CN102712896A - 用于增殖毛囊干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高产地增殖毛囊干细胞的方法，更具体地，涉及一种通过使用包含特定浓度的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的特定培养基来培养细胞的大量地增殖毛囊干细胞的方法，以及涉及在所述方法中使用的培养基。

Description

用于增殖毛囊干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种高产地增殖毛囊干细胞的方法，更具体地，本发明涉及通过使用含有特定浓度的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的特定培养基来培养细胞的大量增殖毛囊干细胞的方法，以及涉及在所述方法中使用的培养基。
背景技术
近来，随着对美容的兴趣越来越浓，对于治疗秃头症的关注也有所增长。秃头症是指在通常长有毛发的皮肤区域上的毛发脱落。尽管毛发不具有直接涉及生命的重要的生理功能，但就美观和阻挡UV光线并保护头部的功能而言，毛发起到非常重要的作用。严重的毛发脱落不仅对社交生活而且对心理都会具有负面的影响，因此就生活质量而言，毛发很重要。
脱发可以分为两类：皮肤有瘢痕的瘢痕性毛发脱落(scarring hair loss)；以及仅毛发脱落的非瘢痕性毛发脱落。在瘢痕性毛发脱落的情况下，毛囊被破坏，因而毛发永远不会再生。毛发在毛囊中生长，并且每个毛囊都经历生长和休止的重复循环。毛发循环的间隔根据身体的部位而变化。头部的毛发经历大约2-6年的生长期(生长期)、大约2-4星期的衰退期(退行期)、以及大约3-4个月的休止期(静止期)。在人的一生中，每个毛囊经历10-20个毛囊生长循环。
已提出多种治疗毛发脱落的方法，但是近些年，采用基因治疗毛发脱落的方法受到了关注。例如，已经开发了使用基因结构将理想的DNA密码直接递送到毛囊中的治疗方法或者抑制基因表达的治疗方法。然而，还没有完全确定这种治疗方法的功效、费用及安全性以及这种方法对后代的影响。因此，即使找到参与毛发脱落的基因，在采用所述基因治疗毛发脱落的方法被安全使用之前仍需要大量的时间。
同时，报道了一种毛发再生方法，所述方法包括在生长期采取处于毛球与毛发附接状态的毛发，培养毛囊细胞，并且将经培养的细胞移植到曾被采取毛发的位点。然而，此方法并不很有效。
同时，提出了使用干细胞治疗毛发脱落的方法。这种方法包括鉴定毛囊干细胞并且分析所述细胞的基因并且这些基因是期望被用于治疗毛发脱落或诸如烧伤的其他皮肤疾病的。表皮干细胞的概念自30年前起已经被讨论。毛发生长是一种独特的循环再生现象，并且毛囊干细胞的位置和功能对于理解毛发生长的生物学和病理学是至关重要的议题(Oshima H.et al.，Cell，104：233-245，2001)。发现干细胞的一个特征，标记保留细胞，存在于毛囊的永久上部，所谓的隆突区(参见：Cotsarelis G.et al.，Cell，61：1329-1337，1990)。
然而，尚未清楚地建立培养这种毛囊干细胞的方法。尽管已知毛囊干细胞存在于一些毛囊中，然而需要大量的干细胞用于人类秃头的临床治疗，而增殖经分离的干细胞使所述干细胞多到能够被临床应用的技术仍不令人满意。此外，尚未明确地鉴定用于干细胞的标记蛋白，因此使用干细胞来治疗毛发脱落的方法仍不令人满意。
因此，本发明人做了大量的努力来生产大量的毛囊干细胞，并且结果发现了在含有特定浓度的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的各种培养基中，特定种类的培养基能够增殖并且保持较大量的毛囊干细胞，因此完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种生产大量的毛囊干细胞的培养基。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述培养基以使所述毛囊干细胞能够被临床应用这样大的量增殖毛囊干细胞的方法。
