使用以测定密切相关的多肽(例如来自生物的不同物种的同源多肽)之间的或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，例如GCG Version 6.1。也可以使用FASTA以缺省或推荐的参数比较多肽序列；其为GCG Version6.1中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间的最佳重叠的区域的比对和百分率序列同一性(Pearson(2000)见上)。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数进行。见，例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403410and(1997)Nucleic Acids Res.25:3389402。
术语“治疗有效量”意思是产生施用它所希望获得的效应的量。精确的量将取决于治疗目的、被治疗的受试者的年龄和体型大小、施用途径等，其是本领域技术人员使用已知技术可以确定的(见，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)。
人类抗体的制备
在转基因小鼠中产生人类抗体的方法是本领域已知的。任何此类已知的方法可用于本发明的情景中以制备特异性结合ANGPTL4的人类抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术或任何其它已知的用于产生单克隆抗体的方法，最初分离的针对ANGPTL4的高亲和性嵌合抗体具有人可变区和小鼠恒定区。如下文实验部分所述，就需要的性质、包括亲和性、选择性、表位等等表征并选择抗体。
一般地。本发明的抗体具有非常高的亲和性，通常具有大约10-12M至大约10-9M的KD(通过与固定于固相或处于溶液相中的抗原结合时所测定)。小鼠恒定区被替换为需要的人恒定区，例如野生型IgG1(SEQ ID NO:481)或IgG4(SEQ ID NO:482)，或修饰的IgG1或IgG4(例如，SEQ ID NO:483)，以产生本发明的完全人类抗体。虽然所选的恒定区可以根据特定用途而变化，但是抗体的高亲和性抗原结合和靶标特异性性质存在于可变区中。
表位定位和相关的技术
为了筛选结合特定表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，例如在Antibodies,Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harb.,NY)中所描述的。其它的方法包括丙氨酸筛选突变体、肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)，或肽切割分析。另外，可以使用例如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。
术语“表位”是指抗原上的、B和/或T细胞针对其作出应答的位点。B细胞表位可以形成于连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而毗邻的非连续氨基酸。形成于连续氨基酸的表位通常在暴露于变性溶剂后仍然保持，而通过三级折叠形成的表位通常在以变性溶剂处理之后会丧失。表位通常包括至少3个，更通常为至少5个或8-10个以独特空间构象存在的氨基酸。
修饰辅助谱(MAP)，也称作基于抗原结构的抗体谱(ASAP)，是根据每种抗体与化学或酶学修饰的抗原表面的结合谱的相似性而将针对同一抗原的大量的单克隆抗体(mAb)进行归类的方法(US2004/0101920)。每个类别可以反映出与另一个类别代表的表位截然不同或部分重叠的独特表位。该技术允许对遗传上相同的mAb进行迅速过滤，从而表征可聚焦于遗传上不同的单克隆抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可以促进产生具有需要的性质的单克隆抗体的稀少的杂交瘤克隆的鉴定。MAP可用于将本发明的抗-ANGPTL4单克隆抗体分为结合不同表位的单克隆抗体的组。
ANGPTL4含有氨基末端的卷曲螺旋结构域和羧基末端的纤维蛋白原样结构域，全长的ANGPTL4蛋白通过分子间二硫键形成寡聚体(Ge et al.,2004,J Bio Chem 279(3):2038-2045)。已经有报道指出N末端卷曲螺旋结构域介导ANGPTL4的寡聚化(Ge et al.,见上文)，该结构域在LPL活性的抑制中也具有重要作用(Ge et al.,2005,J Lipid Res46:1484-1490;和Ono et al.,2003,J Biol Chem 278:41804-41809)。因此，在一些实施方式中，抗-hANGPTL4抗体或抗体的抗原结合片段结合hANGPTL4(SEQ ID NO:476)的N末端卷曲螺旋结构域(残基1-123)内的表位。在一些实施方式中，抗-hANGPTL4抗体或其片段结合hANGPTL4(SEQ ID NO:476)的大约残基1至大约残基25、大约残基25至大约残基50、大约残基50至大约残基75、大约残基75至大约残基100、大约残基100至大约残基125、大约残基125至大约残基150的区域内的表位。在一些实施方式中，抗体或抗体片段结合这样的表位，其包括一个以上的所列举的hANGPTL4的N末端卷曲螺旋结构域内的表位。在其它实施方式中，抗-hANGPTL4抗体或其片段结合hANGPTL4的一个或多个片段，例如，SEQ ID NO:476的残基26-406、残基26-148、残基34-66、和/或残基165-406的片段。
本发明包括与本文描述的任何特异性示例性抗体结合相同表位的hANGPTL4抗体。同样，本发明也包括与本文描述的任何特异性示例性抗体竞争结合hANGPTL4或hANGPTL4片段的抗-hANGPTL4抗体。
可以通过使用本领域已知的常规方法容易地确定一个抗体是否与参考抗-hANGPTL4抗体结合相同表位或与参考抗-hANGPTL4抗体竞争。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗-hANGPTL4抗体结合相同的表位，可以在饱和条件下使参考抗体结合hANGPTL4蛋白或肽。然后，测定测试抗体结合hANGPTL4分子的能力。如果测试抗体能够在参考抗-hANGPTL4抗体饱和结合之后结合hANGPTL4，则可以得出结论：该测试抗体与参考抗-hANGPTL4抗体结合不同的表位。另一方面，如果测试抗体在参考抗-hANGPTL4抗体饱和结合之后不能结合hANGPTL4分子，则该测试抗体可能与本发明的参考抗-hANGPTL4抗体结合相同的表位。
为了测试抗体是否与参考抗-hANGPTL4抗体竞争，以两个方向进行上述结合方法。在第一个方向中，使参考抗体在饱和条件下结合hANGPTL4分子，然后测定测试抗体与hANGPTL4分子的结合。在第二个方向中，使测试抗体在饱和条件下与hANGPTL4分子结合，然后测定参考抗体与ANGPTL4分子的结合。如果在两个方向中，只有第一个（饱和）抗体能够结合ANGPTL4分子，则得出结论：测试抗体和参考抗体竞争与hANGPTL4的结合。如本领域普通技术人员所认识到的，与参考抗体竞争的抗体不一定与该参考抗体结合相同的表位，而是可能通过结合重叠表位或邻近表位而空间上阻断参考抗体的结合。
如果两个抗体各自竞争性抑制（阻断）另一个与抗原的结合，则这两个抗体结合相同表位或重叠表位。即，1-,5-,10-,20-或100-倍过量的一种抗体抑制另一种的结合达至少50%、优选75%,90%或甚至99%，如在竞争性结合测定中所测定(见，例如Junghans et al.,CancerRes,1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减少或消除另一种的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变也减少或消除另一种的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
然后可以进行另外的常规实验（例如肽突变和结合分析）以确认所观察到的测试抗体的结合的缺乏是否事实上是由于与参考抗体结合相同的表位引起的，或者是否是空间阻断（或另一种现象）造成所观察到的结合的缺乏。这种类型的实验可以使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定法来进行。
免疫缀合物
