CN102665738A - 用于预防流感感染的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明阐明了针对流感感染的预防效果能够获得自丙酸细菌培养物。本发明的组合物包含丙酸细菌培养物，并且增强在接种流感疫苗的动物中中和抗体的诱导。构成本发明组合物的组分容许长期摄入，并且由于其作为饮食的悠久历史而具有良好的安全性和味道特性。此外，本发明的组合物还可包含乳发酵组分和寡糖。还可期待由施用该组合物带来的肠功能调节作用。

Description

用于预防流感感染的组合物

技术领域

本发明涉及包含丙酸细菌培养物的组合物。或者，本发明涉及用于预防流感感染的组合物或针对流感感染的预防方法。

背景技术

流感是一种高传染性的感染，其中流感病毒为病原体。流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)的负链单链RNA病毒。正粘病毒科由单独一个流感病毒属组成(一属一科)。根据其核内蛋白抗原性上的差异，存在甲型至丙型流感病毒三个亚型。与作为宿主只感染人的乙型和丙型相对，甲型流感病毒能够感染广泛多样的生物，如哺乳动物和禽类。因此，其通过在禽类和哺乳动物体内经历基因杂交能够容易地形成具有不同病原性和抗原性的突变体病毒。

例如，猪流感是近年来的全球性流行病，其是由甲型流感病毒亚型H1N1感染发展出的流感。认为猪流感病毒会感染人，导致大流行病。另外，预计会成为大流行病的高毒力禽流感当该高毒力禽流感病毒获得对人的感染性时可导致大流行病(Sugawara，T.等，WHO)。

用于抑制流感病毒的治疗剂现在已有市售。据称，当在感染后的早期恰当施用市售的流感治疗剂时，能够期望充分的治疗效果。然而，流感仍然是一种危险的感染，尤其是在高风险群体包括老人、儿童、和患有慢性病的人中。另外，已经报道对治疗剂有抗性的病毒的出现。

即使在有发达的治疗剂的现今，接种流感疫苗来防止流感加重也是重要的。使用流感疫苗免疫可诱导出针对流感病毒的中和抗体，后者能够防止感染之后的病毒生长并防止感染的扩散(C，Avendano等和Zhu Q等)。当所述病毒与作为疫苗给予的病毒具有相似的抗原性时，据称防止加重的作用会很高。据报道当与在健康成人中通过疫苗接种诱导出中和抗体的比例(70％至90％)相比，在老人中诱导的比例较低(17％至53％)(Goodwin K，等)。老人中的免疫系统减弱，并且可能在感染发生时导致加重和死亡。鉴于此，提高老人当中的中和抗体的诱导率是尤为重要的。

现有技术文件

[专利文献]

[专利文献1]WO 2001/028547

[专利文献2]WO 2004/085364

[专利文献3]WO 2007/023935

[专利文献4]WO 2005/094850

[非专利文献1]Sugawara T.等，Kansensho-shi(The Journal of Infection)，2008，82：427-433

[非专利文献2]World Health Organization：Department of CommunicableDisease Surveillance and Response Global Influenza Programmed，2005.

[非专利文献3]C，Avendano等，J Parenter Enteral Nutr.2004；28：348-54.

[非专利文献4]Zhu Q，等，Biochem Biophys Res Commun.2005；329：87-94.

[非专利文献5]Goodwin K，等，Vaccine.2006Feb 20；24(8)：1159-69.

发明内容

[本发明解决的技术问题]

本发明的目的是提供包含丙酸细菌培养物的组合物。具体而言，本发明的目的是提供针对流感病毒感染具有预防效果的组合物。本发明的另一目的是提供具有肠功能调节作用的组合物。

[解决技术问题的手段]

针对病毒感染的流感疫苗的预防效果主要依赖于对病毒中和抗体的诱导。因此，在疫苗接种之后刺激中和抗体的诱导被认为有效增强疫苗的预防效果。或者说，在病毒感染过程中，在患者体内作为正常免疫应答而诱导的病毒中和抗体是患者重要的生物防御机制。本发明人对于能够增强因流感疫苗和病毒感染引起的对病毒中和抗体的诱导的组分进行了大量研究。结果是，本发明人揭示出在流感疫苗接种时的病毒中和抗体诱导在施用特定微生物培养物的动物中增强，并由此完成了本发明。具体而言，本发明涉及以下组合物及其用途：

[1].一种用于流感感染的预防组合物，其包含丙酸细菌培养物。

[2].[1]的组合物，其中所述丙酸细菌是费氏丙酸杆菌。

[3].[1]的组合物，其附加地还包含乳发酵组分以及/或寡糖。

[4].[3]的组合物，其中所述乳发酵组分是通过使用属于乳杆菌属(genusLactobacillus)的乳酸细菌和属于链球菌属(genus Streptococcus)的乳酸细菌之任一或二者将乳发酵而产生的乳或其混合物。

[5].[3]的组合物，其中所述乳发酵组分是非成熟乳酪。

[6].[3]的组合物，其中构成前述寡糖的糖中的至少一种是半乳糖。

[7].[3]的组合物，其中所述组合物包含丙酸细菌培养物和乳发酵组分，并且二者均已经过灭菌。

[8].[1]的组合物，所述组合物用于经肠施用给接受流感疫苗接种的动物。

[9].[3]的组合物，其包含以下营养素：

丙酸细菌培养物；

乳发酵组分；

寡糖；

蛋白质；

糖类；

脂质；和

膳食纤维。

[10].[9]的组合物，其附加地还包含至少一种选自下组的营养素：维生素、矿物质、有机酸和有机碱。

[11].一种用于在接种有流感疫苗的动物中促进流感病毒中和抗体的诱导的作用剂，其包含丙酸细菌培养物。

[12].一种流感感染的预防方法，其包括以下步骤：

(1)向动物施用丙酸细菌培养物；和

(2)向动物接种流感疫苗。

[13].[12]中所述的流感感染的预防方法，其中步骤(1)在步骤(2)之前、在步骤(2)之后或与步骤(2)同时进行至少一次。

[14].[12]中所述的流感感染的预防方法，其中在步骤(1)中将所述丙酸细菌培养物与乳发酵组分以及/或寡糖一起施用。

[15].一种包含以下组分的组合物：

(a)寡糖；

(b)乳发酵组分；和

(c)丙酸细菌培养物。

[16].[15]的组合物，其中构成前述寡糖的糖中的至少一种是半乳糖。

[17].[15]的组合物，所述组合物是用于调节肠功能的组合物。

[发明效果]

本发明的组合物增强流感疫苗在诱导中和抗体方面的效果。本发明的组合物可以通过混合现已作为流食施用给人体的组分等来制备。因此，本发明的组合物的高安全性已得保障。相应地，本发明的组合物不仅可以在接种时同时施用，还可以在接种的时间前后连续施用。就本发明组合物的连续施用而言，能够期待促进中和抗体诱导的持续作用。

通常将佐剂混入疫苗来增强针对病毒疫苗如流感病毒的免疫应答。无需赘言，对混入疫苗的佐剂要求有高水平的安全性。因此，开发新佐剂需要谨慎的安全性检查。与之相对，由于所有构成本发明组合物的各组分都是已经作为食品消费的，证明即使在将它们连续经肠施用给人体时也没有风险。另外，本发明的组合物可以与已知佐剂组合进行经肠施用。即，本发明不仅在安全性方面，在提供作为增强针对疫苗的免疫应答的手段的新选择方面亦有重大意义。

在优选的实施方案中，本发明的组合物与已经广泛作为流食或食品消费的组分组合起来提供。因此，连续消费作为流食的本发明组合物能够产生针对流感病毒诱导中和抗体的能力持续升高的状态。流感病毒感染对于流感重症化的风险高的人群(如老人或住院患者)是严重的问题。然而，如果作为流食预防性地施用本发明的组合物，能够提高整个群体预防感染的能力。

附图简述

图1显示实验方案(每种流食的施用期间，疫苗接种和抗体测量的时间点，和经肠菌群分析的时间点)。

图2呈现显示施用乳发酵组分和丙酸细菌培养物对疫苗接种之后中和抗体效价的作用的图表。在该图中，纵轴显示抗体效价的对数值(log10)，而横轴显示疫苗接种之后的经过时间(周)。对照组和试验组这两组之间的统计学显著性通过Mann-Whitney U检验来分析，而疫苗接种后第2周和第6周之间的统计学显著性通过Wilcoxon符号秩和检验来分析。记号*指示第6周和第2周之间在与感染相关的中和抗体效价方面的显著差异(p＜0.05)。A：针对H1N1的中和抗体效价；B：针对H3N2的中和抗体效价；和C：针对B1抗原的中和抗体效价。

图3呈现显示检查过程中粪便得分的变化的图表。在该图中，纵轴显示Bristol粪便分级(1-7)，而横轴显示每种流食的施用期间(周)。对照组和试验组这两组之间的统计学显著性通过Mann-Whitney U检验来分析。对于每周检查前和检查后之间的统计学显著差异通过Wilcoxon符号秩和检验来分析。另外，记号*指示对照组和试验组之间的显著差异(p＜0.05)，而记号“a”指示与分组时(-4周)相比存在显著差异(p＜0.05)。

图4呈现显示乳发酵组分和丙酸细菌培养物对流感疫苗接种时血液细胞因子浓度的作用。在该图的纵轴上，A、B和C分别指示IL-7浓度(pg/mL)、IL-17浓度(pg/mL)和TGF-β1浓度(ng/mL)。横轴显示当定义分组的时间为-4周时在采血时所经过的时间(周)。对照组和试验组这两组之间的统计学显著性通过Student’s t检验(均匀分布)或Welch检验(不均匀分布)来分析。对于每周在检查之前和检查过程中的统计学显著性通过相应的t检验来分析。

发明的实施方式

本发明提供用于预防流感感染的组合物或用于流感感染的预防剂，其包含丙酸细菌培养物。

本发明的预防剂或预防组合物包含丙酸细菌培养物。“丙酸细菌”指属于丙酸杆菌属(genus Propionibacterium)的革兰氏阳性厌氧细菌，其是以无氧方式从糖类产生丙酸的微生物。具体而言，以下微生物的培养物可以添加至本发明的组合物。

弗氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)；

特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii(P.thoenii))；

产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici(P.acidipropionici))；

詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii(P.jensenii))；等。

这些丙酸细菌是用于乳酪生产的微生物。此外，以下微生物也称作丙酸细菌。

贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum(P.avidum))；

疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes(P.acnes))；

嗜淋巴丙酸杆菌(Propionibacterium lymphophilum(P.lymphophilum))；或

颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosam(P.granulosam))。

用于从自然界或发酵乳分离这些微生物的方法是已知的。可以使用在瑞士乳酪(Swiss cheese)生产中使用的丙酸细菌等。本发明中的丙酸细菌培养物指其中在合适培养条件下培养丙酸细菌如上述那些的材料。用于培养丙酸细菌的方法是已知的。在培养丙酸细菌时，可以采用WO 03/016544 A1等文中描述的条件。例如，作为用于培养丙酸细菌的培养基，向粉状脱脂乳添加啤酒酵母提取物等而得到的组合物或通过蛋白水解处理粉状脱脂乳而产生的物质是已知的。丙酸细菌的培养物能够通过将弗氏丙酸杆菌接种至合适的培养基中，并在容许丙酸细菌增殖的条件下培养它们来获得。

