CN110088271A - 芽细胞用于制备微毛囊的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及芽细胞用于获得微毛囊的用途，并且涉及其用于评估化妆品、药物或皮肤病学产品的效果的用途，以及还用于对多毛性减弱状态进行预防或治疗处理的用途。

Description

芽细胞用于制备微毛囊的用途
本发明涉及通过培养和扩增芽细胞来产生微毛囊的“体外”方法。
本发明同样涉及通过以上提及的方法生产的微毛囊，并且涉及其用于治疗脱发的用途，以及用于评估化妆品、药物和皮肤病学产品的效果的用途。
脱发由各种因素：基因、激素和环境，通过饮食和通过身体活动来调节。毛发具有重要的美学和身份作用。女性或男性的脱发可能因此导致相当严重的心理痛苦。
因此，在人的一生中，拥有健康、强韧和浓密的毛发是大多数女性和男性的追求。
已知许多用于治疗脱发的技术，例如细胞疗法、激光疗法、或其他无需手术的植入物。后者立即见效，并且比手术的侵入性小得多。
为了获得植入物，通过培养毛球中存在的各种细胞类型来获得人毛囊。
毛球是梨形的，并且由以下组成：
-作为真皮起源发育的乳头，位于毛囊的基部。毛乳头是高度血管化的部位，通过其生长因子和细胞外基质蛋白的储存参与毛发生长的营养和调节；
-基质，其是遮盖真皮乳头的区域，由一簇没有特别分化的基质细胞构成。基质是强烈的有丝分裂活动的所在地。基质细胞，位于毛球中并且在真皮乳头周围形成小细胞簇，主要由角质形成细胞的前体细胞构成，该前体细胞构成发芽层并且迅速增殖以便分化形成毛干，因此基质细胞在毛发周期中起着重要作用。从生长期开始直到所述阶段结束时，这些基质细胞将增殖直到退化期，并然后在静止期消失。(Ebling FJ.The biology of hair.[毛发的生物学]Dermatol Clin.[临床皮肤病]1987年7月；5(3)：467-81.Review[综述]；Saitoh M，Uzuka M，Sakamoto M.Human hair cycle.[人类毛发循环]J Invest Dermatol.[调查性皮肤病杂志]1970年1月，54，第65-32页。细胞分化将允许外上皮鞘(ORS)、内上皮鞘(IRS)、和之后毛干的各种细胞类型的形成。它还是控制毛发形状的该基质。该基质围绕直发的对称轴均匀分布，而对于卷发的一侧基质分布则更多(Voyage 3D au Coeur ducheveu[3D voyage to the Heart ofthe hair(对毛发中心的3D航海)]网址-URL：www.hair-science.com；Melissopoulos A和Levacher C.Les annexes cutanées[Theskin appendages(皮肤附属器)].在：La peau：structure et physiologie[The skin：structure and physiology(皮肤：结构和生理)]，由Lavoisier出版；1998.第57-99页)。基质还包含负责毛发色素沉着的毛囊黑色素细胞。这些基质细胞的增殖和分化由真皮乳头控制(Botchkarev VA，Kishimoto J.Molecular control of epithelial-mesenchymalinteractions during hair follicle cycling.[毛囊周期中上皮-间质相互作用的分子控制]J Invest Dermatol Symp Proc.[调查性皮肤病研讨会论文集]2003年6月；8(1)：46-55.Review[综述])；
-外上皮鞘和内上皮鞘，由毛球的上层基质产生，还被称为角质化区域。外上皮鞘构成了毛囊的外包膜：它是表皮的内陷。它特别容纳干细胞，毛囊将由这些干细胞循环再生。内上皮鞘将外上皮鞘与毛干分开。该鞘由组织在角质化同心层中的三种类型的细胞组成，该角质化同心层伴随毛发的生长。亨利氏层(Henlé′s layer)、赫胥黎氏层(Huxley’slayer)、以及由扁平细胞形成的指向毛发基质的角质层是不同的；
