CN111999398B - 咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法 - Google Patents
咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111999398B CN111999398B CN202010659428.2A CN202010659428A CN111999398B CN 111999398 B CN111999398 B CN 111999398B CN 202010659428 A CN202010659428 A CN 202010659428A CN 111999398 B CN111999398 B CN 111999398B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- ion pair
- methylxanthine
- mobile phase
- caffeine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 78
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 69
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- PFWLFWPASULGAN-UHFFFAOYSA-N 7-Methylxanthine Natural products N1C(=O)NC(=O)C2=C1N=CN2C PFWLFWPASULGAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- YAPQBXQYLJRXSA-UHFFFAOYSA-N theobromine Chemical compound CN1C(=O)NC(=O)C2=C1N=CN2C YAPQBXQYLJRXSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 17
- MVOYJPOZRLFTCP-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-7H-xanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)NC2=C1NC=N2 MVOYJPOZRLFTCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- GMSNIKWWOQHZGF-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C2=C1N=CN2 GMSNIKWWOQHZGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- 229960004559 theobromine Drugs 0.000 claims description 15
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 claims description 10
- HMLZLHKHNBLLJD-UHFFFAOYSA-N 3,7-dimethyluric acid Chemical compound CN1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2C HMLZLHKHNBLLJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960003190 adenosine monophosphate Drugs 0.000 claims description 9
- NOFNCLGCUJJPKU-UHFFFAOYSA-N 1,7-dimethyluric acid Chemical compound N1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1NC(=O)N2C NOFNCLGCUJJPKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FGWUDHZVEBFGKS-UHFFFAOYSA-N 1-o-tert-butyl 2-o-methyl azetidine-1,2-dicarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CCN1C(=O)OC(C)(C)C FGWUDHZVEBFGKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KWNBDPJHEKVDAW-UHFFFAOYSA-N 4-(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(C(O)=O)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 KWNBDPJHEKVDAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 8
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 8
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 claims description 8
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 8
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004226 guanylic acid Substances 0.000 claims description 8
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 8
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 claims description 8
- BYXCFUMGEBZDDI-UHFFFAOYSA-N trimethyluric acid Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1NC(=O)N2C BYXCFUMGEBZDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 claims description 8