本发明包括缀合于治疗部分、例如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性标记物的人抗-hANGPTL4单克隆抗体(“免疫缀合物”)。细胞毒素试剂包括任何对于细胞有毒性的试剂。用于形成免疫缀合物的合适的细胞毒素试剂和化疗试剂的实例是本领域已知的，见例如WO 05/103081。
双特异性
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性的单克隆抗体可以特异于一个靶多肽的不同表位或者可以包含特异于多个靶多肽的抗原结合结构域。见，例如Tutt et al.(1991)J.Immunol.147:60-69。人抗-hANGPTL4单克隆抗体可以连接于另一个功能分子，例如另一个肽或蛋白，或者与其一起表达。例如，抗体或其片段可以与一个或多个其它分子实体、例如另一个抗体或抗体片段功能性连接（例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合），以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
可用于本发明的情景中的示例性的双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二IgCH3结构域，其中第一和第二IgCH3结构域彼此的区别为至少一个氨基酸，并且其中相对于不含该氨基酸差异的双特异性抗体而言，该至少一个氨基酸差异减少双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，第一IgCH3结构域结合蛋白A，第二IgCH3结构域包含减少或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。在IgG1抗体的情况下，可以存在于第二CH3内的其它修饰包括：D16E,L18M,N44S,K52N,V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E,L358M,N384S,K392N,V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下为N44S,K52N和V82I(根据IMGT;根据EU为N384S,K392N和V422I)；在IgG4抗体的情况下为Q15R,N44S,K52N,V57M,R69K,E79Q和V82I(根据IMGT;根据EU为Q355R,N384S,K392N,V397M,R409K,E419Q和V422I)。上述描述的双特异性抗体形式的变化在本发明的范围内。
生物等同物
本发明的抗-hANGPTL4抗体和抗体片段包括这样的蛋白：其具有不同于所描述的单克隆抗体的氨基酸序列，但是保持与人ANGPTL4结合的能力。此类变体单克隆抗体和抗体片段相对于亲代序列具有一个或多个氨基酸的添加、删除或置换，但是显示出与描述的单克隆抗体基本上等同的生物活性。同样，本发明的hANGPTL4抗体的编码DNA序列包括相对于所公开的序列具有一个或多个核苷酸的添加、删除或置换、但是编码与本发明的抗-hANGPTL4抗体或抗体片段基本上生物等同的抗-hANGPTL4抗体或抗体片段的序列。此类变体氨基酸和DNA序列的实例在上文中有讨论。
如果，例如，两个抗原结合蛋白或抗体是药学上等同的或药学上可替代的，当在相似的实验条件下以单一剂量或多个剂量以相同摩尔剂量施用时，它们的吸收速率和程度未显示出显著差异，则它们被认为是生物上等同的。如果一些抗体在吸收程度上等同但是在吸收速率上不同，这些抗体将被认为是等同或药学可替代的，仍然可以被考虑为生物等同的，因为此类吸收速率上的差异是有意而为，在标记中有所反映，并且对于临床使用上的有效身体药物浓度的达到不是必不可少的，对于所研究的特定药物产品，其被认为是医学上不重要的。在一个实施方式中，如果两个抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度和效力上没有临床意义上的差异，则它们是生物等同的。
在一个实施方式中，如果患者可以在参考产品和生物产品之间转换一次或多次而无预期的副作用风险的增大、包括免疫原性上的临床上显著的变化，或减小的有效性（相对于不进行此类转换的连续治疗），则两个抗原结合蛋白是生物等同的。
在一个实施方式中，如果两个抗原结合蛋白通过共同的机制或作用机理针对条件或使用条件而发挥作用(达到此类机制已知的程度)，则它们是生物等同的。
可以通过体内和体外方法证明生物等同性。生物等同性测定包括，例如(a)人或其它哺乳动物中的体内测试，其中测定血液、血浆、血清或其它生物液体中的抗体或其代谢物的浓度，作为时间的函数；(b)与人体内生物可利用性数据相关联并且合理预测人体内生物可利用性的体外测试；(c)人或其它哺乳动物中的体内测试，其中测定抗体（或其靶标）的适当的急性药理学效应，作为时间的函数；和(d)在建立抗体的安全性、有效性或生物可利用性或生物等同性的良好控制的临床试验中。
本发明的抗-hANGPTL4抗体的生物等同变体可以这样构建：例如，进行残基或序列的多种置换，或删除末端或中间的残基或序列，所述残基或序列不是生物活性所需的。例如，对于生物活性而言不是必不可少的半胱氨酸残基可以被删除或被替换为其它氨基酸以防止复性后形成非必要的或不正确的分子内二硫桥。
治疗施用和制剂
本发明提供了包含本发明的抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合片段的治疗组合物以及使用它的治疗方法。根据本发明的治疗组合物的施用可以与合适的载体、赋形剂和掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等的其它试剂一起施用。在所有的药物化学家已知的处方集中可以找到多种合适的制剂：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括，例如，粉末、糊、膏、胶、蜡、油、脂、含脂（阳离子或阴离子）囊泡(例如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含碳蜡的半固体混合物。另外参见Powell et al."Compendium of excipients forparenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238-311。
剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型大小、目标疾病、治疗目的、状况、施用途径等来决定。当本发明的抗体用于治疗成人患者中的与ANGPTL4直接或间接相关的多种病况和疾病时，包括高胆固醇血症、与LDL和载脂蛋白B相关的病症、脂代谢病症等病症时，有利的是通过静脉内或皮下施用本发明的抗体，单一剂量为大约0.01至大约20mg/kg体重、更优选大约0.02至大约7、大约0.03至大约5，或大约0.05至大约3mg/kg体重。取决于病况的严重性，治疗频率和持续时间可以调整。在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以至少大约0.1mg至大约800mg、大约1至大约500mg、大约5至大约300mg，或大约10至大约200mg、至大约100mg，或至大约50mg的最初给药施用。在一些实施方式中，最初给药之后可以施用抗体或其抗原结合片段的第二次给药或多个随后给药，数量可以与最初给药大体相同或小于最初给药的数量，其中随后的给药间隔大约1天至3天；至少1周；至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
有多种递送系统是已知的并可用于施用本发明的药物组合物，例如，封装于脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞(见，例如Wu et al.(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。导入方法包括但不限于：真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬脑膜外和经口途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，经由表皮或粘膜皮肤内层吸收(例如，口粘膜、直肠和肠粘膜等)，并且可以与其它生物活性试剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