-毛干，部分可见的是毛发。毛干的结构从外到内由三个不同的层组成。角质层、皮质、和髓质全部构成了所有的角质化细胞。
在它的一生中，毛发经历了三个极不相等的持续时间的发育阶段：
-毛发生长期是毛发的活跃期，是毛发生存和规则生长的阶段。它持续从4年至7年。围绕发根球的乳头的芽细胞不断产生允许毛发生存和生长的物质。接下来，芽细胞的增殖停止在毛囊的底部。然后结束毛发的活跃期；另一个短得多的阶段开始。
-退化期：在短短15天内，毛球消失(因为它由于生发细胞的中断而不再进食)并且以加速的速度转变。乳头消失，也就是说空心球变得坚固；它角质化，变硬，并且变得角质化。然后毛发死去；毛囊收紧，以便驱逐死去的毛发。
静止期是持续大约三个月的阶段，在此期间死毛等待脱落。为了脱落，毛发必须被新毛发推出，新毛发进而在相同的毛囊中生长，并且会将旧毛发排出。
然后从位于“隆突”中的称为芽细胞的干细胞开始毛囊的再生。
“隆突”由外上皮鞘的细胞亚群(称为芽细胞)形成，位于毛囊中间部分，更准确地说在毛发竖毛肌插入区中。这些细胞代表毛囊永久部分的最低部分。
在“隆突”中，在生物化学上和超微结构上，角质形成细胞相对未分化。
这种“隆突”处于关键位置，在晚期静止期阶段期间与上升的真皮乳头相互作用，并在毛发生长期开始新的毛囊。因此，芽细胞是对于毛发更新所必需的细胞。静止期毛发的芽细胞(生发细胞或多能细胞或干细胞)参与从休眠期离开毛囊并因此使毛发重新生长。
为了本发明的目的，术语“芽细胞”旨在意指存在于“隆突”中的干细胞。
多年来，已经培养了来自隔室的易于通过显微解剖进入的毛囊细胞，EP 2 274419，EP 2 447 357。
然而，静止期毛囊的切割特别困难，特别是因为其罕见性，其占头皮上存在的所有毛囊的不到15％。此外，静止期毛囊的解剖特别困难，特别是因为其真皮环境。因此，困难之一是获得足够量的芽细胞以再生能够更新的毛囊。S.Lyle团队在2005年通过从用分散酶消化制备的静止期毛囊开始扩增，然后拔出的方式进行这些细胞的原代培养，这使得不可能提取足够量的所有芽细胞以将它们置于培养物中并在体外维持芽细胞特异性标志物的表达以再生毛囊(Roh C，Tao Q，Photopoulos C，Lyle S.J Invest Dermatol.[[皮肤病学研究期刊]]2005，125：1099-1105)。
关于细胞疗法，Replicel公司使用结缔组织鞘细胞来获得无色素且不再循环的微细轴；因为结缔组织鞘细胞会募集皮肤的角质形成细胞(Jahoda使用的方法，1999；Higgins，2013)。
这些模型中没有一个含有芽细胞，其存在和数量对于形成具有人微毛囊的大部分特征，并且特别是其更新能力的微毛囊是所必需的。
令人惊讶的是，诸位发明人成功地获得了足够量的芽细胞，使得当它们与真皮乳头成纤维细胞和结缔组织鞘成纤维细胞接触时，负责微毛囊的管状结构形成，并且由于芽细胞的存在，能够循环。
实际上，本申请人已证明在Rock Y27632抑制剂存在下芽细胞的培养允许这些细胞的显着增殖，以及其分化成对CD200、CD29和K15标志物呈阳性的角质形成细胞。此外，可以注意到这些细胞是小细胞，具有高的核/细胞质比率和均一的表型。
当使这些细胞与结缔组织鞘成纤维细胞以及真皮乳头成纤维细胞接触时，观察到将负责形成微毛囊的管状结构的形成。
将结缔组织鞘成纤维细胞以及还有放置在3D培养物中的真皮家族的成纤维细胞获得的细胞混合使得有可能出乎意料地从由芽细胞和真皮乳头成纤维细胞以及还有结缔组织鞘成纤维细胞构成的混合的球状体中形成芽。这种出芽是以管状结构的形式，该管状结构将负责毛囊的形成。
为了本发明的目的，术语“管状结构”旨在意指由混合的球状体形成的出芽。
为了本发明的目的，术语“混合的球状体”旨在意指芽细胞和真皮乳头成纤维细胞以及还有结缔组织鞘成纤维细胞的3D培养物。