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101100348341 Caenorhabditis elegans gas-1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101100447658 Mus musculus Gas1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100447665 Mus musculus Gas2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- QUNWUDVFRNGTCO-UHFFFAOYSA-N 1,7-dimethylxanthine Chemical compound N1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C QUNWUDVFRNGTCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000007443 Neurasthenia Diseases 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000002937 blood-testis barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/047—Standards external
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其包括如下步骤：确定采用LC‑MS/MS检测分析参数条件，利用18种外标标准品以及9种内标标准品建立标准曲线；将血浆样品预处理，制备供试品溶液，上机测试，根据各标准曲线换算出血浆样品中各成分的含量。该咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法能够准确定量血浆样品种18种成分的含量，快速灵敏，可靠性好，便于进行代谢通路分析。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，尤其涉及一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法。
背景技术
咖啡因是一种从植物样本中提取出的生物碱。适度使用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。自从人们认识到咖啡因的用途以来，咖啡因就被人为添加到多种食品和药物中。但是，大剂量或长期食用咖啡因也会对人体造成损害，特别是其具有成瘾性。
由于咖啡因与人类健康息息相关，经吸收后能完全地进入全身组织并且自由通过血-脑、胎盘、血-睾屏障，其在人体代谢系统的研究也日益深入。因此，对于与咖啡因代谢相关的多种物质进行准确定量十分必要。
但是，常规检测分析仅能够实现对与咖啡因代谢相关的单种成分或者少数几种成分的定量分析，工作量大，效率低。
发明内容
基于此，有必要提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，能够适用于血浆样本分析，实现快速高效定量分析咖啡因及其相关代谢物，可靠性好，还便于快速进行咖啡因代谢通路分析。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，包括如下步骤：
确定采用LC-MS/MS检测分析的参数条件，色谱条件包括：柱温38℃～42℃，流动相A为0.03％～0.05％乙酸的水，流动相B为0.03％～0.05％乙酸的乙腈，采用梯度洗脱方式；质谱条件包括：采用ESI离子源，采用MRM扫描模式；
按照所述参数条件，利用外标标准品以及内标标准品13C3-咖啡因、IS-7-甲基黄嘌呤、13C5-腺苷酸、d3-1-甲基黄嘌呤、d3-副黄嘌呤、d6-可可碱、d3-1,7-二甲基尿酸、d3-1-甲基尿酸、13C5-黄嘌呤核苷，建立1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、鸟苷酸、7-甲基黄嘌呤、腺苷酸、咖啡因、副黄嘌呤、可可碱、茶碱、1,3,7-三甲基尿酸、1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸、3,7-二甲基尿酸、一磷酸腺苷、肌苷、尿酸、黄嘌呤核苷以及黄嘌呤的标准曲线；
制备供试品溶液，按照所述参数条件上机测试，根据各标准曲线换算出血浆样品中咖啡因及其代谢物的成分含量。
在其中一个实施例中，所述色谱柱为ACQUITYHSS T3柱，进样量2μL。
优选地，采用流速为0.32mL/min～0.38mL/min，所述梯度洗脱的条件为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
0.5min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
5min，流动相A与流动相B的体积比为60:40；
5.1min，流动相A与流动相B的体积比5:95；
7.5min，流动相A与流动相B的体积比为5:95；
7.6min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
10min，流动相A与流动相B的体积比为95:5。
在其中一个实施例中，所述MRM扫描参数包括：
1-甲基黄嘌呤的离子对为167.1/110、167.1/136.02，d3-1-甲基黄嘌呤的离子对为170/110；
3-甲基黄嘌呤的离子对为167.1/124、167.1/33；
鸟苷酸的离子对为364/152、364.2/323.2；
7-甲基黄嘌呤的离子对为167/124、167/150，IS-7-甲基黄嘌呤的离子对为173.1/127.9；
腺苷酸的离子对为268.097/136、268.097/212.09，13C5-腺苷酸的离子对为273/136.1；
咖啡因的离子对为195.08/138.06、195.08/83，13C3-咖啡因的离子对为198.1/140；
副黄嘌呤的离子对为181.1/55.1、181.2/124.2，d3-副黄嘌呤的离子对为184.1/124.1；
可可碱的离子对为181/138、181/89.07，d6-可可碱的离子对为187/169；
茶碱的离子对为181.1/137.1、181.1/124.1；
1,3,7-三甲基尿酸的离子对为209.2/137、209.2/165；
1,7-二甲基尿酸的离子对为195/180、195/137，d3-1,7-二甲基尿酸的离子对为198.1/183；
1-甲基尿酸的离子对为181/138、181/86，d3-1-甲基尿酸的离子对为184.1/141；
3,7-二甲基尿酸的离子对为195/180、195/152.04；
一磷酸腺苷的离子对为346/134、346/97；
肌苷的离子对为267.1/135、267.1/108；
尿酸的离子对为166.8/96.1、167.1/124.1；