或者，作为将丙酸细菌培养至高浓度的方法，有在通过将矿物质和单糖添加至乳清蛋白质浓缩物(WPC)或其酶降解产物而制造的培养基中培养丙酸细菌的方法(日本专利申请公开号(JP-A)H10-304871(未经审查的、公开的日本专利申请))。例如，可以通过在含有乳清蛋白质浓缩物的培养基中培养弗氏丙酸杆菌而获得的培养物是本发明中优选的丙酸细菌培养物。或者，作为培养丙酸细菌的高效培养方法，有在循环培养溶液的同时在不同发酵罐中培养双歧杆菌和丙酸细菌的方法(JP-A(Kokai)H08-66178)。能够通过这些培养方法获得的丙酸细菌培养物可以混合入本发明的组合物。

例如，通过添加经加工乳清作为培养基的主要成分，能够以高密度培养丙酸细菌。以下成分可以作为经加工乳清的实例展示：

乳清粉；和

乳清或乳清粉经蛋白酶处理的产物。

除了乳清蛋白质之外，可向所述培养基添加矿物质和单糖的混合物。为了降低培养基中的糖浓度，可以添加乳清蛋白质浓缩物(下文可能将其称作“WPC”)作为乳清蛋白质源。WPC可通过透析处理乳清降低乳糖含量而获得。乳清蛋白质浓缩物通过进一步以高纯度分离蛋白质组分可以制成乳清蛋白质分离物(下文可能将其称作“WPI”)。通过向培养基中添加这些组分和单独添加适量的糖和缺乏的矿物质，培养基组合物可以用于培养丙酸细菌。

乳清是在从牛乳去除了例如脂肪、酪蛋白、脂溶性微生素等后剩余的水溶性组分。乳清通常指乳酪乳清和凝乳乳清(rennet whey)(或者也称作甜乳清)，其可以作为产生天然乳酪或凝乳酶凝乳酪时的副产品获得；或指酪蛋白乳清或夸克乳清(quark whey)(或者也称作酸乳清)，其在从脱脂乳产生酸性酪蛋白或夸克(quark)时获得。乳清的主要成分是蛋白质(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等)、乳糖、水溶性维生素和盐类(矿物质组分)，并且其各自的特征已经在作为牛乳组分而非作为乳清组分的研究中得到了阐释。

“乳清相关产品”的实例包括通过浓缩乳清产生的浓缩乳清；通过干燥乳清产生的乳清粉；通过使用超滤(UF)法等浓缩乳清的主要蛋白、然后进行干燥处理而产生的乳清蛋白质浓缩物(下文也称作“WPC”)；通过使用微滤(MF)法或离心法从乳清去除脂肪、继之以使用UF法浓缩和干燥处理而产生的脱脂WPC(低脂、高蛋白)；通过对乳清的主要蛋白质通过离子交换树脂法或凝胶过滤法进行选择性分级处理、继之以干燥处理而产生的蛋白质分离物(下文中也称作“WPI”)；通过使用纳滤(nanofiltration；NF)法和电透析法进行脱盐处理、继之以干燥处理而产生的脱盐乳清；和通过对源自乳清的矿物质组分进行沉淀处理、然后进行通过离心法等的浓缩处理而产生的矿物质浓缩乳清。其中，将含有干重15％至80％(按固形物含量)乳蛋白的WPC定义为蛋白浓缩乳清粉并在1998年3月30日根据关于乳的省令的部分修订版(partial revision of the ministerial ordinance on milk)归类为乳制品(浓缩乳清、乳清粉、WPC和乳清蛋白质浓缩粉，只要其经历了在关于乳的省令中指明的生产步骤，而与是否存在脱盐步骤无关)。

乳清蛋白质浓缩物(WPC)是通过使用超滤(UF)法等浓缩乳清的主要蛋白、然后进行干燥处理而获得的材料。一般来说，其是固形物含量的约25％或更多为乳清蛋白质的材料的通称。其能够通过减少乳清中的乳糖和盐类以使相对乳清蛋白质含量提高至固形物含量的约25％至80％来获得。具体而言，将以干重的15％至80％含有乳蛋白的WPC根据关于乳的省令定义为蛋白浓缩乳清粉。

用于产生乳清蛋白质浓缩物(WPC)的标准方法如下所述：

(1)对乳清进行膜分离然后进行浓缩的步骤；或

(2)对乳清进行膜分离、然后进行浓缩和干燥的步骤。

常用设备和方法可用于所述浓缩处理，例如，可以使用在减压下加热的方法，使用真空蒸发器、真空釜、升膜管式浓缩器、降膜管式浓缩器、板型浓缩器等。另外，常用设备和方法也可用于所述干燥处理，例如，可以使用喷雾干燥法、转鼓干燥法、冷冻干燥法、真空(降压)干燥法。

乳清蛋白质分离物(WPI)是能够通过用离子交换树脂法或电透析法来浓缩乳清的主要蛋白、然后进行干燥而获得的材料。一般来说，WPI是其中固形物含量的约85％至95％为乳清蛋白质的材料的通称。其可以通过减少乳清中的乳糖、盐类等以使相对乳清蛋白质含量提高至固形物含量的约90％(85％至95％)来获得。

用于生产乳清蛋白质分离物(WPI)的标准方法如下所述：

(1)对乳清进行膜分离、离子交换树脂处理或电透析处理、然后进行浓缩的步骤；或

(2)对乳清进行膜分离、离子交换树脂处理或电透析处理、然后进行浓缩和干燥的步骤。

常用的设备和方法可用于所述浓缩处理，例如，可以使用在减压下加热的方法，使用真空蒸发器、真空釜、升膜管式浓缩器、降膜管式浓缩器、板型浓缩器等。另外，常用设备和方法也可用于所述干燥处理，例如，可以使用喷雾干燥法、转鼓干燥法、冷冻干燥法、真空(减压)干燥法。

在本发明中，以下组合物可以例示为用于培养丙酸细菌的优选培养基组合物。下文所示的数值均为重量比(w/w％)。在下文中，当所述组合物以百分比表示时，将使用重量比(w/w％)，除非另行说明。

蛋白质含量：1％至5％，优选1.5％至4.0％

糖类含量：1％至4％，优选1.5％至3.0％

为了获得这种含量，调整添加的乳清粉、乳清蛋白质或其经蛋白酶处理的产物的量。此外，通过对乳糖进行乳糖酶处理获得的单糖或葡萄糖，而非乳糖，是优选的糖类。

为了降低培养基的成本和获得适合于作为食物消费的培养物，经乳糖酶处理的乳清矿物质溶液可以用作糖类和矿物质的来源。具体而言，WPC可用作蛋白质源，而乳清矿物质可以用作糖类和矿物质的来源。与使用乳清粉作为培养基中的成分时相比，通过使用WPC和乳清矿物质的最优比例混合物作为培养基的成分，可以以更高的浓度培养丙酸细菌。制备用于培养丙酸细菌的培养基的详细方法会在下文描述。

WPC(牛)在被还原后，用蛋白酶处理以降解蛋白质。所述蛋白酶是源自酒曲霉(曲霉(aspergillus))的内切型和外切型蛋白酶，并且使用的量是待降解蛋白质的量的3％。所述反应在50℃和pH 7.0进行，并且持续搅拌三至五个小时直至观察不到pH的降低。将乳清矿物质用乳糖酶处理以降解乳糖。使用的乳糖酶的量是待降解的糖类的量的2％至8％，所述反应在50℃至60℃(55℃为优选)和pH 5至6进行，并且持续搅拌直至所述蛋白质完全降解。

接下来，将所述两种溶液混合，优选使得作为最终培养物浓度，所述蛋白浓度变为1％至5％(优选1.5％至4.0％)且所述糖类浓度变为1％至4％(优选1.5％至3.0％)。最后，将在培养丙酸细菌时常规使用的组分如酵母提取物、硫酸钠、天冬酰胺等添加至所述培养基，然后将pH调节至5至8(优选5.5至7.5)以完成培养基制备。培养丙酸细菌的步骤将如下所述相应地进行。

具体而言，培养基温度设定在20℃至40℃，并且接种起子(starter)使得培养开始后即刻的活细胞数为10⁷-10⁸cfu/mL。然后将细胞培养3至4天。使用碳酸钾水溶液将pH保持在5.5至7.5。在培养过程中可以额外补充葡萄糖。这种方式获得的培养物中丙酸细菌的量达到常规培养物中的量的约五倍。

如上所述的培养条件是优选的，尤其对于培养用于乳酪的丙酸细菌。除了弗氏丙酸杆菌，产丙酸丙酸杆菌、詹氏丙酸杆菌、特氏丙酸杆菌等可以用作用于乳酪的丙酸细菌。更具体而言，能够作为丙酸细菌产生以下细菌菌株的培养物可以用于本发明中。

弗氏丙酸杆菌ATCC 6207

弗氏丙酸杆菌ATCC 8262

弗氏丙酸杆菌IFO 12424

弗氏丙酸杆菌IFO 12426

弗氏丙酸杆菌IFO 12391

弗氏丙酸杆菌ET-3(FERM BP-8115)

这些丙酸细菌可以单独培养或通过混合多种细菌菌株来培养。或者，所述多种微生物可以独立培养，然后可以混合获得的培养物。这种方式获得的培养物可以照原样直接提供用于进食和饮用。此外，可以将其粉末化或进行液化处理以产生功能性成分，然后加工成容易操作的形式。即，通过培养上述丙酸细菌获得的培养物可以直接或在加工后混入本发明的组合物。

此外，本领域技术人员能够恰当地调节培养基组成和培养条件以进一步优化这些已知方法。例如，除了酪蛋白、WPC等，可以添加多种氨基酸及其盐作为氮源，可以提高丙酸细菌的增殖能力和它们针对流感感染的预防效果。不仅是培养基组分，也可以调节培养条件以供优化。培养条件包括培养气氛的氧浓度、温度、压力等。

