乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法
技术领域
本发明涉及一种乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法,属于食品添加剂检测技术领域。
背景技术
核苷酸是一种营养素,对婴幼儿生长发育有重要作用,所以核苷酸可用于乳品添加剂。但是,人体对核苷酸的需求是有一定限度的,并非越多越好,乳品中核苷酸的含量必须加以控制。乳制品生产企业的乳粉标准中,把核苷酸的含量列为重要指标,所以对乳品中核苷酸的含量控制极为重要,这就需要相应的技术支持。目前报道的检测方法主要有微生物法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法分析速度快、效率高、灵敏度高,其应用最为广泛。
高效液相色谱法检测乳粉中核苷酸,测定前对试样必须进行处理,其中试样中蛋白质的分离至关重要。相关资料报导,试样处理时,普遍采用在试样溶液中加入一定量的醋酸或高氯酸使蛋白质沉淀,再分离除去,该方法经多次试验证明效果并不理想。试样溶液加入醋酸或高氯酸使蛋白质沉淀,但是蛋白质沉淀粘稠,溶液分层不清,有乳化层出现,难于过滤和洗涤,严重影响高效液相色谱法对核苷酸的测定,该分离方法不但干扰核苷酸组分中色谱峰的分离,而且严重影响核苷酸测定准确度。因此采用高效液相色谱法测定乳品中核苷酸时,如何使乳品中的蛋白质有效分离且不影响核苷酸含量测定的准确度,成为必须解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法,其方法简单、操作方便、精确度高,蛋白质分离完全,排除了对核苷酸测定的干扰,为试样中核苷酸的测定提供了良好的条件。
本发明所述的乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法,包括如下步骤:
(1)用核苷酸标准品配制对照品溶液;
(2)称取乳粉试样,加蒸馏水于超声器中震荡溶解处理,使试样中核苷酸溶于蒸馏水;
(3)用硝酸调节试样溶液pH值为3~4,使试样溶液中蛋白质形成沉淀,过滤除去,滤液用水定容,作为供试品溶液;
(4)用高效液相色谱测定供试品溶液和对照品溶液核苷酸色谱峰面积;
(5)根据对照品溶液核苷酸浓度及其色谱峰面积,供试品溶液核苷酸色谱峰面积及试样质量,用外标法计算试样中核苷酸的含量。
步骤(2)所述的溶解处理时间为10~12分钟。
核苷酸含量计算公式如下所示:
式中:
Xi—试样中某种核苷酸含量,mg/100g;
Ai—供试品溶液核苷酸色谱峰面积;
As—对照品溶液核苷酸色谱峰面积;
Cs—对照品溶液核苷酸浓度,mg/ml;
Mi—称取试样质量,g。
试样中核苷酸总含量(mg/100g)计算公式如下所示:
X=∑Xi———————————— (2)
本发明的有益效果如下:
本发明提供的乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法,在试样处理中,用硝酸调节试样溶液pH值为3~4,使得蛋白质分离方法简单、分离彻底,排除了对核苷酸测定的干扰,乳粉中5种核苷酸:腺苷酸、尿苷酸、胞苷酸、肌苷酸和鸟苷酸均能得到良好得分离和准确定量,其准确度高、精密度高。5种核苷酸回收率平均值为97.76%,相对标准偏差为1.73%,符合定量分析方法的要求。本发明方法简单、操作方便、精确度高,蛋白质分离完全,排除了对核苷酸测定的干扰,为试样中核苷酸的测定提供了良好的条件,可以用于乳粉中核苷酸含量的测定。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
乳粉中核苷酸含量检测:
1、核苷酸标准对照品溶液的配制:
1.1对照品储备液的配制:称取Sigma公司核苷酸混合样(含胞苷酸、尿苷酸二钠、鸟苷酸二钠、腺苷酸、肌苷酸二钠)标准品200mg(精确至0.1mg)于50ml容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容。
1.2对照品溶液的配制:吸取对照品储备液2.00ml于25ml容量瓶中,用蒸馏水定容。
2、试样溶解:
称取市售含5种核苷酸(胞苷酸、尿苷酸二钠、鸟苷酸二钠、腺苷酸、肌苷酸二钠)的乳粉试样2.00g于100ml烧杯中,加64~66℃蒸馏水30ml,充分摇匀,于超声器中超声10分钟。
3、试样蛋白质的分离:
pH计指示,用硝酸溶液(1+4)调节pH值至3.5~3.8,使蛋白质形成沉淀,静置15分钟,用滤纸过滤于50ml容量瓶中,少量蒸馏水洗涤烧杯和沉淀,合并滤液和洗液,蒸馏水定容作为供试品溶液备用。
4、色谱条件的设定:
4.1流动相:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0,内含1.4mmol/L四丁基硫酸氢胺):甲醇=1000:40;
4.2色谱柱:C18,4.6×250mm,Hypersil ODS2,5μ;
4.3检测器:紫外检测器;
4.4检测方法:色谱峰面积外标定量法;
4.5进样体积:20μl;
4.6色谱柱温度:室温。
5、对供试品溶液和对照品溶液进行测定,获得核苷酸色谱峰面积。分别测定3次,取其平均值按公式(1)、公式(2)计算结果。
本发明方法的可靠性验证:
1、回收率测定:
称取一定量未添加核苷酸的乳粉试样,加入一定量某种核苷酸,按照实施例1的方法测定试样中该种核苷酸总量,平行实验两次,取平均值。测定量与加入量相比获得该种核苷酸回收率。测定结果如下表1所示:
表1 回收率测定表
核苷酸名称 |
加入量(μg) |
测定量(μg)1 |
测定量(μg)2 |
回收率% |
胞苷酸 |
1870 |
1833 |
1872 |
99.06 |
尿苷酸二钠 |
1925 |
1871 |
1893 |
97.77 |
鸟苷酸二钠 |
2014 |
1975 |
1944 |
97.29 |
腺苷酸 |
2103 |
2053 |
2068 |
97.98 |
肌苷酸二钠 |
1835 |
1778 |
1771 |
96.70 |
2、精密度的测定:
取实施例1中市售含5种核苷酸的乳粉试样,按照实施例1方法平行测定5次核苷酸总含量,计算精密度。测定结果如下表2所示:
表2精密度测定表
3、结论:
本发明提供的乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法,在试样处理中,蛋白质分离方法简单、分离彻底,排除了对核苷酸测定的干扰,本发明的高效液相色谱方法,乳粉中5种核苷酸:腺苷酸、尿苷酸、胞苷酸、肌苷酸和鸟苷酸均能得到良好得分离和准确定量。本发明的高效液相色谱方法准确度高,精密度高。5种核苷酸回收率平均值为97.76%,相对标准偏差为1.73%,符合定量分析方法的要求,可以用于乳粉中核苷酸含量的测定。