药物组合物也可以在囊泡中递送，尤其是脂质体(见Langer(1990)Science 249:1527-1533;Treat et al.(1989)in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365;Lopez-Berestein,同前,第317-327页;一般性参见，同上)。
在一些情况下，药物组合物可以通过控释系统递送。在一个实施方式中，可以使用泵(见Langer,见上文;Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一实施方式中，可以使用聚合物材料；见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)。在另一实施方式中，可以将控释系统置于组合物的靶标的附近，因此仅需要一部分的系统性剂量(见，例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,见上文，第2卷，第115-138页,1984)。
可注射的制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、点滴输注的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以这样制备：例如，将上文描述的抗体或其盐溶解于、悬浮于或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中。用于注射的水性介质有，例如，生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助试剂的等渗溶液，其可以与合适的增溶剂组合使用，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]等等。油性介质可以使用例如芝麻油、豆油等，其可以与增溶剂组合使用，例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。由此制备的注射制剂优选装入适当的安瓿。本发明的药物组合物可以使用标准的针头和注射器皮下或静脉内递送。另外，就皮下递送而言，笔递送装置可容易地用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是重复使用的或一次性的。重复使用的笔递送装置一般利用可替代的包含药物组合物的药筒。一旦该药筒内的所有药物组合物都已被施用并且药筒是空的，则可以容易地丢弃空药筒并替代为新的包含药物组合物的药筒。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性的笔递送装置内，没有可替代的药筒。相反，一次性笔递送装置中预装了保持在装置内的贮库内的药物组合物。一旦该贮库中的药物组合物耗尽，则丢弃整个装置。
有多种可重复使用的笔和自动注射递送装置可用于本发明的药物组合物的皮下递送。实例包括但不限于：AUTOPENTM(OwenMumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(DisetronicMedical Systems,Burghdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅举数例。用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包括但不限于：SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利地，用于上文描述的口服或胃肠外使用的药物组合物被配制为适合于一剂活性成分的单元剂量的剂型。单元剂量的此类剂型包括，例如，片剂、药丸、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。包含的上述抗体的量一般是大约0.1至大约800mg/单元剂量剂型；特别是注射的形式，包含的上述抗体是大约1至大约500mg、大约5至300mg、大约8至200mg和大约10至大约100mg，用于其它剂型。
组合治疗
本发明还提供了用于治疗与hANGPTL4直接或间接相关的疾病或病症的治疗方法：与一种或多种另外的治疗剂组合施用本发明的抗-hANGPTL4抗体或其片段。所述另外的治疗剂可以是与本发明的抗体或其片段有利地组合的一种或多种任意试剂，包括HMG-CoA还原酶抑制剂，例如西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、罗舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等；尼克酸；多种贝特类、例如非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝丁酯、吉非贝齐等；LXR转录因子激活剂等。此外，本发明的hANGPTL4抗体或其片段可以与其它ANGPTL4抑制剂以及其它分子的抑制剂共同施用，所述其它分子是例如ANGPTL3、ANGPTL5、ANGPTL6和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)，其参与脂质代谢，特别是胆固醇和/或甘油三酯平衡。这些分子的抑制剂包括小分子和特异性结合这些分子并阻断它们的活性的抗体(见，例如，U.S.2010/0166768A1中公开的抗-PCSK9抗体)。
此外，另外的治疗剂可以是一种或多种抗癌剂，例如化疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、细胞毒性试剂、细胞凋亡试剂和本领域熟知的治疗癌症或其它增殖性疾病或病症的其它试剂。抗癌剂的实例包括但不限于：抗有丝分裂剂，例如多西紫杉醇、紫杉酚等；基于铂的化疗化合物，例如顺铂、卡铂、异丙铂、奥沙利铂等；或其它常规细胞毒性试剂，例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康、亚叶酸、吉西他滨等，和抗血管生成试剂，包括血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂，例如抗VEGF抗体，例如bevacizumab(
Figure BDA00001958829200311
Genentech)和基于受体的VEGF阻断剂，例如描述于美国专利号7,070,959中的“VEGFtrap”，Δ-样配体4(Dll4)拮抗剂，例如美国专利申请公开号2008/0181899中描述的抗-Dll4抗体，和包含Dll4的细胞外结构域的融合蛋白，例如美国专利申请公开号2008/0107648中描述的Dll4-Fc；受体酪氨酸激酶和/或血管生成的抑制剂，包括索拉非尼(BayerPharmaceuticals Corp.的
Figure BDA00001958829200321
)、舒尼替尼(Pfizer的
Figure BDA00001958829200322
)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline的VOTRIENTTM)、托西尼布(Pfizer的PALLADIATM)、凡德他尼(AstraZeneca的ZACTIMATM)、西地尼布(AstraZeneca的
Figure BDA00001958829200323
)、瑞戈非尼(Bayer的BAY73-4506)、阿昔替尼(Pfizer的AG013736)、来妥替尼(Cephalon的CEP-701)、埃罗替尼(Genentech的
Figure BDA00001958829200324
)、吉非替尼(AstraZeneca的IRESSATM)、BIBW 2992(Boehringer Ingelheim的TOVOKTM)、拉帕替尼(Glaxo SmithKline的
Figure BDA00001958829200325
)、奈拉替尼(Wyeth/Pfizer的HKI-272)等等，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，其它治疗剂，例如镇痛剂、抗炎剂包括非甾体抗炎药物(NSAIDS)、例如Cox-2抑制剂等，也可以与本发明的hANGPTL4抗体或其片段共同施用，以缓解和/或减少伴随癌症/肿瘤的症状。
本发明的hANGPTL4抗体或其片段和另外的治疗剂可以一起或分开地共同施用。当使用分开的剂量制剂时，本发明的抗体或其片段和另外的试剂可以同时或在错开的时间施用，即按照合适的顺序顺次施用。
抗体的诊断应用
