TWI476000B - Production of Propionic Acid Bacteria in the Preparation of Preventive Agents for Influenza Infectious Diseases and Induction Promoters for Neutralizing Antibodies - Google Patents

Description

丙酸菌培養物在製備流行性感冒感染症之預防劑和中和抗體之誘導促進劑之用途

本發明係關於含有丙酸菌的培養物的組成物。或者，本發明係關於用於預防流行性感冒感染症的組成物或預防方法。

流行性感冒係以流行性感冒病毒為病原體的感染力強的感染症。流行性感冒病毒(Influenza virus)係屬於正黏病毒科(Orthomyxoviridae )的負股單鏈RNA病毒。正黏病毒科由流行性感冒病毒1個屬構成(1屬1科)。由於核蛋白質的抗原性的不同，流行性感冒病毒存在有A-C的3種次型。相對於專門以人類為寄主並感染的B型及C型，A型流行性感冒病毒可感染哺乳動物或鳥類等廣泛的生物。因此，會在鳥類或哺乳動物的體內發生基因的雜交，容易產生病原性或抗原性不同的變異病毒。

例如，近年來在全世界流行的豬流行性感冒，係由於A型H1N1亞型流行性感冒病毒的感染而發病的流行性感冒。豬的流行性感冒病毒，據認為會感染人類且與造成大流行有關。且據預測會大流行(pandemic)的鳥的強毒性流行性感冒，據認為是鳥類的強毒性流行性感冒病毒獲得對於人類的感染力而可能造成大流行(管原民枝等人，WHO)。

目前已有阻礙流行性感冒病毒增殖的治療藥市售。目前市售的流行性感冒的治療藥，當於感染後的早期階段適當投藥時，可期待有充分的治療效果。但是，尤其是對於老年人、孩童、患病者等高危險群，流行性感冒仍然是危險的感染症。又，也有人報告出現對於治療藥有抗藥性的病毒。

即使是已開發治療藥的現在，為了防止流行性感冒的重症化，接種流行性感冒疫苗仍有意義。若接種流行性感冒疫苗，則會誘導對抗流行性感冒病毒的中和抗體，可防止感染後的病毒的增殖或感染擴大(C. Avendano et al.,Zhu Q et al.)。對於與作為疫苗接種的病毒的抗原性類似的病毒，防止重症化的效果高。已有報告指出，與疫苗接種的健康正常的成人中的中和抗體的誘導率(70-90%)相比，老年人的誘導率較低(17-53%)(Goodwin K,et al.)。老年人由於免疫力降低，因此，若感染會重症化，有時會造成死亡，因此，提高於老年人的中和抗體誘導率尤其重要。

[先前技術文獻]

專利文獻1:WO 2001/028547

專利文獻2:WO 2004/085364

專利文獻3:WO 2007/023935

專利文獻4:WO 2005/094850

非專利文獻1：管原民枝等人，感染症誌，2008,82:427-433

非專利文獻2:World Health Organization: Department of Communicable Disease Surveillance and Response Global Influenza Programmed,2005.

非專利文獻3:C,Avendano et al.,J Parenter Enteral Nutr. 2004;28:348-54.

非專利文獻4:Zhu Q,et al.,Biochem Biophys Res Commun. 2005;329:87-94.

非專利文獻5:Goodwin K,et al.,Vaccine. 2006 Feb 20;24(8):1159-69.

本發明之課題在於提供一種含有丙酸菌的培養物的組成物。尤其本發明之課題在於提供一種具有流行性感冒病毒感染症的預防效果的組成物。或者，本發明之課題在於提供一種具有整腸作用的組成物。

流行性感冒疫苗的病毒感染預防作用，主要依存於病毒中和抗體的誘導。因此，疫苗接種後刺激中和抗體的誘導，據認為對於增強疫苗的預防作用有效。或者，病毒感染時，在患者體內形成一般的免疫反應所誘導的病毒中和抗體，為患者的重要生體防禦機能之一。本案發明人等，對於能夠增強因流行性感冒疫苗或病毒感染所產生的病毒中和抗體的誘導之成分反覆研究。結果發現，在投予特定的微生物培養物的動物中，流行性感冒疫苗接種時的病毒中和抗體的誘導被增強，乃完成本發明。亦即，本發明係關於以下組成物及其用途。

[1]　一種流行性感冒感染症的預防組成物，包含丙酸菌的培養物。

[2]　如[1]之流行性感冒感染症的預防組成物，其中丙酸菌為費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )。

[3]　如[1]之流行性感冒感染症的預防組成物，更額外地包含乳發酵成分及寡糖任一者或兩者。

[4]　如[3]之流行性感冒感染症的預防組成物，其中乳發酵成分係以乳酸桿菌(Lactobacillus )屬的乳酸菌及鏈球菌屬(Streptcoccus )的乳酸菌之任一者或兩者使乳發酵的乳、或其混合物。

[5]　如[3]或[4]之流行性感冒感染症的預防組成物，其中乳發酵成分為非熟成乳酪。

[6]　如[3]之流行性感冒感染症的預防組成物，其中構成前述寡糖的糖之至少一種為半乳糖。

[7]　如[3]或[4]之流行性感冒感染症的預防組成物，其中該組成物包含丙酸菌的培養物及乳發酵成分，且兩者經過殺菌。

[8]　如[1]至[5]中任一項之流行性感冒感染症的預防組成物，係用於對接種流行性感冒疫苗的動物經腸投予。

[9]　如[3]之流行性感冒感染症的預防組成物，包含以下營養素：丙酸菌的培養物；乳發酵成分；寡糖；蛋白質；糖；脂質；及食物纖維。

[10]　如[9]之流行性感冒感染症的預防組成物，更額外地包含選自由維生素類、礦物質類、有機酸及有機鹼所構成的群組中之至少1種營養素。

[11]　一種於已接種流行性感冒疫苗的動物中之流行性感冒病毒的中和抗體的誘導促進劑，包含丙酸菌的培養物。

[12]　一種流行性感冒感染症的預防方法，包含以下步驟：

(1)對於動物投予丙酸菌的培養物之步驟；及

(2)對於動物接種流行性感冒疫苗之步驟。

[13]　如[12]之流行性感冒感染症的預防方法，其中在步驟

(2)之前、後或同時，至少進行1次步驟(1)。

[14]　如[12]或[13]之流行性感冒感染症的預防方法，其中在步驟(1)中，丙酸菌的培養物與乳發酵成分及寡糖任一者或兩者一起投予。

[15]　一種組成物，含有以下成分(a)~(c)：

(a)寡糖、

(b)乳發酵成分，及

(c)丙酸菌的培養物。

[16]　如[15]之組成物，其中，構成前述寡糖的糖之至少一種為半乳糖。

[17]　如[15]或[16]之組成物，係整腸用組成物。

本發明之組成物，增強流行性感冒疫苗的中和抗體誘導作用。本發明的組成物可調製為既為流質食物等而投予人的成分來製造。因此，本發明的組成物已有高度安全性的保障。因而，不僅可與疫苗接種同時投予本發明之組成物，也可在其前後持續投予本發明之組成物。藉由持續的投予，可以持續期待因本發明之組成物所形成的中和抗體的誘導促進作用。

為了增強對始自於流行性感冒病毒的病毒疫苗的免疫反應，在疫苗中常會調配佐劑。調配疫苗的佐劑，當然要求高度安全性。因此，開發新穎的佐劑時，需要謹慎的安全性試驗。對此，構成本發明組成物的各成分，由於均已為食品被食用者，雖持續經腸投予人，也已證明沒有危險性。再者，本發明的組成物，可以組合公知的佐劑而經腸投予。亦即，不僅是安全性，從提供新的選項作為對疫苗的免疫反應的增強方法之觀點，本發明的意義重大。

本發明的組成物，其較佳態樣中，藉由既為流質食物或食品而廣泛攝取的成分之組合而提供。因此，藉由將本發明的組成物作成流質食物持續攝取，可造成對流行性感冒病毒的中和抗體的誘導能力常在增高的狀態。對於如老年人或住院患者具有流行性感冒重症化風險的人群，流行性感冒病毒的感染是嚴峻的問題。但是，若將本發明的組成物作成流質食物而預防性投予，則可提高族群全體對於感染的預防能力。

(實施發明的形態)

本發明提供包含丙酸菌的培養物之流行性感冒感染症的預防組成物，或流行性感冒感染症的預防劑。

本發明的預防劑或組成物，包含丙酸菌的培養物。丙酸菌，係指丙酸桿菌屬(Propionibacterium )的革蘭氏陽性的厭氧菌，無氧地從糖類形成丙酸的微生物。具體而言，可將如下的微生物培養物添加到本發明組成物中。

費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )、

特氏丙酸桿菌(P. thoenii )、

丙酸丙酸桿菌(P. acidipropionici )