为了本发明的目的，术语“管状结构”旨在意指在芽细胞和真皮乳头成纤维细胞或结缔组织鞘成纤维细胞的3D培养后观察到的出芽。这种管状结构一方面构成毛发的上皮干细胞，另一方面构成毛发的间充质细胞，负责形成微毛囊。
因此，根据本发明的方法证明是有利的，因为这使得可能使用毛发的成纤维细胞和形成具有人微毛囊的大部分特征并且特别是能够再生的毛囊所需的芽细胞来获得毛囊。
因此，根据其第一个主题，本发明涉及用于获得毛囊的芽细胞的用途。
芽细胞用于制备微毛囊的用途
可以根据以下方法对芽细胞进行取样：将处于静止期的毛囊置于含有补充有2％抗生素和非必需氨基酸的最小培养基的有盖培养皿中。
从结缔组织鞘中提取芽细胞的区域(称为隆突)，然后置于含有3T3i成纤维细胞饲养层的有盖培养皿中。
为了获得足够量的用于获得微毛囊的芽细胞，本申请人已经开发了一种扩增这些细胞的方法，使得它们分化成CD200、CD29和K15角质形成细胞。
因此，本申请人已经开发了用于制备微毛囊的方法，该方法包括至少一个步骤：在有效量的ROCK抑制剂的存在下扩增芽细胞，持续足以允许所述细胞分化成对CD200、CD29和K15标志物呈阳性的角质形成细胞的一段时间。
用于制备微毛囊的此方法特征在于该方法包括以下步骤：
a-从头皮样品中分离处于静止期的毛囊；
b-将芽细胞与结缔组织鞘分开；
c-在Green 7F培养基中，在已经经照射的或用丝裂霉素阻断的3T3i成纤维细胞的饲养层上沉积细胞集合体；
d-在ROCK抑制剂的存在下，在所述支持物的表面上扩增该芽细胞；
e-回收展现出CD200、CD29和K15标志物的角质形成细胞；
f-在来自结缔组织鞘和/或来自真皮乳头的成纤维细胞存在下，在3D培养物中培养步骤e)中获得的角质形成细胞。
在来自结缔组织鞘和/或来自真皮乳头的成纤维细胞存在下，在3D培养物中培养芽细胞使得可能获得负责微毛囊的毛发结构，其能够借助于芽细胞的存在进行更新。
因此，从芽细胞培养物中获得的微毛囊能够更新。
特别地，在来自结缔组织鞘和/或来自真皮乳头的成纤维细胞存在下从芽细胞培养中物获得的微毛囊能够更新。
显微解剖
要克服的困难之一在于通过显微解剖在静止期获得毛囊。
这是因为，在正常情况下，当头发脱落时，含有称为芽细胞的干细胞的隆突隔室将使得可以开始新的毛发循环的发展并且将再次给出新的毛囊。
因此，拔出静止期毛发不能获得这些芽细胞；因此将对于进行头皮活组织检查是必须的，并然后通过显微解剖分离这些细胞。
根据本发明，通过新的显微解剖技术获得芽细胞，该技术保留细胞的量和完整性，因此这些细胞彼此不分离。实际上，在支持物上分离静止期的毛发，并提取含有位于隆突中的芽细胞的静止期轴。该显微解剖能够分离和保存所有的芽细胞。
为了本发明的目的，术语“静止期”旨在意指在静止期中含有毛发的毛囊。
扩增
除了难以分离之外，芽细胞还难以培养，至少出于以下原因：
a)基质细胞数量特别少；
b)它们很难被扩增。
本申请人已经分离出芽细胞，并且开发了用于培养这些细胞的方法。具体地，在Y27632生长因子的存在下，该因子是ROCK抑制剂，这些细胞迅速扩增并分化为CD200、CD29和K15角质形成细胞，直到它们达到铺满。
根据Rheinwald和Green技术(Cell[细胞]，第6卷，331-344，1975)通过在由成纤维细胞组成的饲养支持物上，在本领域技术人员已知的合适的培养基中，在生长因子(特别是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲状腺氨酸、和pH缓冲溶液)的存在下进行培养来扩增细胞。特别地，这样的培养基可以特别包含至少一种针对角质形成细胞的促有丝分裂生长因子(例如表皮生长因子(EGF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)，特别是KGF)、胰岛素、氢化可的松，以及任选地抗生素(例如，庆大霉素，二性霉素B)，向该培养基中添加ROCK抑制剂，Y27632。