本发明的抗-ANGPTL4抗体还可用于检测和/或测定样品中的ANGPTL4，例如，用于诊断目的。例如，抗-ANGPTL4抗体或其片段可用于诊断特征在于ANGPTL4的异常表达（例如，过表达、表达不足、不表达等）的病况或疾病。ANGPTL4的示例性诊断测定可以包括例如，将获自患者的样品与本发明的抗-ANGPTL4抗体接触，其中抗-ANGPTL4抗体用可检测标记物或报告分子标记，或用于从患者样品选择性捕获和分离ANGPTL4蛋白。或者，未标记的抗-ANGPTL4抗体可以与本身为可检测地标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记物或报告分子可以是放射性标记物，例如3H,14C,32P,35S,131I或125I；荧光或化学发光部分，例如荧光素异硫氰酸酯或若丹明；酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于检测或测定样品中的ANGPTL4的测定法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活的细胞分选(FACS)等等。
实施例
以下实施例是为了给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的详细公开和描述，不是意在限制本发明人所认为的本发明的范围。已经付出了努力以确保所用的数字的精确性，但是有一些实验误差和偏差。除非另有指明，否则分子量是指平均分子量，温度是指摄氏温度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1：针对人ANGPTL4的人类抗体的产生
使用人ANGPTL4免疫VELOCIMMUNETM小鼠，使用从这些小鼠获得的血清，通过抗原特异性免疫测定监视抗体免疫应答。从经免疫的小鼠(显示出具有升高的抗-hANGPTL4抗体效价)的脾脏收获表达抗-hANGPTL4的B细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。使用如下文描述的测定法筛选杂交瘤并进行选择以鉴定表达hANGPTL4特异性抗体的细胞系。所述测定法鉴定了产生嵌合抗-hANGPTL4抗体(被称作H1M222,H1M223,H1M224,H1M225,H1M234和H1M236)的数个细胞系。
还从不与骨髓瘤细胞融合的抗原免疫的B细胞中直接分离了人ANGPTL4特异性抗体，如U.S.2007/0280945A1中所描述。克隆重链和轻链可变区以产生完整的人抗-hANGPTL4抗体，这些抗体被称作H1H257,H1H268,H1H283,H1H284,H1H285,H1H291,H1H292,H1H295,H1H624,H1H637,H1H638,H1H644和H1H653。建立了稳定的表达重组抗体的CHO细胞系。
实施例2：可变基因使用分析(Variable Gene Utilization Analysis)
为了分析所产生的抗体的结构，克隆并测序了编码抗体可变区的核酸。根据抗体的核酸序列和预测的氨基酸序列，就每个重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)鉴定了基因使用。表1显示了根据本发明的所选抗体的基因使用。
表1
表2显示了所选的抗-hANGPTL4抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对和它们的对应的抗体标识符。N、P和L符号代表具有包含相同CDR序列但是在CDR序列之外的区域(即在框架区)具有序列差异的重链和轻链的抗体。因此，特定抗体的N、P和L变体在它们的重链和轻链可变区内具有相同的CDR序列，但是在框架区内具有修饰。
表2
实施例3：hANGPTL4结合亲和性测定
使用实时生物感应器表面等离子共振测定法(BIACORETMT100)，通过表面动力学测定与系内融合至小鼠IgG2a的人ANGPTL4(hANGPTL4-mFc;SEQ ID NO:480)的氨基酸残基26-148结合的所选择的抗体的抗原结合平衡解离常数(KD值)。使用通过游离氨基而化学偶联至BIACORETM芯片的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(GEHealthcare)捕获hANGPTL4-mFc。在捕获的抗原表面注射不同浓度(12.5nM至50nM)的抗-ANGPTL4抗体，持续90秒。在25°C和37°C实时监测抗原-抗体结合和解离。进行动力学分析以及算抗原/抗体复合物解离的KD和半衰期。结果显示于表3。使用人抗-EGFR抗体作为阴性对照，其显示不与捕获的hANGPTL4-mFc结合。
表3
Figure BDA00001958829200361
对于H1H268P和H1H284P，通过木瓜蛋白酶消化制备Fab片段并通过标准纯化方法纯化，使用BIACORETM系统，基本上根据上文描述的方法，在25°C、pH7.2和pH 5.75测定所述片段与hANGPTL4的结合亲和性。简而言之，在低密度的抗-mFc捕获的hANGPTL4(26-148)-mFc(~68±4RU)表面上，或氨基偶联的hANGPTL4(26-406)-His(R&D Systems)(450RU)表面上或氨基偶联的猕猴N-末端区域(SEQ ID NO:490的氨基酸残基1-130)[表达C-末端六组氨酸标签(MfANGPTL4(1-130)-His)](1,028RU)的表面上，注射不同浓度的(3.125nM-100nM)抗-hANGPTL4抗体(即，H1H268Fab、完整H1H268mAb、H1H284Fab和完整H1H284mAb)。进行动力学分析以测定ka和kd，并计算抗原/抗体复合物解离的KD值和半衰期。结果显示于表4(H1H268P)和表5(H1H284P)。
表4
表5
Figure BDA00001958829200381
两个Fab片段都能够结合所有形式的ANGPTL4，虽然比完整抗体分子的亲和性低。
实施例4：抗-hANGPTL4抗体的交叉反应性测定
使用BIACORETM系统，就所选择的抗体即H1H268P和H1H284P测试抗-hANGPTL4抗体与相关蛋白即hANGPTL3、人血管生成素样蛋白5(hANGPTL5)和小鼠ANGPTL4(mANGPTL4)的可能的交叉反应性。简而言之，分别在5228RU的hANGPTL3-His(R&D Systems,cat#3829-AN)、6247RU的hANGPTL4-His(R&D Systems,cat#4487-AN)、5265RU的hANGPTL5-His(Abnova Corp.,cat#H00253935-P01)，和5233RU的mANGPTL4-His[mANGPTL4(SEQID NO:478)的R26-S410，使用AS连接子融合至C末端的6-组氨酸标签]的氨基偶联的芯片表面上注射3.125μg/mL-50μg/mL的抗-hANGPTL4抗体以及阴性对照即与任何ANGPTL蛋白都不结合的两个单克隆抗体(对照a和对照b)。也测试了特异于hANGPTL3的多克隆抗体(R&D System,cat#BAF3485)。测定了每个抗体的结合，表达为比RU值(specific RU value)，结果显示于表6。
表6
H1H268P和H1H284P仅特异性结合hANGPTL4-His，不与任何其它相关的ANGPTL蛋白结合。
此外，还通过BIACORETM系统测定了H1H268P和H1H284P对于各个ANGPTL3和ANGPTL4肽的结合亲和性。简而言之，在抗-人Fc表面捕获H1H268P(1348±11RU)和H1H284P(868±13RU)，并注射不同浓度(62.5nM-500nM)的hANGPTL3和hANGPTL4肽。所测的肽是hANGPTL4(SEQ ID NO:476的R34-L66)、N末端生物素化的hANGPTL4(SEQ ID NO:476的R34-L66)、hANGPTL3(SEQ IDNO:485的R36-I68)和N-末端生物素化的hANGPTL3(SEQ IDNO:485的R36-I68)。进行动力学分析以测定ka和kd，并计算抗原/抗体复合物解离的KD值和半衰期。结果显示于表7。NB：在所描述的实验条件下不结合。
表7
Figure BDA00001958829200401
抗体均不结合任何hANGPTL3肽。另外，即使在所测的最高肽浓度(500nM)，H1H284P也不结合任何hANGPTL4肽，而H1H268P能够结合两种hANGPTL4肽。这说明H1H268P识别34-66区域内的线性表位。相反，H1H284P在该区域之外结合，或者不识别该区域内的线性表位。
实施例5：通过抗-hANGPTL4抗体抑制hANGPTL4