只要本发明的丙酸细菌培养物的级分保持其针对流感病毒感染的预防效果，就可以使用。因此，丙酸细菌培养物包括，例如，丙酸细菌培养物本身、培养物上清液、细菌细胞、其提取物、其干粉或其稀释物。此处，“丙酸细菌培养物本身”意指所述丙酸细菌和培养基组分处于混合状态。丙酸细菌在培养基组分中的分散状态可以是任何状况。即，丙酸细菌在所述培养基组分中可以是分散的或沉淀的。另一方面，“培养物上清液”通常指从所述“丙酸细菌培养物本身”通过过滤、离心等去除丙酸细菌的细菌细胞的状况。此外，“细菌细胞”指从所述“丙酸细菌培养物本身”分离的丙酸细菌。培养基组分和丙酸细菌细胞的不完全分离通常是可以接受的。因此，例如，培养基组分对从所述培养物分离的丙酸细菌细胞的污染是可以接受的。

例如，当所述丙酸细菌培养物的某个级分的促进流感疫苗接种之后的中和抗体诱导的效果与同一丙酸细菌培养物相比(分级之前)例如是30％或更高，优选50％或更高，或更优选70％或更高时，则可以说保持了所述培养物针对流感病毒感染的预防效果。

丙酸细菌培养物可以在培养之后灭菌并与本发明的组合物混合。或者，可以将已经与乳发酵组分混合的组合物灭菌。例如，如关于牛乳的省令所规定的，通常对牛乳进行以下加热灭菌：

低温保持巴氏消毒；

高温保持巴氏消毒；

高温短时间巴氏消毒；或

超高温瞬时巴氏消毒(ultrahigh-temperature flash pasteurization)。

这些杀菌方法或灭菌方法可以应用于本发明的丙酸细菌培养物或应用于包含它们的组合物。杀菌处理可以分批次单位进行，或者可以连续进行。处理温度和处理时间可能依赖于杀菌方法而不同，但是优选地，其依赖于上述巴氏消毒法选自50℃至200℃和0.1秒至1小时的范围。在对所述丙酸细菌培养物进行巴氏消毒时，期望的是将溶液中溶解氧量保持在降低的状态。相应地，优选在加热灭菌过程中保持连续的惰性气体气氛。惰性气体的实例包括氮气、氩气和二氧化碳气体。在它们之中，氮气是优选的惰性气体，因为其大量存在于空气中。它的成本相对较低且其安全性是确定的。另外，它不影响食品和饮料的味道和质量。本发明人确认了丙酸细菌培养物在灭菌之后保有其对于流感的预防效果。

在本发明中，所述丙酸细菌培养物针对流感感染的预防效果在灭菌之后得到保持。概括而言，乳酸细菌对于宿主的作用依赖于活细菌的功能。因此，在灭菌后培养物中鉴定出有用的功能是出乎意料的发现。有许多报道称益生菌(probiotics)和益生元(prebiotics)改善经肠环境并激活免疫系统。一般来说，益生菌指在活状态下引入宿主肠内时可为宿主带来有益作用的微生物。与益生菌相对，益生元指通过作用于原本生长在经肠的微生物而为宿主提供有益作用的物质。例如，尤其是在用人体进行的试验中，数种类型的乳酸细菌菌株被报道为针对流感疫苗具有促进中和抗体诱导的效果。然而，由于这些乳酸细菌是作为活细菌发挥作用的益生菌，生产和质量控制并不容易。此外，活细菌制剂通常储藏稳定性有限。例如，即使将活细菌制剂在生产之后保存在低温下，其通常经不住长期保存。

与乳酸细菌相对，本发明的丙酸细菌培养物是益生元。在灭菌的培养物(益生元)中，没有由于微生物的活性而导致的质量改变。因此，针对流感感染的预防效果能够在益生元中稳定保持。即，本发明的组合物的生产和质量控制是容易的。此外，作为益生元的本发明组合物能够在常温下长时间保存。另外，一般而言，在期待来自活乳酸细菌的口服施用的效果时，必须考虑胃酸的影响。这是因为乳酸细菌因胃酸而减少，无法将足量的活细菌递送至肠内。另一方面，在本发明中，丙酸细菌针对流感感染的预防效果不依赖于活细菌的活性。因此，针对流感的充分的预防效果也能够通过口服施用达成。

所述丙酸细菌培养物在灭菌后可以加工成粉末形式或液体形式。例如，在向培养物溶液添加合适的赋形剂从而使得培养物的固形物含量变成30-40重量％之后，可以将其干燥，然后粉末化。粉末化的脱脂乳、乳清粉、生淀粉、糊精等可以用于赋形剂。除了上述赋形剂之外，必要时也可使用WPC、乳清蛋白质分离物(WPI)和改性淀粉作为赋形剂。用于干燥培养物的方法也是已知的。例如，培养物溶液可以直接进行喷雾干燥。具体而言，对于改性淀粉，除了糊精之外，可以使用可溶性淀粉、英国糊精(British gum)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等。或者，可以将所述培养物溶液与赋形剂的还原溶液混合，并且可以在浓缩直至其固形物含量达到30-40重量％之后喷雾干燥。通过在填充时进行脱氧处理(氮封、添加脱氧剂等)，干燥的培养物可以长时间稳定保存。此外，可将其加工成倍散制剂(0.2％倍散物)以供在食品中的方便使用。

丙酸细菌培养物已知具有促进乳酸细菌增殖的作用。具有这种作用的丙酸细菌培养物，或其加工产物，称为“双歧生长刺激剂(bifidogenic growthstimulator；BGS)”。BGS可以作为本发明的丙酸细菌培养物使用，只要其具有在接种流感疫苗的动物中促进针对流感病毒的中和抗体产生的作用。

作为本发明的丙酸细菌培养物，通过丙酸细菌产生的乳清发酵产物是优选的。例如，通过在10％乳清粉还原液中发酵产生双歧生长刺激剂的弗氏丙酸杆菌ET-3菌株获得的丙酸细菌培养物可以作为活性成分包括在本发明的组合物中。例如，含有BGS的丙酸细菌培养物称作“Profec”，并且其被批准作为用于特定保健用途的食品的有效成分。作为含有“Profec”的组合物，B.G.S.粉末(商品名；由Meiji Dairies Corporation制造)，和Onaka Katsuryoku片剂(由Meiji Dairies Corporation制造；商品名：“Onaka Katsuryoku”是Meiji Dairies Corporation的注册商标)是可商购的。因此，“B.G.S.粉末”或“Onaka Katsuryoku片剂”可以用作本发明的组合物。

具体而言，Profec中包括的BGS是1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)和2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌(ACNQ)。在它们之中，DHNA是微生物中维生素K2(甲基萘醌类)的生物合成中间体。这些物质通过高效再氧化双歧杆菌能量代谢过程中产生的NADH来促进增殖。因此，作为丙酸细菌培养物，可以使用以下组分(i)和(ii)之一或二者。具体而言，本发明提供对于流感感染的预防剂，所述预防剂包含以下之一或二者：

(i)1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)；和

(ii)2-氨基-羧基-1，4-萘醌(ACNQ)。

当将丙酸细菌培养物中所含的DHNA的量作为指标时，通常对于成人，在本发明中包含上述成分(i)和/或(ii)的用于流感感染的预防剂的剂量范围通常是在丙酸细菌中含有0.01μg/kg至100mg/kg DHNA。在一些情况下，更小的剂量就是足够的，但是另一方面，更大的剂量可能是必要的。此外，施用可以分成一日2至4次施用。所述剂量可以通过考虑患者的状态如年龄和体重、施用途径、期待的预防效果的程度等来设定。

由于Profec特异性增加人的经肠双歧杆菌，其被批准作为用于特定保健用途的食品的有效成分(N.Yoda：ILSI，No.80，5-13(2004))。目前，作为包含Profec的组合物，“B.G.S.粉末”和“Onaka Katsuryoku片剂”是可商购的。因此，其不是难以获得的。然而，向接种流感疫苗的动物给予Profec可增强对中和抗体的诱导是未知的。具体而言，本发明提供在接种流感疫苗的动物中促进中和抗体诱导的作用剂，所述作用剂包含以下二者或之一：

(i)1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)；和

(ii)2-氨基-羧基-1，4-萘醌(ACNQ)。或者，本发明涉及用于在接种流感疫苗的动物中促进中和抗体诱导的药物组合物，所述组合物包含上述组分(i)和(ii)之一或二者。

当将1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)混入本发明的组合物时，期望将所述组合物中的溶解氧保持在低水平。这是因为溶解氧可分解DHNA，从而DHNA浓度在储藏过程中降低。用于降低包含DHNA的组合物中溶解氧水平的方法是已知的(WO 2004/85364)。具体而言，当所述组合物处于液态时，可以通过将不含氧气体鼓泡到所述液体组合物中来用氧气之外的气体置换溶解氧。优选的不含氧气体是氮气。此外，可以通过与DHNA一同添加具有抗氧化性的化合物来将溶解氧保持在低水平。对于具有抗氧化性的化合物，可以使用已知的抗氧化剂。具体而言，作为氧化剂已知连二硫酸(hyposulfurous acid)、抗坏血酸(维生素C)、异抗坏血酸、胡萝卜素、生育酚和具有抗氧化功能的多酚类。

可以使用源自天然产物的多酚类和源自合成产物的多酚类。例如，源自茶、葡萄、柠檬、咖啡、紫薯、大豆等的多酚类是已知的。含有大量这些多酚类的水果和蔬菜、种子、植物的叶片等的提取汁液、或其提取物可以作为多酚类混入本发明的组合物。例如，使用水或有机溶剂的提取可以生成多酚提取物。此外，这些天然含多酚的产物的浓缩物、纯化物和干燥物也可以作为多酚类使用。

根据抗氧化剂的类型，可以通过添加与用于常规抗氧化用途添加的量相比相同或更大量的抗氧化剂来降低溶解氧的水平。例如，当期望通过单独向组合物添加抗坏血酸而不鼓泡惰性气体可得到DHNA稳定性时，可以以溶液总重量的0.01重量％或更多添加抗坏血酸。可以将所述抗氧化剂在向组合物添加DHNA之前加入所述组合物。或者，其可以与DHNA一同添加至组合物以防止其降解。例如，当添加抗坏血酸作为抗氧化剂时，添加的量可以设定在每100kcal(或每100g组合物)1μg至2g，通常为150μg至1.5g，并且优选1mg至500mg左右。

所述丙酸细菌培养物可以以总组合物的0.001％至20％，通常为0.01％至15％，并且优选为0.01％至10％的比例混合。或者，当添加夸克作为乳发酵组分时，可以设定本发明的总组合物中所含的乳发酵组合物使得所述夸克蛋白部分的浓度为所述总组合物的大约0.01％至大约30％，优选大约0.1％至大约20％，并且更优选大约0.5％至大约10％。

