CN102712932A

CN102712932A - 经修饰的木聚糖酶的核苷酸分子及其应用

Info

Publication number: CN102712932A
Application number: CN2010800552878A
Authority: CN
Inventors: 黄雅惠; 谢俊辉
Original assignee: Yuen Foong Yu Paper Mfg Co Ltd
Current assignee: Yongfengyu Investment Holdings Co.,Ltd.
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: EP2535415A1; US8809018B2; EP2535415A4; DK2535415T3; EP2535415B1; CN102712932B; WO2011097792A1; US20120288915A1

Abstract

一种经修饰的木聚糖酶的核苷酸分子，以及该核苷酸分子在构建重组载体或宿主细胞或在木聚糖酶的制造中的应用，其中，该核苷酸分子包含与SEQIDNO:1所列的核苷酸序列有大于80%的序列同一性的核苷酸序列。

Description

经修饰的木聚糖酶的核苷酸分子及其应用技术领域

本发明关于一种经修饰的木聚糖酶的核苷酸分子，以及该核苷酸分子的应用，尤其关于利用该核苷酸分子以制造木聚糖酶。背景技术

木聚糖酶 (xylanase)是糖水解酶中分解半纤维素的主要酶，其应用范围非常广泛，例如食品、动物饲料、纺织或造纸等。举例言之，木聚糖酶可用于处理鸡饲料，以分解饲料中的抗营养因子，从而促进饲料的可吸收性，以促进鸡的生长。此外，若将木聚糖酶加入至面团中，则可改进面团的机械强度，进而改善面粉制品的色泽及储存性。

就现有的木聚糖酶而言，在不同来源的木聚糖酶中，来自厌气性真菌（anaerobic fungi，又称为瘤胃真菌（rumen fungi))的木聚糖酶备受瞩目，由于厌气性真菌通常生长于生存竞争压力高的瘤胃 (；如反刍动物与单胃草食性动物的消化道）中，故演化成可产生具高活性的酶（此可参见 Anthony et al. 1994. Anaerobic fungi in herbivorous animals. Myco l. Res. 98 : 129- 152.)。

鉴于厌气性真菌的木聚糖酶的广泛利用性，其在各领域中的需求量甚大，然而，受到厌气性真菌培养技术与缓慢的菌体生长速度的限制，故无法以天然培养方法来大量生产，进而影响其应用性。因此，若能利用基因克隆方法，并利用易于操作的宿主细胞来表达，则可望解决上述问题。

部分酵母菌由于具有生长快速、适合高细胞密度培养及可利用甲醇作为碳源等优点，故目前已有文献建议利用酵母菌作为宿主细胞，以大量生产重组蛋白质（此可参见 Romano s et al. 1992. Foreign Gene Expression m Ye ast: A Review. Yeast 8 : 423 -488.)。然而，产业界需要符合工厂规模量的木聚糖酶，以应用于各种民生或工业用途，而学术界则需要大量的木聚糖酶，以利进行科学研究，因此，上述克隆技术仍不足以满足产业界或学术界对于大规模制备木聚糖酶的需求。因此，一种能增进宿主细胞的表达效率，以大量制备所欲的木聚糖酶的方法是迫切需要的。

本发明即是针对上述需求所进行的研究，利用基因克隆的分子生物技术，制造具高活性及耐热性的木聚糖酶。本发明人发现，藉由修饰原始木聚糖酶的特定基因，可大幅增进木聚糖酶的表达量。发明内容

本发明的一个目的在于提供一种核苷酸分子，其包含与 SEQ ID ΝΟ:1 所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性（sequence homology) 的核苷酸序列，且编码木聚糖酶。

本发明的另一目的在于提供一种重组载体，其包含 a)载体及 b)包含以下至少一种的核苷酸分子： _bi:> 与 SEQ ID N0:1所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码木聚糖酶，及 b2) 与 SEQ