本发明的又另一目的在于提供一种治疗毛发脱落的组合物，所述组合物含有通过所述方法获得的作为活性成分的大量的毛囊干细胞。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于增殖并保持毛囊干细胞的培养基，所述培养基在基础培养基中含有5-50μM的Rho相关激酶(ROCK)抑制物。此处，所述基础培养基可以是选自由M199/F12(混合物)培养基、MEM-α培养基、含低浓度葡萄糖的DMEM培养基、MCDB 131培养基以及IMEM培养基构成的组中的一种。此处，所述含低浓度葡萄糖的DMEM培养基含有大约1000mg/L浓度的葡萄糖。在上述培养基中，尤其优选M199/F12(混合物)培养基或MEM-α培养基。
所述基础培养基优选地含有ITS+(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸)预混合物、EGF、bFGF以及抗生素，例如，抗生素/抗真菌的混合物。特别地，所述ROCK抑制物的浓度优选的是5-20μM，并且更优选的是大约10μM。
本发明还提供了一种增殖并保持毛囊干细胞的方法，所述方法包括将经分离的毛囊干细胞在培养基中传代培养，所述培养基包括补充了5-50μM的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的基础培养基。
此处，优选地将所述经分离的毛囊干细胞作2-6轮传代培养，并且在细胞培养期间以每2天的间隔更换培养基。
本发明还提供了一种治疗秃头症或毛发缺乏的细胞治疗组合物，所述组合物含有通过所述方法获得的作为活性成分的大量的毛囊干细胞。此处，所述组合物可进一步包括相对容易分离的脂肪干细胞。
附图说明
图1至5是示出在9种培养基中培养的毛囊干细胞的照片。
图6和7示出在各种浓度的ROCK抑制物之间，毛囊干细胞的增殖能力的比较。
图8是在市售M199/F12培养基组中与在M199/F12培养基中含有ITS+预混合物、EGF、bFGF以及抗生素/抗真菌的混合物的组合物之间，毛囊干细胞的增殖能力的比较。
图9是示出通过用二氢睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3％米诺地尔(minoxidil)、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在0-14周每周测量小鼠的毛发脱落的情况而获得的结果的一系列图表。
图10是示出通过用二氢睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3％米诺地尔、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在6-14周每周拍照小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列照片。
图11是示出通过用睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3％米诺地尔、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在0-16周每周测量小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列图表。
图12是示出通过用睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3％米诺地尔、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在6-16周每周测量小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列图表。
图13是示出通过给予毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合并且在0-6周(0周：给药的时间点)每周拍照小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列照片。
用于实施本发明的最佳实施方式
以下将详细描述本发明。
干细胞指不仅具有自我复制的能力而且还具有分化为至少两类细胞的能力的细胞。
成体干细胞是出现在发育过程后形成胚胎的各器官的时期或出现在成年期的干细胞。已知成体干细胞是多能的并且能够分化成组织特异性细胞以及器官特异性细胞。这种多能干细胞，即能够分化成对含有这些细胞的组织和器官特异的细胞的干细胞不仅参与胎儿、新生儿以及成年时期的各种组织和器官的生长和发育，还参与成年组织的内稳态的维持以及在组织损坏时诱导再生的功能。
