CN102677179A - 利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，以普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，利用SLμCUT系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，对小麦根尖染色体进行了显微切割。本发明的方法具有制片简单、快速、方便，制片快速、染色体分散均匀等优点；在利用该系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，优化了切割系统切割小麦根尖细胞染色体的主要技术参数，并成功地对小麦染色体片段、单条染色体、两条/三条染色体进行了显微切割，这为特定小麦染色体、小麦中异源染色体的微切割、微克隆乃至外源染色体携带优良基因的克隆等后续研究提供了参考。

Description

利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法

技术领域

本发明涉及一种利用SLμCUT系统切割小麦染色体技术体系的建立，属于分子细胞遗传学领域。

背景技术

染色体微切割、微分离与微克隆(chromosome micro-dissection and micro-cloning)技术是由Scalenghe等(Scalenghe F.，E.Turco，J.E.Edstrom，et al.Microdissection and cloning ofDNA from a specific region of Drosophila melanogaster polytene chromosome[J].Chromosoma，1981，82：205-216)创立的一项分子细胞遗传学新技术。该技术首先对果蝇染色体进行了切割，成功获得了80个克隆，随后用于鼠和人类(Rohme Dan，Howard Fox，Bernhard Herrmann，et al.Molecular clones of the mouse complex derived from microdissectedmetaphase chromosomes[J].Cell，1984，36：783-788.)。随着PCR技术的发展，微切割和微克隆技术得到了较大发展(Ludecke HJ，Gabriele Senger，Use Claussen，et al.Cloning definedregions of human genome by microdissection of banded chromosomes and enzymaticamplification[J].Nature，1989，338：348-350)。自Sandery等(Sandery M J，et al.Isolation ofsequence common to A and B chromosomes of rye(Secale cereal L.)by micro cloning[J].PlantMolecular Biology Reporter，1991，9(1)：21-30)利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物染色体文库的构建、特异探针筛选、抗性基因的克隆以及遗传与进化研究上得到了较为广泛应用，但是，相比较而言，植物在这方面开展的研究仍然滞后于动物和人类。目前，植物染色体显微切割技术主要存在以下几个方面的困难：

(1)植物细胞壁的存在、同步化的困难，阻碍了良好分散染色体标本的制备，而染色体标本的制备是影响染色体切割最基础的技术之一；背景不干净，影响了切割效率。

(2)植物基因组倍性多样，染色体结构变异大，基因排列顺序不够保守；植物染色体DNA含量高、蛋白质含量低，绝大多数染色体不能象脊椎动物染色体显示G、R或Q带带纹而不影响DNA序列(Fukui k.，M.Minezawa，Y.Kamisugi，et al.Microdissection ofplant chromosome by argon-ion laser beam[J].Theor Appl Genet.，1992，84：787-791)；通行的C带，对染色体DNA破坏太大，不利于构建完整的DNA文库；而有些植物染色体不仅小，而且大小差异不明显，带纹相似，难于精确识别染色体及其细微结构，所有这些都加大了分析的复杂性。

(3)植物染色体DNA高度重复序列多，如小麦、大麦、黑麦和燕麦核基因组有约80％的重复序列(Albani Diego，Marie-Jose Cote，Ken C，et al.PCR amplification ofmicrodissected wheat chromosome arms in a“single tube”reaction[J].Plant J，1993，4：899-903)。麦类作物DNA含量高，如六倍体燕麦(2n＝6x＝42)DNA含量为13.2～14.3pg，约1.3～1.4×10¹⁰bp。小麦C值为1.7×10⁹bp，平均每条染色体0.8×10⁹bp，相当于人类基因组的四分之一(Wang ML，Andrew R.Leitch，Trude Schwarzacher，et al.Construction ofa chromosome-enriched HpaII library from flow-sorted wheat chromosomes[J].Nucl AcidsRes，1992，20：1897-1901)。若每个插入片段为1kb，每条染色体特异性DNA文库包含8×10⁵以上克隆，筛库工作量巨大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，以实现对小麦根尖染色体进行显微切割。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，以普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，在利用SLμCUT系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，成功地对小麦根尖染色体进行了显微切割。