黄嘌呤核苷的离子对为283.076/151、283.076/108，13C5-黄嘌呤核苷的离子对为288/151；
以及黄嘌呤的离子对为151/108、151/80。
优选地，所述离子源温度500℃，喷雾压力为-4500/5500V，气帘气压力为35psi，辅助加热气Gas1压力为45psi，辅助加热气Gas2压力为55psi，碰撞气为Medium。
在其中一个实施例中，所述标准曲线的建立方法包括如下步骤：
利用外标标准品1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、鸟苷酸、7-甲基黄嘌呤、腺苷酸、咖啡因、副黄嘌呤、可可碱、茶碱、1,3,7-三甲基尿酸、1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸、3,7-二甲基尿酸、一磷酸腺苷、肌苷、尿酸、黄嘌呤核苷以及黄嘌呤和溶剂甲醇配置外标浓度为1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL的外标混合工作液；
利用内标标准品13C3-咖啡因、IS-7-甲基黄嘌呤、13C5-腺苷酸、d3-1-甲基黄嘌呤、d3-副黄嘌呤、d6-可可碱、d3-1,7-二甲基尿酸、d3-1-甲基尿酸、13C5-黄嘌呤核苷和溶剂甲醇配置内标浓度为100ng/mL的内标混合工作液；
利用外标混合工作液、内标混合工作液和溶剂甲醇配置浓度分别为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL的标准品溶液，其中各浓度点内标浓度均为10ng/mL；
按照上述任一项所述的参数条件上机测试，分别建立标准曲线。
在其中一个实施例中，所述制备供试品溶液包括如下步骤：将血浆样品解冻，涡旋混匀，取50μL加入到100μL～180μL甲醇中，再加入20μL、浓度为100ng/mL的内标混合工作液，涡旋混匀，离心，取上清液，即得。优选地，所述离心的速度为11000r/min～13000r/min，时间为min～5min。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法通过筛选特定的分析条件，可实现高效定量分析生物样本中与咖啡因代谢相关的18种成分，效率高，可靠性好，适用于血浆样本及代谢通路分析。
附图说明
图1为1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤、鸟苷酸、腺苷酸、咖啡因、副黄嘌呤、可可碱、茶碱的检测谱图。
图2为1,3,7-三甲基尿酸、1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸、3,7-二甲基尿酸、一磷酸腺苷、肌苷、尿酸、黄嘌呤核苷、黄嘌呤的检测谱图。
图3为对比例1的总离子流图。
图4为对比例2的总离子流图。
图5为对比例3的总离子流图。
图6为对比例4的总离子流图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
试验仪器：AB SCIEX QTRAP 6500LC-MS/MS仪器。
咖啡因及其代谢物主要包括1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、鸟苷酸、7-甲基黄嘌呤、腺苷酸、咖啡因、副黄嘌呤、可可碱、茶碱、1,3,7-三甲基尿酸、1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸、3,7-二甲基尿酸、一磷酸腺苷、肌苷、尿酸、黄嘌呤核苷以及黄嘌呤。
实施例1
本实施例提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，包括如下步骤：
S1，确定采用LC-MS/MS检测分析的参数条件。
其中，色谱条件如下：
色谱柱：采用ACQΜITYHSS T3柱，规格为i.d.2.1×100mm，1.8μm。
流动相：流动相A为含0.04％乙酸的水，流动相B为含0.04％乙酸的乙腈。梯度洗脱程序如下表1所示：
表1梯度洗脱程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 0.35 | 95 | 5 |
| 0.5 | 0.35 | 95 | 5 |
| 5 | 0.35 | 60 | 40 |
| 5.1 | 0.35 | 5 | 95 |
| 7.5 | 0.35 | 5 | 95 |
| 7.6 | 0.35 | 95 | 5 |
| 10 | 0.35 | 95 | 5 |
质谱条件如下表2和表3所示：
表2质谱参数条件
| 离子模式 | ESI-/ESI+ | 气帘气 | 35Psi |
| 离子喷雾电压 | -4500/+5500V | 温度 | 500℃ |
| IonSourceGas1 | 45Psi | IonSourceGas2 | 55Psi |
| 碰撞气体 | Medium中级 | 扫描方式 | MRM多重反应监测 |
| 入口电压 | -10/10V | 出口电压 | -12/12V |
表3 MRM参数条件
S2，建立标准曲线。
配置外标混合工作液：分别准确称量下表4所示的外标标准品各1mg，加入超纯水溶解，分别配制成浓度为1000μg/mL的标准品单标储备液。取100μL标准品单标储备液，加入400μL超纯水、500μL纯甲醇，配制成浓度为100μg/mL标准品单标中间液。再分别各取18种标准品单标中间液10μL，加入820μL 50％甲醇水，配制成浓度为1μg/mL的外标混合工作液。再逐级稀释为1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL的外标混合工作液。
表4外标标准品信息
配置内标混合工作液：取下表5所示的内标标准品，分别配制成浓度为100μg/mL的内标单标中间液；取10μL内标单标中间液，加入990μL、50％甲醇水，配制成浓度为1μg/mL的内标单标工作液；分别取9种1μg/mL的内标单标工作液100μL，再加入100μL 50％甲醇水，配制成浓度为100ng/mL内标混合工作液。
表5内标标准品信息
配置不同浓度标准品溶液：按照下表6所示用量配置：
表6不同浓度的标品溶液配置方法表
将不同浓度标准品溶液按照S1中的参数条件上机测试，质谱数据导入MultiQuant软件，分别根据18种标准品物质的特征离子碎片确定其色谱保留时间。其中，50ng/mL标准品溶液的出峰情况见图1和2。
由图1和图2可以看出，18种标准品物质均出峰，且峰形良好，能够实现准确定性。其中，18种标准品保留时间及对应内标结果分别见下表7:
表7标准曲线拟合结果统计表
由表7可以看出，与咖啡因代谢相关的18种物质在定量范围内均具有良好的线性(线性方程的相关系数R2>0.99)，可实现准确定量。
实施例2血浆样品测试
血浆样品来源：血浆样本A、B、C均来源于中国人民解放军总医院(301医院)。