本发明涉及成体干细胞的有效培养，特别地，涉及源自上皮组织的毛囊干细胞的有效培养。
毛囊干细胞包括大约10％的位于上皮的基底层(也称为毛囊间上皮)的干细胞，以及出现在毛囊中的干细胞。特别地，已知作为未分化细胞的毛囊干细胞在上皮再生中起到重要的作用。
用于本发明的毛囊干细胞可从包括人类的所有哺乳类的上皮组织(例如，头皮组织)中分离。此处，所述头皮组织必须包括毛囊。
确切地说，措词“源自上皮组织的毛囊干细胞”或“源自头皮组织的毛囊干细胞”是指从上皮组织中分离的未分化的成体干细胞并且在此也简称为“毛囊干细胞”。这些毛囊干细胞能够通过本领域已知的常规方法获得。在本发明的一个实例中，采用源自人类头皮组织的毛囊干细胞。
所述本领域已知的常规方法的一个实例可以是以下方法。
为了从头皮组织中分离毛囊干细胞，将头皮组织细碎地剪切。然后，从经剪切的组织中分离毛囊组织。将经分离的毛囊组织细碎地剪切并且在含胶原酶的培养基中化学降解。此处，能够在重力对流孵育箱中，以50-200rpm，在30～40℃下对经剪切的组织执行化学降解0.5-24小时。收集经化学降解的组织细胞(头皮细胞)并且在含血清的培养基中培养，以及收集经培养的细胞并且从中分离毛囊干细胞。
一方面，本发明涉及用于增殖并保持大量毛囊干细胞的培养基，所述培养基在基础培养基中含有Rho相关激酶(ROCK)抑制物。
在本发明中用于增殖大量的毛囊干细胞的培养基可以是通常用于细胞培养的基础培养基。如在此使用的，术语“基础培养基”是指细胞能够在其中增殖的具有简单组成的培养基。在本发明中用于细胞培养的基础培养基的一般实例包括MEM(最小必需培养基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、RPMI(洛斯维公园纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial InstituteMedium))和K-SFM(角化细胞无血清培养基)以及本领域采用的其他培养基。
优选地，所述基础培养基可以选自由M199/F12(混合物)(GIBCO)、MEM-α培养基(GIBCO)、含低浓度葡萄糖的DMEM培养基(Welgene)、MCDB 131培养基(Welgene)以及IMEM培养基(GIBCO)构成的组。此处所述含低浓度葡萄糖的DMEM培养基含有大约1000mg/L的浓度的葡萄糖。在这些培养基中，优选地采用M199/F12(混合物)(GIBCO)或MEM-α培养基(GIBCO)。
此处，这些培养基优选地含有ITS+预混合物(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸)、EGF以及bFGF。此外，这些培养基可进一步含有抗生素，例如，抗生素/抗真菌的混合物。
ITS+预混合物是含有胰岛素、人类转铁蛋白以及亚硒酸的培养基添加物，所述胰岛素、人类转铁蛋白以及亚硒酸是限制培养基的必需元素，并且所述ITS+预混合物有在无血清培养基的条件下刺激细胞增殖的功能。EGF(上皮生长因子)与其受体结合以便调节细胞的生长、增殖以及分化。bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)是参与血管生成、伤口愈合等的细胞生长因子并且通常在各种类型的细胞的增殖和分化中起到关键的作用。
特别地，本发明采用的培养基对于毛囊干细胞的培养和增殖是有效的。尽管通常已知被用于毛囊干细胞培养的培养基是DMEM或K-SEM，但在本发明的实例2中选择了对于毛囊干细胞的培养更有效的特定的培养基。
在毛囊干细胞的培养物中，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸的浓度各为0.1μg/ml(100ng/ml)-10μg/ml，优选地为0.1-6.25μg/ml，更优选地为0.1-1μg/ml。在本发明的一个实例中，采用的胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸的浓度各为0.625μg/ml。
所述培养基的特征为含有5-50μM的Rho相关激酶(ROCK)抑制物。优选含有5-20μM，更优选7-15μM，并且最优选大约10μM的所述ROCK抑制剂。