ID NO:2所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码分泌蛋白信号肽。

本发明的又一目的在于提供一种 Pichia methanolica宿主细胞，其包含本发明的核苷酸分子或重组载体。

本发明的再一目的在于提供一种制造木聚糖酶的方法，其包含： 1) 将表达木聚糖酶的重组载体转化至 Pichia methanolica宿主细胞中；及

2)培养该 Pichia /«et/ «o/ i/宿主细胞，以表达该木聚糖酶。

本发明的详细技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本领域技术人员了解本发明的特征。附图说明

图 1 所示为原始木聚糖酶与经基因最适化的木聚糖酶 co j«7W的核苷酸序列与氨基酸序列的比对图；

图 2所示为原始分泌蛋白信号肽 aF与经基因最适化的分泌蛋白信号肽 coaF的核苷酸序列与氨基酸序列的比对图；以及

图 3 所示为包含； '基因、 co^y" JS'基因或 coaF-coXywI IB ' 基因的转基因株所表达的木聚糖酶的蛋白质电泳图。具体实施方式

除非文中有另外说明，在本说明书中（尤其是在后述权利要求中;)所使用的 "一" 、 "该" 及类似用语应理解为包含单数及复数形式。

如一般生物领域的技术人员所熟知，一个密码子是由三个核苷酸所组成，其中，核苷酸又分为以下四种：腺嘌呤，简称为 A ; 鸟嘌呤，简称为 G ; 胞嘧啶，简称为 C ; 胸腺嘧啶，简称为 T。因此，四种核苷酸共可组成六十四种不同的密码子（其中三种为终止密码子：)，而该些密码子可进而翻译成二十种氨基酸。

对于各种微生物而言，其密码子偏好性并不相同。举例言之，丙氨酸可经由 GCT、 GCC、 GCA及 GCG四种密码子所翻译而产生，然而，对某一微生物而言， GCT密码子可能较易于辨认，而对另一微生物而言，则可能倾向于辨识 GCC密码子。

微生物对其基因具有高密码子使用偏好性者通常为高表达量的基因 (此可参见 Sharp e t al. 1986. Codon usage in yeast : cluster analysis clearly differentiates highly and lowly expres sed gene s . Nucleic Acids Res 14 : 5 125 -5 143 . ) o 因此，若将一目标蛋白质的异源性基因修饰成适合宿主 (或表达系统）或宿主易于辨认的密码子，则可提升宿主表达目标蛋白质的效率。上述针对特定宿主修饰异源性基因的过程，即称为 "基因最适化" 。

在生物技术领域中，常用的宿主细胞包含一般原核生物 (例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌 Bacill sub ^；或真核生物（例如酵母菌、动物细胞或植物细胞）。其中，由于甲醇营养型酵母菌（methylotrophic ye ast)具有菌体生长快速、适合高细胞密度培养及利用甲醇作为碳源等优点，故可用作高效率的表达系统。常见的甲醇营养型酵母菌包含假丝酵母菌 (Candida)属、毕赤 (Pichia)属、及汉逊氏酵母菌（Hcm^n /a)属的酵母菌。

本发明即是将原始的木聚糖酶基因修饰为适合 Pichw me thanolica 宿主的表达基因，依据 Pichia methanolica宿主的密码子使用比例，选择适合的密码子，再合成核苷酸分子，以修饰 /改变原始的木聚糖酶基因。藉由此修饰操作， Pichia me thanolica宿主将更易于辨识木聚糖酶基因，进而使其大量表达木聚糖酶。

以 Pichia methanolica 作为宿主细胞，具有以下优点： CPichia methanolica可以利用甲醇作为唯一碳源； (2)¾ Pichia methanolica基因组上， AUG 1基因（alcohol utilizing gene)为进行甲醇代谢时所利用的第一个酶基因，故 AUG 1 激活子（promoter)可被利用来驱动异源性基因的表达；及 (3 )Pichia methanolica 可以非同源性重组 (non-homologous recombination)的方式，将异源性基因插入至基因组来表达，故易于筛选到多拷贝数、高表达量与高甲醇利用率的转基因株。

因此，本发明提供一种经修饰的核苷酸分子，其包含与 SEQ ID ΝΟ : 1 所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性（sequence homology)的核苷酸序列，且编码木聚糖酶。较佳地，本发明的核苷酸分子所包含的该核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ : 1所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性，更佳是与 SEQ ID ΝΟ : 1所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。