本发明的组合物可以制成任何剂量形式，如液体形式、糊剂形式或干燥固体材料。本发明的组合物可以通过将适合于经肠施用的载体或药学上可接受的载体混入丙酸细菌培养物而制成组合物。更具体而言，其可以配制成片剂、胶囊、颗粒、粉末、糖浆等。或者，其可以作为丙酸细菌培养物分散在乳发酵组分中的形式提供。这些多种多样的制剂可以根据常规方法使用通常用于医药制剂技术领域的已知佐剂作为主要试剂来配制，所述佐剂如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、悬浮剂、包衣剂、溶剂和等渗剂。此外，可以包括适当量的矿物质如钙。此外，可以添加适当量的维生素、矿物质、有机酸、糖类、氨基酸、肽等。有机酸包括脂肪酸如短链脂肪酸。

丙酸细菌的乳清发酵产物可望有卓越的肠调节作用是已知的。然而，丙酸细菌培养物显示出针对流感感染的预防效果，这是未知的。

可以向本发明的组合物额外添加乳发酵组分和寡糖。具体而言，本发明涉及包含以下组分的组合物：

(a)寡糖；

(b)乳发酵组分；和

(c)丙酸细菌培养物。

通常，寡糖也称作低聚糖，指由2至20个糖形成糖苷连结的化合物。例如，在本发明中，可以使用以下糖作为寡糖：

低聚乳果糖(lactosucrose)；

异麦芽寡糖；

果糖寡糖；

半乳寡糖；

木糖寡糖；

大豆寡糖；

黑曲霉寡糖；

龙胆寡糖；

乳糖；

蔗糖；

麦芽糖；等等。

在寡糖之中，存在在酸性条件下容易降解的化合物。因此，当本发明的组合物或含有该组合物的食品是酸性时，优选使用在酸性条件下稳定的寡糖。例如，包含半乳糖作为构成糖的寡糖作为要在酸性条件下混入的寡糖是优选的。在本发明中，包含半乳糖作为构成糖的寡糖是2至20个糖形成糖苷连结的化合物，并且包括其中构成所述化合物的糖含有一个或多个半乳糖分子者。更具体而言，棉子糖家族寡糖(大豆寡糖)、半乳寡糖等可以标示为优选的寡糖。它们之中，半乳寡糖在本发明中是优选的寡糖。

在本发明中，半乳寡糖指其中半乳糖是主要构成糖的寡糖。乳糖(Gal(β1-4)Glc)是基本结构，而具有其中一至数个半乳糖残基连接在一起的结构的寡糖，其中半乳糖与葡萄糖β-1，3连接等的二糖(转移的二糖)，Gal-(Gal)n-Glc(n＝1～18)，和Gal-(Gal)n-Gal(n＝1～18)也可以包括在半乳寡糖的实例中。在本发明中，构成半乳寡糖的半乳糖残基数通常可以为1至20，优选1至10，并且更优选1至8。此外，构成半乳寡糖的半乳糖的比例可以表示为，例如，构成所述半乳寡糖的单糖总数的10％或更多，优选30％或更多，并且更优选50％或更多。用于产生半乳寡糖的方法的实例是使用β-半乳糖苷酶作用于乳糖的方法，这种酶具有高的半乳糖转移能力(Sawairi，Y.，“Function of Galacto-oligosaccharides and Application to Foods(garakutoorigo-to no kino to syokuhin e no oyo)”FOOD STYLE 21，2，pp.76-78(1998))。对于β-半乳糖苷酶，例如，可以使用源自微生物等者，所述微生物如劳伦梯隐球菌(Cryptococcus laurentii)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans).

此外，在用于特定保健用途的(标准化)食品(FOSHU)的法规和标准系统中，将通过β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，E.C.3.2.1.23，源自隐球菌属酵母)的作用自乳糖产生的寡糖定义为半乳寡糖。以这种方式产生的半乳寡糖是其中一个或多个半乳糖与乳糖的半乳糖残基形成糖苷连结，且据称4’-半乳糖基-乳糖(Gal(β1-4)Gal(β1-4)Glc)是其主要组分(Director of theDepartment of Food Safety，Pharmaceutical and Food Safety Bureau，Ministry ofHealth，Labour and Welfare的No.0701007通告，日期2005年7月1日，“Regarding the setting of codes and standards accompanying the establishment ofthe(standardized)food for specified health use system and such”)。

半乳糖寡糖包含于母乳中。已知其在经肠具有适当增加双歧杆菌的效果，并且是难以消化和吸收的糖。此外，已知半乳糖寡糖可用于在胃切除手术后补充矿物质(国际公开WO 98/15196)。此外，尽管果糖寡糖在强酸条件下水解(Nakamura A.，“Changes in Sugars in Sweet-and-Sour-Pork and CookedFood Using Fructo-oligosacchrides(Furukuto-origoto wo mochiita subuta yanimono tyu deno to no henka)，Annals of Tokyo Kasei Gakuin University，43，pp.49-53(2003))，乳糖寡糖具有在酸性条件下或加热条件下不易因降解等而衰减的性质(Sawairi，Y.，“Function of Galacto-oligosacchrides and Applicationto Foods(garakutoorigo-to no kino to syokuhin e no oyo)”FOOD STYLE 21，2，pp.76-78(1998)。通过向本发明的组合物添加寡糖，该组合物的肠功能调节作用能够进一步增强。即，本发明的组合物可以用作用于肠道调节的组合物。胃肠症状如腹泻是因流感病毒感染的代表性症状之一。因此，兼具肠功能调节作用的组合物可以说具有作为用于在预防流感感染中使用的组合物的理想特性。

本发明的组合物中包含的寡糖的浓度为总组合物含量的大约0.001％至20.0％，优选大约0.05％至11％，并且更优选大约0.1％至6％。混合的寡糖量可根据剂量形式、症状、体重等来调节。

本发明的组合物在丙酸细菌培养物之外，还可以包含寡糖和乳发酵组分之一或二者。在本发明中，乳发酵组分指通过以微生物或酶的活性发酵动物乳而获得的加工产品。在本发明中，动物乳包括牛乳、水牛乳、山羊乳、绵羊乳、马乳等。在它们之中，牛的乳(牛乳)具有经济学优势，因为能够容易地获得大量的原料乳。乳发酵组分不仅可以从采集自活生物体的乳产生，也可以自其级分或加工产品产生。乳的级分或加工产品包括半脱脂乳、脱脂乳、复原全乳、复原脱脂乳、复原半脱脂乳、乳清、酪蛋白、粉状脱脂乳、乳清蛋白质浓缩物(WPC)、乳清蛋白质分离物(WPI)、黄油(butter)、酪乳(buttermilk)、奶油(cream)等。这些乳衍生加工产品有时称作原料乳。可以使用原料乳本身，或者在与不同的原料乳混合之后使用，以作为乳发酵组分的来源。

在本发明中，所述乳发酵组分可以作为通过添加用于乳发酵的微生物而产生的培养物来获得。微生物培养物的级分可以用作本发明中的乳发酵组分，只要当它们与丙酸细菌混合时有针对流感感染的预防效果。为了发酵目的向乳添加的微生物通常称作起子(starter)。要在乳发酵中使用的微生物优选是乳酸细菌和双歧杆菌。具体而言，例如，乳发酵组分可以通过使用属于以下各属的乳酸细菌或双歧杆菌作为起子来获得：

乳杆菌属；

链球菌属；

乳球菌属(genus Lactococcus)；

明串珠菌属(genus Leuconostoc)；

片球菌属(genus Pediococcus)；等等。

更具体而言，通过以下微生物产生乳发酵组分是已知的。使用这些微生物获得的乳发酵组分作为本发明中的乳发酵组分是优选的。

乳杆菌：乳酸链球菌(Streptococcus lactis)，

酪链球菌(Streptococcus cremoris)，

双乙酰乳链球菌(Streptococcus diacetylactis)，

屎肠球菌(Enterococcus faecium)，

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，

乳酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，

瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，

德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)，

加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，

粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，

鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)，

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，

口乳杆菌(Lactobacillus oris)，

路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，和

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)

双歧杆菌：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，

双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，和

短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)

用于从自然界或发酵乳分离这些微生物的方法是已知的。或者，已经分离的微生物可以通过从细胞库等分让(subdivision)获得。此外，用于获得乳发酵组分的乳酸细菌起子是可商购的。通过可商购的乳酸细菌起子产生的乳发酵组分也可以用于本发明的组合物。根据产生的发酵乳在pH和物理性质上的差异有多种产品在售。发酵乳的物理性质指硬度(stiffness)和顺滑度(smoothness)。可商购的乳酸细菌起子可以用作用于获得本发明的乳发酵组分的乳酸细菌起子，只要其在与丙酸细菌培养物一起使用时可促进流感疫苗的中和抗体诱导。

为了获得本发明的乳发酵组分，可以将以下微生物接种至原料乳中作为乳酸细菌起子：

保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(L.bulgaricus)；

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(S.thermophilus)；和

乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)(L.lactis)。

在发酵乳的通常生产中，可以向原料乳加入这些乳酸细菌之外的一种、两种或更多种选自酵母和乳酸细菌的菌种。然而，在本发明中，在任何情况下，使用含有保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)和嗜热链球菌(S.thermophiles)的混合起子是优选的，这种起子是根据Codex标准的标准化酸乳起子。此外，当添加额外的微生物时，所述额外的微生物可以通过考虑用于目标发酵乳的发酵温度和发酵条件而添加至此种混合起子。要额外混入所述混合起子的微生物包括其他乳酸细菌，如加氏乳杆菌(L.gasseri)和双歧杆菌(Bifidobacterium)。

在本发明中，要作为混合起子向原料乳添加的微生物可以选自保藏在细胞库中的微生物。能够用于所述混合起子的理想的细菌菌株的实例如下所示：

包含以下微生物的混合培养物的乳酸细菌起子：

保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus JCM 1002T)

嗜热链球菌(S.thermophilus ATCC 19258)

包含以下微生物的混合培养物的乳酸细菌起子：

嗜热链球菌OLS 3059(FERM BP-10740)

嗜热链球菌OLS3294(NITE P-77)

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL 1073R-1(FERM BP-10741)

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL 1255(NITE BP-76)

能够经由通过这些微生物进行的发酵获得的乳酪、天然乳酪、酸乳、发酵乳、乳清发酵产品、乳清乳酪等包括在本发明的乳发酵组分中。例如，要混入本发明的组合物的乳发酵组分是通过从发酵乳(酸乳)减少水分(乳清)获得的(例如，日本专利No.3,179,555)。源自发酵乳(酸乳)的蛋白质具有高营养价值，因为这些蛋白质具有100的氨基酸得分，并且这些蛋白质的消化和吸收性质因发酵而提高。