在添加了ROCK抑制物的培养基中培养经分离的毛囊干细胞，并且回收经培养的毛囊干细胞。然后，在存在ROCK抑制物的情况下将细胞进行传代培养，由此，毛囊干细胞能够保持在未分化的状态中。
Rho相关激酶(ROCK)抑制物是具有抑制细胞凋亡的作用的物质并且已知具有抑制在轴突再生、肌球蛋白磷酸化以及平滑肌收缩中的激动剂诱导的Ca2+敏化的功能。更具体地，已知ROCK抑制物缓解肌肉细胞中的导致高血压和哮喘的异常，并且具有增加在视神经头中的血液流量以及连续地降低眼压的功能。此外，已知ROCK抑制物具有抑制细胞凋亡以及将细胞保持在未分化的状态中的生物功能。
本发明采用的ROCK抑制物的典型实例包括Y-27632、HA-1077、Y-39983、Wf-536等。其中本发明的一个实例中采用Y-27632(Calbiochem或Sigma)。Y-27632(Calbiochem或Sigma)具有由以下式1代表的结构：
[式1]
Figure BDA00001822974500061
在本发明中用于处理毛囊干细胞的ROCK抑制物的浓度为5-50μM，优选地为5-20μM，并且更优选地为大约10μM。如果使用的ROCK抑制物的浓度低于5μM，将难于长时间地唯持毛囊干细胞的未分化状态，并且如果使用的ROCK抑制物的浓度高于50μM，细胞能够在形态上改变并且能够进入分化期。
特别地，当使用上述浓度的ROCK抑制物处理毛囊干细胞时，从形态和功能的角度讲，将使经增殖的毛囊干细胞长时间保持健康的状态。
另一方面，本发明涉及一种使用上述培养基来增殖和保持大量的毛囊干细胞的方法。即，本发明涉及一种增殖和保持毛囊干细胞的方法，所述方法包括在包括添加了Rho相关激酶(ROCK)抑制物的基础培养基的特定培养基中，将经分离的毛囊干细胞进行传代培养。
上述培养基也用在该增殖和保持毛囊干细胞的创新的方法中，并且因此将省略对该培养基的详细描述。
特别地，将经分离的毛囊干细胞作传代培养2-6代，优选2代。此外，在细胞培养过程中，每间隔两天更换一次培养基。为了使通过传代培养增殖的毛囊干细胞有效地应用于临床应用，在传代培养期间，不应轻易地被改变所述细胞的形态和功能。含有特定浓度的ROCK抑制物以及特定的组成成分的特定培养基具有防治这种形态上的和功能上的改变的发生的功能。
在又另一方面，本发明涉及用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，用于治疗秃头症的药剂，或用于治疗毛发缺乏的药剂，所述药剂含有通过所述方法获得的作为活性成分的大量的毛囊干细胞。此外，本发明涉及一种使用通过所述方法获得的大量的毛囊干细胞来治疗秃头症或毛发缺乏的方法。优选地，这些组合物可不仅含有毛囊干细胞，也含有脂肪干细胞。可通过本领域已知的任何方法获得脂肪干细胞。例如，可通过冲洗脂肪组织，用例如胶原酶降解经冲洗的脂肪组织，离心经降解的组织，去除上清液，以及在血清培养基中过夜或更长时间地培养留下的脂肪干细胞来获得脂肪干细胞。
如在此使用的，“诱导毛发生长”的表述是指在脱发的区域或无发的区域形成毛囊以诱导毛发生长的能力。
除非另有说明，否则如在此使用的术语“治疗(动词)”意为逆转、缓解、抑制此词适用的紊乱或状况或者这种紊乱或状况的一或多个症状的进展，或预防此词适用的紊乱或状况或这种紊乱或状况的一或多个症状。如在此使用的，术语“治疗(名词)”是指同就在上面限定的“治疗”一样的治疗的行为。因此，如在此使用的，“治疗”哺乳类的疾病或对哺乳类的疾病的“治疗”包括以下一种或多种：
(1)抑制疾病的发展；
(2)防止疾病的蔓延；
(3)减轻疾病；
(4)防止疾病的复发；以及
(5)减轻疾病的症状。
为了治疗秃头症或毛发缺乏，以药学上有效的量给予本发明的组合物。
如在此使用的，术语“治疗有效的量”意为被给予的化合物某种程度地减轻被治疗的疾病的一个或多个症状的量。因此，治疗有效的量是指具有(1)逆转疾病进展的速度；(2)某种程度地抑制疾病的进展；或(3)某种程度地减轻(优选地消除)与疾病相关的一个或多个症状的效果的量。
可通过不经肠胃的途径给予本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂，所述不经肠胃的途径包括静脉内、腹腔内、肌内、皮下或局部的途径。更优选地，可皮下或局部地给予这些药剂以及将这些要接直接注射进毛发脱落区域或需要毛发生长的区域。