在本发明的一个实施方式中，在 Pichia methanolica宿主细胞中，利用包含 SEQ ID ΝΟ : 1 所列的核苷酸序列的核苷酸分子来制造木聚糖酶时，可得到最佳的效果。藉由基因最适化的操作，使本发明的核苷酸分子所包含的编码木聚糖酶的核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ : 1 所列的核苷酸序列的序列同一性等于 100%时，可大幅提升 me tmo/ a宿主细胞表达木聚糖酶的效率。

利用本发明的核苷酸分子所表达的木聚糖酶可应用于各种现有的用途，例如食品、动物饲料、纺织或造纸等。举例言之，就造纸的应用而言，已知在制造纸浆的过程中，若添加木聚糖酶于纸浆中，可有效降低磨浆动力，从而减少能量的损耗。此外，于纸浆漂白的过程中，通常须添加大量的含氯漂白剂，然而氯会导致高毒性的有机氯化物的生成，进而造成废液处理的问题。已知若在漂白过程前，先添加木聚糖酶以进行预处理，则可有效地减少含氯物质的使用量，有效减缓废液处理的问题。

其中，针对纸浆处理的应用而言，若木聚糖酶可在高温下作用，且不具有分解纤维素的活性，则可增加处理纸浆的反应速率，且可避免纤维质纤维遭受破坏。因此，若可选择专一性地水解半纤维素（即不水解纤维素；)，且耐热的木聚糖酶，则可更有效地改良造纸制程。

基于上述考量，在本发明的一个实施方式中，即是以具有高酶活性、高专一性及耐热性的厌气性真菌的木聚糖酶基因作为修饰的标的，由于厌气性真菌的木聚糖酶具有高酶活性、高专一性及耐热性。其详言之，在该实施方式中，是利用厌气性真菌 Neoci?//;maWw frontalis 的木聚糖酶基因进行修饰。其中， Neocallhnas Wc frontalis的木聚糖酶基因是经过去除锚定结构域（dockerin domain)处理，以进一步提升木聚糖酶的热稳定性与酶活性。举例言之，可以如下方式去除木聚糖酶基因的锚定结构域：首先，利用聚合酶链反应 (； polymerase chain reaction , PCR)扩增 (amphiy)Neocallimastix fron talis的木聚糖酶基因（约 1 , 01 1 bp) , 再使用限制酶移除木聚糖酶基因的锚定结构域，并以连接酶加以接合；之后，以聚合酶链反应扩增该经移除锚定结构域的木聚糖酶基因（约 729 bp) , 即可获得具高酶活性及热稳定性的木聚糖酶的基因，此可参见台湾专利公开第 200720435号，该文献内容倂于此处以供参考。于下文中，经去除锚定结构域的 Neoca mas tv frontalis 的木聚糖酶基因是以 Xy l lB ' 表示。

本发明的核苷酸分子可更包含与 SEQ ID NO : 2所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的编码分泌蛋白信号肽的核苷酸序列（下文简称为信号肽核苷酸序列）。于不受理论限制的情形下，可相信在一核苷酸分子中，藉由结合信号肽核苷酸序列与不同的目标蛋白质的核苷酸序列，经表达后，可使宿主细胞得以辨识与该目标蛋白质连接的由该信号肽核苷酸序列所表达的分泌蛋白信号肽，进而将该目标蛋白质分泌至细胞外，从而提升该目标蛋白质分泌至细胞外的量，增加胞外表达量。任何蛋白质的核苷酸分子可包含上述信号肽核苷酸序列，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、或半纤维素酶（例如木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶（arabinofurano sidase)或木聚糖酶）的核苷酸分子。

此外，经发现，依据宿主细胞的密码子偏好性，修饰信号肽核苷酸序列，并将其与经修饰的木聚糖酶序列结合时，可进一步增加宿主的木聚糖酶合成速度，以及增加胞外表达量。于本发明的一个实施方式中，经由修饰木聚糖酶基因，可增加木聚糖酶的表达量达至少约 5倍，若再结合经最适化的分泌蛋白信号肽基因，则可进一步提升木聚糖酶表达量达至少约 9倍。于不受理论限制的情形下，可相信本发明所利用的基因修饰手段，不仅可应用于木聚糖酶基因，亦可应用于信号肽基因，使宿主同时可易于辨识木聚糖酶基因与信号肽基因，以达成促进木聚糖酶表达的协同效果。