例如，在这些乳发酵组分中，乳酪是本发明中优选的乳发酵组分。例如，通过组合一种、两种或更多种类型的液体形式的原料乳制备的液体形式的乳可以通过在用乳酸细菌发酵之后添加酶或酸制成凝乳(curd)。乳酪是通过从凝乳去除乳清产生的材料。与固化或熟化无关，通过从凝乳去除乳清产生的物质均称为乳酪。乳酪大致分为在生产之后经历了熟化过程的成熟乳酪，和非成熟乳酪。通常，在乳酪的成熟过程中，乳酸细菌或霉菌进行增殖(发酵)，而每种乳酪形成某种特征性的味道。与成熟乳酪相对，非成熟乳酪保持乳清从凝乳去除时产生的状态。非成熟乳酪(新鲜乳酪)作为本发明中的乳发酵组分是优选的。存在许多类型的非成熟乳酪(新鲜乳酪)，包括酪农乳酪(cottagecheese)、夸克(quark cheese)、条状乳酪(string cheese)、纽沙特尔乳酪(neufchatelcheese)、乳脂乳酪(cream cheese)、莫扎里拉乳酪(mozzarella cheese)、乳清乳酪(ricotta cheese)和马斯卡朋乳酪(mascarpone cheese)。在这些新鲜乳酪中，优选将夸克用于本发明中。用于产生夸克的方法是已知的(例如，JP-A(Kokai)H06-228013；Cheese and Fermented Milk Foods，Volume I：Origins andPrinciples，Frank V.Kosikowski and Vikram V.Misstry，F.V.Kosikowski，L.L.C.，1999，第147至161页)。夸克是乳酪的一种类型(通称)，且其营养组成等已经得到了阐明(Milk and Dairy Product Technology，Edgar Spreer；AxelMixa，Marcel Dekker Inc.，1998，pages 245-249)。

用于非成熟乳酪的通用生产方法如下所述。首先，从原料乳产生凝乳。将起子接种至原料乳中，并在培养后，进一步加入粗制凝乳酶(rennet)以产生凝乳。在产生凝乳之前，必要时可以预处理原料乳。例如，为了减少生产批次之间质量上的差异，可以通过混合多种类型的乳源来调节质量。这种处理称作标准化。此外，可以应用匀质化(homogenization)以机械破坏乳中的脂肪小球。或者，可以进行通过离心和加热处理灭菌来去除混入乳源的微生物。

能够通过从获得的凝乳分离乳清而获得的固体组分是非成熟乳酪(新鲜乳酪)。用于通过离心分离和膜分离从凝乳分离乳清的方法是已知的。例如，离心分离器如夸克分离器用于乳清分离。或者，可以通过在需要时事先切割或加热凝乳使所述分离过程变得高效。

更具体而言，能够从以下来源和步骤获得的新鲜乳酪优选作为本发明的乳发酵组分。在以下步骤中，主要可以使用保加利亚乳杆菌和/或嗜热链球菌用于发酵：

加热灭菌牛的脱脂乳；

通过以0.5％至5％接种乳酸细菌起子来起始发酵；

当pH达到4.6时从形成的凝乳分离乳清；和

冷却通过分离乳清获得的凝乳而获得非成熟乳酪。

概括而言，能够如此产生的非成熟乳酪也可称为夸克。非成熟乳酪的组成的实例如下：

17％至19％总固形物含量，

11％至13％蛋白质；

1％或更少的脂肪(即，0％至1％)，

2％至8％糖类，和

2％或更少的乳糖(即，0％至2％)。

能够混入的乳发酵组分的量为例如总组合物中源自乳发酵组分的蛋白质占大约0.01％至30％，通常为大约0.1％至20％，优选地大约0.5％至10％的比例。或者，可以将0.01g至33g，0.1g至22g，0.5g至11g，优选2g至6g，且更优选2.5g至4.5g混入100mL组合物。或者，可以将本发明的总组合物中所含的源自乳发酵组分的蛋白质设定为总组合物中蛋白质量的大约0.1％至100％，优选大约1％至100％，且更优选大约30％至100％。

此外，通过向加热灭菌的脱脂乳添加属于乳球菌属的乳酸细菌作为乳酸细菌起子而发酵的乳发酵组分可以是本发明的非成熟乳酪。更具体而言，可以使用混入以下微生物的乳酸细菌起子：

乳酸乳球菌，

酪乳球菌(Lactococcus cremoris)，和

和属于明串珠菌属的微生物。

凝乳可以通过向加热灭菌的脱脂乳添加通过混合微生物如上述那些而产生的乳酸细菌起子，然后进行培养来获得。非成熟乳酪也可以通过从乳发酵组分去除乳清来获得。本发明中的乳发酵组分还包括可以通过使用切割工具(cutter)事先切割凝乳并在加热的同时分离乳清而获得的非成熟乳酪。

此外，本发明的非成熟乳酪还包括通过向原料乳添加粗制凝乳酶，而后固化而产生的材料。粗制凝乳酶是用于产生乳酪等的、含有凝乳酶(EC3.4.23.4)作为主要成分的原料(source)。

本发明的组合物可以经肠施用。经肠施用指将本发明的组合物递送至肠道。因此，经肠施用不仅包括口服施用，还包括通过灌肠(intestinal infusion)施用，以及多种类型的使用管饲施用的方法。管饲是向膳食经口摄入不佳的患者直接将流食等通过管施用至消化道的方法。依赖于管的放置方法上的差异，存在以下施用途径：

通过鼻腔(鼻饲)

外部瘘管

经皮胃镜下胃造瘘术(PEG)

空肠造口术

外部瘘管指从腹壁外部将管送入消化道，包括经皮胃镜下胃造瘘术和空肠造口术。此外，将组合物从肛门灌注至直肠的灌肠剂施用也包括在经肠施用中。在口服施用的情况下，所述组合物可以是任何剂量形式。然而，对于通过管或灌肠剂施用的施用，有利的是将本发明的组合物制成糊剂、半固体或液体形式。

本发明的组合物对于在动物中预防流感病毒感染是有用的。在本发明中，“动物”指是作为流感病毒宿主的哺乳动物和禽类。除了人之外，流感病毒感染的病例已知还存在于哺乳动物如猪等之中。除猪以外其可适用于牛、山羊、绵羊、马、水牛、骆驼等，以及宠物、动物园中饲养的动物和家畜。包括家禽如鸡在内的禽类和许多野生禽类也显示流感病毒感染。对于所有这些动物物种，可以期待通过施用本发明组合物的针对流感感染的预防效果。当向动物施用本发明的组合物时，本发明的组合物可以通过混入饲料来施用。

当将乳发酵组分混入本发明的组合物时，乳发酵组分的剂量(摄入量)(固形物含量)是例如大约每千克体重每日1mg至20g，优选大约10mg至15g，且更优选大约50mg至10g。所述剂量可以依赖于剂量形式、症状、性别、年龄、体重等调节。

例如，当将乳发酵组分混入本发明的组合物并施用于人时，所述剂量通常为大约0.05g至1,500g，优选大约0.05g至1,000g，且更优选大约2.5g至800g(固形物含量)每日。这可以适当地向需要通过本发明的组合物促进中和抗体诱导的那些对象一次施用，或分开并在餐前、餐后或餐间，和/或就寝时施用。所述剂量可以依赖于要施用的受试者的年龄和体重以及施用目的单独地适当调节。此外，本发明的组合物可以用作膳食的替代品或者可以将其用作膳食补充剂。

构成本发明组合物的丙酸细菌培养物，以及额外添加的乳发酵组分或寡糖均已用作营养素和流食的组分。因此，本发明的组合物可以通过混合含有这些组分的营养剂或流食来生产。例如，含有BGS的丙酸细菌培养物称作“Profec”，并且被批准作为用于特定保健用途的食品的有效成分。名为“B.G.S.粉”和“Onaka Katsuryoku片”的产品包括“Profec”，其为通过丙酸细菌发酵产生的乳清发酵产品。此外，名为“Fibren YH”的产品(MeijiDairies Corporation)是含有乳发酵组分的流食。因此，本发明的组合物可以通过根据上述混合比例混合这些产品获得。

此外，可以通过将包含丙酸细菌培养物的组合物与包含乳发酵组分的组合物组合来构建用于预防流感感染的试剂盒。更具体而言，本发明涉及用于预防流感感染的试剂盒，其包含(is composed of)：

(a)包含丙酸细菌培养物的组合物；和

(b)包含乳发酵组分的组合物。或者，本发明提供用于在接种流感疫苗的动物中促进流感病毒中和抗体诱导的试剂盒，其中所述试剂盒包括上述组合物(a)和(b)。例如，本发明的试剂盒可以通过组合包含丙酸细菌培养物的营养组合物和包含乳发酵组分的营养组合物来构成。这些营养组分作为流食或营养剂流通(distribute)。

本发明人发现，在摄取丙酸细菌培养物的人中，缘于流感疫苗接种的中和抗体诱导得到增强。更具体而言，本发明提供要通过经肠施用用于接种流感疫苗的动物的包含丙酸细菌培养物的组合物。或者，本发明提供用于在接种流感疫苗的动物中促进流感病毒中和抗体诱导的作用剂，其中所述作用剂含有丙酸细菌培养物。此外，在优选的实施方案中，用于促进中和抗体诱导的本发明的组合物或作用剂可以额外包含乳发酵组分和寡糖之一或二者。

此外，本发明涉及丙酸细菌培养物在制备用于在接种流感疫苗的动物中促进流感病毒中和抗体的诱导的作用剂方面的用途。或者，本发明涉及用于在接种流感疫苗的动物中促进中和抗体诱导的丙酸细菌培养物。另外，本发明涉及用于产生在接种流感疫苗的动物中促进中和抗体诱导的试剂的方法，所述方法包括将丙酸细菌培养物与药学上可接受的载体混合的步骤。

本发明还涉及丙酸细菌培养物在制备针对流感感染的预防剂中的用途。或者，本发明涉及用于预防流感感染的丙酸细菌培养物。

或者，本发明提供用于在接种流感疫苗的动物中促进流感病毒中和抗体诱导的药物组合物，其中所述组合物含有丙酸细菌培养物。此外，本发明涉及丙酸细菌培养物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在以流感病毒疫苗接种的动物中促进针对流感病毒的中和抗体的诱导。本发明的药物组合物包含药学有效量的丙酸细菌培养物。可以将适用于口服施用或经肠施用的载体混入本发明的药物组合物。本发明的药物组合物也可以出于在接种流感疫苗的动物中诱导中和抗体的目的作为流食提供和施用。

在本发明中，流感疫苗包括为了预防流感病毒感染和感染后加重的目的而施用的疫苗。目前在日本投入实际应用的灭活疫苗，和在其他国家投入实际应用的经鼻疫苗包括在本发明的流感疫苗中。灭活疫苗通常皮下、皮内、或肌肉内施用。另一方面，经鼻疫苗是活病毒疫苗。喷雾经鼻疫苗至鼻腔中的目的是诱导呼吸道粘膜中的IgA抗体，其对病毒感染具有高预防作用。

或者，本发明提供用于预防流感感染的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向动物施用丙酸细菌培养物；和