对于注射，本发明的组成可优选地用诸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液的药学上可接受的缓冲液来配制。对于跨，在配制上采用适合于组合物穿过待通过的屏障的的非侵入型药剂。这种非侵入型药剂是本领域普遍知晓的。
用于非肠胃给药的制剂包括经灭菌的水溶液、非水溶剂、悬剂、乳化剂。本发明中可采用的悬剂和乳化剂包括植物油如丙二醇、聚乙二醇及橄榄油，以及可注射的酯如油酸乙酯。
为了治疗被认为是秃头的典型的雄性型秃头症，或能够在停经期后或卵巢切除术后发生的雌性型秃头症，可将本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂，以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂施用至头皮。此外，可将这些药剂施用至身体上任何需要毛发生长的部位。例如，为了呈现单纯的美观效果，可将这些药剂施用至由于创伤疤痕导致的脱发区，或施用至宽大的额头或M形前额，以及可用这些药剂来改善睫毛或眉毛稀少的状况。
可用药物上可接受的载体来配制本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂，以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂。所述药物上可接受的载体的示例包括，但不局限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钾、精氨酸、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆剂、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、以及矿物油。
除了以上的组成部分，本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂，以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂可进一步包括润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬剂、防腐剂以及类似物。在Remington′sPharmaceutical Sciences(第19版，1995)中详细描述了适合于本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂，以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂的药物上可接受的载体以及制剂。
根据本领域的技术人员已知的常规技术，可用药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂，以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂并且这些药剂可以以单位剂量的形式或多剂量的形式提供。这些药剂可进一步含有分散剂或稳定剂。
本发明的用于诱导毛发生长的细胞治疗药剂，本发明的用于治疗秃头症的药剂，以及本发明的用于治疗毛发缺乏的药剂可单独使用或与其他常规药或用于诱导毛发生长的手术治疗一起使用。这种组合疗法能够呈现最大化的功效。
对于人，本发明的细胞治疗药剂可按104-1010个细胞/人的剂量，并且优选地以106-108个细胞/人的剂量常规地一次或几次给药。特别地，本发明的组合物优选地含有1×108个细胞/100μl至1×109个细胞/100μl的浓度的成体干细胞。
然而，应理解所述组合物的活性成分的实际剂量应根据各种相关的因素确定，所述各种相关的因素包括待治疗的疾病、给药途径、病患的年龄、性别和体重，以及疾病的严重程度。因此，上述剂量并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的技术人员将显而易见的是这些实施例仅是解释性的目的并不理解为限制本发明的范围。
在下面的实施例中使用的培养基和试剂的来源在下面的表1中示出。
表1
Figure BDA00001822974500101
实施例1：毛囊干细胞的分离