较佳地，本发明的核苷酸分子所包含的信号肽核苷酸序列与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性，更佳是与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。于本发明的一个实施方式中，在 P c/n'a 宿主细胞中利用包含 SEQ ID NO:2所列的核苷酸序列的核苷酸分子来制造木聚糖酶时，可得到最佳的效果。藉由基因最适化的操作，使本发明的信号肽核苷酸序列与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列的序列同一性等于 100%时，可大幅提升 Pichia methanolica宿主细胞表达木聚糖酶的效率。

于本发明的一个实施方式中，是以啤酒酵母菌 Saccharomyces cerevisiae的分泌蛋白信号肽 α-factor signal peptide (下文以 aF ¾ )δ 因作为信号肽核苷酸序列，并加以修饰。其后，再将该经修饰后的 aF 基因与经修饰的编码木聚糖酶的核苷酸序列结合，以提供所需的表达量的提升效果。其中，利用来自 Saccharomyces cerevisiae的分泌蛋白信号肽（目卩 ctF)将目标蛋白质引导至胞外分泌，可增加目标蛋白质纯化回收的效率。相关技术可参见 Micheelsen et al. 2008. High-level expression of the native barley a-amylase/subtilisin inhibitor in Pichia pastoris . Journal of Biotechnology. 133:424-432.，该文献全文倂于此处以供参考。

本发明亦关于一种重组载体，其包含 a) 载体，及 b) 包含以下至少一种的核苷酸分子： bl) 与 SEQ ID N0:1所列的核苷酸序列有大于 80% 的序列同一性的核苷酸序列，且编码木聚糖酶，及 b2) 与 SEQ ID N0:2 所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编分泌蛋白信号肽。其中，该编码木聚糖酶的核苷酸序列（即 bl) 核苷酸序列；)与该编码分泌蛋白信号肽的核苷酸序列（S卩 b2) 核苷酸序列;)如上文中所描述的。

此外，该 a) 载体是表达载体，其是线形或环形的核苷酸分子，且与该 b) 核苷酸分子相连接。该 a) 载体可包含促进该核苷酸分子进行转录的片段（segment)。

本发明重组载体中的载体可选用任何现有或市面上可取得的载体，只要其是可复制的，且可在宿主细胞中发挥功能。举例言之，当利用尸 /wet/jaMo//ca作为宿主细胞时，可选择的载体为例如 Invitrogen公司的 pMET A、 pMET B、 pMET C、 ρΜΕΤαΑ , ρΜΕΤαΒ或 pMET aC等。当于本发明的重组载体中结合该 b2) 核苷酸序列与一目标蛋白质的核苷酸序列（例如该 b l ) 核苷酸序列）)来制造该目标蛋白质（例如木聚糖酶）时，藉由上文所述的机制，可提升目标蛋白质分泌至细胞外的量，从而增加胞外表达量。

本发明亦提供一种 Pichia _et/ «o//_Ca宿主细胞，其包含本发明的核苷酸分子或重组载体。于本发明的一个实施方式中，使用 Pichm et/jawo//ca以构建宿主细胞，且据此修饰木聚糖酶基因； T ^ 7 '，以提升木聚糖酶的表达量。

本发明另提供一种制造木聚糖酶的方法，其是利用一表达木聚糖酶的重组载体来进行，包含： 1；) 将表达木聚糖酶的重组载体转化到 methanolica宿主细胞中；以及 2) 培养该 Pichia methanolica宿主细胞，以表达该木聚糖酶。其中，所涉及的重组载体与 P c n meth ! ica 宿主细胞，均如上文中所描述。

可以任何现有的分子生物技术进行步骤 1)的转化操作，例如：原生质体聚乙二醇法、化学法、电穿孔法、或基因枪转殖法等。

在一个实施例中，是利用化学法及电穿孔法进行转化。其中，合宜的化学法包括醋酸锂法与氯化钙法，其是在包含宿主细胞的反应液中，添加大量的醋酸锂或氯化钙，藉由高浓度的正离子（即锂或钙离子）与负离子（即醋酸根或氯离子）来破坏宿主细胞的细胞膜的电平衡，进而使细胞膜的结构发生变化，而使异源性基因易于进入宿主细胞内。电穿孔法则是利用细胞受电流剌激时，细胞膜的可通透性（p erme ability )会突然增加的特性，使异源性基因得以进入宿主细胞内。一般而言，化学法与电穿孔法具备操作简单方便、适用于各种细胞，且转化成功率高等优点。