脂蛋白脂酶(LPL)在人类的脂质代谢中具有重要作用。LPL催化甘油三酯的水解并释放待代谢的脂肪酸。ANGPTL4抑制LPL活性，导致增加的脂质水平(Oike et al.,2005,Trends in Molecular Medicine11(10):473-479)。ANGPTL4的N末端卷曲螺旋区域经历同多聚体化，在分离和结合至C末端纤维蛋白原样区域时都是如此。当不与C末端纤维蛋白原区域一起表达时，N末端区域也抑制LPL。开发了无细胞测定法以测定所选择的抗-hANGPTL4抗体的抑制ANGPTL4诱导的LPL活性下降的能力。
使用两种hANGPTL4蛋白：具有C末端六组氨酸标签的全长hANGPTL4(即SEQ ID NO:476的氨基酸残基26-406)(hANGPTL4-His;R&D Systems,MN)和含有N末端卷曲螺旋区域的hANGPTL4-mFc(SEQ ID NO:480)，通过
Figure BDA00001958829200411
Continuous Fluorometric Lipase Test(Progen,Germany)测定所选择的抗-hANGPTL4抗体对于hANGPTL4活性的抑制。
简而言之，在96孔测定板中预先混合2nM牛LPL、0.25μM人ApoCII(LPL的辅因子)、2mg/mL BSA和1.6mM CaCl2。将hANGPTL4-His或hANGPTL4-mFc蛋白加入到Apo/LPL混合物中分别至10nM和2nM的终浓度。然后，在Apo/LPL/ANGPTL4蛋白混合物中加入连续稀释的抗-hANGPTL4抗体，起始浓度为300nM(用于抑制hANGPTL4-His)或100nM(用于抑制hANGPTL4-mFc)，并在室温温育30分钟(最终体积为50μl)。温育之后，将200μl重构的脂酶底物1-三硝基苯基-氨基-十二烷酰-2-芘癸酰-3-0-十六烷基-sn-甘油(LS-A,Progen)加入到抗体混合物中并在37°C温育2小时。然后使用
Figure BDA00001958829200412
3Microplate Reader(Molecular Devices,CA)在342nm/400nm(激发/发射)测定荧光。荧光与LPL活性成正比。结果显示于表8。对照I：特异于hANGPTL4的兔子多克隆抗体(BioVendor)。对照II：不结合hANGPTL4的不相关的人抗体。NT：未测定。从使用2nM牛LPL、0.25μM人ApoCII、2mg/mL BSA和1.6mM CaCl2，在不存在抗-ANGPTL4抗体和ANGPTL4蛋白的情况下测定的相对荧光单位(RFU)确定总抑制(即100%抑制)。
表8
Figure BDA00001958829200413
Figure BDA00001958829200421
在所测试的抗体中(包括多克隆hANGPTL4抗体对照)，抗体H1H284P和H1H268P显示出对于ANGPTL4对LPL的抑制活性的最高抑制。对于抗体H1H284P和H1H268P，对于2nM hANGPTL4-mFc的50%最大抑制(IC50)所需的抗体浓度经测定分别为0.8nM和1.2nM。另外，对于10nM hANGPTL4-His的50%最大抑制所需的抗体浓度经测定分别为0.5nM和0.2nM。
类似地，在LPL生物测定中测试了H1H284P和H1H268P的抑制交叉物种直向同源物的能力：具有N末端六组氨酸标签的猕猴N末端区域(氨基酸残基26-148)(His-MfANGPTL4;SEQ ID NO:488)和具有C末端六组氨酸标签的小鼠全长直向同源物(SEQ ID NO:478的氨基酸残基26-410)(mANGPTL4-His)。首先使用ANGPTL4蛋白在LPL测定中进行全剂量应答，以测定每个实验的ANGPTL4EC50，然后使用ANGPTL4蛋白的恒定浓度进行每个抗体的IC50测定，如表9所示。抗体浓度为0-100nM。NB：不阻断。
表9
Figure BDA00001958829200422
两种抗体都抑制人ANGPTL4(全长和N末端)和猴子ANGPTL4(N末端)蛋白活性，IC50是大约0.3-0.5nM，但是在所测试的最高抗体浓度(即100nM)，两种抗体都不抑制小鼠ANGPTL4(全长)。
实施例6：在体内，ANGPTL4对于血浆脂质水平的效应
向C57BL/6小鼠静脉内施用hANGPTL4以测定hANGPTL4对于血浆脂质水平的生物学效应。简而言之，将C57BL/6小鼠分为4个组，每组5只动物，每组施以不同数量的hANGPTL4-mFc蛋白(SEQID NO:480)：25μg,50μg,100μg和300μg/小鼠。对照组接受注射PBS。通过静脉内注射方式(i.v.)通过尾部静脉施用hANGPTL4-mFc蛋白和PBS。在递送hANGPTL4-mFc或PBS后第15分钟、30分钟、60分钟和120分钟采血，通过
Figure BDA00001958829200431
1650Chemistry System(Siemens)测定血浆脂质水平。对于每个剂量组测定甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、非酯化脂肪酸(NEFA-C)和高密度脂蛋白(HDL)。对于注射后的每个时间点，在各个剂量组之间，总胆固醇、LDL、NEFA-C和HDL的测量值无显著性差异。在注射后30分钟，相对于对照小鼠(PBS)，注射25μg/小鼠的hANGPTL4-mFc增加了循环的甘油三酯2倍。因此，选择25μg剂量的hANGPTL4-mFc作为最低的可能剂量，用于分析由选择的抗-hANGPTL4抗体对于ANGPTL4诱导的血清中的甘油三酯水平上升的抑制，如下文所描述。
实施例7：在体内，抗-ANGPTL4抗体对于ANGPTL4的抑制
在另一组实验中，测试了选择的抗-hANGPTL4抗体的抑制hANGPTL4诱导的甘油三酯水平升高的能力。还测定了总胆固醇(总-C)、LDL、NEFA-C和HDL。简而言之，对于所测的每种抗体，将C57BL/6小鼠分为每组5只小鼠。通过皮下注射方式以5mg/kg的剂量施用抗体。对照组I，即不接受抗-hANGPTL4抗体或hANGPTL4的小鼠，以PBS进行注射。注射抗体后24小时，以25μg/小鼠的剂量向每个抗体组施用(i.v.)hANGPTL4-mFc(SEQ ID NO:480)。注射hANGPTL4-mFc之后30分钟，对小鼠采血，通过
Figure BDA00001958829200432
1650Chemistry System(Siemens)测定脂质水平。对于每种抗体或对照组的甘油三酯、总胆固醇、LDL、NEFA-C和HDL的每个测量值取平均值。还使用标准的ELISA测定法测定循环的抗-hANGPTL4抗体水平(血清抗体)。简而言之，以山羊抗-人Fc抗体(Sigma-Aldrich)包被平板，以捕获血清抗体。然后将血清添加至平板中，使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗-人IgG抗体(Sigma-Aldrich)通过化学发光法检测捕获的抗-hANGPTL4抗体。结果表示为血清脂质浓度的平均值±SEM，如表10-12所示。对照I：接受PBS、但不接受抗-hANGPTL4抗体或hANGPTL4-mFc的小鼠。对照II：接受特异于CD20的人类抗体(即具有如US 2008/0260641中公开的2F2克隆的序列的单克隆抗体)和hANGPTL4-mFc的小鼠。
表10
Figure BDA00001958829200441
表11
Figure BDA00001958829200442
表12
Figure BDA00001958829200451
相对于以不相关抗体(对照II)处理的小鼠，注射hANGPTL4-mFc(25μg)之后，所测试的多数抗-hANGPTL4抗体(如表10-12所示)显示出显著降低的血清甘油三酯水平。
实施例8：具有hIgG4同种型的抗-hANGPTL4抗体的制备
通过将各个恒定区替换为SEQ ID NO:483的hIgG4氨基酸序列(其在铰链区包含S108P突变)，将具有hIgG1同种型的抗体H1H268P和H1H284P转化为hIgG4同种型。此外，在H1H268P(SEQ ID NO:42)的框架区1中导入单一的氨基酸置换以在IgG4形式中形成H4H268P2(SEQ ID NO:487)。根据上文实施例3描述的程序，通过Biacore法在pH7.4和25°C获得分别被命名为H4H268P2和H4H284P的IgG4抗体对于结合hANGPTL4-mFc(SEQ ID NO:480)的KD(pM)和t1/2值。结果显示于下表13。
表13
  抗体   KD(pM)   t1/2(分钟)
  H4H268P2   146   195