詹氏丙酸桿菌(P. jensenii )等。

這些丙酸菌為用於製造乳酪(cheese)的微生物。除此之外，以下的微生物也可作為丙酸菌。

貪婪丙酸桿菌(P. avidum )、

座瘡丙酸桿菌(P. acnes )、

嗜淋巴丙酸桿菌(P .lymphophilum )、

顆粒丙酸桿菌(P .granulosam )。

這些微生物從自然界或發酵乳中單離的方法為公知。丙酸菌也可利用在瑞士乳酪(Swiss cheese)製造時使用的微生物。本發明中的丙酸菌培養物，係指將如上述的丙酸菌於適當的培養條件培養後的培養物。丙酸菌的培養方法為公知。丙酸菌在培養時，可應用WO03/016544A1等記載的條件。例如，培養丙酸菌的培養基，已知有在脫脂奶粉或脫脂奶粉的蛋白分解處理物中添加啤酒酵母萃取物等的組成。若在適當培養基中接種費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )而可增殖丙酸菌的條件下培養，可獲得丙酸菌的培養物。

或者，以高濃度培養丙酸菌的方法，有以在乳清蛋白濃縮物(Whey Protein Concentrate: WPC)或其酵素分解物中添加礦物質及單糖的培養基培養丙酸菌的方法(日本公開特許平10-304871號公報)。例如，以含有乳清蛋白濃縮物的培養基培養費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )而獲得的培養物，作為本發明的丙酸菌的培養物為較佳。或者，就丙酸菌的效率培養法而言，有將雙岐桿菌與丙酸菌以不同的培養槽一面使培養液循環一面培養的方法(日本公開特許平8-66178號公報)。藉由這些培養方法而獲得的丙酸菌培養物，也可調配於本發明的組成物中。

例如，添加乳清加工品作為培養基的主成分，可高密度地培養丙酸菌。乳清的加工品，例如以下成分。

乳清粉末，乳清或乳清粉末的蛋白酶處理物。

培養基中除了添加乳清蛋白以外，也可添加礦物質、單糖的混合物。為了降低培養基中的糖濃度，可添加乳清蛋白濃縮物(以下也稱為WPC)作為乳清蛋白質源。WPC可藉由將乳清進行透析處理而減少乳糖含量來獲得。乳清蛋白濃縮物，可進一步將蛋白質成分以高純度分離，而成為乳清蛋白分離物(以下也稱為WPI)。除了在培養基添加這些成分以外，也可分別添加適量的糖及不足的礦物質，將培養基的組成用於培養丙酸菌。

乳清係例如將脂肪、酪蛋白、脂溶性維生素等從牛乳除去時所殘留的水溶性成分。乳清一般而言，係在天然乳酪、粗凝乳酶酪蛋白製造時，為副產物而獲得的乳酪乳清或粗凝乳酶乳清(或也稱為甜乳清)、從脫脂乳製造酸酪蛋白或夸克乳酪(Quark Cheese)時獲得的酪蛋白乳清、夸克乳清(或也稱為酸乳清)。乳清的主成分為蛋白質(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等)、乳糖、水溶性維生素、鹽類(礦物質成分)，各別的特徵，在作為牛乳成分的研究較作為乳清成分的研究清楚。

「乳清相關製品」，例如：將乳清濃縮處理後的濃縮乳清、將乳清乾燥處理後的乳清粉末末、將乳清的主要蛋白質等以超過濾(Ultrafiltration:UF)法等進行濃縮處理後乾燥處理的乳清蛋白濃縮物(Whey Protein Concentrate：以下也稱為WPC)、將乳清利用微過濾(Microfiltration:MF)法或離心分離法等除去脂肪後以UF法濃縮處理後進行乾燥處理的脫脂WPC(低脂肪、高蛋白質)、將乳清的主要蛋白質利用離子交換樹脂法或凝膠過濾法等選擇性地分層處理後進行乾燥處理的乳清蛋白分離物(Whey Protein Isolate，以下也稱為WPI)、利用奈米過濾(Nanofiltration:NF)法或電透析法等進行脫鹽處理後乾燥處理的脫鹽乳清、將來自於乳清的礦物質成分進行沉澱處理後利用離心分離法等濃縮處理的礦物質濃縮乳清等。這些之中，含有乳蛋白質乾重(固體成分的)15%~80%的WPC，作為蛋白質濃縮乳清粉末的形式，根據平成10年3月30日乳等政府法令的部分修正，定義為乳製品(關於濃縮乳清、乳清粉末、WPC、乳清蛋白濃縮粉末，只要是經過乳等政府法令規定的製造步驟者即為乳製品，無論是否有經過脫鹽步驟)。

乳清蛋白濃縮物(WPC)，係將乳清的主要蛋白質等利用超過濾(Ultrafiltration:UF)法等濃縮處理後乾燥處理而獲得者。一般而言，為固體成分約25%以上為乳清(whey)蛋白者的總稱。可藉由從乳清使乳糖或鹽類等減少，使乳清蛋白質相對增加，使成為固體成分約25%~約80%而獲得。尤其，以含有乳蛋白質乾重15%~80%的WPC，依照乳等政府法令定義為蛋白質濃縮乳清粉末。

乳清蛋白濃縮物(WPC)的標準製造方法，如下所述。

(1)將乳清進行膜分離後，進行濃縮的階段。或

(2)將乳清進行膜分離後，進行濃縮、乾燥的階段。

又，濃縮處理可使用一般的裝置或方法，例如使用真空蒸發罐(蒸發器)、真空釜、薄膜垂直上升管狀型濃縮機、薄膜垂直下降管狀型濃縮機、平板型濃縮機等，於減壓下進行加熱的方法。又，於乾燥處理也可使用一般的裝置或方法，例如使用噴霧乾燥法(spray dry)、滾筒乾燥法、冷凍真空乾燥(freeze dry)法、真空(減壓)乾燥法等。

乳清蛋白分離物(WPI)係將乳清的主要蛋白質等利用離子交換樹脂法或電透析法等濃縮處理後進行乾燥處理而獲得者。一般而言，為固體成分約85%至約95%為乳清(whey)蛋白者的總稱。可藉由從乳清使乳糖或鹽類等減少，使乳清蛋白質相對增加，使成為固體成分約90%(85%~95%)而獲得。

乳清蛋白分離物(WPI)的標準製造方法，如下所述。

(1)將乳清進行膜分離或離子交換樹脂處理或電透析處理後，進行濃縮的階段。或

(2)將乳清進行膜分離或離子交換樹脂處理或電透析處理後，進行濃縮、乾燥的階段。

又，濃縮處理可使用一般的裝置或方法，例如使用真空蒸發罐(蒸發器)、真空釜、薄膜垂直上升管狀型濃縮機、薄膜垂直下降管狀型濃縮機、平板型濃縮機等，於減壓下進行加熱的方法。又，於乾燥處理也可使用一般的裝置或方法，例如使用噴霧乾燥法(spray dry)、滾筒乾燥法、冷凍真空乾燥(freeze dry)法、真空(減壓)乾燥法等。

本發明中，丙酸菌的培養的較佳培養基組成，可為如下所示的組成。以下所述數值均為重量比(W/W%)。以下，以百分比表示組成時，如無特別指明，為重量比(W/W%)。

蛋白質含量：1~5%，較佳為1.5~4.0%

糖含量：1~4%，較佳為1.5~3.0%

以能得到如此的含量的方式，調整乳清粉末、乳清蛋白或這些的蛋白酶處理物的添加量。又，糖不是乳糖，較佳為葡萄糖或將乳糖以乳糖酶處理後的單糖。

為了減少培養基的成本，而且獲得適於食用的培養物，可使用乳清礦物質的乳糖酶處理液作為糖及礦物質的供給源。具體而言，可將WPC作為蛋白質來源、乳清礦物質作為糖來源及礦物質來源。若將兩者的最適化比率之混合物利用作為培養基原料，則比起以乳清粉末作為培養基原料的情形，更可以高濃度培養丙酸菌。用於培養丙酸菌的詳細培養基製備方法如下所示。

將WPC(牛)還原後，以蛋白酶分解蛋白質。蛋白酶為來自麴菌的內切型及外切型，使用量定為分解的蛋白質量的3%。反應於50℃、pH7.0進行，持續攪拌3~5小時直到觀察到pH不再下降。乳清礦物質，以乳糖酶將乳糖分解。乳糖酶的使用量定為分解的糖量的2~8%，反應於50~60℃(55℃較佳)、pH5~6進行，持續攪拌直到蛋白質完全分解。

接著，較佳為將此述的兩液混合使得最終的培養基濃度為蛋白質濃度1~5%(較佳為1.5~4.0%)、糖濃度為1~4%(較佳為1.5~3.0%)。最後，在培養基中添加酵母萃取物、硫酸鈉、天冬醯胺酸等丙酸菌培養常用的成分，並將pH調整成5~8(較佳為5.5~7.5)，完成培養基的製備。丙酸菌的培養步驟如下所述。