可利用微生物领域中技术人员所熟知的各种发酵技术进行步骤 2) 的培养。举例言之，当使用嗜甲醇酵母菌（例如 A_c/jza ww z^o/ica)以构建宿主细胞时，可以甲醇诱导进行发酵，以进一步提升木聚糖酶的表达量。

兹以下列具体实施方式以进一步举例说明本发明。其中这些实施方式仅提供作为说明，而不是用以限制本发明的范畴。

实施例实施例 1、建构木聚糖酶的表达载体

经比对分析 Pwhm methanolica 的密码子使用比例后，合成经修饰的胃瘤真菌的木聚糖酶基因（即包含如 SEQ ID ΝΟ:1所示的核苷酸序列 (即 _C0^^ '基因）的木聚糖酶基因），并将其克隆于 pCR4保存载体，且保存于 ECOS IOITM的大肠杆菌中。

于建构表达载体之前，以限制酶 5' coR I 及 I 将 pCR4-co ¾^77 '保存载体中的 co j^i ^ ^'基因切下（片段大小为 720 bp), 并克隆到 Invitrogen的 ρΜΕΤαΑ表达载体，以完成 ' 表达载体的构建，并将其保存于 ECOS IOITM的大肠杆菌中。实施例 2、建构包含分泌蛋白信号肽基因的木聚糖酶表达载体经比对分析 Pichia methanolica 的密码子使用比例后，合成经修饰的啤酒酵母菌 Saccharomyces cerevisiae的分泌蛋白信号肽基因（SP包含如 SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列（S卩 coaF基因）的分泌蛋白信号肽基因），并将其克隆于 pUC57保存载体，且保存于大肠杆菌 ECOS IOITM中。

于建构表达载体前，以限制酶 I及 3'£coR I将 pUC57-coaF 保存载体中的 co«F基因切下（片段大小 267 bp), 并克隆到实施例 1 中所制备的 ρΜΕΤαΑ-(:ο ^/7 7 '表达载体，以完成 pMETcoocF-co Tyw^ ' 表达载体的构建，并将其保存于 ECOS IOITM的大肠杆菌中。实施例 3、分析比对 coXj^ B，与 coaF的核苷酸与氨基酸序列利用序歹 J比对软件 BioEdit Sequence Alignment Editor进行胃瘤真菌的木聚糖酶与 '的核苷酸与氨基酸序列的比对。如图 1 所示，原始 ^ yw7W与经基因最适化的 co W '的序列比对的结果显示， co^y^LS'的核苷酸序列仅有选定的核苷酸的碱基发生改变，而经翻译的氨基酸序列则没有改变。

再禾 1」用序列比对软件 BioEdit Sequence Alignment Editor 进行 saccharomyces cerevisiae的分泌蛋白信号肽《F与 cocci⁷的核苷酸与氨基酸序列的比对。如图 2所示，原始 CLP与经基因最适化的 coaF的序列比对的结果显示， coaF的核苷酸序列仅有选定的核苷酸的碱基发生改变，而经翻译的氨基酸序列则没有改变。实施例 4、表达木聚糖酶