前处理：离心管盒里装上碎冰，从-80℃冰箱中取出待测血浆样品放在装有碎冰的离心管盒里解冻(样品在冰上解冻以及后续所有操作都要求在冰上进行)至样本中没有冰块，解冻完成后，涡旋10s混匀。
制备供试品溶液：取待测血浆样品50μL，加入150μL在甲醇溶液，20μL内标混混合工作液(100ng/mL)。涡旋3min，12000r/min，4℃条件下离心10min。离心完后吸取上清液150μL转到另一个编号的离心管中，-20℃静置过夜。12000r/min，4℃条件下再离心5min，取上清液100μL。取100μL上清液装到对应进样瓶内衬管中，盖盖，用于上机分析。
按照实施例1的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法的参数条件进行分析测试，结果如表8所示：
表8血浆样品测试结果统计表
实施例3方法学验证
(1)精密度
分别对同一份标准品溶液(50ng/mL)，按照实施例1的测试条件连续3天进行测试，每天测试1针，计算RSD。分别对同一份标准品溶液(50ng/mL)，按照实施例1的测试条件在一天内间隔重复测试3次，计算RSD。统计结果见下表9：
表9精密度结果统计表(N＝3)
(2)回收率
采用血浆样本D(来源于中国人民解放军总医院(301医院))作为对照按照实施例2的方法测试18种成分的基础含量，再分别添加各标准品，进行回收率测试，各样品平行测试3次。结果统计如下表10：
表10回收率结果统计表(N＝3)
由表10可以看出，采用本发明探索的液质联用最优测试条件，18种物质的回收率均较高。
对比例1
本对比例提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其确定采用LC-MS/MS检测分析参数条件的洗脱程序与实施例1不同，分别如下表11所示，测试获得的总离子流图如图3所示。
表11梯度洗脱程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 10.00 | 0.35 | 5 | 95 |
| 11.00 | 0.35 | 5 | 95 |
| 11.10 | 0.35 | 95 | 5 |
| 14.00 | 0.35 | 95 | 5 |
对比例2
本对比例提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其确定采用LC-MS/MS检测分析参数条件的洗脱程序与实施例1不同，区别如下表12所示，测试获得的总离子流图如图4所示。
表12梯度洗脱程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 3.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 7.00 | 0.35 | 5 | 95 |
| 9.00 | 0.35 | 5 | 95 |
| 9.10 | 0.35 | 95 | 5 |
| 12.00 | 0.35 | 95 | 5 |
对比例3
本对比例提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其确定采用LC-MS/MS检测分析参数条件的洗脱程序与实施例1不同，区别如下表13所示，测试获得的总离子流图如图5所示。
表13梯度洗脱程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 1.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 6.00 | 0.35 | 50 | 50 |
| 7.00 | 0.35 | 5 | 95 |
| 9.00 | 0.35 | 5 | 95 |
| 10.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 11.00 | 0.35 | 95 | 5 |
对比例4
本对比例提供一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其确定采用LC-MS/MS检测分析参数条件的洗脱程序与实施例1不同，区别如下表14所示，测试获得的总离子流图如图6所示。
表14梯度洗脱程序表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 0.35 | 95 | 5 |
| 0.50 | 0.35 | 95 | 5 |
| 5.00 | 0.35 | 60 | 40 |
| 5.10 | 0.35 | 5 | 95 |
| 7.50 | 0.35 | 5 | 95 |
| 7.60 | 0.35 | 95 | 5 |
| 10.00 | 0.35 | 95 | 5 |
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
确定采用LC-MS/MS检测分析的参数条件，色谱条件包括：色谱柱为ACQUITY HSS T3柱，柱温38℃～42℃，流动相A为含0.03％～0.05％乙酸的水，流动相B为含0.03％～0.05％乙酸的乙腈，采用梯度洗脱方式；质谱条件包括：采用ESI离子源，采用MRM扫描模式；
所述梯度洗脱采用的流速为0.32mL/min～0.38mL/min，所述梯度洗脱的条件为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
0.5min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
5min，流动相A与流动相B的体积比为60:40；
5.1min，流动相A与流动相B的体积比5:95；
7.5min，流动相A与流动相B的体积比为5:95；
7.6min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
10min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；
按照所述参数条件，利用外标标准品以及内标标准品13C3-咖啡因、2,4,5,6-13C4-1,3,9-15N3-7-甲基黄嘌呤、13C5-腺苷酸、d3-1-甲基黄嘌呤、d3-副黄嘌呤、d6-可可碱、d3-1,7-二甲基尿酸、d3-1-甲基尿酸、13C5-黄嘌呤核苷，建立1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、鸟苷酸、7-甲基黄嘌呤、腺苷酸、咖啡因、副黄嘌呤、可可碱、茶碱、1,3,7-三甲基尿酸、1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸、3,7-二甲基尿酸、一磷酸腺苷、肌苷、尿酸、黄嘌呤核苷以及黄嘌呤的标准曲线；
制备供试品溶液，按照所述参数条件上机测试，根据各标准曲线换算出血浆样品中咖啡因及其代谢物的成分含量。
2.根据权利要求1所述的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，进样量2μL。