亦即，培養基溫度定為20~40℃，以剛開始培養的活菌數為10⁷ ~10⁸ cfu/ml之菌元(starter)接種，培養3~4日。pH以碳酸鉀水溶液保持在pH5.5~7.5。於培養中也可追加葡萄糖。以如此方式獲得的培養物中，丙酸菌達到以往的約5倍。

如以上的培養條件，尤其適於乳酪用的丙酸菌的培養。乳酪用丙酸菌，除了費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )以外，可利用丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici )、詹氏丙酸桿菌(Propionibacterium jensenii )、特氏丙酸桿菌(Propionibacterium theonii )等。更具體而言，在本發明中可利用以如下列菌株作為丙酸菌所獲得的培養物。

費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )ATCC 6207

費氏丙酸桿菌(P .freudenreichii )ATCC 8262

費氏丙酸桿菌(P .freudenreichii )IFO 12424

費氏丙酸桿菌(P .freudenreichii )IFO 12426

費氏丙酸桿菌(P .freudenreichii )IFO 12391

費氏丙酸桿菌(P .freudenreichii )ET-3(FERM BP-8115)

這些丙酸菌可以單獨培養，也可將多數菌株混合並培養。或者，也可將複數個微生物單獨培養後，將獲得的培養物混合。以如此方式獲得的培養物，本身可直接供作飲食。也可將其進一步進行粉末化或液狀處理，以容易操作的型態加工處理為機能性原料。亦即，由上述丙酸菌的培養所獲得的培養物，可以直接或經加工後調配於本發明的組成物。

而且，該技術領域之人士為了將這些公知的方法更加最適化，可適當調整培養基組成或培養條件。例如，就氮源而言，除了酪蛋白、WPC等以外，也可更添加各種胺基酸或其鹽，以提高丙酸菌的增殖能力或流行性感冒感染症的預防效果。不僅是調整培養基組成，也可調整培養條件以達到最適化。培養條件，包含培養氣體氛圍的氧濃度、溫度、壓力等。

本發明的丙酸菌培養物，只要能夠維持流行性感冒病毒感染的預防效果，也可使用其分離出來的部分。因此，丙酸菌培養物，例如含有丙酸菌的培養物本身、培養上清液、菌體、這些的萃取物、這些的乾燥粉末或這些的稀釋物等。在此，「丙酸菌的培養物本身」，係指丙酸菌與培養基成分處於混合狀態者。培養基成分中的丙酸菌分散狀態是任意的。亦即，丙酸菌在培養基成分中為分散或沉澱均無妨。另一方面，「培養上清液」通常係指利用過濾或離心分離等，從「丙酸菌的培養物本身」將丙酸菌的菌體除去的狀態。再者，「菌體」係指從「丙酸菌的培養物本身」分離的丙酸菌。將培養基成分與丙酸菌的菌體分離時，通常兩者的分離不完全者也是被容許的。因此，例如從培養物分離的丙酸菌的菌體中混入培養基成分者也是被容許的。

例如，丙酸菌培養物分離出來的部分在促進流行性感冒疫苗接種後的中和抗體的誘導作用，比起相同丙酸菌的培養物(分離前)，為例如30%以上，較佳為50%以上，更佳為70%以上時，則可說維持了培養物的流行性感冒病毒感染的預防效果。

可將培養後的丙酸菌培養物進行殺菌而調配於本發明的組成物。或者，也可將與乳發酵成分與調配後的組成物進行殺菌。例如為牛奶時，依照乳等政府法令的規定，一般進行以下的加熱殺菌處理。

低溫保持殺菌，高溫保持殺菌，高溫短時間殺菌，超高溫瞬間殺菌。

本發明中的丙酸菌培養物或含有其的組成物，可適用這些殺菌法或滅菌法。殺菌處理可以批次單位進行，也可連續進行。根據殺菌方法，處理溫度、處理溫度不同，較佳為因應上述殺菌方法從50~200℃、0.1秒~1小時的範圍選擇。丙酸菌培養物的殺菌，希望保持在液中的溶氧量減低的狀態。因此，即使在加熱殺菌中，較佳為持續保持惰性氣體氛圍。惰性氣體，例如氮氣、氬氣、二氧化碳氣體等。其中，氮氣在空氣中大量存在，成本相對較低而且安全性已確認，不會影響飲食品的風味、品質，因此為較佳的惰性氣體。本案發明人等，已確認滅菌後的丙酸菌培養物可維持流行性感冒的預防效果。

本發明中，丙酸菌培養物的流行性感冒感染症的預防作用，在滅菌後仍然維持。通常，乳酸菌對於寄主的影響，依存於活菌的作用。因此，發現滅菌後的培養物具有有用的功能，是超越預想的見解。眾多報告益生菌(probiotics)或益生源(prebiotics)會改善腸內環境並活化免疫系統。一般而言，益生菌係指以活的狀態導入寄主腸內而帶來對寄主有益的作用之微生物。相對於益生菌，益生源係指以作用於原本棲息在腸內的微生物者，提供寄主有益作用的物質。例如，特別於人類的試驗中，具有對流行性感冒疫苗的中和抗體誘導之促進效果的益生菌之數種乳酸菌株已有報告。但是，這些乳酸菌係以活菌作用的益生菌，因此製造或品質管理不易。而且，活菌製劑一般而言保存性有極限。例如，於製造後即使將活菌製劑於低溫保存，也常無法長期保存。

相對於乳酸菌，本發明的丙酸菌培養物為益生源。經滅菌的培養物(益生源)中，不會因為微生物的活動造成品質變化。因此，於益生源中，能穩定維持流行性感冒感染症的預防效果。亦即，本發明的組成物，在製造或品質管理上容易。再者，為益生源的本發明組成物，可在常溫長期保存。又，一般而言期待經口投予而獲得乳酸菌活菌的效果時，必需考慮胃酸的影響。因為乳酸菌會因為胃酸而減少，無法將足夠量的活菌送達腸內。另一方面，本發明中，丙酸菌的流行性感冒感染症的預防效果，不依存於活菌的作用。因此，即使是經口投予仍能達成充分的流行性感冒的預防效果。

丙酸菌的培養物，在殺菌後可以加工為粉末狀或液狀。例如，可對於培養液添加適當的賦形劑，使培養基的固體成分為30~40重量%後，使乾燥並粉末化。賦形劑可利用脫脂奶粉、乳清粉末、生澱粉、糊精等。賦形劑除上述以外，視需要也可使用WPC、乳清蛋白分離物(Whey Protein Isolate:WPI)、加工澱粉。培養物的乾燥方法亦為公知。例如，可將培養液直接噴霧乾燥。加工澱粉，具體而言，例如糊精，除此以外，可利用可溶性澱粉、大英膠(British gum)、氧化澱粉、澱粉酯、澱粉醚等。或者，可將培養液與賦形劑的還原液混合，濃縮至固體成分成為30~40重量%後，進行噴霧乾燥。乾燥的培養物，可藉由於充填時進行脫氧處理(封入氮氣或添加脫氧劑等)而能穩定地長期保存。也可加工為經碾磨(trituration)的製劑(0.2%碾磨粉末)，使容易用在食品。

丙酸菌的培養物，已知具有乳酸菌的增殖促進作用。具有如此作用的丙酸菌培養物或其加工品，稱為「雙岐桿菌增殖促進物」(Bifidogenic Growth Stimulator ;BGS)。BGS，只要是在已接種流行性感冒疫苗的動物中，具有促進對流行性感冒病毒的中和抗體的產生的作用者，即可在本發明中作為丙酸菌的培養物利用。

本發明中的丙酸菌培養物，較佳為由丙酸菌而來的乳清發酵物。例如，使產生雙岐桿菌增殖促進物(Bifidogenic Growth Stimulator;BGS)的費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )ET3株以10%乳清粉還原液發酵獲得的丙酸菌培養物，可包含於本發明的組成物中作為有效成分。例如，含有BGS的丙酸菌培養物，稱為「Profec」，其係經許可作為特定保健用食品的參與成分。含有「Profec」的組成物，有B.G.S powder(明治乳業製，商品名)、腹活力錠(明治乳業製，商品名；「腹活力」為明治乳業(股)公司的註冊商標)市售。因此，「B.G.S powder」或「腹活力錠」，也可利用於作為本發明的組成物。

尤其，含有Profec的BGS，為1,4-二羥基-2-萘甲酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA))與2-胺基-3-羧基-1,4-萘醌(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))。其中，DHNA為微生物的維生素K2(menaquinone)的生合成中間體。這些物質將雙岐桿菌的能量代謝過程中所生成的NADH有效率地再氧化而促進增殖。因此，丙酸菌培養物，可利用以下成分(i)及(ii)任一者或兩者。亦即，本發明提供一種流行性感冒感染症的預防劑，包含

(i)1,4-二羥基-2-萘甲酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA))，及

(ii)2-胺基-3-羧基-1,4-萘醌(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))任一者或兩者。