(2)用流感疫苗接种动物。

在本发明中，流感感染的预防具体包括预防流感病毒感染和防止流感病毒感染之后的加重之一或二者。流感感染是伴随着多种由病原体流感病毒的感染而引起的症状的传染病。在本发明中，流感感染有时可简称为“流感”。流感感染的加重包括以下状况：

感染症状变得严重；

感染症状的类型增加；

病毒感染的组织或感染的细胞增加；和

体内病毒增殖。

因此，抑制这些状况中的至少一种意味着本发明中的流感感染的预防。在本发明中，流感感染的预防包括流感病毒感染的预防。更具体而言，增强病毒中和抗体的诱导包括在流感病毒感染的预防中。通过流感疫苗接种体内诱导的中和抗体的产生水平可能随着时间减少。防止中和抗体的减少有助于预防流感感染。因此，防止中和抗体产生水平的减少也包括在促进病毒中和抗体的诱导中。

中和抗体有助于防止流感病毒感染的组织或流感病毒感染的细胞在体内扩散。对其而言能够期待本发明的组合物或本发明的方法针对流感感染的预防效果的动物物种是流感病毒的宿主动物。更具体而言，实例包括人、包括人在内的动物，和除人之外的动物。

此外，本发明的组合物产生的针对流感感染的预防效果不依赖于流感病毒的抗原性。因此，其可有效预防多种类型的流感病毒的感染。具体而言，属于甲型及其亚型的流感病毒是优选的，本发明应该能预防其感染的流感病毒。更具体而言，宿主为人、猪、禽类等的甲型流感病毒是本发明中的预防优选的靶标。

例如，中和抗体诱导的增强可以如下确认。即，向施用了本发明组合物的组以及向未施用本发明组合物的组施用相同的流感疫苗。然后，可以比较两组中病毒中和抗体诱导的状态。此时，各个组的构成的分配使得除了组合物的施用外的条件相同。换言之，理想的是，分配如健康状况、年龄、体格和性别比等条件，使得两组之后没有偏差。同样理想的是使遗传特征尽可能均匀。因此，当人作为受试者时，相同种族的组是理想的。当在非人动物中确认预防效果时，试图使用遗传上相同的组。

在这些条件下，对于两个组的组合物施用和疫苗接种根据相同的时间表实施。此外，当中和抗体的诱导在使用了本发明组合物的组中显著增强时，可以确认所述组合物针对流感感染的预防效果。此处，中和抗体诱导的增强是指，例如，以下任一能够得到确认。在如下所示的指标中，可以评估中和抗体效价，例如，通过比较两组之间超过感染抑制抗体效价的个体的比例(发病率)。

当中和抗体的抗体效价增加迅速时，

当中和抗体的产生长时间持续时，或

当高中和抗体效价达成时。

因此，若其中确认了上述任一效果的个体数因施用本发明的组合物而显著增加，则能够确认所述组合物针对流感感染的预防效果。用于定量评估中和抗体效价的方法是已知的。例如，通过施用感染性流感病毒和培养的细胞，能够确认抗体的感染抑制效果。抗体的系列稀释容许定量比较感染抑制作用。

在本发明中，在疫苗接种的时间前后或与疫苗接种同时施用丙酸细菌培养物。从疫苗接种之前到之后连续施用丙酸细菌培养物是优选的。更具体而言，本发明提供用于如此使用的包含丙酸细菌培养物的组合物：在向将会接种流感疫苗的动物进行疫苗接种的时间前后连续经肠施用。例如，疫苗接种的时间前后指当将疫苗接种之日设定为第0日时，-150日至+150日，通常为-60日至+60日，或-8周至+8周。

在此期间，至少每日施用一次药学有效量的本发明的组合物。每日剂量可以分开并以多个批次施用。或者，其可以隔日施用。此外，在本发明中，可以将有效量的丙酸细菌培养物与多种类型的组合物以不同混合比例组合施用。

事实上，本发明人确认了在流感疫苗接种的时间前后摄取了丙酸细菌培养物的人中，疫苗的中和抗体诱导得到了促进。因此，本发明提供用于在施用流感疫苗的动物中促进或增强中和抗体诱导的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(1)向动物施用丙酸细菌培养物；和

(2)向动物接种流感疫苗。

可以期待本发明的组合物不仅促进疫苗接种的中和抗体诱导，甚至在病毒感染时也可发挥增强中和抗体诱导的作用。即，甚至在感染流感病毒的患者中，本发明的组合物能够通过增加患者本身产生病毒中和抗体的能力来遏制患者体内病毒感染的扩散并减轻症状。具体而言，当高毒力病毒感染时，不仅预期有诱导气道感染的危险，还预期有诱导系统性症状的危险。通过患者连续摄入本发明的组合物，预期诱导针对感染病毒的中和抗体的能力能够增加，并且能够防止加重。

本发明的组合物可以以任何药物或食品和饮料的形式使用。例如，通过流感疫苗的中和抗体的诱导能够通过直接作为药物施用所述组合物来增强。或者，伴随着对流感疫苗的预防效果增强的预期，可将其作为用于特殊用途的食品，如用于特定保健用途的食品，或具有营养机能食品来摄取。此外，与形式如液体形式、糊剂形式、固体形式和粉末形式无关，可以通过将所述组合物添加至多种类型的食品和饮料中来将该组合物作为食品摄入。食品和饮料的实例包括牛乳、软饮、发酵乳、酸乳、乳酪、面包、饼干、薄脆饼干(cracker)、比萨饼皮、调制乳粉(modified powdered milk)、流食、病人用食品、营养食品、冷冻食品、食品组合物、加工食品和其他可商购食品。当将本发明的组合物制成酸性药物或食品和饮料的形式时，其pH可以设在pH 2.0至pH 6.0，并优选pH 3.0至pH 5.0。

当向动物连续施用本发明的组合物时，可将其作为营养剂、食品、饮料或膳食施用。当将本发明的组合物作为营养剂、食品、饮料或膳食施用时，其营养组分可以通过在乳发酵组分和丙酸细菌培养物之外混入额外的营养素来调节。水、蛋白质、糖类、脂肪、维生素、矿物质、有机酸、短链脂肪酸、有机碱、果汁、矫味剂等可以用作本发明中的额外营养素。对于这些营养素，可以使用如下组分：

蛋白质：(动物蛋白和植物蛋白，或其降解产物)

全脂乳粉、粉状脱脂乳、粉状半脱脂乳、酪蛋白、乳清、乳清粉、乳清蛋白质、乳清蛋白质浓缩物、乳清蛋白质分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡卵蛋白、肉蛋白等；

自乳衍生的脂肪和糖类：黄油、乳清矿物质、奶油、非蛋白氮、唾液酸、磷脂、多种类型的乳衍生组分如乳糖等。

肽和氨基酸：肽和多种类型的氨基酸如酪氨酸磷酸肽、精氨酸和赖氨酸。

糖类：改性淀粉(糊精(麦芽糊精、难消化性糊精等)、可溶性淀粉、英国淀粉(British starch)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、膳食纤维等；

油和脂肪：动物油和脂肪如猪油、鱼油等，以及其分离的油、氢化油、转酯化的油(transesterified oil)；和植物油如棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油和棕榈油，以及分离的油、氢化油和转酯化的油；

维生素：维生素A、胡萝卜素、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K组、维生素P、维生素Q、尼克酸(niacin)、烟酸(nicotinicacid)、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等；

矿物质：钙、磷、钾、氯、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒、铬、钼等；

有机酸：苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等；和

短链脂肪酸：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等。

任何化学合成的物质或天然产物衍生的组分可以用作这些额外营养素。或者，可以将含有目的组分的食品作为原料混入。这些组分可以通过根据目的营养剂的组成组合至少一种、两种、或更多种类型来混入。所述组合物的形式可以是固体或液体。此外，其可以制成凝胶或半固体形式。因此，营养剂可以作为流食施用。

事实上，如下文所述实施例中所指明的，本发明的组合物通过将其作为包含丙酸细菌培养物的流食摄入而在以流感疫苗接种的宿主动物中促进了流感病毒中和抗体的诱导。因此，其中混入了丙酸细菌培养物的、具有流食构成的组合物是本发明的优选实施方案。即，本发明涉及用于产生流食的方法，所述流食在已经以流感疫苗接种的受试者中促进针对流感病毒的中和抗体的诱导，其中所述方法包括将丙酸细菌培养物混入流食的步骤。或者，本发明提供用于提供具有在以流感疫苗接种的受试者中促进流感病毒中和抗体诱导的能力的流食的方法，所述方法包括将丙酸细菌培养物混入流食的步骤。此外，本发明提供对于流感感染的预防性组合物，所述组合物包含以下营养素：

丙酸细菌培养物；

乳发酵组分；

寡糖；

蛋白质；

糖类；

脂肪；和

膳食纤维。

在上述组合物中，丙酸细菌培养物可以是例如以下之一或二者：(i)1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)，和(ii)2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌(ACNQ)。此外，当上述组合物中的乳发酵组分含有蛋白质时，不同来源的蛋白质可以额外地作为蛋白质混入。例如，除了乳发酵组分，可以混入乳组分，类似地，可以混入除了寡糖之外的糖类作为上述组合物中的糖类。

构成本发明组合物的各种组分可以根据不同的条件适当调整，所述条件如将所述组合物作为流食向其施用的受试者的体格、年龄和性别。更具体而言，组合物如以下组合物可以作为常用组合物(每100mL)显示：

丙酸细菌培养物：1mg至22g，通常10mg至17g，且优选10mg至11g；或0.01μg至15mg，通常0.5μg至10mg，且优选0.5μg至0.1mg，以DHNA的量计；

乳发酵组分：就蛋白量而言，0.01g至33g，通常0.1g至22g，优选0.5g至11g；

寡糖：1mg至20g，通常50mg至11g，且优选0.1g至6g；

蛋白质：0.01g至50g，通常0.1g至30g，且优选0.5g至15g；

糖类：0.1g至40g，通常0.5g至30g，优选1g至25g；

脂肪：0.1g至20g，通常0.3g至15g，优选0.6g至10g；和

膳食纤维：0g至15g，通常0g至10g，且优选0g至8g。

在上述组成中，当混合含有DHNA的丙酸细菌培养物时，可将所述培养物以DHNA当量混合而成为上述组成。类似地，混入上述组合物的寡糖可以作为糖类的部分混入。即，所述寡糖构成上述组合物中的糖类的一部分。

此外，在本发明的组合物中，可以额外地混合至少一种选自下组的营养素：维生素、矿物质、有机酸或短链脂肪酸，和有机碱。当混入这些组分时，所述组合物可以根据各种条件如施用所述流食的受试者的体格、年龄和性别来适当调整。更具体而言，下述组成可示为一般组成(每100mL)：