具体包括以下步骤：

(1)染色体标本制备

首先要挑选小麦根尖染色体为制备染色体标本的材料，制备的染色体标本要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时间，以防DNA受损；将目标染色体转移到膜上；

(2)目标染色体的识别

染色体标本制好之后，对目标染色体进行识别，识别方法可以采用分带、核型分析、原位杂交等方法；

(3)染色体(片断)显微切割和分离

借助于SLμ

(Molecular machine industry，MMI)切割系统及系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。

还包括以下步骤：

染色体经过显微切割和分离后进行微克隆库的建立

分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的的研究工作。显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种。

1)酶切直接克隆法

首先将分离出的多个同一目标染色体片段抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库。本发明采用适于对目标染色体进行酶切。

2)PCR介导的微克隆技术

目标染色体经显微切割、分离得到的染色体数量有限，往往通过PCR扩增以得到更多的产物以用于后续研究。常用的PCR方法主要有以下两种：

兼并引物PCR(Degenerate Oligonucleotid Primed-PCR，DOP-PCR，)，DOP-PCR即用一个简单的简并引物，经两次PCR反应来扩增(第一次复性温度低)。利用DOP-PCR技术扩增显微切割的染色体DNA，无需进行染色体DNA的限制性酶切、设计连接接头等步骤，直接以染色体DNA为模板，具有快速、高效的特点。DOP-PCR扩增产物既有高度重复序列，也有低拷贝序列。本发明采用DOP-PCR对目标染色体进行扩增。

连接体-结合体介导的PCR(Linker-adaptor-PCR，LA-PCR)，LA-PCR即将分离的染色体DNA用限制性内切酶进行消化，根据酶切后产生的粘性末端的碱基序列，分别设计一个连接体(linker)和一个结合体(adaptor)，并使linker与adaptor混合后产生与某一内切酶同样的粘性末端。由于粘性末端不受限制，当酶切后的染色体DNA与连接体-结合体混合后，可大大提高连接效率。再用其中的连接体作PCR扩增的引物，由于每个酶切产物都连接一个已知的连接体(引物)，这样就可扩增任一未知DNA片段。在PCR反应前无需分离程序，所构建的染色体区带特异性文库不仅避免了分离等步骤，减少了产生污染的可能，而且由于DNA丢失少而极大提高了文库的完整性。

另外，还包括微克隆的筛选和鉴定

所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定

1)Southern杂交分析

Southern杂交时可用一定的标记物标记基因组DNA，与建立的染色体DNA文库进行杂交，或标记建立的DNA文库中插入片段，用其作为探针与基因组DNA进行杂交。其目的是初步鉴定该文库中插入片段的来源。但是Southern杂交可能存在假阳性，需要进一步验证。

2)原位杂交分析

用得到的染色体DNA文库中插入片段作探针进行原位杂交。其目的是检测插入片段是否源自目的染色体；鉴别该染色体特有的克隆；鉴别与其他染色体共有的克隆。所用探针可用放射性同位素和非放射性标记物如地高辛、生物素等进行标记。

3)PCR扩增方法

PCR扩增时所用DNA模板可以是微分离的染色体DNA，也可以是染色体DNA文库中的插入片段。只要该染色体某一基因DNA两侧序列可知，就可利用PCR鉴别该染色体的特异性。本发明利用定位于不同小麦染色体上的SSR标记进行鉴定。

本发明采用普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，利用“原位”移膜法制备适合在SLμ

激光切割系统进行小麦染色体切割的染色体标本。本发明的方法具有制片简单、快速、方便，制片快速、染色体分散均匀等优点；在利用该系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，优化了切割系统切割小麦根尖细胞染色体的主要技术参数，并成功地对小麦染色体片段、单条染色体、两条/三条染色体进行了显微切割，这为特定小麦染色体、小麦中异源染色体的微切割、微克隆乃至外源染色体携带优良基因的克隆等后续研究提供了参考。

附图说明

图1为“原位”移膜法制得的小麦根尖染色体标本；

图2为染色体显微切割(示激光参数设置不当)a：表示分离之前；b：分离之后；

图3为CCD机相关参数设置；

图4为单步收集示意图；

图5为单条染色体显微切割；a：切割前  b：切割后；

图6为2条染色体显微切割；a：切割前  b：对一条染色体切割  c：对另一条染色体切割；

图7为切割后染色体的PCR扩增产物鉴定。

具体实施方式

1、根尖细胞染色体标本的制备

(1)催根：将小麦烟农15、中国春、小偃麦山农0095、中间偃麦草种子在室温下浸泡至露白，1-4℃冰箱中冰冻24h，然后在25℃条件下培养，根长1.5-2.0cm时取根尖；或在温暖的天气傍晚将田间生长的材料浇水，第二天上午9-10时挖取根尖；

(2)固定与保存：根尖先在冰水中处理24h，再用卡诺氏液于1-4℃条件下固定24h以上后，转入70％酒精保存；

(3)预处理：将根尖细胞从保存液中取出，无菌蒸馏水低渗处理10min；

(4)初步镜检：对根尖细胞分裂相进行初步镜检，挑选大多数处于中期的根尖细胞备用；

(4)酶解：将挑选过的根尖细胞放于2％纤维素酶+2％果胶酶(Sigma公司)混合酶液于37℃下酶解1-1.5h，无菌蒸馏水冲洗10min；

(5)制片：用无菌镊子将根尖细胞捣碎于载玻片(盖玻片亦可)，然后覆膜压片将染色体“原位”转移到分离膜上，再将玻片与膜剥离，70％、100％酒精各脱水3min，最后制成如图1所示的小麦根尖染色体标本。

需要注意的是，制片之前为了清洁和增加分离膜的粘性，可以用紫外光照射，也可以用多聚赖氨酸处理以增加粘性；但是不能采用常规冷冻揭片的方法，因为冷冻揭片特别容易撕烂分离膜。

2 染色体显微切割的有关技术参数设置

(1)普通光源照明强度

设置120V/100W的普通光源照明强度，能够满足所有倍数下对染色体切割的要求，以下有关参数就是在该强度下进行的设置。

(2)紫外激光参数设置

在120V/100W普通光源照明强度下，对紫外激光参数进行了调试。如图2所示，当在100×物镜下进行切割，激光速度偏高(设置不当)，切割速度过快，切割不彻底，需要多次进行切割，影响切割效率；加之紫外激光的热效应，容易导致目标染色体变形，严重者可能造成“焦煳”染色体，影响回收效率，也影响进行下游PCR扩增等工作。

当各种激光参数设置适当时，切割的切口自然圆滑，激光的热效应对目标染色体影响小(图5-b所示)。一般情况下，在不改变激光聚焦的情况下，适当调高激光的能量(如以5-10％的比率递增)，或是降低激光的速度(如以5-10％的比率降低)，均可以提高激光切割效率。经过多次调试和试验，初步确定不同倍数显微镜激光参数设置如下：

表1不同物镜下的紫外激光参数设置一览表

(3)CCD摄像机设定

可以通过软件的Option菜单更改CCD摄像机设定(如图3)。在软件中，可以调整白平衡、曝光时间和增益等参数。具体操作可以根据实际情况加以自主设置，只要达到清晰即可。

(4)激光校正

多次使用后，激光的位置可能会略有偏差。当激光不遵循选定的切割路径，或是位置与指针位置有所偏差时，需要调整和确认激光的位置。应该在每一个物镜倍数下进行染色体切割，都需要进行调整。

(5)切割样本的选择

原则上，使用软件中所列的所有绘图工具均可以完成对样本的切割，但是，在实际操作过程中，建议采用圆形或者矩形等规则工具进行绘图，如果采用用手勾画不规则形状，容易出现如图2所示的情形；另外，要将样本选择的区域与待切割样本保持一定的距离，以免激光在切割过程中由于热效应造成对样本的损伤。

(6)单步收集

在操作

显微切割系统时，可以在全部操作过程中将反应管盖放置在组织上，因为管盖中包含扩散体，可以显著地提高成像质量。原则上，在切割之前，管盖需要放置在染色体标本上(如图4)，激光从下面照射上来，切割染色体和膜。在实际切割过程中，经多次试验，低倍物镜下，管盖可以放在膜上，也可以提起来切割；但是在40×、100×物镜下进行切割，则要求必需提起来切割；切割完毕，把管盖放下进行收集，每次切割之后可以单独收集样本，也可以将几次切割的样本收集在同一个反应管中。

3 染色体显微切割

根据调试好的技术参数，依次打开相应激光器、照明电源、CCD机和CellCUT软件开关，将制备好的染色体标本置于载物台上，以备切割。

(1)小麦根尖细胞单条染色体(片段)的微切割

对小麦的根尖细胞单条染色体进行切割。如在40×物镜下，对图5-a箭头所示的单条染色体进行切割，切割之后放下Eppendorf管管盖进行收集，图5-b表明，该条染色体已经被成功切割并进行了收集。

(2)小麦根尖细胞两条/多条染色体的微切割

对小麦根尖多条染色体进行切割，用同一个Eppendorf管进行收集。如图6-a所示的两条染色体进行切割，首先对其中一条进行了切割和收集(如图6-b所示)，然后对另外一条再行切割，并用同一个管盖进行收集(如图6-c所示)。这表明，同时切割两条相同的或者不同的多条染色单体，用同一个管盖进行收集，不会影响收集效率，还会大大提高工作效率，也能为下一步的PCR扩增提供更多的摸板或者底物。

4 切割染色体的DOP-PCR扩增

(1)扩增前预处理：切割染色体用黏性的Eppendorf管盖进行收集，然后加入20μl×20ng/μl的蛋白酶K处理液(内含用于DOP-PCR的1×Taq DNA聚合酶缓冲液)于0.2mlEppendorf管，1000r/min离心3min，37℃处理4h，70℃灭活20min，-20℃保存备用；

(2)DOP-PCR扩增：进行两轮PCR

第一轮：向含有上述酶解液的Eppendorf管中添加4μl 10×Buffer、3μl Mg²⁺(25mM)、4μl dNTP(2.5mM)、0.4μl Taq酶(5U/μl)、2μl兼并引物(15ng/μl)、ddH₂O配成体积为50μl的反应体系，然后按如下程序进行扩增：94℃预扩增10min；然后94℃1min，30℃1.5miu，72℃3min，其中，30℃变化至72℃需要3min，共计5个循环；接着，94℃1min，57℃1.5miu，72℃1.5min，共计25个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用。

第二轮：取第一轮的PCR扩增产物5μl作为第二次扩增的模板，其他反应条件不变。反应程序：94℃预扩增5min，然后94℃1min，55℃1.5miu，72℃1.5min，共计30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

为避免外源DNA的污染，上述整个单染色体体外扩增过程均在无菌条件下进行，并设立严格不含染色体DNA的阴性(无菌水)对照和以10pg总DNA为模板的阳性对照。

(3)扩增产物的检测

将第二次扩增产物中加入适量溴酚兰(产物/溴酚兰4V/1V)，6％聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳，银染显色，然后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察。具体结果详见图7。

有关试剂的配置方法如下：

(1)蛋白酶K处理液的配置

称取0.3mg蛋白酶K溶入500μl 1Taq DNA聚合酶缓冲液，配成600ng/μl的蛋白酶K溶液，用时稀释至20ng/μl。

(2)兼并引物序列：5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’，由上海生物工程公司(Sangon)合成。