本發明中，含有上述成分(i)及/或(ii)的流行性感冒感染症之預防劑的投予量，通常對於成人，以丙酸菌培養物中所含的DHNA量為指標時，一般而言，丙酸菌培養物中所含的DHNA量為0.01μg/kg-100mg/kg的範圍。視情形，有時在此以下已足夠，又，反之，有時需要在此以上的用量。又，也可於1日分成2~4次投予。投予量可考慮年齡、體重等患者的狀態、投予路徑、期待的預防效果的程度等而設定。

Profec由於可專一性地增加人類腸內雙岐桿菌(Bifidobacterium )，因此被認可為特定保健用食品的參與成分(依田伸生：ILSI,No.80,5-13(2004))。現在含有Profec的組成物，已有「B.G.S powder」或「腹活力錠」市售。因此取得並無困難。然而，藉由對於已接種流行性感冒疫苗的動物投予Profec，而強化中和抗體的誘導為未知。亦即，本發明提供一種對於已接種流行性感冒疫苗的動物之中和抗體的誘導促進劑，包含

(i)1,4-二羥基-2-萘甲酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA))，及

(ii)2-胺基-3-羧基-1,4-萘醌(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))任一者或兩者。

或者，本發明關於一種用於促進已接種流行性感冒疫苗的動物中的中和抗體的誘導之醫藥組成物，包含上述成分(i)及(ii)任一者或兩者。

本發明的組成物中，調配1,4-二羥基-2-萘甲酸(DHNA)時，希望組成物的溶氧程度為低保持。因為溶氧使DHNA分解，造成保存中其濃度降低。使含有DHNA的組成物中的溶氧程度降低的方法為公知(WO 2004/85364)。具體而言，組成物為液狀時，藉由以不含氧的氣體對於該液體組成物打氣泡，可將溶氧取代為氧以外的氣體。不含氧的氣體，以氮氣較佳。而且，藉由將具有抗氧化性的化合物與DHNA同時添加，可將溶氧程度壓低。具有抗氧化性的化合物，可利用公知的抗氧化劑。具體而言，作為抗氧化劑為公知的有：次亞硫酸、抗壞血酸(維生素C)、異抗壞血酸、胡蘿蔔素、生育酚、具有抗氧化作用的多酚類。

多酚類，除了合成品以外，也可利用來自於天然物的多酚。例如，茶類、葡萄、檸檬、咖啡、紫芋、大豆等來源的多酚為公知。可將含有多量這些多酚的果實類或蔬菜類、種子類、植物葉片等的榨汁液，或這些的萃取物，作為多酚調配於本發明的組成物。例如，可利用水或有機溶劑萃取，而獲得多酚萃取物。又，這些含有天然多酚的製品之濃縮物或精製物、乾燥物，也可作為多酚使用。

抗氧化劑的添加量，視抗氧化劑的種類，以通常作為抗氧化用途使用的添加量之等量或以上添加，可使溶氧程度降低。例如，當不進行惰性氣體的打氣泡，而將抗壞血酸單獨添加於組成物以期待DHNA的安定性時，相對於溶液的總重量，可添加0.01重量%以上的抗壞血酸。抗氧化劑可在添加DHNA於組成物之前添加於該組成物。或者，可與DHNA同時添加於組成物中，以防止其分解。例如添加抗壞血酸作為抗氧化劑時，其添加量每100kcal(或組成物每100g)，例如可為1μg-2g，通常為150μg-1.5g，較佳為1mg-500mg左右。

丙酸菌的培養物，相對於組成物全體，例如可以0.001~20%的比例調配，通常為0.01~15%，較佳為0.01~10%。或者，本發明的組成物全體所含的乳發酵成分，以添加夸克乳酪作為乳發酵成分時，夸克乳酪的蛋白質部分的濃度，相對於組成物全體，可定為約0.01%~約30%，較佳為約0.1%~約20%，更佳為0.5%~約10%。

本發明的組成物可為液狀、糊狀或乾燥的固體物等任意劑型。本發明的組成物可對於丙酸菌的培養物調配適於經腸投予的、或藥學上可容許的載體而製成組成物。更具體而言，可製劑化為錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等。或者，也可以將丙酸菌培養物分散於乳發酵成分的狀態供給。這些各種製劑，可依照常法，對於主劑使用賦形劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、矯味劑、溶解輔助劑、懸浮劑、包覆劑、溶劑、等張化劑等醫藥的製劑技術領域中通常可使用的已知輔助劑而製劑化。又，也可含有適量的鈣等礦物質。再者，也可添加適量的維生素、礦物質、有機酸、糖類、胺基酸、胜肽類等。有機酸包含短鏈脂肪酸等脂肪酸類。

丙酸菌的乳清發酵物，可期待優異的整腸作用一事已為公知。但是，丙酸菌培養物的流行性感冒感染症的預防作用為未知。

本發明的組成物，更可額外地添加乳發酵成分或寡糖。亦即，本發明係關於一種組成物，包含以下成分(a)~(c)：

(a)寡糖

(b)乳發酵成分，及

(c)丙酸菌培養物。

一般而言，寡糖也稱為少糖類，係指2~20個糖鏈以糖苷鍵鍵結的化合物。例如，本發明中，可利用以下的糖類作為寡糖。

乳果寡糖、異麥芽寡糖、果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、大豆寡糖、黑麴黴寡糖、龍膽寡糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等。

寡糖之中，存在容易於酸性條件分解的化合物。因此，本發明的組成物或含有本發明組成物的食品為酸性時，宜使用於酸性條件下穩定的寡糖。例如，構成糖含有半乳糖的寡糖，宜作為於酸性條件調配的寡糖。本發明中，構成糖含有半乳糖的寡糖，包含2~20個糖以糖苷鍵鍵結的化合物，且也包含構成化合物的糖包含1個或複數個半乳糖者。更具體而言，較佳的寡糖例如棉子糖族寡糖(大豆寡糖)、半乳寡糖等。其中，半乳寡糖為本發明中較佳的寡糖。

本發明中，半乳寡糖係指主要以半乳糖作為構成糖的寡糖。半乳寡糖之例，包括以乳糖(Ga1(β1-4)G1c)作為基本構造，具有於其鍵結1~數個半乳糖殘基構造的寡糖，或半乳糖與葡萄糖以β-1,3鍵結等的雙糖類(轉移雙糖類)、Ga1-(Ga1)n-G1c(n=1~18)、Ga1-(Ga1)n-Ga1(n=1~18)。本發明中，構成半乳寡糖的半乳糖殘基的數目，通常為1~20，較佳為1~10，更佳為1~8。又，構成半乳寡糖的半乳糖的比例，相對於構成半乳寡糖的單糖的總數，例如可為10%以上，較佳為30%以上，更佳為50%以上。半乳寡糖的製造方法，例如使半乳糖轉移能力高的β-半乳糖苷酶作用於乳糖(澤入淑人，半乳寡糖的機能及對於食品的應用，Food Style 21,2,pp76-78(1998)。β-半乳糖苷酶，可利用例如羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii )、環形芽孢桿菌(Bacillus circulans )等微生物來源者。

又，特定保健用食品(規格基準型)制度中的規格基準，將從乳糖利用β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galactohydrolase,E.C. 3.2.1.23，隱球菌屬酵母來源)的作用生成的寡糖，定義為半乳寡糖。如此生成的半乳寡糖，係在乳糖的半乳糖殘基上以糖苷鍵鍵結1個或複數個半乳糖的寡糖，且以4’-半乳糖苷基乳糖((Ga1(β1-4)Ga1(β1-4)G1c)為主成分(平成17年7月1日食安發第070100號厚生勞動省醫藥食品局食品安全部長通知、「特定保健用食品(規格基準型)制度創設配套的規格基準的設定等」)。

在母乳中含有半乳寡糖，具有適性增加腸內的雙岐桿菌的效果，已知為不易消化吸收的糖。又，已知胃切除手術後的礦物質補給，半乳寡糖為有用者(國際公開WO 98/15196)。而且，相對於果糖寡糖在強酸性下會水解(中村厚子，使用果糖寡糖的糖醋豬肉或煮物中的糖的變化，東京家政學院大學紀要，43,pp49-53(2003))，半乳寡糖具有在酸性條件下或加熱條件下不易因為分解產生衰減的性質(澤入淑人，半乳寡糖的機能及對於食品的應用，Food Style 21,2,pp76-78(1998)。藉由在本發明的組成物中添加寡糖，可更強化組成物的整腸作用。亦即，本發明的組成物，可為整腸用的組成物而利用。下痢等胃腸症狀，為流行性感冒病毒的代表性感染症狀之一。因此，兼具整腸作用的組成物，可說是流行性感冒感染症的預防用組成物希望有的特徵。

本發明的組成物中含有的寡糖濃度，相對於組成物全體的含量，約0.001~約20.0%，較佳為約0.05~約11%，更佳為約0.1~約6%。寡糖的調配量，可因應劑型、症狀、體重等而調整。