细碎地剪切源自头皮的组织(毛发移植中心，韩国)。将经剪切的组织置于含有2mg/ml的A1型胶原酶(Gibco，美国)的L/G DMEM培养基(Welgene，韩国)中并且在重力对流恒温箱中在100rpm、37℃下保持30-50分钟进行化学降解。
通过离心，收集经化学降解的组织并用DPBS冲洗。在M199/F12血清培养基(添加了1∶1的M199和F12、0.1×ITS预混合物、20ng/ml的rEGF(Gibco，美国)、10ng/ml的bFGF(Gibco，美国)、1×抗生素/抗真菌的混合物以及10％胎牛血清(Gibco，美国))中培养经冲洗的组织。此处，0.1×ITS+预混合物含有0.625μg/ml的胰岛素、0.625μg/ml的转铁蛋白、0.625μg/ml的亚硒酸以及0.535μg/ml的亚油酸。
大约3天之后当组织状态为贴附于培养皿底部时，用无血清M199/F12培养基替换培养基(称为“P0细胞”)。收集未贴附的组织并且在含有血清的M199/F12培养基(添加了1∶1的M199和F12、0.1×ITS预混合物、20ng/ml的rEGF(Gibco，美国)、10ng/ml的bFGF(Gibco，美国)、1×抗生素/抗真菌的混合物以及10％胎牛血清(Gibco，美国))中再培养3天，经培养的组织称为“P0T1”。然后，每间隔2天向P0细胞中添加新鲜的培养基，并且在3天后用无血清M199/F12培养基替换P0T1细胞的培养基。从P0T1收集的未贴附的组织称为“P0T2”并且再培养。用同样的方法，每间隔2天向P0和P0T1组织/细胞中添加新鲜的培养基，并且在3天后用无血清M199/F12培养基替换P0T2细胞的培养基，并且继续培养P0T2细胞。结果，分离了毛囊干细胞。
实施例2：在含有ROCK抑制物的各种培养基中培养毛囊干细胞的效率
2-1：经分离的毛囊上皮干细胞的培养
首先，测量在实施例1中获得的毛囊干细胞的数量和活力。测量的结果如下：
P0：1.33×106(91％)
然后，将毛囊干细胞加至12孔板的每个孔中，并且将1ml的用于9种培养基的对照组和测试组的每一组的毛囊干细胞加至12孔板的每个孔中，所述9种培养基各包含ITS+(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸)预混合物、EGF、bFGF以及抗生素/抗真菌的混合物。将10μl(10μM)的ROCK抑制物Y-27632加至各测试组，并且培养细胞。
在开始培养后的2、3和4天，观察在各培养基中的毛囊干细胞的增殖的状态，观察结果在图1至5中示出。
[表2]
Figure BDA00001822974500111
Figure BDA00001822974500121
正如能够从图1至5中看出，在9种培养基中，M199/F-12、MEM-α、DMEM L/G、DMEM H/G、MCDB 131、IMDM、DMEM/F-12、RPMI 1640以及MCDB 153中，M199/F12培养基、MEM-α培养基、DMEM L/G、DMEMH/G、MCDB 131培养基以及IMEM培养基使毛囊干细胞大量增殖。
关于ROCK抑制物的效果，与对照组比较，含有ROCK抑制物的M199/F12培养基、MEM-α培养基、DMEM L/G、DMEM H/G、MCDB 131培养基以及IMEM培养基对毛囊干细胞的增殖具有良好的效果。其中，M199/F12培养基和MEM-α培养基显示出最优的效果。
换言之，能够看出含有ROCK抑制物的特定培养基对于增加毛囊干细胞的数量以及毛囊干细胞的活力具有优异的效果。
2-2：各种浓度的ROCK抑制物中的毛囊干细胞的增殖能力的比较
为了检查在各种浓度的ROCK抑制物中的毛囊干细胞的增殖能力，将各种浓度的ROCK抑制物加至含有ITS+预混合物、EGF、bFGF以及抗生素/抗真菌的混合物的M199/F-12培养基，并且在培养基中培养在实施例1中获得的毛囊干细胞。
具体地，将10μM的ROCK抑制物加至实施例1中使用的M199/F-12，并且在M199/F-12培养基中培养P1毛囊干细胞并且通过TrypLE-Express处理收集。然后，将细胞按照7.70×105个细胞的密度加入6孔板的每个孔中，并且将2ml的M199/F12加入所述6孔板的每个孔中。
将细胞悬浮液布置在6孔板的每个孔中，然后将10nM、100nM、1μM、10μM以及100μM的浓度的ROCK抑制物Y-27632分别加至所述6孔板的5个孔(排除用于对照组的孔)中，随后培养毛囊干细胞。在细胞的培养过程中每间隔2天替换培养基，并且在开始细胞培养后的2、3、4、5和6天拍照。