有利地，所述培养基还可以包含血清或垂体提取物，例如牛科动物来源的，肾上腺素、转铁蛋白和/或非必需氨基酸。
用于该培养的成纤维细胞将更优先地是3T3成纤维细胞。3T3成纤维细胞是对本领域技术人员熟知的。这是自1962年来已知的成纤维细胞细胞系。“3T3”表示“3天转移，3x105个细胞接种”。
细胞培养优选地在成纤维细胞(优先地3T3成纤维细胞)上培养，细胞的增殖事先停止，优先地通过先前辐照细胞(例如用γ辐射)或先前用丝裂霉素处理。丝裂霉素(特别是丝裂霉素C)阻断这些细胞的增殖，然而不阻止它们产生可用于角质形成细胞增殖的营养物质。
用该技术，芽细胞在与其他细胞类型分开的支持物上增殖。这使得可以保留足够数量的芽细胞。细胞在Y27632的存在下迅速增殖直至铺满，并分化成对标志物CD200、CD29和K15呈阳性的细胞。
根据本发明，术语“有效量”表示在铺满时获得CD200、CD29和K15角质形成细胞培养物所需要的量。
根据本发明，ROCK抑制剂，Y27632的有效量是在1μM和100μM之间，并优选地在5μM和25μM之间，并且优选地是10μM。
根据本发明，在ROCK抑制剂，Y27632的存在下将芽细胞培养至少2天，并优选地至少3天。
优选地，将细胞置于细胞数为1000至4000个细胞之间的培养物中，并且优选地为每cm2 3000个细胞。
术语“在铺满时”旨在意指在合适的支持物(例如培养皿)上的单层中培养的每个粘附细胞之间无空隙的细胞层。
在3D培养物中培养CD200、CD29、K15细胞以获得微毛囊
通过悬滴法或用微孔板培养非粘附细胞的方法在Insphero型的96孔微孔板上接种细胞获得3D球(GravityPLUS White paper system)。
然后将来自结缔组织鞘和/或真皮乳头的芽细胞和成纤维细胞在37℃的green培养基中培养；在培养至少3天后观察微毛囊的外观。
根据一个实施例，将细胞保持培养至少3天，并优选地至少5天。
优选地，置于培养中的细胞数目是在1000个和4000个细胞之间，并且优选地是每cm2 3000个细胞。
本发明的另一个主题是可以通过使用根据本发明的方法获得微毛囊。
这些微毛囊一方面使得能够使用它们用于对多毛性减弱状态(特别是脱发)进行预防或治疗处理，并且另一方面组成针对化妆品和/或药物活性剂的活性或局部成分的其他副作用的预测性测试。
对多毛性减弱状态，特别是脱发进行预防或治疗处理
考虑到微毛囊具有在体内毛囊的特征，该微毛囊可以被用作植入物，任选地与皮肤替代物结合。
因此，根据本发明的微毛囊还将具有用于制备植入物和/或皮肤替代物用于治疗皮肤障碍(例如烧伤、愈合缺陷、或变白或变灰的毛发)的用途。
治疗效果被定义为无论是全部还是部分恢复到正常的多毛性状态。
为了本发明的目的，如果受试者具有脱发的先决条件(例如家族性倾向)，则建议进行预防性治疗。
毛发数量减少的情况可能是由脱发、遗传性脱发、疤痕、烧伤、或意外伤害引起的。
对化妆品和/或药物活性剂活性的预测性测试
根据本发明的微毛囊等效物使得能够在体毛或头发生长的特定时间过程中进行，并因此任何需要在活体内并且尽可能在体内背景下尽可能完整的多种毛发的研究(例如研究毛发周期和能够影响该周期的因素)，从对促进毛发生长的活性剂的研究，对使得能够防止脱发的活性剂或减缓体毛生长的活性剂的研究。
为了鉴定新的活性剂的产品筛选方法包括：步骤(a)使所述测试产品与根据本发明的微毛囊接触，然后步骤(b)分析所述产品对微毛囊的至少一个参数的影响，和步骤(c)选择使所述参数改变的产品。
优选地，为了进行步骤(a)，将测试产品局部应用，例如配制成常规局部制剂或引入培养基中的其他制剂。
特别地，可以通过对与微毛囊的质量和/或微毛囊的稳态有关的标志物的表达、产生、和/或活性(例如针对结构蛋白的毛囊标志物)的分析来进行步骤(b)。作为结构蛋白的实例，可以提及毛发角蛋白。
为此，在筛选过程的步骤(b)中将对产品对毛干生长的影响进行分析。
分析产品效果的步骤(b)将优选地将将与测试产品接触的在根据本发明微毛囊上测量的至少一个参数与在相同条件下培养的但未接受测试产品的对照微毛囊上测量的那些参数进行比较。