本發明的組成物，除了含有丙酸菌的培養物，也可含有寡糖及乳發酵成分之任一者或兩者。

本發明中，乳發酵成分，係指將動物的乳汁以微生物或酵素作用發酵成的加工品。本發明中，動物乳汁包含牛乳、水牛乳、山羊乳、羊乳及馬乳等。其中，牛的乳(牛乳)，由於可輕易獲得多量的原料乳，於經濟面有利。乳發酵成分，不僅是由生乳採集的乳，也可由其分離的部分或經加工者而製作。乳的分離部分或加工品，例如部分脫脂乳、脫脂乳、還原全乳、還原脫脂乳、還原部分脫脂乳、乳清、酪蛋白、脫脂奶粉、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)、奶油、白脫乳、鮮奶油等。這些的乳來源的加工品，有時稱為原料乳。原料乳與可以單獨或混合不同的原料乳，作為乳發酵成分的原料。

本發明中，乳發酵成分，可在乳中加入微生物使發酵後的培養物而獲得。微生物的培養物，只要是調配丙酸菌時具有流行性感冒感染症的預防效果，則其分離出來的部分可作為本發明中的乳發酵成分利用。以發酵為目的加入乳的微生物，一般稱為菌元(starter)。乳發酵使用的微生物宜為乳酸菌或雙岐桿菌。具體而言，例如如下述屬的乳酸菌或雙岐桿菌可作為菌元獲得乳發酵成分。

乳酸桿菌(Lactobacillus )屬、鏈球菌(Streptococcus )屬、乳球菌(Lactococcus )屬、念球菌(Leuconostoc )屬，及足球菌(Pediococcus )屬等。

更具體而言，由以下的微生物而來的乳發酵成分為公知。由這些微生物獲得的乳發酵成分，宜為本發明中作為乳發酵成分。

乳酸菌：乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis )、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris )、雙乙醯鏈球菌(Streptococcus diacetylactis )、腸球菌(Enterococcus faecium )、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis )、凱氏乳酸桿菌(Lactobacillus casei )、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus )、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)、德氏乳酸桿菌乳酸亞種(Lactobacillu delbrueckii subsp. lactis)、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri )、黏液乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae )、鼠乳酸桿菌(Lactobacillus murinus )、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )、口乳酸桿菌(Lactobacillus oris )、洛德乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri )，及鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)

雙岐桿菌：龍根雙岐桿菌(Bifidobacterium longum )、分支雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum )，及短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve )

將這些微生物從自然界或發酵乳單離的方法為公知。或者可從細胞庫等分讓已經單離的微生物而取得。再者，用於獲得乳發酵成分的乳酸菌菌元，已有市售。利用市售的乳酸菌菌元製造的乳發酵成分，也可利用於本發明的組成物。依照生成的發酵乳的pH或物理性狀差異，有多數製品在販售。發酵乳的物理性狀，係指硬度或滑順度(smoothness)。市售的乳酸菌菌元，只要是與丙酸菌培養物同時投予時，能促進由於流行性感冒疫苗而來的中和抗體的誘導，即可利用為作為用於獲得本發明中乳發酵成分的乳酸菌菌元。

本發明中，為了獲得乳發酵成分，可將如下的微生物接種於原料乳中作為乳酸菌菌元。

保加利亞乳酸桿菌(L. bulgaricus )、嗜熱鏈球菌(S. thermophilus )、乳酸乳球菌(L. lactis )、

一般的發酵乳製造中，原料乳中也可添加這些乳酸菌以外的選自乳酸菌或酵母菌之1種或2種以上。但是，本發明中，利用在CODEX規格中規格化為優酪乳菌元的保加利亞乳酸桿菌(L. bulgaricus )與嗜熱鏈球菌(S. thermophilus )的混合菌元為佳。而且，加入額外的微生物時，也可於該混合菌元中，考慮目的發酵乳的發酵溫度或發酵條件而混合追加的微生物。額外混合於混合菌元的微生物，例如加氏乳酸桿菌(L. gasseri )或雙岐桿菌(Bifidobacterium )等其他的乳酸菌。

本發明中，作為混合菌元添加於原料乳的微生物也可從寄存於細胞庫的微生物中選擇。能利用為混合菌元的希望菌株例如以下：

保加利亞乳酸桿菌(L. bulgaricus )JCM 1002T

嗜熱鏈球菌(S. thermophilus )ATCC 19258

由以下的微生物的混合培養物構成的乳酸菌菌元：

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )OLS 3059(FERM BP-10740)

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )OLS3294(NITE P-77)

德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)OLL 1073R-1(FERM BP-10741)

德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)OLL 1255(NITE BP-76)

由這些微生物的發酵獲得的乳酪、天然乳酪、優酪乳、發酵乳、乳清(whey)發酵物、乳清乳酪等，包含於本發明的乳發酵成分。用於調配於本發明組成物的乳發酵成分，例如減少發酵乳(優酪乳)的水分(乳清)者(例如日本特許第3,179,555號)。發酵乳(優酪乳)來源的蛋白質，胺基酸級數為100，經發酵使蛋白質的消化吸收性增加，營養價值高。

這些乳發酵成分當中，例如乳酪為本發明較佳乳發酵成分。例如，可將使用1種或組合2種以上液狀乳原料而製備的液狀乳以乳酸菌發酵後，藉由添加酵素或酸而使成為凝乳(curd)。乳酪係從凝乳除去乳清者。無論有無固體化或熟成，從凝乳除去乳清者稱為乳酪。乳酪可大致分成製造後經過熟成步驟的熟成乳酪與非熟成乳酪。乳酪的熟成步驟，通常進行乳酸菌或真菌的繁殖(發酵)，並形成各種乳酪特有的風味。相對於熟成乳酪，維持從凝乳除去乳清的狀態的乳酪為非熟成乳酪。非熟成乳酪(新鮮乳酪)，宜為本發明中之乳發酵成分。非熟成乳酪(新鮮乳酪)有鄉村乳酪(cottage cheese)、夸克乳酪(quark cheese)、絲狀乳酪(string cheese)、納紗泰爾乳酪(neuchateli cheese)、鮮奶油乳酪、莫札瑞啦乳酪(mozzarella cheese)、瑞可達乳酪(ricotta cheese)、瑪斯卡波乳酪(mascarpone)等許多種類。這些新鮮乳酪之中，本發明較佳為使用夸克乳酪。夸克乳酪的製造方法為公知(例如日本特開平6-228013,Cheese and Fermented Milk Foods,Volume I: Origins and Principles,Frank V,Kosikowski and Vikram V. Mistry,F.V. Kosikowski,L.L.C.,1999,pp 147-161)。夸克乳酪為一種乳酪(一般名)，其營養學的組成已經明瞭(Milk and Dairy Product Technology,Edgar Spreer;Axel Mixa,Marcel Dekker Inc,1998,pp.245-249)。

以下說明非熟成乳酪的一般製造法。首先，從原料乳製造凝乳。在原料乳中接種菌元並培養後，再添加粗凝乳酶製成凝乳(curd)。在製造凝乳之前，視需要可將原料乳進行前處理。例如，為了使製造批次之間的品質差異減小，可混合多種乳原料而進行品質調節。此種處理稱為標準化。又，也可將乳中的脂肪球進行機械性破壞的均質化(homogenize)處理。或者，為了去除混入乳原料的微生物，也可施行離心除菌或加熱處理。

從獲得的凝乳(curd)將乳清(whey)分離而獲得的固體成分，為非熟成乳酪(新鮮乳酪)。利用離心分離或膜分離從凝乳分離乳清的方法為公知。例如，可將夸克分離機等離心分離機利用於乳清的分離。或者，可視需要預先將凝乳切斷或利用加溫使得分離過程有效率。

更具體而言，以如下的原料與步驟可獲得的新鮮乳酪，在本發明中作為乳發酵成分較佳。以下步驟中，發酵主要使用保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus )及/或嗜熱鏈球菌(Streptcoccus thermophilus )。

將脫脂牛奶進行加熱殺菌；接種0.5~5%乳酸菌菌元開始發酵；從pH到達4.6而形成的凝乳分離乳清；將已分離乳清的凝乳冷卻，獲得非熟成乳酪。

以如此方式可製造的非熟成乳酪，一般也有人稱為夸克(Quark)乳酪。非熟成乳酪的組成的一例，如下所述。

總固體成分17~19%、蛋白質11~13%、脂肪1%以下(亦即0-1%)、碳水化合物2~8%、乳糖2%以下(亦即0-2%)

乳發酵成分的調配量，來自於乳發酵成分的蛋白質，相對於組成物全體，例如為約0.01~30%，通常為約0.1~20%，較佳為約0.5~10%的比例調配。又，組成物每100ml，可調配0.01~33g、0.1~22g、0.5~11g，較佳為2~6g，更佳為2.5~4.5g。或者，本發明的組成物全體所含的來自於乳發酵成分的蛋白質，相對於組成物全體的蛋白質質量，可為約0.1~100%，較佳約1~100%，更佳為約30%~100%。