3.根据权利要求1所述的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，所述MRM扫描参数包括：
1-甲基黄嘌呤的离子对为167.1/110、167.1/136.02，d3-1-甲基黄嘌呤的离子对为170/110；
3-甲基黄嘌呤的离子对为167.1/124、167.1/33；
鸟苷酸的离子对为364/152、364.2/323.2；
7-甲基黄嘌呤的离子对为167/124、167/150，IS-7-甲基黄嘌呤的离子对为173.1/127.9；
腺苷酸的离子对为268.097/136、268.097/212.09，13C5-腺苷酸的离子对为273/136.1；
咖啡因的离子对为195.08/138.06、195.08/83，13C3-咖啡因的离子对为198.1/140；
副黄嘌呤的离子对为181.1/55.1、181.2/124.2，d3-副黄嘌呤的离子对为184.1/124.1；
可可碱的离子对为181/138、181/89.07，d6-可可碱的离子对为187/169；
茶碱的离子对为181.1/137.1、181.1/124.1；
1,3,7-三甲基尿酸的离子对为209.2/137、209.2/165，
1,7-二甲基尿酸的离子对为195/180、195/137，d3-1,7-二甲基尿酸的离子对为198.1/183；
1-甲基尿酸的离子对为181/138、181/86，d3-1-甲基尿酸的离子对为184.1/141；
3,7-二甲基尿酸的离子对为195/180、195/152.04；
一磷酸腺苷的离子对为346/134、346/97；
肌苷的离子对为267.1/135、267.1/108；
尿酸的离子对为166.8/96.1、167.1/124.1；
黄嘌呤核苷的离子对为283.076/151、283.076/108，13C5-黄嘌呤核苷的离子对为288/151；
以及黄嘌呤的离子对为151/108、151/80。
4.根据权利要求3所述的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，所述离子源温度500℃，喷雾压力为-4500/5500V，气帘气压力为35psi，辅助加热气Gas1压力为45psi，辅助加热气Gas2压力为55psi，碰撞气为Medium。
5.根据权利要求1至4任一项所述的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法包括如下步骤：
利用外标标准品1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、鸟苷酸、7-甲基黄嘌呤、腺苷酸、咖啡因、副黄嘌呤、可可碱、茶碱、1,3,7-三甲基尿酸、1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸、3,7-二甲基尿酸、一磷酸腺苷、肌苷、尿酸、黄嘌呤核苷以及黄嘌呤和溶剂甲醇配制外标浓度分别为1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL的外标混合工作液；
利用内标标准品13C3-咖啡因、2,4,5,6-13C4-1,3,9-15N3-7-甲基黄嘌呤、13C5-腺苷酸、d3-1-甲基黄嘌呤、d3-副黄嘌呤、d6-可可碱、d3-1,7-二甲基尿酸、d3-1-甲基尿酸、13C5-黄嘌呤核苷和溶剂甲醇配制内标浓度为100ng/mL的内标混合工作液；
利用外标混合工作液、内标混合工作液和溶剂甲醇配制外标浓度分别为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL的标准品溶液，其中各浓度点内标浓度均为10ng/mL；
按照权利要求1至4任一项所述的参数条件上机测试，分别建立标准曲线。
6.根据权利要求5所述的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，所述制备供试品溶液包括如下步骤：
将血浆样品解冻，涡旋混匀，取50μL加入到100μL～180μL甲醇中，再加入20μL、浓度为100ng/mL的内标混合工作液，涡旋混匀，离心，取上清液，即得。
7.根据权利要求6所述的咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法，其特征在于，所述离心的速度为11000r/min～13000r/min，时间为3min～5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010659428.2A CN111999398B (zh) | 2020-07-09 | 2020-07-09 | 咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010659428.2A CN111999398B (zh) | 2020-07-09 | 2020-07-09 | 咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111999398A CN111999398A (zh) | 2020-11-27 |
| CN111999398B true CN111999398B (zh) | 2022-03-08 |
Family
ID=73467399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010659428.2A Active CN111999398B (zh) | 2020-07-09 | 2020-07-09 | 咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111999398B (zh) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100366534B1 (ko) * | 2000-03-13 | 2003-01-09 | 학교법인 인하학원 | 6가지 ｃｙｐ효소의 기질 및 그의 대사물질 모두 분리가능한 단일 용매체계와 분리방법 |
| US7566401B2 (en) * | 2005-10-03 | 2009-07-28 | Kelm Mark A | Process for separating and isolating xanthines, individual polar protic monomers, and polar protic oligomers |
| JP5214226B2 (ja) * | 2007-11-02 | 2013-06-19 | 株式会社 資生堂 | チャフロサイド高含有茶葉およびその製造方法 |
| CN102095816B (zh) * | 2011-01-08 | 2013-02-13 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种咖啡酊中生物碱的测定方法 |