选择使微毛囊参数改变的产品的步骤(c)将作为预先确定的标准功能进行。
该参数的改变可以是对表达、产品和/或标志物的活性和/或毛干的生长的刺激、降低或全部或部分的抑制。
用于选择所述产品的标准将例如是该产品对所测量的参数具有刺激或抑制作用。
根据本发明的微毛囊也可以在自动化方法中使用，用于筛选用于鉴定新活性剂的化妆品、药物、或皮肤病学化合物。
附图说明：
附图使得能够更好地说明本发明，然而不限制其范围。
图1：芽细胞定位
图2：用针分离结缔组织鞘细胞和芽细胞
图3：分离含有芽细胞的静止期毛囊
图4：静止期毛囊沉积在3T3的饲养层上以及第一芽细胞在毛囊周围的迁移
图5：培养10天后铺满的芽细胞
图6：在铺满时K15+、CD29+和CD200+角质形成细胞中细胞的表征
图7：用Rock抑制剂(图7a)和不用Rock抑制剂(图7b)，芽细胞的增殖
图8：在培养3天、7天和10天后负责毛囊的管状结构的形成。
以下给出的实例被呈现为本发明的非限制性说明。
实例1-芽细胞的制备
实验方案
芽细胞区域称为隆突(图1)，从结缔组织鞘中提取(图2)，并且然后置于含有3T3i细胞的有盖培养皿中(图3)。
i.芽细胞显微解剖
从头皮的手术残余物中提取毛囊。首先将所述残余物切割成5mm2的部分，并然后使用解剖刀在真皮与皮下组织之间切片。
使用眼科手术钳将毛囊提取出来，并然后用解剖刀在乳头上方切片。然后回收毛球。在该阶段，毛球包括两个隔室：真皮隔室(真皮乳头和结缔组织鞘)以及形成细胞块的基质细胞。
使用灌注针将上皮部分与真皮部分分开。仅培养上皮部分。
ii.培养条件：
培养条件具有三个主要的部分：
·基础培养基：
除非另有说明，在实例中使用的所有的培养基和缓冲液在Bell等人，1979(P.N.A.S.USA[美国国家科学院院刊]，76，1274-1278)；Asselineau和Prunieras，1984(British J.of Derm.[英国皮肤病学杂志]，111，219-222)或Asselineau等人，1987(Models in dermato.[皮肤病研究模型]，第III卷，Lowe和Maibach编辑，1-7)中进行了描述。
MEM培养基+10％FCS+7F(被称为Green 7F培养基)具有以下组分：
·培养补充物：生长因子，并且例如10μM的Y27632。
·粘附表面：在基于Green的培养基中，通过丝裂霉素处理在细胞周期中捕获的鼠科动物3T3成纤维细胞的饲养层的存在下芽细胞增殖。
角质形成细胞的培养-扩增
显微解剖后，处于静止期的毛囊沉积在直径为60mm的有盖培养皿中，事先用1百万个3T3细胞接种，并用完全Green 7F培养基覆盖；获得在铺满时的芽细胞的培养物。
为了产生球，通过酶处理在亚聚集阶段回收细胞。可以用已经描述的常规技术(悬滴、离心、非粘附性支持)以各种方式获得球。在悬滴的情况下，将3000个细胞以球面放入板中。为了监测它们的进展，48小时后在96孔板中回收这些细胞。
将具有未解离的芽细胞簇的静止期毛发分离并沉积在3T3饲养层上(图3)。培养3天后，细胞开始以芽簇周围的集落形式增殖(图4)。细胞在7天内达到亚铺满(图5)。
它们的特点是体积非常小，并且增殖能力强。为了确保扩增，然后将细胞接种到T75烧瓶中。因此，将3个毛球培养3周后，在第1代有可能产生大约4000万个芽细胞。
可以观察到，在浓度为10μM的Rock Y27632抑制剂存在下，芽细胞能够在green 7F培养基中非常快速地达到铺满(图7a))，而在没有添加rock抑制剂的相同的培养基中，细胞不增殖(图7b))。
因此，在含有rock抑制剂的7F培养基中培养的芽细胞使得可以获得足够量的对K15、CD29和CD200标志物呈阳性(图6)的角质形成细胞。此外，这些细胞是小尺寸的，具有高的核/细胞质比率和均一的表型。