除此之外，也可將在經加熱殺菌的脫脂乳中加入屬於乳球菌(Lactococcus )屬的乳酸菌作為乳酸菌菌元並使發酵的乳發酵成分，製成本發明的非熟成乳酪。更具體而言，也可利用將以下微生物混合而成的乳酸菌菌元。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis )、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris )，及乳酸鏈球菌(Leuconostoc )屬的微生物。

混合上述微生物的乳酸菌菌元添加到經過加熱殺菌的脫脂乳培養，可獲得凝乳(curd)。也可從乳發酵成分除去乳清而成為非熟成乳酪。事先將以發酵獲得的凝乳以裁刀切斷，一面加溫一面分離乳清而獲得的非熟成乳酪，也包含在本發明的乳發酵成分。

此外，在原料乳中添加粗凝乳酶(rennet)使凝固者，包含於本發明之非熟成乳酪中。粗凝乳酶係指以凝乳酶(chymosin，EC 3.4.23.4)為主成分的乳酪等的製造原料。

本發明的組成物可經腸投予。經腸投予，係指將本發明的組成物送達腸管。因此，不僅是經口投予，注腸投予或利用各種經管餵食(tube feeding)的投予方法也包含在經腸投予。經管餵食是對於難以經口攝食的患者，通過管子直接投予流質食物等到消化管的方法。由於管子設置方法的不同，有以下的投予路徑。

經鼻腔(nasal feeding)外廔(external fistula)胃廔(percutaneous endoscpic gastrostomy;PEG)空腸廔(jejunostomy)。

外廔(external fistula)係指管子從腹壁外通到消化管內，包含胃廔或空腸廔。再者，將組成物從肛門注入直腸內的注腸投予，也包含在經腸投予中。經口投予時，組成物的劑型為任意。但是，為了經管投予或注腸投予，本發明的組成物以糊狀、半固體化或液狀為有利。

本發明的組成物，對於預防動物的流行性感冒病毒感染有用。本發明中，動物係指為流行性感冒病毒寄主的哺乳動物或鳥類。哺乳類，以人為首、豬等，已知有流行性感冒病毒的感染例。除了豬以外，牛、山羊、羊、馬、水牛、駱駝以外，也適用在寵物或動物園飼養的動物或家畜。又，鳥類，在雞等家禽或多數野鳥也觀察到有流行性感冒病毒的感染。這些動物種，均可期待藉由投予本發明的組成物而有流行性感冒感染症的預防效果。本發明的組成物對於動物投予時，可將本發明的組成物調配於飼料中投予。

對於本發明的組成物調配乳發酵成分的情形，乳發酵成分的投予(攝取)量，1日以體重每1公斤以固體成分含量計，為例如約1mg~約20g，較佳為約10mg~約15g，更佳為約50mg~約10g。投予量可因應劑型、症狀、性別、年齡、體重等調整。

例如，將乳發酵成分調配於本發明組成物而投予人時，投予量一般為每日以固體成分含量計，為例如約0.05g~約1500g，較佳為約0.05g~約1000g，更佳為約2.5g~約800g。對於必需利用本發明組成物促進中和抗體誘導者，可一次或分次在餐前、餐後、餐間及/或睡前適當投予。投予量可分別因應受投予者的年齡、體重及投予目的而適當調整。也可將本發明的組成物用於取代餐食，也可利用作為餐飲的輔助。

構成本發明組成物的丙酸菌培養物，或可額外地添加的乳發酵成分或寡糖，均已利用作為營養劑或流質食物的成分。因此，調配含有這些成分的營養劑或流質食物而，也可作為本發明的組成物。例如，含有BGS的丙酸菌培養物稱為「Profec」，已許可作為特定保健用食品的參與成分。商品名「B.G.S. powder」或「腹活力錠」，包含以丙酸菌發酵的乳清發酵物「Profec」。又，商品名「Fibren YH」(明治乳業)係含有乳發酵成分的流質食物。因此，將這些商品依照如上述調配比調配，也可獲得本發明的組成物。

再者，組合含有丙酸菌培養物的組成物與含有乳發酵成分的組成物，也可構成流行性感冒感染症的預防用套組。亦即，本發明係關於一種流行性感冒感染症的預防用套組，由

(a)含有丙酸菌培養物的組成物，及

(b)含有乳發酵成分的組成物，所構成。

或者，本發明提供一種促進已接種流行性感冒疫苗的動物中流行性感冒病毒的中和抗體誘導的套組，包含上述組成物(a)及(b)。本發明的套組，例如可組合含有丙酸菌培養物的營養組成物與含有乳發酵成分的營養組成物所構成。這些營養組成物，以流質食物或營養劑的形式流通。

本案發明人等發現，攝取了丙酸菌培養物的人因接種流行性感冒疫苗所形成的中和抗體的誘導被增強。亦即，本發明提供含有丙酸菌培養物之組成物，用於對接種流行性感冒疫苗的動物經腸投予。或者，本發明提供一種已接種流行性感冒疫苗的動物中流行性感冒病毒的中和抗體的誘導促進劑，含有丙酸菌培養物。本發明的組成物或中和抗體的誘導促進劑，在較佳態樣中可額外含有乳發酵成分與寡糖之兩者之一或兩者。

而且，本發明關於將丙酸菌培養物使用於已接種流行性感冒疫苗的動物中流行性感冒病毒的中和抗體的誘導促進劑之製造。或者，本發明關於將丙酸菌培養物於促進已接種流行性感冒疫苗的動物中之中和抗體的誘導之使用。而且，本發明關於一種已接種流行性感冒疫苗的動物中的中和抗體的誘導促進劑之製造方法，包含調配丙酸菌培養物與藥學上可容許知載體的步驟。

而且，本發明關於將丙酸菌培養物於流行性感冒感染症預防劑之製造的用途。或者，本發明關於將丙酸菌培養物於流行性感冒感染症的預防之使用。

或者，本發明提供一種用於促進已經接種流行性感冒病毒疫苗的動物中流行性感冒病毒的中和抗體的誘導之醫藥組成物，包含丙酸菌培養物。更者，本發明提供一種丙酸菌培養物之使用，用於促進已經接種流行性感冒病毒疫苗的動物中流行性感冒病毒的中和抗體的誘導之醫藥組成物的製造。本發明的醫藥組成物，包含藥學上有效量的丙酸菌培養物。本發明的醫藥組成物，可調配適於經口投予或經腸投予的載體。本發明的醫藥組成物，能以誘導已接種流行性感冒疫苗的動物中的中和抗體的誘導之目的，與流質食物一起投予。

本發明中，流行性感冒疫苗包含以預防流行性感冒病毒感染或預防感染後重症化的目的所投予的疫苗。現在在日本實用化的不活化疫苗或在海外實用化的經鼻疫苗，包含於本發明之流行性感冒疫苗中。不活化疫苗，一般係以皮下、皮內或肌肉內投予。另一方面，經鼻疫苗，為活的病毒疫苗。經鼻疫苗，以鼻腔內噴霧誘導氣道黏膜中病毒感染的預防效果高的IgA抗體為目的。

或者，本發明提供一種流行性感冒感染症的預防方法，包含以下步驟：

(1)對動物投予丙酸菌培養物之步驟；及

(2)對動物接種流行性感冒疫苗之步驟。

本發明中，流行性感冒感染症的預防，具體而言，包含防止流行性感冒病毒感染及防止流行性感冒病毒感染後的重症化之兩者之一或兩者。流行性感冒感染症，係由於病原體流行性感冒病毒的感染所帶來的各種症狀所伴隨的感染性疾病。本發明中，有時流行性感冒感染症僅記載為「流行性感冒」。流行性感冒感染症的重症化，包含以下狀態：感染症狀嚴重化、感染症狀的種類增加、病毒感染組織或感染細胞增加、病毒於生體內增殖。

因此，阻礙這些狀態之至少一種者，意味著本發明中之流行性感冒感染症之預防。本發明中，流行性感冒感染症之預防，包含流行性感冒病毒感染的預防。更具體而言，強化病毒中和抗體的誘導者，包含在流行性感冒病毒感染的預防。藉由流行性感冒疫苗的接種而誘導活體內的中和抗體，隨時間其產生的程度會降低。防止中和抗體的降低者，則對流行性感冒感染症的預防有貢獻。因此，防止中和抗體產生的程度降低，也包含在病毒中和抗體的誘導促進中。

中和抗體，對防止流行性感冒病毒在體內的感染組織或感染細胞的擴大具有貢獻。利用本發明的組成物或本發明的方法，可期待流行性感冒感染症的預防效果的動物種為流行性感冒病毒的寄主動物。更具體而言，例如人類或包含人類的動物或人類以外的動物。

又，由於本發明的組成物所具有的流行性感冒感染症的預防效果，不依存於流行性感冒病毒的抗原性。因此，對於各種種類的流行性感冒病毒的感染預防有效。尤其，對於A型及其亞型的流行性感冒病毒，為本發明中作為預防感染的流行性感冒病毒為佳。更具體而言，以人、豬、鳥等為寄主的A型流行性感冒病毒，為本發明之適當的預防對象。