图6和7示出所述细胞的照片。
正如在图6和7中看出，用100nM或更低的ROCK抑制物处理的细胞的增殖与没有用ROCK抑制物处理的细胞的增殖无显著的区别。此外，观察到在1μM或100μM的ROCK抑制物浓度中细胞的增殖增强，然而出现形态改变或所述细胞的分化。因此，ROCK抑制物的最优浓度确定为大约10μM。
实施例3：培养基组分的确定
为了找出适合毛囊干细胞的培养基组成，比较对照组与测试组之间的毛囊干细胞的增殖能力，对照组仅由市售的M199/F-12培养基组成构成而测试组由添加了ITS+预添加物、EGF、bFGF以及抗生素/抗真菌的混合物的M199/F-12培养基构成。
在各对照组与测试组中培养在实施例1中获得的毛囊干细胞，并且在细胞培养开始4天后观察细胞的增殖状态。
观察结果在图8中示出。正如在图8中看出，当在仅为市售的M199/F-12培养基组成中培养毛囊干细胞时，毛囊干细胞的增殖速度低并且发生细胞的严重的形态改变。另一方面，当在添加了ITS+预添加物、EGF、bFGF以及抗生素/抗真菌的混合物的M199/F-12培养基中培养毛囊干细胞时，毛囊干细胞的形态保持完整，并且细胞的增殖速度显著的高。
上述结果表明不仅培养基的种类，而且加入培养基的特定分也对毛囊干细胞的增殖具有巨大的影响。
实施例4：干细胞对于秃头症的治疗效果的体内检查
4-1：在小鼠模型中干细胞对于秃头症的治疗效果的检查
为了检查通过本发明培养的毛囊干细胞是否有效地治疗秃头症，尝试了使用干细胞对秃头症的治疗。
将在实施例1中获得的毛囊干细胞给予作为雄性式秃发动物模型的雄激素慢性源性秃发(B6CBAF1/j)小鼠。更具体地，将双氢睾酮或睾酮以2mg/天的量皮下注射进12周龄的雌性B6CBAF1杂交鼠(雌性C57BL/6×雄性CBA)以诱导毛发脱落，此后将各测试物质给予小鼠。
将所述测试中使用的50只动物分为5组，每组由10只动物构成。
[测试组]
1.阴性对照组(盐水)
2.阳性对照组(3％米诺地尔)
3.仅给予毛囊干细胞(hHFSC)的组
4.仅给予脂肪干细胞(hASC)的组
5.给予脂肪干细胞和毛囊干细胞的组合物(hASC/hHFSC)的组
在整个的测试期间甚至在诱导毛发脱落之后，将雄性荷尔蒙皮下注射进测试动物。
使用分级系统(在从0至4的等级；见下表3)每间隔2周对通过使用雄性荷尔蒙双氢睾酮或睾酮处理而在测试动物上诱导的毛发脱落状况进行评估。
[表3]
  指数   症状
  0   无毛发脱落
  1   在肩胛区(intrascapular area)的毛发脱落
  2   1cm2左右的毛发脱落
  3   2cm2左右的毛发脱落
  4   4cm2左右的毛发脱落
在使用雄性荷尔蒙处理后至4周时，没能够观察到特别的毛发脱落现象。从使用雄性荷尔蒙处理后的5周起，在用二氢睾酮处理的组中，毛发开始变细，在动物的背部能够观察到绒毛和毛发脱落的现象。在使用睾酮处理的组中，毛发脱落的诱导比在使用二氢睾酮处理的组中慢，并且在从处理后大约7周时能够观察到毛发脱落的现象。
因此，在使用二氢睾酮处理的组中，测试动物从处理后7周开始给药，而在使用睾酮处理的组中，对测试动物的给药从处理后9周开始。治疗结果在图9至12中示出。
正如能够在图9和10中看出，在使用二氢睾酮处理的组中，相对于阴性对照组，使用测试物质(仅脂肪干细胞、仅毛囊干细胞或脂肪干细胞和毛囊干细胞的组合)治疗的组或给予米诺地尔的阳性对照组的毛发脱落情况在给予测试物质后的1-2周起开始显著地变好。在开始给予测试物质后进行8周观察的结果表明给予仅脂肪干细胞或仅毛囊干细胞的效果等于给予阳性对照(米诺地尔)的效果并且给予脂肪干细胞/毛囊干细胞组合对于抑制毛发脱落的效果不仅比阴性对照组好而且也比阳性对照组好。
此外，正如能够在图11和12中看出，在使用睾酮处理的组中，在阴性对照组的毛发脱落程度在对测试动物开始给药后2周起开始加重，而在给予测试物质(仅脂肪干细胞、仅毛囊干细胞或脂肪干细胞和毛囊干细胞的组合)的组中的毛发脱落情况却开始改善。具体地，在开始给予测试物质后4周时，显著地抑制了在给予脂肪干细胞和毛囊干细胞的组合、已表现出显著的脱毛的组中的毛发脱落的恶化。在开始给予测试物质后10周时，与阳性对照(米诺地尔)相比，使用仅脂肪干细胞以及仅毛囊干细胞进行治疗对毛发脱落的抑制的效果显著地优异。