维生素：0g至2g，通常0g至1.5g，优选0mg至500mg；

矿物质：0g至5g，通常0g至3g，优选0g至2g；和

有机酸或短链脂肪酸：0g至5g，通常0g至3g，优选0g至2g。

更具体而言，本发明提供用于产生流食的方法，所述流食用于增强通过流感疫苗的中和抗体诱导，其中所述方法包括将上述营养素根据上述组合物混合的步骤。通过本发明产生的流食可以标示为通过向以流感疫苗接种的受试者在流感疫苗接种时间前后施用流食来在受试者中促进针对流感病毒的中和抗体诱导的流食。

本发明的组合物可以通过将丙酸细菌培养物与药学上可接受的载体混合来制备。当进一步混合额外的组分时，将上述糖类、蛋白质、脂肪等作为载体或流食混合，通过均匀混合制备所述组合物。一般而言，所述组合物可以制备成使得源自细菌培养物和乳发酵组分的蛋白质达到所述组合物中蛋白质的大约1重量％或更高，例如，大约30重量％或更高，优选70重量％或更高，且更优选大约100重量％的比例。当将本发明的组合物制备为流食时，希望的是制备成每1mL 0.1kcal至3kcal，或优选0.7kcal至2kcal。此外，当混合时，可添加至少一种或多种由维生素、矿物质和膳食纤维组成的额外组分。膳食纤维可分成水溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维，且二者之任一均可使用。具体而言，以下组分可以作为水溶性膳食纤维的实例：

果胶(原果胶、果胶酯酸和果胶酸)；

瓜尔胶水解物；

葡甘露聚糖；

半乳甘露聚糖；

欧车前；

玉米纤维；

藻酸；

藻酸水解物；

角叉胶(carrageenin)；和

难消化性糊精。

不溶性膳食纤维的实例包括结晶纤维素、甜菜纤维、和麦麸。优选地，可以使用果胶、瓜尔胶水解物或难消化性糊精。此外，在一些情况下，可以添加矫味剂和其他制剂。

可以将上述各种类型的组分混合，然后填充入容器，并且在需要时进行加热灭菌处理以产生流食或经肠营养剂。当所述组合物的pH为酸性时，加热处理可以在比通常更温和的条件下进行。例如，尽管中性流食的加热灭菌处理使用120℃至130℃进行20分钟至40分钟的釜式灭菌(retort sterilization)条件或140℃至145℃进行4秒至10秒的间接灭菌条件，可以对本发明的组合物进行80℃至90℃的釜式灭菌15分钟至30分钟或95℃至110℃的间接灭菌20秒至60秒。通过使用温和灭菌条件可以改善味道且可以混合热不稳定性组分。此外，本发明的组合物可使用琼脂或明胶制成凝胶，可通过喷雾干燥等制成粒状食品和药物，还可制成固体食品和药物。

可以通过流食和经肠营养剂领域已知的方法产生本发明的组合物。例如，可以使用事先热灭菌液体形式组合物然后将其无菌填充入容器的方法(例如，组合UHT灭菌法和无菌包装法的方法)，和将液体组合物填充入容器然后与容器一起进行热灭菌的方法(例如，釜式灭菌法和高压蒸汽灭菌法)。更具体而言，当以液体形式使用组合物时，如有必要，将基于所述组合物的匀质化物(匀质化液)再次在大约120℃至145℃加热灭菌1秒至10秒并冷却，然后将其无菌填充，或无菌填充入罐或软包并釜式灭菌。此外，当以粉末形式使用所述组合物时，例如，将匀质化物喷雾干燥或冷冻干燥。

在下文中，会更详细地描述本发明，但是不应理解为其限于下述个别的实施方案。在本发明中，当调和(添加/混合)原料时，在加热的同时调和它们。当调和温度设在高温如90℃时，蛋白质固化(凝固)，而当调和温度设定在低温如2℃时，所述蛋白质几乎不在水等中溶解或分散。因此，为了调和步骤，温度优选为5℃至85℃，更优选15℃至75℃，甚至更优选25℃至55℃，并且尤其优选35℃至50℃。此时，优选考虑调和液中细菌(污染细菌等)的增殖而采用合适的调和时间。

此外，在本发明中，将调和液在高温灭菌之后匀质化。理由是用高温灭菌(加热)，蛋白质可能变性且粘度可能增加(变稠)，而通过在高温灭菌之后匀质化，能够降低变稠程度。此处，高温灭菌之后匀质化，是指高温灭菌之后、填充入容器等成为产品之前的匀质化，并且进行匀质化的次数不限于一次，可为多次如两次或更多次。例如，当灭菌混合溶液并且照原样(as it is)第二次灭菌时，匀质化会在第二次灭菌之后再次进行。此外，可在灭菌之后将调和液匀质化，并且当第二次灭菌时，匀质化会在第二次灭菌之后在第二轮中再次进行。此外，可将调和液在灭菌之后匀质化，而可以在不进行灭菌的情况下再次进行第二次匀质化。更具体而言，在本发明中，在高温灭菌调和液之后，在填充入容器等成为产品之前进行至少一次匀质化是重要的。

另一方面，甚至在将进行了高温灭菌(灭菌液)的调和液匀质化之后，可以将其再次灭菌至不引起灭菌液的程度。例如，灭菌混合溶液之后可以接着是匀质化，然后在不进行高温灭菌的情况下，可将其再次进行第二次灭菌。此时，作为高温灭菌步骤，例如，加热历史(thermal history)对应于100℃至150℃的温度和1秒至30秒的保持时间；优选115℃至145℃进行1秒至20秒；更优选120℃至145℃进行1秒至10秒；并且甚至更优选125℃至145℃进行1秒至5秒。当实施高温灭菌时，蛋白质变性并且灭菌溶液容易稠化。换言之，如果不进行高温灭菌，那么混合溶液在灭菌之后难以变稠。因此，通过匀质化降低变稠程度的作用在进行高温灭菌时是特别有效的。

此外，当进行高温灭菌时，可以调节对调和液的压力(加压或减压)。此时，正常情况下，出于防止调和液沸腾等目的，例如，将灭菌压力设定在约1kg/cm²至10kg/cm²。即，在本发明的高温灭菌中，除了施加温度(加热)之外，还可以施加这种压力。用于高温灭菌的设备包括板型热交换器、管型热交换器、蒸汽注入型灭菌器、蒸汽灌入型灭菌器和焦耳加热型灭菌器。另一方面，在匀质化时，如果使用匀质化器，那么例如将温度设定在约10℃至60℃，且流速设定为约100L/h至10,000L/h，压力设定为10MPa至100MPa，优选20MPa至80MPa，更优选30MPa至70MPa，且更优选20MPa至50MPa。此外，如有需要，如高温灭菌和匀质化等操作的条件可以改变，并通过多种处理来进行。

在下文中，会参考更具体的实施例来描述本发明，但本发明不限于此。在调和步骤中，将前述温度下的温水在槽中搅拌，并且考虑到混合和分散的容易性，将除了维生素混合物(混合的维生素组分)之外的原料加入、混合并搅拌以产生调和液。为了促进混合和分散而添加原料的顺序因原料的量和性质而不同。因此，取决于组成，各种类型的混合组分可以一次(at once)添加或以多种顺序分开来添加。具体而言，例如，一种方法是以糖、蛋白质、油和脂肪、然后是矿物质的顺序添加它们。另一实例是以一部分糖、蛋白质其他糖、矿物质、然后是油和脂肪的顺序添加它们的方法。此外，另一实例是以油和脂肪、蛋白质、糖、然后是矿物质的顺序添加它们的方法。向该灭菌液中加入维生素混合物(混合的维生素组分)，矫味剂(香料)等并混合，以产生最终的灭菌液。对该最终的灭菌液进行蒸汽注入型加热灭菌，然后使用匀质化器匀质化(通过两阶段加压的匀质化)以生成组合物。

本发明的组合物可以用作针对流感感染具有预防效果的经肠营养剂。即，当将本发明的组合物混入流食或经肠营养剂时，由于所述流食或经肠营养剂本身具有针对流感感染的预防效果，其不仅可以用作食品，而且还可以用于预防流感感染的目的。其可以用作制成拥有至少以下功能之一的食品，例如特定保健用食品和营养机能食品等保健机能食品：

针对流感感染的预防作用；

增强中和抗体诱导的作用；或

在疫苗接种之后防止中和抗体效价降低的作用。

在有许多老年人和住院患者的设施中，其可成为增强流感疫苗的感染预防效果的预防手段。或者，其可用作供婴儿用的流感预防用婴儿食品、或通用的流感感染预防用营养食品。此外，在优选的实施方案中，本发明的组合物可以制成具有肠调节作用的组合物。因此，它还可以作为兼具肠功能调节作用的营养辅助医药品或流感感染预防食品来加以利用。

将此处引用的所有现有技术参考文献通过提述并入本说明书中。在下文中，会参考实施例进一步具体描述本发明。

实施例

[实施例1]向管饲患者接种流感疫苗之后的抗体效价测量：

[方法]

将接受管饲的患者分成两组，即试验组和对照组，并评估丙酸细菌培养物对流感疫苗的中和抗体诱导的作用。对照组和试验组的患者背景归纳于表1。当通过Student氏t检验(均匀分布)或Welch检验(不均匀分布)分析时，各组之间未显示患者背景中的显著差异。

对照组和试验组的患者背景

[表1]

通过Student氏t检验(均匀分布)或Welch检验(不均匀分布)分析统计学显著性。

向各组施用的流食如下：

对照组(11人)：常规组成流食；

试验组(11人；但对12人进行了粪便得分和菌群分析)：同时施用试验流食和丙酸细菌培养物。

“常规组成流食”是含有乳蛋白作为蛋白质，但是不含乳发酵组分或丙酸细菌培养物的流食。

另一方面，试验流食是含有乳发酵组分(3.8g/100kcal)作为蛋白质的流食。包括在试验流食中的乳发酵组分如下产生：使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵脱脂乳，浓缩；向其添加蜂蜜、维生素、矿物质、食用油脂、膳食纤维和糊精，然后灭菌。

此外，丙酸细菌培养物是弗氏丙酸杆菌(一种丙酸细菌)培养物。此外，丙酸细菌培养物含有DHNA(1，4-二羟基-2-萘甲酸)，其是来源于丙酸细菌培养物的组分。将同时施用试验流食和丙酸细菌培养物视为施用含有乳发酵组分和丙酸细菌培养物的新营养组合物。此外，施用半乳寡糖作为寡糖。

除了所述试验流食含有乳发酵组分之外，所述常规组成流食和所述试验流食之间没有实质区别。在实施例最后，显示了这些流食的组成(平均)(表6)。将每种组分施用于对照组(常规组成流食施用组)和试验组(试验流食施用组)二者使得不存在基于热量的显著差异。结果，向试验组中的患者分别添加如下量的乳发酵组分和丙酸细菌培养物：