中和抗體的誘導的促進，例如可利用下述方法確認。亦即，對於已投予本發明組成物的群組及未投予的群組，同樣投予流行性感冒疫苗，可比較在兩群組的病毒中和抗體的誘導狀態。此時，各群組的構成成員，除了組成物投予以外，其餘的條件相同。亦即，希望群組之中的健康狀態、年齡、體格、性別比等條件是以無偏頗的方式配置。遺傳的特徵也儘可能均質者為理想。因此，以人類為對象時，希望人種為同群組。在非人類動物中確認預防效果時，儘可能利用遺傳上為同一群組。

在如此的條件之下，對於兩群組以相同時程施行組成物的投予及疫苗的接種。並且，在已投予本發明組成物的群組中，當中和抗體的誘導顯著增強時，可確認該組成物的流行性感冒感染症預防效果。在此，所謂中和抗體的誘導增強，例如下述者可確認。以下所示指標中，中和抗體價，可藉由比較例如超過群組間的阻止感染抗體價的個體比例(表現率)而評估。

當中和抗體的抗體價的上升快速時，當中和抗體的產生長期持續時，或達到高的中和抗體價時，因此，藉由投予本發明的組成物，如果已確認此述之一的效果的個體數顯著增加時，則可確認該組成物的流行性感冒感染症的預防效果。用於定量評價中和抗體價的方法為公知。例如，利用感染性流行性感冒病毒與培養細胞，可確認抗體的感染阻礙效果。藉由將抗體系列稀釋，可定量地比較感染阻礙作用。

本發明中，丙酸菌的培養物，可在疫苗接種的前後或接種同時投予。較佳為，從疫苗接種前至後，連續投予丙酸菌的培養物。亦即，本發明提供含有丙酸菌培養物的組成物，用於在疫苗接種前後連續經腸投予接種流行性感冒疫苗的動物。所謂疫苗接種的前後，以疫苗接種日為第0日，係指例如-150~+150日，通常為-60~+60日，或-8週~+8週。

於該期間中，本發明的組成物，以藥學上有效量每1日至少投予1次。每1日的投予量，也可分成數次投予。或者，也可每隔1日投予。再者，本發明中，也可將丙酸菌培養物的有效量，組合其調配比不同的多種組成物而投予。

實際上，本案發明人等，確認在流行性感冒疫苗投予前後攝取丙酸菌培養物的人，疫苗所產生的中和抗體的誘導受到促進。因此，本發明提供在已投予流行性感冒疫苗的動物中促進或增強中和抗體的誘導之方法，包含以下步驟(1)及(2)。

(1)對動物投予丙酸菌培養物之步驟；及

(2)對動物接種流行性感冒疫苗之步驟。

本發明的組成物，不僅可期待在疫苗接種時促進中和抗體的誘導，而且可期待病毒感染時強化中和抗體的誘導之作用。因此，本發明的組成物，在感染流行性感冒病毒的患者中，也能提高患者本身的病毒中和抗體的產生能力，抑制患者體內病毒感染擴大而緩和症狀。尤其當感染強毒性病毒時，預測不僅是呼吸道感染，有引發全身症狀的危險性。本發明的組成物，藉由使患者持續攝取，可期待提高對感染病毒的中和抗體的誘導能力，防止重症化的作用。

本發明的組成物能以醫藥品或飲食品任一種的形態利用。例如，藉由以醫藥品的形式直接投予，能增強流行性感冒疫苗的中和抗體的誘導。或者，期待流行性感冒疫苗的預防效果的增強，也可以作為特定保健用食品等特別用途食品或營養機能食品攝取。又，也可不問液狀、糊狀、固體、粉末等形態，添加於各種飲食品，作為食品攝取。作為飲食品，可例如牛奶、清涼飲料、發酵乳、優酪乳、乳酪、麵包、軟餅乾、薄脆餅乾、比薩麵餅皮、調製奶粉、流質食物、病人用食品、營養食品、冷凍食品、食品組成物、加工食品等其他市售食品等。本發明的組成物製成酸性醫藥品或飲食品的形態時，其pH可定為pH2.0~pH6.0，較佳為pH3.0~pH5.0。

本發明的組成物連續投予動物時，也可為營養劑或飲食品或飼料投予。本發明的組成物作為營養劑或飲食品或飼料投予時，除了調配乳發酵成分與丙酸菌培養物之外，藉由調配額外的營養素，可調整其營養學的組成。本發明中，附加的營養素，可使用水、蛋白質、糖、脂質、維生素類、礦物質類、有機酸、短鏈脂肪酸、有機鹼、果汁、香料類等。這些營養素，可使用如下的成分。

蛋白質：(動物性蛋白質或植物性蛋白質，或這些的分解物)全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂奶粉、酪蛋白、乳清、乳清粉末、乳清蛋白質、乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、大豆蛋白質、雞蛋蛋白質、肉蛋白質等。

乳來源的脂質或糖類等：奶油、乳清礦物質、鮮奶油、非蛋白質態氮、唾液酸、磷脂質、乳糖等各種乳來源成分等胜肽或胺基酸類：酪蛋白磷酸胜肽、精胺酸、離胺酸等胜肽或各種胺基酸

糖類：加工澱粉(糊精(麥芽糊精、難消化糊精等)、可溶性澱粉、大英澱粉、氧化澱粉、澱粉酯、澱粉醚等)、食物纖維等

油脂類：豬脂、魚油等、這些的分別油、氫化油、酯交換油等動物性油脂；棕櫚油、葵花油、玉米油、菜籽油、椰子油、這些的分別油、氫化油、酯交換油等植物性油脂等

維生素類：維生素A、胡蘿蔔素類、維生素B群、維生素C、維生素D群、維生素E、維生素K群、維生素P、維生素Q、菸鹼、菸鹼酸、泛酸、生物素、肌醇、膽鹼、葉酸等

礦物質類：鈣、磷、鉀、氯、鎂、鈉、銅、鐵、錳、鋅、硒、鉻、鉬等

有機酸類：蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸等

短鏈脂肪酸類：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等

這些額外的營養素，可利用化學合成者或天然物來源的成分之一。或者，也可將含有目的成分的食品作為原材料進行調配。這些成分，可與目的營養劑的組成一併，以至少一種或組合2種以上進行調配。組成物的形態，可為固體也可為液體。又，也可為凝膠狀或半固體等。因此，營養劑為流質食物投予也可以。

實際上，如後述實施例所示，本發明的組成物，藉由攝取含有丙酸菌培養物的流質食物，促進已接種流行性感冒疫苗的寄主動物中流行性感冒病毒中和抗體的誘導。因此，具有已調配丙酸菌培養物的流質食物之組成的組成物，為本發明之較佳態樣之一。亦即，本發明關於一種促進已攝取流行性感冒疫苗的對象中流行性感冒病毒中和抗體的誘導之流質食物的製造方法，包含將丙酸菌培養物調配於流質食物的步驟。或者，本發明提供一種對於流質食物賦予促進已攝取流行性感冒疫苗的對象中流行性感冒病毒中和抗體的誘導能力之方法，包含將丙酸菌培養物調配於流質食物的步驟。再者，本發明提供一種流行性感冒感染症的預防組成物，包含以下營養素。

丙酸菌培養物；乳發酵成分；寡糖；蛋白質；糖；脂質；及食物纖維。

上述組成中，丙酸菌的培養物，可為例如

(i) 1,4-二羥基-2-萘甲酸(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA))，及

(ii) 2-胺基-3-羧基-1,4-萘醌(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone(ACNQ))兩者之一或兩者。又，上述組成中的乳發酵成分含有蛋白質時，蛋白質也可再調配額外不同來源的蛋白質。例如，除乳發酵成分以外，也可調配乳成分。同樣地，上述組成中的糖也可調配寡糖以外的糖。

構成本發明組成物的各成分，可因應流質食物投予的對象體格、年齡、性別等各條件適當調整。更具體而言，一般組成可例示如下述之組成(每100mL)。

丙酸菌培養物：1mg~22g，通常為10mg~17g，較佳為10mg~11g，或：DHNA量為0.01μg~15mg，通常為0.5μg~10mg，較佳為0.5μg~0.1mg；乳發酵成分：0.01g~33g，通常為0.1g~22g，較佳為0.5g~11g(就蛋白質質量而言)；寡糖：1mg~20g，通常為50mg~11g，較佳為0.1g~6g；蛋白質：0.01g~50g，通常為0.1g~30g，較佳為0.5g~15g；糖：0.1g~40g，通常為0.5g~30g，較佳為1g~25g；脂質：0.1g~20g，通常為0.3g~15g，較佳為0.6g~10g；及食物纖維：0~15g，通常為0~10g，較佳為0~8g。

上述組成中，在調配含有DHNA的丙酸菌培養物時，該培養物的量，以DHNA換算，可調配成如上述組成者。同樣地，上述組成中調配的寡糖，也可作為糖的一部分調配。亦即，寡糖構成上述組成中的糖一部分。