因此，证实当采用在实施例1的培养基中培养的毛囊干细胞时，以与阳性对照组中相似或比其更优的方式抑制或治疗了毛发脱落疾病。这样的结果表明给予具有优秀的增殖能力的毛囊干细胞使得能够有效地治疗毛发脱落疾病。
4-2：干细胞的组合对于毛发脱落的治疗效果的检查
源自脂肪组织的脂肪干细胞明显地容易分离和收集，并且用于增殖以及保持这些脂肪干细胞的方法是普遍知晓的。因此，为了检查使用脂肪干细胞与相对不容易分离的毛囊干细胞的组合是否对于毛发脱落疾病的治疗具有效果，进行了以下测试。
以与在实施例4-1中相同的方式诱导小鼠的毛发脱落疾病，并且检查细胞对毛发脱落的治疗效果。在6周中将二氢睾酮以2mg/天的量皮下注射进12周大的雌性B6CBAF1杂交鼠(雌鼠C57BL/6×雄鼠CBA)，并且因此能够观察到在大腿和腹部区域上的明显的毛发脱落。
因此，在6周中将脂肪干细胞和毛囊干细胞以3-4天的间隔(每周一次的脂肪干细胞给予+每周一次的毛囊干细胞给予)交替地给予大腿区域。在给予测试物质以及之后的观察期间，将雄性式荷尔蒙每天皮下注射进测试动物中。对给予测试物质6周的小鼠拍照并且照片在图13中示出。
正如能够在图13中看出，在开始给予细胞1周后，视觉观察的结果表明在腹部上的毛发脱落地方上的毛发生长。然而，在给予细胞的地方或其他毛发脱落地方上的毛发生长不显著。然而，在开始给予干细胞2周后，能够观察到在腹部上的毛发脱落地方上的毛发生长，并且在大腿地方上的毛发脱落不再恶化，表明毛发脱落疾病得以治疗。
证实了在需要大量干细胞来治疗的毛发脱落疾病的情况下，当将相对容易分离和收集的脂肪干细胞组合毛囊干细胞使用时，以与仅给予毛囊干细胞相似或比其更优的方式抑制或治疗了毛发脱落。这样的结果表明，当与具有优异的增殖能力的毛囊干细胞组合地给予脂肪干细胞时，对于毛发脱落疾病的有效治疗是可能的。
尽管参照具体的特征已经详细地描述了本发明，对于本领域的技术人员将显而易见的是这种描述仅是为了优选的实施方式而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实质的范围将由所附权利要求和其等效物限定。
工业应用
本发明的用于培养毛囊干细胞的培养基能够使从头皮组织中分离的毛囊干细胞以使所述毛囊干细胞能够被临床应用这样大量的方式增殖。因此，所述毛囊干细胞作为用于针对诸如秃头症或毛发缺乏的毛发脱落疾病的毛发生长的细胞治疗药剂是有用的。

Claims (12)

1.一种用于增殖并保持毛囊干细胞的培养基，所述培养基在基础培养基中含有5-50μM的Rho相关激酶(ROCK)抑制物。
2.如权利要求1所述的培养基，其中所述基础培养基进一步含有ITS+预混合物(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸预混合物)、EGF、bFGF或抗生素。
3.如权利要求1所述的培养基，其中以5-20μM的浓度含有所述Rho相关激酶(ROCK)抑制物。
4.如权利要求1所述的培养基，其中以10μM的浓度含有所述Rho相关激酶(ROCK)抑制物。
5.如权利要求1所述的培养基，其中所述基础培养基是选自由M199/F12(混合物)培养基、MEM-α培养基、含低浓度葡萄糖的DMEM培养基、MCDB131培养基以及IMEM培养基构成的组中的至少一种。
6.如权利要求1所述的培养基，其中所述基础培养基是M199/F12(混合物)培养基或MEM-α培养基。
7.如权利要求1所述的培养基，其中所述毛囊干细胞源自人的头皮组织。
8.如权利要求1所述的培养基，其中所述Rho相关激酶(ROCK)抑制物是具有由以下1代表的结构的化合物：
[1]
Figure FDA00001822974400011
9.一种增殖并保持毛囊干细胞的方法，所述方法包括将经分离的毛囊干细胞在权利要求1所述的培养基中传代培养。
10.如权利要求9所述的方法，其中将所述经分离的毛囊干细胞传代培养2-6代。
11.一种治疗毛发脱落的组合物，所述组合物含有通过权利要求9所述的方法获得的作为活性成分的毛囊干细胞。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述治疗毛发脱落的组合物进一步含有源自脂肪组织的干细胞。
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