| CN102680601B (zh) * | 2011-12-20 | 2013-09-18 | 山东凯盛新材料股份有限公司 | 乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法 |
| GB201602394D0 (en) * | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Mdb Medical Services Ltd | Method |
-
2020
- 2020-07-09 CN CN202010659428.2A patent/CN111999398B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111999398A (zh) | 2020-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109655568B (zh) | 高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒 | |
| CN104807920B (zh) | 一种试剂盒在利用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素中的应用 | |
| CN113196052B (zh) | 复杂基质中分析物的定量质谱分析中基质效应校正的方法 | |
| CN106814150B (zh) | 一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素k1的方法 | |
| CN109212120B (zh) | 一种吴茱萸药材特征图谱的构建方法和吴茱萸药材质量检测方法 | |
| CN117147736B (zh) | 一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法 | |
| CN111579679A (zh) | 一种抗肿瘤药物检测试剂盒及其应用 | |
| Hellmuth et al. | Aqueous normal phase chromatography improves quantification and qualification of homocysteine, cysteine and methionine by liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| CN110133169A (zh) | 一种采用液质联用检测人血浆中呋塞米的方法及应用 | |
| CN110243963A (zh) | 一种人血浆中卡托普利的lc-ms/ms检测方法 | |
| CN112666273A (zh) | 一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法 | |
| CN114487141A (zh) | 一种吲哚布芬原料药中基因毒性杂质的检测方法 | |
| CN111999398B (zh) | 咖啡因及其代谢物的液质联用分析方法 | |
| CN113607854B (zh) | 同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒 | |
| Singhal et al. | Determination of capecitabine-an anticancer drug in dried blood spot by LC-ESI-MS/MS | |
| CN110726799A (zh) | 同时检测血液中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法 | |
| CN109541106A (zh) | 一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法 | |
| CN114814018A (zh) | 通过lc-ms/ms测定人血浆中多西拉敏的方法 | |
| Parekh et al. | Rapid and sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) method for the determination of clonidine in human plasma | |
| CN107045031A (zh) | 人血浆中沙格列汀和5‑羟基沙格列汀的lc‑ms/ms高通量检测方法 | |
| Wani et al. | Development and validation of sensitive uplc-ms/ms based method for the estimation of crizotinib in human plasma | |
| Wang et al. | Simultaneous determination of tofacitinib and its principal metabolite in beagle dog plasma by UPLC-MS/MS and its application in pharmacokinetics | |
| CN106248825B (zh) | 盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料a的检测方法 | |
| CN115060819B (zh) | 基于hplc-ms/ms单峰法同时测定人血浆中sun及su12662的方法 | |
| CN114609293B (zh) | 一种采用lc-ms法检测血浆中匹维溴铵的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 430075, 3rd to 4th floors, Building A5, Phase II of Optics Valley Biological Innovation Park, No.1 Jiufeng 1st Road, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan Maiwei Metabolic Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 430000 B7 and B8 Biological Industry Innovation Bases, 666 High-tech Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee before: Wuhan Mai Tver Biological Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |