CN102676499A

CN102676499A - 适于SLμCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法

Info

Publication number: CN102676499A
Application number: CN2012100114910A
Authority: CN
Inventors: 王黎明; 李兴锋; 王春平; 董普辉; 袁瑛; 袁建国; 高居荣; 王洪刚
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-15
Filing date: 2012-01-15
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及一种适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，包括以下步骤：(1)染色体标本的制备，得到目标染色体；(2)目标染色体(片断)显微切割和分离，将一滴无水乙醇滴于处理好的带有目标染色体的分离膜上，覆盖一张干净的载玻片，置于载物台以备切割；切割时先在低倍镜下寻找分散好的目标染色体，然后转于高倍镜下进行切割，分离后的染色体被带有粘性的Eppendorf管收集。本发明的方法具有取材简单、制片快速、识别容易、制片成本低廉、大大减少了酸碱等对染色体的破坏等特点；利用该系统对杂种F₁ PMC MI中的外源染色体(单价体)进行了切割与收集，为小麦异代换系中外源染色体的微切割提供了参考，为染色体文库的构建等后续研究工作奠定了基础。

Description

适于SLμCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法

技术领域

适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备方法与微切割，属于分子细胞遗传学领域。

背景技术

染色体微切割、微分离与微克隆(chromosome micro-dissection and micro-cloning)技术是由Scalenghe等(Scalenghe F.，E.Turco，J.E.Edstrom，et al.Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophila melanogaster polytene chromosome[J].Chromosoma，1981，82：205-216)创立的一项分子细胞遗传学新技术。该技术首先对果蝇染色体进行了切割，成功获得了80个克隆，随后用于鼠和人类(Rohme Dan，Howard Fox，Bernhard Herrmann，et al.Molecular clones of the mouse complex derived from microdissected metaphase chromosomes[J].Cell，1984，36：783-788.)。随着PCR技术的发展，微切割和微克隆技术得到了较大发展(Ludecke HJ，Gabriele Senger，Use Claussen，et al.Cloning defined regions of human genome by microdissection of banded chromosomes and enzymatic amplification[J].Nature，1989，338：348-350)。自Sandery等(Sandery M J，et al.Isolation of sequence common to A and B chromosomes of rye (Secale cereal L.)by micro cloning[J].Plant Molecular Biology Reporter，1991，9(1)：21-30)利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物染色体文库的构建、特异探针筛选、抗性基因的克隆以及遗传与进化研究上得到了较为广泛应用，但是，相比较而言，植物在这方面开展的研究仍然滞后于动物和人类。目前，植物染色体显微切割技术主要存在以下几个方面的困难：

(1)植物细胞壁的存在、同步化的困难，阻碍了良好分散染色体标本的制备。背景不干净，影响了切割效率。可以说，染色体标本的制备是影响染色体切割最基础的技术之一。

(2)植物基因组倍性多样，染色体结构变异大，基因排列顺序不够保守；植物染色体DNA含量高、蛋白质含量低，绝大多数染色体不能象脊椎动物染色体显示G、R或Q带带纹而不影响DNA序列(Fukui k.，M.Minezawa，Y.Kamisugi，et al.Microdissection of plant chromosome by argon-ion laser beam[J].Theor Appl Genet.，1992，84：787-791)；通行的C带，对染色体DNA破坏太大，不利于构建完整的DNA文库；而有些植物染色体不仅小，而且大小差异不明显，带纹相似，难于精确识别染色体及其细微结构。所有这些都加大了分析的复杂性。

(3)植物染色体DNA高度重复序列多，如小麦、大麦、黑麦和燕麦核基因组有约80％的重复序列(Albani Diego，Marie-Jose Cote，Ken C，et al.PCR ampl ification of microdissected wheat chromosome arms in a“single tube”reaction[J].Plant J，1993，4：899-903)。麦类作物DNA含量高，如六倍体燕麦(2n＝6x＝42)DNA含量为13.2～14.3pg，约1.3～1.4×10¹⁰bp。小麦C值为1.7×10⁹bp，平均每条染色体0.8×10⁹bp，相当于人类基因组的四分之一(Wang ML，Andrew R.Leitch，Trude Schwarzacher，et al.Construction of a chromosome-enriched HpaII library from flow-sorted wheat chromosomes[J].Nucl Acids Res，1992，20：1897-1901)。若每个插入片段为1kb，每条染色体特异性DNA文库包含8×10⁵以上克隆，筛库工作量巨大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，包括以下步骤：

(1)染色体标本的制备，得到目标染色体；

(2)目标染色体(片断)显微切割和分离，将一滴无水乙醇滴于处理好的带有目标染色体的分离膜上，覆盖一张干净的载玻片，置于载物台以备切割。切割时先在低倍镜下寻找分散好的目标染色体，然后转于高倍镜(40×或100×对小麦染色体切割在40×即可)下，进行切割，分离后的染色体被带有粘性的Eppendorf管收集。

步骤(1)所述染色体标本的制备包括以下步骤：

1)取材与固定：选取山农0095/烟农15杂种F₁大多数处于减数分裂中期I花粉母细胞，放于卡诺氏液固定3-24h，后转入70％酒精保存；

2)预处理：将花粉母细胞从保存液中取出，蒸馏水低渗处理10min；

3)酶解：用混合酶液在37℃的温度下酶解1h，蒸馏水冲洗10min；

4)制片：将花粉母细胞用无菌镊子捣碎于载玻片(盖玻片亦可)，然后覆膜压片将染色体“原位”转移到分离膜上，再将玻片与膜剥离，70％、100％酒精各脱水3min，最后制成染色体标本。

在步骤4)制片之前为了清洁和增加分离膜的粘性，可以用紫外光照射，也可以用多聚赖氨酸处理以增加粘性；但是不能采用常规冷冻揭片的方法，因为冷冻揭片特别容易撕烂分离膜。

步骤1)所述的卡诺氏液由酒精和乙酸组成，两者的体积比为酒精∶乙酸＝3∶1。

步骤1)所述的混合酶液由2％纤维素酶和2％果胶酶(Sigma公司)混合而成，两者的重量比为纤维素酶∶果胶酶＝1∶1。

本发明制备的适合于激光切割系统(Molecular machine industry，MMI)的小偃麦异代换系中含有外源染色体的标本，并利用该系统对其中的外源染色体进行显微切割、分离。主要包括目标染色体标本的制备、目标染色体的识别和微切割。

(1)染色体标本制备

首先要挑选带有目标染色体的适宜的材料，一般有根尖和花粉母细胞两种类型。要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时间，以防DNA受损。采用染色体显微切割仪进行激光切割时必须采用合适方法将目标染色体转移到膜上。本发明主要是采用小麦异代换系与其亲本杂种F1花粉母细胞为材料，利用“原位”移膜法制备适合在

激光切割系统进行小麦中外源染色体切割的染色体标本。具有制片简单、快速、方便等优点。

(2)目标染色体的识别

染色体标本制好之后，必须采用合适方法对目标染色体进行识别，常常可以采用分带、核型分析、原位杂交等方法。本发明，主要是根据细胞遗传学理论，判定染色体标本中的一个单价体即为外源染色体，可以非常快速、明显地识别出目标染色体。

(3)目标染色体(片断)显微切割和分离

激光灼烧法也叫激光切割法，就是指借助于激光对目标染色体进行灼烧达到显微切割、分离的目的。借助于

(Molecular machine industry，MMI)切割系统及系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。本发明主要就是利用

紫外激光切割系统进行目标染色体的激光灼烧。

本发明的方法选用小麦-中间偃麦草二体异代换系山农0095与普通小麦杂种F₁花粉母细胞为材料，建立了花粉母细胞染色体标本制备的“原位法”，该法具有取材简单、制片快速、识别容易、制片成本低廉、大大减少了酸碱等对染色体的破坏等特点；利用该系统对杂种F₁ PMC MI中的外源染色体(单价体)进行了切割与收集，为小麦异代换系中外源染色体的切割提供了参考，为染色体文库的构建等后续研究工作奠定了基础。

具体实施方式

本实施例的方法包括以下步骤：

1、花粉母细胞染色体标本的制备

(1)取材与固定：选取山农0095/烟农15杂种F₁大多数处于减数分裂中期I花粉母细胞，放于卡诺氏液(酒精∶乙酸＝3∶1)固定3-24h，后转入70％酒精保存；

(2)预处理：将花粉母细胞从保存液中取出，蒸馏水低渗处理10min；

(3)酶解：用2％纤维素酶+2％果胶酶(Sigma公司)混合酶液于37℃下酶解1h，蒸馏水冲洗10min；

(4)制片：将花粉母细胞用无菌镊子捣碎于载玻片(盖玻片亦可)，然后覆膜压片将染色体“原位”转移到分离膜上，再将玻片与膜剥离，70％、100％酒精各脱水3min，最后制成如图1所示的染色体标本，图2-a示真实染色体标本。

需要注意的是，制片之前为了清洁和增加分离膜的粘性，可以用紫外光照射，也可以用多聚赖氨酸处理以增加粘性；但是不能采用常规冷冻揭片的方法，因为冷冻揭片特别容易撕烂分离膜。

2、染色体微切割

依次打开相应激光器、照明电源、CCD机和CellCUT软件开关，将制备好的染色体标本置于载物台上，以备进行染色体微切割。

(1)山农0095/烟农15杂种F₁花粉母细胞染色体的显微切割

将一滴无水乙醇滴于处理好的带有目标染色体的分离膜上，覆盖一张干净的载玻片，置于载物台以备切割。切割时先在低倍镜下寻找分散好的目标染色体，然后转于高倍镜(40×或100×对小麦染色体切割在40×即可)下，进行切割。

如图2-a箭头所示，是山农0095与烟农15杂种F₁ PMC MI的待要切割的两个单价体，先选择其中一个单价体进行切割；图2-b所示正在进行切割，切割完毕，放下Eppendorf管盖进行收集，然后再提起管盖，如图2-c所示，被切割的单价体已经被带有粘性的 Eppendorf管盖成功收集。为了验证被切割的单价体是否粘在管盖上，可稍微转动载物台选择一个空白区域，然后把管盖放下，如图2-d所示，在分离膜的空白区域发现了被切割的单价体，这进一步表明，染色体已经被成功切割、分离，切割、分离后的染色体被带有粘性的Eppendorf管收集。

Claims

1.一种适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)染色体标本的制备，得到目标染色体；

(2)目标染色体(片断)显微切割和分离，将一滴无水乙醇滴于处理好的带有目标染色体的分离膜上，覆盖一张干净的载玻片，置于载物台以备切割；切割时先在低倍镜下寻找分散好的目标染色体，然后转于高倍镜、下，进行切割，分离后的染色体被带有粘性的Eppendorf管收集。

2.根据权利要求1所述的适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，其特征在于：步骤(1)所述染色体标本的制备包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，其特征在于：在步骤4)制片之前分离膜可以用紫外光照射或用多聚赖氨酸处理以增加粘性。

4.根据权利要求2所述的适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，其特征在于：步骤1)所述的卡诺氏液由酒精和乙酸组成，两者的体积比为酒精∶乙酸＝3∶1。

5.根据权利要求2所述的适于SL μCUT系统的小麦异代换系染色体标本制备及微切割方法，其特征在于：步骤1)所述的混合酶液由2％纤维素酶和2％果胶酶(Sigma公司)混合而成，两者的重量比为纤维素酶∶果胶酶＝1∶1。