  H4H284P   143   205
如上文实施例5的描述，分别在LPL抑制测定中测试H4H268P2和H4H284P以及相应的IgG1形式H1H268P和H1H284P，以测定IC50值。结果显示于表14。NB：不阻断。
表14
Figure BDA00001958829200461
在该测定中，H1H268P和H1H284P显示出对于全长和N末端的hANGPTL4蛋白的大约0.2-0.7nM的IC50，而H4H268P2和H4H284P显示出大约1.0-2.0nM的IC50。
实施例9：抗-hANGPTL4抗体的药代动力学研究
在野生型小鼠和表达人ANGPTL4的转基因小鼠[hANGPTL4(+/+)中]中测定了抗-hANGPTL4抗体H4H268P2和H4H284P的药代动力学清除速率。野生型和转基因小鼠的株系背景都是：C57BL6(75%)和129Sv(25%)。由5只小鼠组成的分开的组[野生型或hANGPTL4(+/+)小鼠]皮下(s.c.)接受1mg/kg H4H268P2、H4H284P或具有不相关特异性的同种型匹配(hIgG4)的对照。在注射后0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、7天、10天、15天、22天和30天采集血液样品。通过夹心ELISA测定人类抗体的血清水平。简而言之，在96孔板中以1μg/mL的浓度包被山羊多克隆抗-人IgG(Fc特异性)捕获抗体(Jackson ImmunoResearch,PA)，并在4°C过夜温育。以BSA封闭平板之后，向平板中加入6-点连续稀释的血液样品和12-点连续稀释的各个抗体的参考标准物，并在室温温育1小时。以适当的洗涤缓冲液洗涤之后，使用以辣根过氧化物酶(HRP)缀合的相同的山羊多克隆抗-人IgG(Fc特异性)抗体(JacksonImmunoResearch,PA)检测捕获的人类抗体，并使用四甲基联苯胺(TMB)底物通过标准比色反应显示，在酶标仪中在450nm测定吸收值。使用就相同的样品平板产生的参考标准物曲线测定血清中的人类抗体的浓度。结果显示于表15和图3A及3B。
表15
如表15所示，在野生型小鼠中，两种抗-hANGPTL4抗体显示出与同种型匹配的对照抗体相似的清除速率，如30天的时间内的曲线下面积(AUC)所反映，对于H4H268P2、H4H284P和hIgG4对照，该面积分别是大约318、200和199(hr*μg/mL)(另外参见图3A)。在仅表达人ANGPTL4的转基因小鼠[hANGPTL4(+/+)]中，如AUC所反映的清除速率对于H4H268P2(37.0hr*μg/mL)和H4H284P(7.60hr*μg/mL)都比野生型小鼠中的清除速率快(分别是318和200hr*μg/mL)，比hANGPTL4(+/+)小鼠中的同种型匹配的对照抗体的清除速率(168hr*μg/mL)或野生型小鼠中的同种型匹配的对照抗体的清除速率(199hr*μg/mL)也较快(另外参见图3B)。在hANGPTL4(+/+)小鼠中，H4H284P(7.60hr*μg/mL)的30天AUC是H4H268P2(37.0hr*μg/mL)的大约1/5。综上，这些结果说明两种抗-hANGPTL4抗体在表达人ANGPTL4的小鼠中显示出靶标介导的清除，H4H284P显示出比H4H268P2显著更快的清除速率。
实施例10：在体内，IgG1抗-hANGPTL4抗体对于人源化的ANGPTL4小鼠中的循环的TG水平的影响
在表达包含人N末端卷曲螺旋区域的ANGPTL4蛋白的小鼠(“人源化的ANGPTL4小鼠”)中测定了抗-hANGPTL4抗体H1H268P和H1H284P对于血清TG水平的影响。通过将小鼠Angptl4基因(N末端卷曲螺旋区域)的前3个外显子替换为C57BL6/129(F1H4)胚胎干细胞中的相应的人N末端卷曲螺旋ANGPTL4序列而制备人源化ANGPTL4小鼠。建立种系传递之后，将杂合小鼠(ANGPTL4hum/+)一起繁育以在C57BL6背景下产生纯合小鼠[ANGPTL4hum/hum或hANGPTL4(+/+)]。在实验前7天(第-7天)对人源化的ANGPTL4小鼠进行预先采血，并对于所测的每种抗体分为6只小鼠/组。通过皮下注射以10mg/kg的剂量施用抗体(H1H268P、H1H284P和不具有对于小鼠抗原的已知交叉反应性的同种型匹配的(hIgG1)对照)。在抗体注射后1、4、7和11天，空腹4小时之后，对小鼠采血；通过
Figure BDA00001958829200481
1800Chemistry System(Siemens)测定血清TG水平。对于每种抗体对于每个时间点计算平均TG水平。结果表示为血清TG浓度的平均值±SEM，显示于表16中。
表16
还使用标准的ELISA测定法测定了循环的抗-hANGPTL4抗体(“血清人类抗体”)的水平。简而言之，以山羊抗-人Fc抗体(Sigma-Aldrich)包被平板以捕获血清人类抗体。然后将血清添加至平板并使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗-人IgG抗体(Sigma-Aldrich)通过化学发光法检测捕获的抗-hANGPTL4抗体。结果表示为血清人类抗体的平均值±SEM，显示于表17中。
表17
与施用了同种型匹配的对照抗体的小鼠相比，向人源化的ANGPTL4小鼠施用H1H268P导致了在施用抗体后4-11天，循环的TG下降~25-30%。在注射抗体之后第4天，由于施用H1H268P而导致的TG下降最为有效(~34%的TG下降)，但是到第11天时，TG水平上升返回至对照水平，这可能是由于抗体的迅速的清除速率。
实施例11：在体内，IgG4抗-hANGPTL4抗体对于人源化ANGPTL4小鼠中的循环的TG水平的影响
在人源化ANGPTL4小鼠中测定了抗-hANGPTL4抗体H4H268P2和H4H284P对于血清TG水平的影响。在实验前7天对人源化的ANGPTL4小鼠预先采血，并对于所测的每种抗体分为6只小鼠/组。通过皮下注射以10mg/kg的剂量施用抗体(H4H268P2、H4H284P和不具有对于小鼠抗原的已知交叉反应性的同种型匹配的(hIgG4)对照)。在抗体注射后1、4、7和11天，空腹4小时之后，对小鼠采血；通过
Figure BDA00001958829200492
1800Chemistry System(Siemens)测定血清中的TG水平。对于每种抗体对于每个时间点计算平均TG水平。结果表示为血清TG浓度的平均值±SEM，显示于表18中。
表18
Figure BDA00001958829200501
相对于施以同种型匹配的对照抗体的小鼠，向人源化ANGPTL4小鼠施用H4H268P2和ANGPTL4导致在施用抗体后第1天(H4H268P2)和第4天(H4H268P2和H4H284P)的循环的TG显著降低。
在与ApoE空小鼠杂交的人源化ANGPTL4小鼠中进一步研究了H4H268P2对于循环的TG水平的影响。已知ApoE空小鼠模型是高度致动脉粥样化性的和高脂血模型，由于受损的VLDL残余清除，大部分的胆固醇和TG在VLDL颗粒中循环。在实验前7天对人源化ANGPTL4xApoE空小鼠预先采血，并分成2组，每组6只。通过皮下注射方式以10mg/kg施用抗体H4H268P2和对照抗体。在抗体注射后第1、4、7、11和17天，空腹4小时后对小鼠采血，通过
Figure BDA00001958829200502
1800Chemistry System(Siemens)测定血清中的TG水平。如图4所示的TG降低表示为相对于对照抗体的TG水平的百分率。
相对于施以对照抗体的小鼠，在施用H4H268P2之后所有17天TG水平均显著降低(42%以上)，在第7天降低最多(~50%)。
实施例12：在体内，抗-hANGPTL4抗体与非诺贝特的组合对于血清TG水平的影响
在人源化ANGPTL4小鼠中评价了单独的抗-ANGPTL4抗体H4H268P2和降低TG的药物非诺贝特以及二者的组合对于血清TG水平的影响。在实验前7天对小鼠预先采血(空腹4小时)，分为4组，每组6只。组2和组4通过皮下注射在第0天施以10mg/kg的H4H268P2，组1（对照组）和组2进行常规饲料喂养。组3和组4接受补充0.05%(w/w)非诺贝特(在初步研究中通过实验确定的剂量水平)的饲料。在施用H4H268P2和/或非诺贝特后第7天（在空腹4小时之后）从末端血收集血清，并通过
Figure BDA00001958829200511
1800Chemistry System(Siemens)分析。结果显示于图5。