(3)小麦基因组DNA的提取：

1)取5g叶片置液氮中速冻后研成粉末，装入50ml离心管。

2)加入20ml已预热到65℃的提取液(100mM Tris.HCl pH8.5，100mM NaCl，50mM EDTApH8.0，2％SDS)。每管中加入100μl 10mg/ml蛋白酶K，混匀。

3)置65℃水浴中1-2h，不时轻轻倒转离心管以混匀。

4)从水浴中取出离心管，加入20ml酚/氯仿(1∶1)抽提，轻轻混匀20min。

5)3000转/分离心20min，取上清，加入等体积氯仿，轻轻混匀。

6)3000转/分离心20min，取上清，加入0.6体积异丙醇，轻轻混匀，用玻璃钩将DNA缠出，70％酒精冲洗，稍气干，溶于5ml 1×TE。

7)加入10μl 10mg/ml RNA酶，轻轻混匀，置37℃1h。

8)加入5ml酚/氯仿抽提，3000转/分离心15min，取上清。

9)加入等体积氯仿抽提，3000转/分离心15min，取上清。

10)加入1/10体积3M醋酸钠，混匀，然后加入2倍体积冷乙醇，混匀。

11)用玻璃钩钩出DNA，70％酒精冲洗，置于1.5ml离心管，气干，溶于1×TE，测DNA浓度经琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量。

(4)硝酸银染色步骤

1)电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3min。

2)用去离子水快速冲洗2-3次，每次30-40S。

3)于银染液中染色5-7min。

4)用水快速冲洗(10S)，不超过20S。

5)放入显影液中显影至第一条带出现(一般以泳道出现为准)。

6)最后放入停影液中停影。

所用试剂的配制

6％聚丙烯酰胺凝胶的配方(一块板用量30ml)

其中，后两者是催化剂，用量可随温度升高酌情减少。

固定液：40ml乙醇+360ml水+2ml乙酸

银染液：0.6克AgNO3+300ml水即0.2％AgNO3

显影液：3％NaOH(12gNaOH+400ml水+2ml甲醛)，甲醛用时现用现加

停影液：10％乙酸(30ml乙酸+270ml水)

其中，固定液和银染液可以重复利用，前者2次，后者可用3次。

电泳电压一般掌握在低于120V。

Claims (9)

1.一种利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：以普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，利用SLμCUT系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，对小麦根尖染色体进行了显微切割。

2.根据权利要求1所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：所述的普通小麦为烟农15或中国春。

3.根据权利要求1所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)染色体标本制备

首先要挑选小麦根尖染色体为制备染色体标本的材料，将目标染色体转移到膜上；

(2)目标染色体的识别

染色体标本制好之后，对目标染色体进行识别；

(3)染色体(片断)显微切割和分离

借助于SLμ

(Molecular machine industry，MMI)切割系统及系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。

4.根据权利要求3所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：步骤(2)中的识别方法可以采用分带、核型分析或原位杂交。

5.根据权利要求3所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：在染色体经过显微切割和分离后进行微克隆库的建立。

6.根据权利要求5所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆方法。

7.根据权利要求6所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：酶切直接克隆法为：首先将分离出的多个同一目标染色体片段抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库。

8.根据权利要求3所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：还包括微克隆的筛选和鉴定步骤。

9.根据权利要求8所述的利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于：所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定：

1)Southern杂交分析

Southern杂交时可用一定的标记物标记基因组DNA，与建立的染色体DNA文库进行杂交，或标记建立的DNA文库中插入片段，用其作为探针与基因组DNA进行杂交；

2)原位杂交分析

用得到的染色体DNA文库中插入片段作探针进行原位杂交；

3)PCR扩增方法

PCR扩增时所用DNA模板可以是微分离的染色体DNA，也可以是染色体DNA文库中的插入片段，利用定位于不同小麦染色体上的SSR标记进行鉴定。

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