乳发酵组分：平均33g/天；和

丙酸细菌培养物：平均1g/天(大约13μg/天，当换算成DHNA量时，或1.6μg DHNA每100kcal热量摄入)。

在各组中开始施用上述流食的日期定义为第-4周(分组时间)，并在四周之后(设为第0周)向上臂皮下接种0.5mL流感疫苗(H1N1型、H3N2型或B型疫苗)(Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)(图1)。在疫苗接种之前4周和之后4周，计算粪便中的双歧杆菌数，并比较肠道菌群。从各组中的所有受试者根据以下时间表采集血液，并测定针对疫苗的抗体效价和血液中的细胞因子浓度。为了测定血液中的细胞因子浓度，根据以下时间表收集血液：

在分组之日(第-4周)；

在流感疫苗接种之时(第0周)；和

疫苗接种之后2周(第2周)和6周(第6周)。

通过血凝抑制试验(HI法)测量了中和抗体，通过ELISA法测定了血液细胞因子，并通过实时PCR方法测定了粪便中的双歧杆菌数。比较两组在分组时间前后、以及在疫苗接种之后第2周和第5周的所述测量结果。此时，将少于10的抗体效价定义为5。

此外，关于粪便得分的值，对于每个患者从分组之时起(第-4周)根据Bristol粪便分级每天记录该得分(表2)，并分析该周的平均得分。Bristol粪便分级具有从1至7的七个等级，将1定义为最硬的粪便，7定义为水样的粪便，3和4定义为正常粪便。

如下进行统计学分析。通过chi方检验分析抑制感染的抗体的表达率的统计学显著性。关于中和抗体效价，计算log10(抗体效价)，然后通过Mann-Whitney U检验分析两组之间的统计学显著性，并且在疫苗接种之后通过Wilcoxon符号秩和检验进行分析。关于血液中的细胞因子浓度和肠道菌群，通过Student氏t检验(均匀分布)或Welch检验(不均匀分布)来分析两组之间的统计学显著性，通过相应的t检验分析每周试验之前和过程中的统计学显著性。两组之间的粪便得分的统计学显著性通过Mann-Whitney U检验来分析，并通过Wilconxon符号秩和检验来分析试验之前和过程中的统计学显著性。

[表2]Bristol粪便表

[结果]

将感染抑制抗体效价设为40或更高(Kojimahara N，等，Vaccine.2006；24：5966-9.，Scharpe J，等，Am J Kidney Dis.2009；54：77-85)，并且测定在分组之时(第-4周)和疫苗接种之时(第0周)平均抗体效价低于40的受试者在疫苗接种之后第2周和第6周的感染抑制抗体的表达率。通过chi方检验分析获得的结果。关于H1N1和H3N2抗原，对于第2周和第6周两个时间点，试验组中达到感染抑制抗体效价的受试者的表达率均高于对照组中。关于B-1抗原，在第6周两组中的表达率均为9％，但试验组在第2周具有比对照组高的表达率。此外，当在两组之间进行显著性检验时，在第6周在试验组中对于H3N2抗原的感染抑制抗体效价表达率显著更高(表3)。

因此，通过比较实验，揭示了通过同时摄入乳发酵组分和丙酸细菌培养物增强了流感疫苗的中和抗体诱导。

感染抑制抗体的表达率

[表3]

	H1N1	H3N2	B-1
					n  第2周   第6周	n  第2周   第6周	n  第2周   第6周
对照组	10 30％(3) 10％(1)	10 50％(5) 10％(1)	11 18％(2) 9％(1)
				试验组	9  44％(4) 44％(4)	11 64％(7) 64％(7)	11 27％(3) 9％(1)
P值	0.86    0.24	0.85    0.04	1       1

()表示患者数

比较在流感疫苗接种之后第2周和第6周的中和抗体效价，对照组中针对H1N1和H3N2抗原的抗体效价在第6周与第2周相比显著降低。而另一方面，在试验组中，所述中和抗体效价在第2周和第6周之间没有改变(图2A和图2B)。

接下来，当分析流感疫苗接种时间前后的肠道菌群时，试验组中的肠道双歧杆菌(Bifidobacterium)数(log10(细菌数/g粪便))从6.39±1.91增加至7.37±2.4，但对照组中为从6.65±2.97至6.18±2.80，没有任何改变(表4)。

肠道双歧杆菌数的变化(单位：细菌数/1g粪便的对数值)

[表4]

此外，试验组的粪便得分值在第-1、0、1、2和6周与分组时(第-4周)相比显著降低，并且观察到粪便的改善。而另一方面，对照组中在施用过程中的分数值与施用开始时相比没有显著降低(图3)。此外，试验组中在第3周和第6周粪便得分与对照组相比显著降低。

关于血液细胞因子浓度上的变化，在试验组和对照组之间不能观察到任何细胞因子的大的变化。然而，在试验组内，与疫苗接种之前(第-4周)相比在第6周的IL-7显著提高。此时，在对照组中，第-4周和第6周IL-7浓度没有观察到变化。

[IL-7]

在试验组中，IL-7浓度在第6周与第-4周(在分组之时或在第一次血液采样之时)相比显著增加，但在对照组中与第-4周相比未显示显著变化(图4)。此外，在对照组和试验组之间未观察到显著差异。

[IL-17]

在试验组和对照组二者中，IL-17浓度在第6周中与第-4周(在分组之时或在第一次血液采样之时)相比减少(对照组：p＜0.05，试验组：p＞0.05)(图4)。在对照组和试验组之间未观察到显著差异。

[TGF-β1]

在两组中，与第-4周相比在施用期间对于血液TGF-β1浓度均未观察到显著变化。另一方面，在第0周和第2周在试验组中与对照组相比观察到了显著增加。然而，因为血液TGF-β1浓度在分组之时(第-4周)(p＝0.074)在试验组中趋向于高于对照组，因此认为在对血液TGF-β1浓度的作用上两组之间没有区别(图4)。

从上述结果可见，组合施用乳发酵组合物和丙酸细菌培养物在流感疫苗接种时对中和抗体诱导具有特定增强效果。此外，组合施用乳发酵组分和丙酸细菌培养物显示了明显的肠功能调节作用。

[实施例2]生产新型流食的方法

在调和步骤中，考虑到混合和分散的容易性，将温水在槽中搅拌，将除维生素混合物(混合的维生素组分)之外的原料以油脂、乳发酵组分蛋白质、糖、矿物质和丙酸细菌培养物的顺序充入槽中(表5)。使用以下微生物作为乳酸细菌起子进行乳酸发酵制备了乳发酵组分：

嗜热链球菌OLS 3059(FERM BP-10740)；和

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL 1073R-1(FERM BP-10741)。

将该制备物通过蒸汽注入法进行加热灭菌，然后使用匀质机匀质化(通过两阶段加压的匀质化)以产生灭菌液。向该灭菌液中添加维生素混合物(混合的维生素组分)和矫味剂(香料)并混合以产生最终灭菌液。将该最终灭菌液通过蒸汽注入法进一步加热灭菌(两步灭菌)，然后使用匀质机匀质化(通过两阶段加压的匀质化)以产生组合物。这种组合物的质量和味道良好。

[表5]

新型流食的组成：

(每100kcal的组成)

(*)：维生素A的量以视黄醇当量表示。

[实施例3]生产新型流食的方法

按照与实施例2中所述类似的方式获得了组合物，只是乳发酵组分是通过使用以下微生物作为乳酸细菌起子的乳酸发酵制备的。与实施例2中一样，这种组合物的质量和味道良好。

用作乳酸细菌起子的微生物：

嗜热链球菌OLS3294(NITE P-77)；和

德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL 1255(NITE BP-76)。

[实施例4]生产新型流食的方法

按照与实施例2中所述类似的方式获得了组合物，只是乳发酵组分是通过使用乳酸细菌起子(使用接种用于生产由Meiji Dairies Corporation制造的“Meiji Bulgaria yogurt”的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)的乳酸发酵制备的。与实施例2中一样，这种组合物的质量和味道良好。

[表6]

用于比较的流食组成：

(每100kcal的组成)

(*)：维生素A的量以视黄醇当量表示。

工业实用性

本发明提供的含有丙酸细菌培养物的组合物可通过将其与乳发酵组分一起施用而用作对于流感感染的预防剂。本发明的组合物可增强接种流感疫苗的动物中流感病毒中和抗体的诱导。因此，通过向接种流感疫苗的动物施用本发明的组合物，能够增强所述疫苗预防感染或加重的效果。本发明的组合物也可混入食品或营养剂如流食以产生用于口服摄入的组合物，可以期待所述组合物产生预防流感的效果。此外，本发明的组合物可以额外含有乳发酵组分和寡糖。还可以期待通过施用所述组合物的肠功能调节作用。

Claims (17)

1.一种用于预防流感感染的组合物，其包含丙酸细菌培养物。

2.权利要求1的组合物，其中所述丙酸细菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)。

3.权利要求1的组合物，其附加地还包含乳发酵组分以及/或寡糖。

4.权利要求3的组合物，其中所述乳发酵组分是通过使用属于乳杆菌属(genus Lactobacillus)的乳酸细菌以及/或属于链球菌属(genus Streptococcus)的乳酸细菌将乳发酵而产生的乳或其混合物。

5.权利要求3的组合物，其中所述乳发酵组分是非成熟乳酪。

6.权利要求3的组合物，其中构成前述寡糖的糖中的至少一种是半乳糖。

7.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含丙酸细菌培养物和乳发酵组分，并且二者均已经过灭菌。

8.权利要求1的组合物，所述组合物用于经肠施用给接受流感疫苗接种的动物。

9.权利要求3的组合物，其包含以下营养物：

丙酸细菌培养物；

乳发酵组分；

寡糖；

蛋白质；

糖类；

脂质；和

膳食纤维。

10.权利要求9的组合物，其附加地还包含至少一种选自下组的营养素：维生素、矿物质、有机酸和有机碱。

11.一种用于在接种有流感疫苗的动物中促进流感病毒中和抗体的诱导的作用剂，其包含丙酸细菌培养物。

12.一种流感感染的预防方法，其包括以下步骤：

(1)向动物施用丙酸细菌培养物；和

(2)向动物接种流感疫苗。

13.权利要求12中所述的流感感染的预防方法，其中步骤(1)在步骤(2)之前、在步骤(2)之后或与步骤(2)同时进行至少一次。

14.权利要求12中所述的流感感染的预防方法，其中在步骤(1)中将所述丙酸细菌培养物与乳发酵组分以及/或寡糖一起施用。

15.一种包含以下组分的组合物：

(a)寡糖；

(b)乳发酵组分；和

(c)丙酸细菌培养物。

16.权利要求15的组合物，其中构成前述寡糖的糖中的至少一种是半乳糖。

17.权利要求15的组合物，所述组合物是用于调节肠功能的组合物。

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