单独施用H4H268P2和与非诺贝特的组合施用导致施用后7天的循环TG水平显著降低。相对于以饲料处理的对照组，单独施用H4H268P2之后7天，TG水平降低~40%(平均值)；单独施用非诺贝特之后，降低~25%；组合施用H4H268P2和非诺贝特之后，降低~50%。相对于非诺贝特，H4H268P2显示对于降低小鼠模型中的循环TG水平更加有效。组合处理显示出H4H268P2和非诺贝特对于TG水平的协同效应。显著的，相对于对照饲料组小鼠（组1和组2）（数据未显示），以非诺贝特处理7天（组3和组4）的小鼠的肝脏显著增大（1.8倍，肝脏重量/体重）。
实施例13：关于抗ANGPTL4抗体在肥胖恒河猴中的药代动力学/药效学的初步研究
第I阶段：在初步的非-GLP药代动力学/药效学(PK/PD)研究中，将H4H268P2和H4H284P以单次推注静脉内(IV)注射方式施用至肥胖恒河猴(Macaca mulatta)。选择恒河猴是因为该物种在系统发生和生理上与人是密切相关的，并且是常规用于非临床毒性测评的物种。选择以高脂肪膳食喂养6个月以上的肥胖猴子是因为它们通常显示出中等升高的TG水平(即，平均值>100mg/dL;高-TG)。8只确认的健康、雄性猴子进行适应并分配用于给药前7天的基线测定研究。所有的动物在第-5天接受介质(10mM组氨酸，pH 6)IV输注，然后，在第0天，其中4只IV接受H4H268P2，另外4只IV接受H4H284P，剂量为10mg/kg。在输注后任何时间点都未观察到注射位点反应或其它副作用。
从基线期至给药后第35天收集血清样品，通过
Figure BDA00001958829200512
1800Chemistry System(Siemens)测定血清脂质水平。基于第-7、-5和0天采集的样品测定每只动物的平均基线。施用介质之后采集的样品的初步分析揭示：来自每个组的3只肥胖动物显示出升高的空腹TG水平(即，TG>100mg/dL)，而来自每个组的一只动物具有完全落在正常范围内的平均TG水平(即，平均空腹TG水平为42mg/dL和84mg/dL)。因此，以每个组的3只动物进行数据分析。对于每只动物测定相对于基线的血清TG水平的百分率变化，并对于每个抗体组取平均值。结果显示于图6。
向3只轻度高-TG动物施用H4H268P2显示出在给药后第4天最大57%的降低。在H4H268P2处理后，这些动物的平均血清TG水平保持在等于或低于100mg/dL，直至大约第25天。在其它脂质，例如LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-C中观察到中等效应；然而，总-C不变(数据未显示)。向具有低TG水平的单一肥胖动物施用H4H268P2未产生任何降低空腹TG或任何其它脂质参数的显著效应（数据未显示），这说明抗体对于降低TG水平的下限。
第II阶段：在第二个非-GLP药代动力学/药效学(PK/PD)研究中，仅将H4H268P2以单次推注静脉内(IV)注射方式施用至8只肥胖恒河猴(Macaca mulatta)。在该研究中略去给药前的注射介质的步骤。在研究的第-7、-3和0天进行3次基线测定，所有8只猴子在第0天通过IV接受10mg/kg的H4H268P2。从基线期至给药后第35天收集血清样品，通过
Figure BDA00001958829200521
1800Chemistry System(Siemens)测定血清脂质水平。根据平均基线TG水平对动物进行分组以进行数据分析，以预测效应。A：TG<150mg/dL(n=3)；B：150mg/dL<TG<500mg/dL(n=4)；和C：TG>1000mg/dL(n=1)。
图7显示了3个组的TG水平，表示为相对于3个基线TG值的平均值的TG水平百分率变化。如基于临床前数据所预期的那样，在具有较高的基础血清TG水平的动物中见到空腹TG水平的较大下降。在基线TG水平>1000mg/dL的一只动物中，观察到TG水平的特别显著和迅速的下降。对于具有150mg/dL<TG<500mg/dL的基线水平的动物观察到TG水平的有力下降(50-68%)。在该组肥胖猴子中，施用H4H268P2使HDL-C升高，但是对于LDL-C或总-C(数据未显示)没有影响。具有<150mg/dL(正常TG水平)的基线TG的动物对于H4H268P2无反应。
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Claims (27)

1.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含：选自SEQ ID NO:28/30/32,76/78/80,4/6/8,52/54/56,100/102/104,124/126/128,148/150/152,172/174/176,196/198/200,220/222/224,244/246/248,268/270/272,292/294/296,316/318/320,340/342/344,364/366/368,388/390/392,412/414/416,436/438/440和460/462/464的重链互补决定区1(HCDR1)/HCDR2/HCDR3组合。
2.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含：选自SEQ ID NO:36/38/40,84/86/88,12/14/16,60/62/64,108/110/112,132/134/136,156/158/160,180/182/184,204/206/208,228/230/232,252/254/256,276/278/280,300/302/304,324/326/328,348/350/352,372/374/376,396/398/400,420/422/424和444/446/448的轻链互补决定区1(LCDR1)/LCDR2/LCDR3组合。
3.权利要求1或2的抗体或抗原结合片段，其包含：包含选自SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40,76/78/80/84/86/88,4/6/8/12/14/16,52/54/56/60/62/64,100/102/104/108/110/112,124/126/128/132/134/136,148/150/152/156/158/160,172/174/176/180/182/184,196/198/200/204/206/208,220/222/224/228/230/232,244/246/248/252/254/256,268/270/272/276/278/280,292/294/296/300/302/304,316/318/320/324/326/328,340/342/344/348/350/352,364/366/368/372/374/376,388/390/392/396/398/400,412/414/416/420/422/424,436/438/440/444/446/448和460/462/464/396/398/400的CDR序列组合的重链和轻链CDR序列HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3。
4.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或抗体的抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO:487,90,2,18,22,26,42,46,50,66,70,74,94,98,114,118,122,138,142,146,162,166,170,186,190,194,210,214,218,234,238,242,258,262,266,282,286,290,306,310,314,330,334,338,354,358,362,378,382,386,402,406,410,426,430,434,450,454,458,466和468的重链可变区(HCVR)。
5.权利要求4的抗体或抗原结合片段，其还包含选自SEQ IDNO:44,92,10,20,24,34,48,58,68,72,82,96,106,116,120,130,140,144,154,164,168,178,188,192,202,212,216,226,236,240,250,260,264,274,284,288,298,308,312,322,332,336,346,356,360,370,380,384,394,404,408,418,428,432,442,452和456的轻链可变区(LCVR)。