然后在来自结缔组织鞘和/或来自真皮乳头的成纤维细胞存在下，将足够量且具有K15、CD29和CD200标志物的所得细胞均一地且可再现地置于3D培养物中。
培养3天后，这些细胞形成球。
培养大约另外3天后，这些球改变了构象，呈现出两极化的组织。出现出芽，这似乎表明球分化成负责毛囊形成的管状结构。

Claims (20)

1.芽细胞用于制备微毛囊的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于该微毛囊能够更新。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述芽细胞在结缔组织鞘成纤维细胞和/或真皮乳头成纤维细胞的存在下培养。
4.一种用于制备微毛囊的方法，该方法包括至少一个步骤：在有效量的ROCK抑制剂的存在下培养芽细胞，持续足以允许所述细胞分化成对CD200、CD29和K15标志物呈阳性的角质形成细胞的一段时间。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该ROCK抑制剂是Y27632。
6.根据权利要求4和5所述的方法，其中该ROCK抑制剂的有效量是从1μM至100μM。
7.根据权利要求4至6所述的方法，其中该ROCK抑制剂的有效量是从5μM至25μM。
8.根据权利要求4至7所述的方法，其中该ROCK抑制剂的有效量是10μM。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中将该芽细胞在该ROCK抑制剂的存在下培养持续至少2天，并且优选地持续至少3天。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a-从头皮样品中分离处于静止期的毛囊；
b-将芽细胞与结缔组织鞘分开；
c-在green 7F培养基中，在已经用丝裂霉素阻断的3T3i成纤维细胞的饲养层上沉积细胞集合体；
d-在ROCK抑制剂的存在下，在所述支持物的表面上扩增该芽细胞；
e-回收对CD200、CD29和K15标志物呈阳性的角质形成细胞；
f-在具有结缔组织鞘成纤维细胞和/或真皮乳头成纤维细胞的3D培养物中培养步骤e)中获得的角质形成细胞。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其中所述对CD200、CD29和K15标志物呈阳性的角质形成细胞在它们达到铺满同时形成规则簇时回收。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于在步骤f)中，置于培养物中的角质形成细胞的数目是在每cm21000个和4000个细胞之间，并且优选地是每cm23000个细胞。
13.一种微毛囊，该微毛囊可以通过根据权利要求4至12中任一项所述的方法获得。
14.根据权利要求13所述的微毛囊，其特征在于该微毛囊由在ROCK抑制剂的存在下的芽细胞的扩增和分化而形成的细胞所构成。
15.根据权利要求14所述的微毛囊，其特征在于该ROCK抑制剂是Y27632。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的微毛囊，用于对多毛性减弱状态进行预防或治疗处理。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的微毛囊，用于治疗脱发。
18.根据权利要求13至15中任一项所述的微毛囊用于体外测试活性剂对毛发特性的影响的用途。
19.根据权利要求18所述的微毛囊的用途，用于鉴定调节体毛和/或头发生长的化合物。
20.一种为了鉴定新的活性剂的产品筛选方法，该方法包括：步骤(a)将所述测试产品与如根据权利要求13至15中任一项定义的所述的微毛囊接触，然后步骤(b)分析所述产品对微毛囊的至少一个参数的影响，以及步骤(c)选择使所述参数改变的产品。
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