I、利用醋酸锂法及电穿孔法进行转化

将 Pichia methanolica(PMAO l l 感受态细胞）培养于 YPAD 培养基 (包含 1重量％酵母菌提取物（Yeast extract)、 2重量。 /。蛋白胨（Peptone)、 0.0 1 重量％腺嘌呤（Adenine)及 2 重量％葡萄糖（Dextro se))的培养基中。首先，以醋酸锂溶液（包含 100毫摩尔浓度醋酸锂溶液、 10毫摩尔浓度 DTT、 0.6摩尔浓度山梨醇及 pH值为 7.5 的 10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲垸 -盐酸（tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl 或 Tri s-HCl)处理 PMAD 1 1感受态细胞达 30分钟，再将其溶于 1毫升的 1摩尔浓度山梨醇中备用。将 20微升的线形核苷酸分子（S卩 pMETaA-J W '表达载体与实施例 1及实施例 2中所制得的表达载体）加入至 80微升的感受态细胞，再移至 0.2公分的电穿孔小试管（electroporation cuvette)中进行电穿孔。脉冲（Pulse)条件为： 1 , 500伏特， 25 微法拉第， 200 欧姆。脉冲完成后，将感受态细胞置入 1毫升 YPDS培养基（包含 1重量％酵母菌提取物、 2 重量％蛋白胨、 2重量％葡萄糖及 1 摩尔浓度山梨醇）中，于 300 转 /分钟的转速下培养 2 小时后，将经培养的感受态细胞涂覆于 MD 培养基 (minimal dextrose medium , 包含 1 .34 重量％YNB(yeast nitrogen base) , 4 χ 10_⁵体积％生物素、 1 重量 °/。葡萄糖及 2重量％洋菜）上，即可获得包含 ρΜΕΊαΑ-ΧγηΠ Β ' 、 γΜΕΎαΑ-coXynl l Β ' 或 pMETc oaF-coXynl 1 B ' 的表达载体的 Pichia m etha olica。

II、筛选高活性的转化株

将 200 微升的上述步骤中所获得的 Pichia methanolica 点至包含 YPAD培养基的 96孔盘中培养，待菌体生成后，取 10微升菌液滴至含有木聚糖基质的 MMX(methanol medium xylan)培养皿（包含 1 .34重量％ ΥΝΒ、 4 χ 10·⁵体积％生物素、 1重量％甲醇（methanol)、 0.3重量％斯卑尔脱小麦木聚糖（oat spelts xylan) , 及 2重量％洋菜；)上。以甲醇诱导 3天后，进行刚果红染色，挑选透明环较大的高活性转化株，并接种至 MD 筛选培养基中。于 30°C下培养约 48小时后，挑选单一菌落，并接种至 YPD培养基 (；包含 1重量％酵母菌提取物、 2重量％蛋白胨及 2重量％葡萄糖）中，于 300转 /分钟的转速下培养至隔夜后（不超过 24小时将经培养的菌与等体积的 20%甘油混合，并保存于 - 80°C 的冰箱中。此后，每次实验皆以此冻菌为种菌。于此，获得高活性的包含 ρΜΕΤαΑ- Μ〃5 ' (转化株 1)、 pMETaA-co^yw 7 ' (转化株 2 至 4)或 pMETc oocF-coJ ^ S ' (转化株 5)的表达载体的 Pichia me thano lica转化株。

包含 pMETcoaF-coJT 77 7 '的表达载体，且具有高木聚糖酶表达量的 Pwhm methano lica 宿主细胞（即转化株 5)已基于布达佩斯条约，于 2010 年 1 月 15 日保藏于德国国家菌种保藏中心 D S MZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) , 其寄存编号为 D SM Number: 23237。

III、发酵槽或培养瓶培养

发酵前，取 1体积％的冻菌并接种至 3亳升 YPD培养基中使其活化，再于 30°C， 300转 /分钟的转速下培养一整夜。之后，再取 1体积％的菌液，并接种于 100毫升 YPD培养基中，培养至后对数期（late-log phase , 约 20小时）即停止。

接着，取 100毫升的菌液，并接种至 2升发酵基础盐（Fermentation basal salts , 包含 2%葡萄糖及 4.35毫升 /升 PTM 1 微量元素）培养基中，分别以培养瓶或发酵槽进行培养。其中，于 A组中，在培养瓶中分批培养转化株 1至 4，而于 B组中，则在发酵槽中分批培养转化株 1、 3及 5。培养条件为： 30°C及 800转 /分钟，以 2当量浓度的硫酸及 10%氨水维持 pH值为 5，通气量约为 2至 4 v.v. m. (；每分钟每单位液体体积的气体体积流量， gas volume flow per unit of liquid volume per minute)。

培养约 20 小时后，即可根据明显跳升的溶氧值或观察到菌体不再产生酸（即毋须再添加碱以维持 pH 值；)，来判断菌体是否已完全利用碳源。当溶氧值跳升，且毋需添加碱液以维持 pH值时，即可开始以甲醇 ( 1升甲醇包含 12毫升 /升 PTM 1微量元素）诱导木聚糖酶的生成。