6.权利要求1-5任一项的抗体或抗原结合片段，其包含选自SEQID NO:487/44,90/92,2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/82,94/96,98/106,114/116,118/120,122/130,138/140,142/144,146/154,162/164,166/168,170/178,186/188,190/192,194/202,210/212,214/216,218/226,234/236,238/240,242/250,258/260,262/264,266/274,282/284,286/288,290/298,306/308,310/312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360,362/370,378/380,382/384,386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432,434/442,450/452,454/456,458/394,466/404和468/408的HCVR/LCVR序列对。
7.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段，其包含HCVR/LCVR序列对：SEQ ID NO:487/44或90/92。
8.特异性结合hANGPTL4的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含：包含于根据权利要求6或7的抗体或抗原结合片段的HCVR/LCVR序列对内的重链和轻链CDR序列。
9.抗体或其抗原结合片段，其与权利要求3、6和7任一项的抗体或抗原结合片段竞争与hANGPTL4的结合。
10.抗体或其抗原结合片段，其与权利要求3、6、7和9任一项的抗体或抗原结合片段结合相同的表位。
11.权利要求3、6和7任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与猕猴ANGPTL4和恒河猴ANGPTL4交叉反应。
12.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20(SEQ ID NO:471)的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)，其中X1是Ala,X2是Arg或Lys,X3是Gly或Glu,X4是Gly,Asp或不存在,X5是Asp或不存在,X6是Leu,Arg或不存在,X7是Arg或Ser,X8是Phe,Gly或Arg,X9是Leu,His或Asn,X10是Asp,Pro或Tyr，X11是Trp,Tyr或Phe，X12是Leu,Phe,Val或Asp,X13是Ser,Tyr或Gly,X14是Ser,Tyr或Asp,X15是Tyr,X16是Phe或Gly,X17是Leu或不存在,X18是Asp,X19是Tyr,Val或Phe，X20是Trp;和
(b)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ IDNO:474)的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)，其中X1是Gln,X2是Asn或Gln,X3是Tyr或Leu,X4是Asn,His,Ser或Asp,X5是Thr或Ser,X6是Ala或Tyr,X7是Pro,Ser或Phe,X8是Leu或Arg,X9是Thr，X10是Phe。
13.权利要求12的抗体或抗原结合片段，还包含：
(c)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:469)的氨基酸序列的HCDR1，其中X1是Gly,X2是Gly或Phe,X3是Ser或Thr,X4是Phe,X5是Ser,X6是Ile,Ser或Thr,X7是His或Tyr，X8是His,Gly或Asp;
(d)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:470)的氨基酸序列的HCDR2，其中X1是Ile,X2是Asn,Ser或Gly,X3是His,Phe,Ser或Val,X4是Arg,Asp或Ala,X5是Gly,X6是Gly或不存在,X7是Ser,Asn或Asp，X8是Thr或Lys;
(e)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO:472)的氨基酸序列的LCDR1，其中X1是Gln,X2是Gly或Ser,X3是Ile,X4是Ser或Asn,X5是Asp,Ser或Arg，X6是Tyr或Trp;和
(f)包含式X1-X2-X3(SEQ ID NO:473)的氨基酸序列的LCDR2，其中X1是Ala或Lys，X2是Ala，X3是Ser。
14.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含：由衍生自VH、DH和JH种系基因区段的核苷酸序列区段编码的重链可变区(HCVR)，和由衍生自VK和JK种系基因区段的核苷酸序列区段编码的轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR和LCVR由衍生自下列组合的核苷酸序列区段编码：(i)VH4-34,DH3-3,JH4,VK1-27和JK4;或(ii)VH3-30,DH5-12,JH6,VK1-9和JK4。
15.编码前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
16.包含权利要求15的核酸分子的表达载体。
17.包含权利要求16的表达载体的宿主细胞。
18.产生抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合片段的方法，包括在允许产生所述抗体或其片段的条件下生长权利要求17的宿主细胞，和回收所产生的抗体或其片段。
19.包含权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。
20.权利要求19的药物组合物，还包含选自下列的一种或多种另外的治疗剂：HMG-CoA还原酶的抑制剂；胆固醇摄取或胆汁酸重吸收的抑制剂，或二者；增加脂蛋白分解代谢的试剂；减少非致命心脏病发作次数的试剂；和LXR转录因子的激活剂。
21.权利要求19的药物组合物，还包含选自下列的一种或多种另外的治疗剂：抑制素、尼克酸、贝特和抗-PCSK9抗体。
22.预防或治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症通过减少或抑制ANGPTL4活性而被预防、缓解、改善或抑制，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求19-21任一项的药物组合物。
23.权利要求22的方法，其中所述疾病或病症选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、导致动脉粥样化的血脂异常、心血管疾病或病症、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
24.权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段，其用于改善、缓解、抑制或预防ANGPTL4介导的疾病或病症。
25.权利要求24的抗体或抗原结合片段，其中所述ANGPTL4介导的疾病或病症选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、导致动脉粥样化的血脂异常、心血管疾病或病症、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
26.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于改善、缓解、抑制或预防ANGPTL4介导的疾病或病症的药物中的用途。
27.权利要求26的用途，其中所述ANGPTL4介导的疾病或病症选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、导致动脉粥样化的血脂异常、心血管疾病或病症、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
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