于 A组中，培养转化株 1至 4达 120小时，而于 B组中，则培养转化株 1、 3及 5达 72或 192小吋后，结束发酵。接着，收集菌液，并进行离心后，取上清液即可获得木聚糖酶的粗酶液。实施例 5、测试木聚糖酶活性藉由下述原理以量测木聚糖酶的活性：共同加热二硝基水杨酸 (dinitrosalicylic acid， DNS)溶液与经木聚糖酶水解所产生的还原糖后，可形成棕红色的氨基化合物，再利用比色法测量样品中的还原糖的含量，即可测得木聚糖酶的活性。详细的活性测定方法是根据 Geons的方法，请见 Georis et al. 1999. Sequence, overproduction and purification of the family 11 endo-beta- 1,4-xylanase encoded by the xyll gene of Streptomyces sp. S38. Gene 237:123-33.。

首先，取用实施例 4中经培养 120小时（A组）或 192小时（B组）后所获得的木聚糖酶粗酶液，并调整至适当浓度；其后，混合 40 微升的木聚糖酶粗酶液与 360微升的 1%木聚糖基质溶液（3重量％的木聚糖（斯卑尔脱小麦木聚糖， oat spelts xylan, 溶解于 pH值为 8.0的 25毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲垸 (tris(hydroxymethyl)aminomethane 或 Tris)缓冲液）），于 60°C下反应 5分钟后，加入 DNS试剂，以终止反应，再于 98°C 下反应 5分钟，以进行呈色。最后，以 540奈米的波长测定吸光值，并计算还原糖的量，即测得木聚糖酶的活性。测试结果如表 1及表 2所示，其中， 1 活性单位 (U)定义为每分钟每毫升释出 /水解 1 微摩尔的还原糖所需的酶量。

表 1、 A组

信号肽基因木聚糖酶活性酶活性表达载体木聚糖酶基因

{a- factor) (活性单位 /毫升）提升倍数 ρΜΈΊ Α-XynlJB ' 原始原始

565 + 24 1 (转化株 1) (Wild type) (XynllB ')

pMETaA-co ¾W 经最适化

原始 3,975 ±78 7.0 (；转化株 ²) {coXynllB')

pMETaA-co 《 £ ' 经最适化

原始 4,692± 172 8.3 (转化株 3) (coXynllB')

pMET A-coXynlJB 经最适化

原始 3,843+ 199 6.8 (转化株 4)' (coXynllB') 表 1 的木聚糖酶活性测试结果显示，于培养瓶中培养 120小时后，包含原始木聚糖酶基因的转化株所表达的木聚糖酶活性为 565 ±24活性单位 /毫升（U/ml); 包含经基因最适化的木聚糖酶 co^^ '基因的转化株所表达的活性为 3,843 ± 199至 4,692± 172活性单位 /毫升。

表 2、 B组

信号肽基因木聚糖酶活性酶活性表达载体木聚糖酶基因

(a-factor) (活性单位 /毫升）

ρΜΈΊ Α-XynllB ' 原始

原始 4,251 + 242 1 (转化株 1) (XynllB ')

pMETaA-coJ(y« / ' 经最适化

原始 20，654± 1,560 4.9 (转化株 3) (coXynllB ')

pMETcoaF-coXynl IB ' 经最适化经最适化

38,740±543 9.1 (；转化株 ⁵) (coaF) (coXynllB ')

表 2的木聚糖酶活性测试结果显示，于发酵槽中培养 192小时后，包含原始木聚糖酶 XynllB '基因的转化株所表达的木聚糖酶活性为 4,251±242活性单位 /毫升；包含经基因最适化的木聚糖酶 coJTj^ B'基因的转化株所表达的活性为 20,654± 1,560活性单位 /毫升；而包含经结合最适化分泌蛋白信号肽基因的木聚糖酶 _COaF-_Co^W T基因的转化株所表达的活性则高达 38,740±543活性单位 /毫升。实施例 6、利用蛋白质电泳分析木聚糖酶的表达

分别对实施例 4的 B组中所制得的包含原始木聚糖酶基因 (即转化株 1)、经基因最适化的木聚糖酶 _C0 _yWLB'基因（即转化株 3)、以及经结合最适化分泌蛋白信号肽基因的木聚糖酶 coocF-co j^ W基因（即转化株 5)的转化株所表达的木聚糖酶，进行十二垸基硫酸钠 -聚丙稀酷氨凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfate -poly aery lamide gel electrophoresis , SDS-PAGE)分析（；此可参见 Sambrook et al. 2001. Molecular Cloning: SDS-poly aery lamide gel electrophoresis of protein. Third edition: A8. 40-49.)。

如图 3 所示，蛋白质电泳分析显示，木聚糖酶的分子量约为 29千道尔顿，其中，历经 72小时的培养时间后，包含原始木聚糖酶 j^ W 基因的转化株并无出现明显的蛋白质信号，但包含 co^y^/S'基因或 coaF-coXynllB '基因的转化株的蛋白质信号已经相当明显。

此外，历经 192小时的培养时间后，相较于包含；基因的转化株，包含 CO^VM '基因与 co F-co^^ B '基因的转化株所表达的木聚糖酶的量明显较高，而包含 co F-coJ^WW基因的转化株的木聚糖酶表达量又明显高于包含 COJ^M J '基因的转化株。

实施例 5及实施例 6的结果证明，利用本发明的经修饰的核苷酸分子来制造木聚糖酶，可提升其于宿主细胞中的表达量。再者，于本发明的核苷酸分子中，经由结合经修饰的分泌蛋白信号肽基因，可进一歩增加木聚糖酶的合成速度，并将其分泌至胞外，以提高胞外表达量。上述实施例仅用以举例说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。因此，本发明的权利保护范围应如后述的权利要求所列。

Claims

权利要求

1. 一种核苷酸分子，包含与 SEQ ID N0 : 1所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码木聚糖酶。
2. 如权利要求 1 的核苷酸分子，其所包含该编码木聚糖酶的核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ: 1所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性。
3. 如权利要求 1 的核苷酸分子，其所包含该编码木聚糖酶的核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ: 1所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。
4. 如权利要求 1 至 3 中任一项的核苷酸分子，更包含与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的编码分泌蛋白信号肽的核苷酸序列。
5. 如权利要求 4 的核苷酸分子，其所包含该编码分泌蛋白信号肽的核苷酸序列与 SEQ ID NO:2所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性。
6. 如权利要求 4 的核苷酸分子，其所包含该编码分泌蛋白信号肽的核苷酸序列与 SEQ ID NO:2所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。
7. 一种重组载体，包含-

(a)载体；及

(b)包含以下至少一种的核苷酸分子- b l) 与 SEQ ID ΝΟ: 1所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码木聚糖酶，及 b2) 与 SEQ ID NO:2所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码分泌蛋白信号肽。
8. 如权利要求 7 的重组载体，其中该 b l) 核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ: 1所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性。
9. 如权利要求 7 的重组载体，其中该 b l) 核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ: 1所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。
10. 如权利要求 7 的重组载体，其中该 b2) 核苷酸序列与 SEQ ID NO:2所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性。
1 1. 如权利要求 7 的重组载体，其中该 b2) 核苷酸序列与 SEQ ID

NO:2所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。
12. 一种制造木聚糖酶的方法，包含：

(1) 将表达木聚糖酶的重组载体转化至 Pichia methanolica 宿主细胞中；及

(2) 培养该 Pichia methanolica宿主细胞，以表达该木聚糖酶，其中，该表达木聚糖酶的重组载体包含：

(a) 载体；及

(b) 核苷酸分子，包含 bl) 与 SEQ ID ΝΟ:1所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码木聚糖酶。
13. 如权利要求 12的方法，其中该 bl) 核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ:1 所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性。
14. 如权利要求 12的方法，其中该 bl) 核苷酸序列与 SEQ ID ΝΟ:1 所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。
15. 如权利要求 12 的方法，其中该 b) 核苷酸分子更包含 b2) 与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列有大于 80%的序列同一性的核苷酸序列，且编码分泌蛋白信号肽。
16. 如权利要求 15 的方法，其中该 b2) 核苷酸序列与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列有大于 85%的序列同一性。
17. 如权利要求 15 的方法，其中该 b2) 核苷酸序列与 SEQ ID NO:2 所列的核苷酸序列有大于 90%的序列同一性。