本發明的組成物中，也可以更額外地調配選自由維生素類、礦物質類、有機酸或短鏈脂肪酸及有機鹼構成之群組中之至少1個營養素。調配這些成分時的組成，可因應流質食物的投予對象的體格、年齡、性別等各條件適當調整。更具體而言，一般組成例如以下組成(每100mL)。

維生素類：0~2g，通常為0~1.5g，更佳為0~500mg；礦物質類：0~5g，通常為0~3g，較佳為0~2g；有機酸或短鏈脂肪酸：0~5g，通常為0~3g，較佳為0~2g。

亦即，本發明提供一種用於增強因流行性感冒疫苗所形成的中和抗體的誘導之流質食物的製造方法，包含以上述組成調配上述營養素的步驟。依照本發明製造的流質食物，顯示該流質食物於流行性感冒疫苗接種前後投予已接種流行性感冒疫苗的對象，會促進對象中對流行性感冒病毒的中和抗體的誘導。

本發明的組成物，可將丙酸菌培養物與例如藥學上可容許的載體調配而製備。在調配額外的成分時，上述糖、蛋白質、脂質等作為載體，或作為流質食物混合，均質混合而製備。乳發酵成分與丙酸菌培養物來源的蛋白質以組成物中的蛋白質之約1重量%以上的比例，例如約30重量%以上的比例，較佳為該組成物中的蛋白質70重量%以上的比例，更佳為約100重量%的比例調製。本發明的組成物製備為流質食物時，希望調整為每1ml為0.1~3kcal，較佳為0.7~2kcal。又，混合時，也可添加由維生素類或礦物質類及食物纖維所構成的額外成分之至少1種以上。食物纖維分成水溶性食物纖維與不溶性食物纖維，兩者皆可使用。具體而言，水溶性食物纖維可為例如以下成分。

果膠(原果膠、果膠酯酸、果膠酸)、瓜爾膠水解物、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖、印度車前子(psyllium)、玉米纖維、藻酸、藻酸分解物、鹿角菜膠、

難消化性糊精

不溶性食物纖維例如結晶纖維素、甜菜纖維、小麥麩等。較佳為，使用果膠、瓜爾膠水解物、難消化性糊精。又，視情形，也可添加香料或其他調配物。

上述之各種成分混合後充填於容器，視需要施行加熱殺菌處理，可製成流質食物或經腸營養劑。組成物的pH為酸性時，加熱處理可於較通常更溫和的條件進行。例如，中性流質食物的加熱殺菌處理為蒸餾器殺菌條件120-130℃、20-40分鐘，間接殺菌條件140-145℃、4-10秒，本發明組成物可於80-90℃實施15-30分鐘的蒸餾器殺菌或95-110℃實施20-60秒的間接殺菌。由於溫和的殺菌條件，可使風味良好，也容許調配對熱不耐的成分。又，本發明的組成物可利用瓊脂或明膠製成凝膠狀，或利用噴霧乾燥製成顆粒狀食品、醫藥品，或甚至固體的食品、醫藥品。

本發明的組成物，可根據流質食物或經腸營養劑的領域公知的方法製造。例如，將液狀組成物預先加熱滅菌後再無菌充填於容器的方法(例如，併用UHT殺菌法及無菌包裝法的方法)，或將液狀組成物充填於容器後和容器一起加熱滅菌的方法(例如蒸餾器法、高壓釜法)等。亦即，組成物的使用形態為液狀時，依據該組成物的均質化物(殺菌液經過均質化者)視需要再度於約120~145℃加熱殺菌約1~10秒後，冷卻再進行無菌充填，或充填於罐容器或軟質袋後進行蒸餾器殺菌。組成物的使用形態為粉末時，該均質化物進行例如噴霧乾燥或冷凍乾燥。

以下對於本發明詳細說明，但是本發明不限於下述各形態。本發明中，調和(添加、混合)原料時，係加溫調和。若調和溫度為90℃等的高溫時，蛋白質會凝固(凝乳化)，若調和溫度為2℃等的低溫時，蛋白質不易溶解或分散於水等。因此，調和步驟，較佳溫度為5~85℃，更佳為15~75℃，又更佳為25~55℃，尤佳為35~50℃。又，此時，宜考慮調和液中的細菌(污染菌等)的增殖，採用適當的調和時間。

再者，本發明中，將調和液進行高溫殺菌後進行均質化。高溫殺菌(加熱)時蛋白質會變性而黏度增加(增黏)，但是，藉由高溫殺菌後進行均質化，能減低其增黏程度。在此，進行高溫殺菌後均質化，係指進行高溫殺菌後，在充填於容器等製品前進行均質化，其次數不限於1次，也可為2次以上的複數次。例如，將調和液殺菌後，直接進行第2次殺菌時，在該第2次殺菌後也進行均質化。又，也可在調和液殺菌後均質化，再於第2次時也殺菌時，在該第2次殺菌後重新第2次均質化。又，也可於調和液殺菌後均質化，且不殺菌而重新第2次均質化。亦即，本發明中，將調和液進行高溫殺菌後，在充填於容器等而製成製品前為止，即使1次均質化也是重要。

另一方面，將經過高溫殺菌後的調和液(殺菌液)均質化後，只要是殺菌液未增黏的程度，則可再度殺菌。例如，可將調和液殺菌後均質化，並且不高溫殺菌而重新第2次殺菌。此時，高溫殺菌步驟，例如為相當於溫度為100~150℃、保持時間為1~30秒，較佳為115~145℃、1~20秒，更佳為120~145℃、1~10秒，又更佳為125~140℃、1~5秒的熱履歷。若高溫殺菌，則蛋白質會變性，殺菌液容易增黏。換言之，若不高溫殺菌，則殺菌後的混合液不易增黏。因此，利用均質化減低增黏程度的效果，於進行高溫殺菌時可說是特別有效。

又，進行高溫殺菌時等，也可對調和液調整壓力(加壓或減壓)。此時，通常為了防止調合液沸騰等目的，例如，殺菌壓力定為約1~10kg/cm² 左右。因此，本發明的高溫殺菌，除了溫度(加熱)，也可施加如此的壓力。高溫殺菌裝置為例如：板式熱交換器、管式熱交換器、蒸氣注入式殺菌器、蒸氣灌輸式殺菌機、通電加熱式殺菌機等。另一方面，均質化時，使用均質機，例如設定溫度為約10~60℃、流量為約100~10000L/h，則壓力為10~100MPa，較佳為20~80MPa，更佳為30~70MPa，又更佳為20~50MPa。又，若有需要，也可改變高溫殺菌或均質化等的操作條件，進行數次處理。

以下對於本發明舉更詳細的例子說明，但是本發明不限於這些。調和步驟中，將前述溫度的溫水在槽內攪拌好，考慮混合維生素混合物(維生物的混合成分)以外的原料擴散容易度，依序添加、混合、攪拌，製成調和液。使原料容易混合、擴散的投入順序，視原料量或特性而不同。因此，可因應組成，將各主調配成分一次或分幾次以各種順序投入。具體而言，例如，有依序投入糖、蛋白質、油脂、礦物質的方法。又一例，有依序投入一部分糖、蛋白質、其他糖類、礦物質、油脂的方法。又另一例，有依序投入油脂、蛋白質、糖、礦物質的方法。將該調和液以蒸氣注入式加熱殺菌後，以均質機均質化(以2階段壓力均質化)，製成殺菌液。對於此殺菌液添加維生素混合物(維生素的混成成分)、風味劑(香料)等並混合，製成最終的殺菌液。將該最終殺菌液再以蒸氣灌輸式加熱殺菌(二階段殺菌)後，以均質機均質化(以二階段壓力均質化)，獲得組成物。

本發明的組成物，可作為具有流行性感冒感染症的預防效果之經腸營養劑利用。亦即，本發明組成物調配於流質食物或經腸營養劑時，流質食物或經腸營養劑本身具有流行性感冒感染症的預防效果，因此，不單是食品，也可使用於流行性感冒感染症的預防目的。具有下述機能之至少一種的食品，例如可作為特定保健用食品、營養機能食品等保健機能食品使用。

流行性感冒感染症的預防作用、中和抗體的誘導增強作用，或防止疫苗接種後的中和抗體價降低的作用。

在老年人或醫院住院患者多的設施，可考慮作為提高流行性感冒疫苗的感染預防效果的預防方法等。或者，也可利用於作為乳幼兒用的流行性感冒預防用的嬰兒食品、一般用的流行性感冒感染症的預防用營養食品。又，本發明組成物的希望態樣，可製成具有整腸作用的組成物。因此，也可作為兼有整腸作用的營養輔助醫藥品或流行性感冒感染症的預防用食品而利用。

本說明書中引用的所有先前技術文獻，作為參照納入本說明書。以下基於實施例對於本發明更具體說明。

實施例 實施例1：對於經管餵食患者接種流行性感冒疫苗後的抗體價測定： [方法]

將經管餵食患者分成試驗群與對照群兩群，評價丙酸菌培養物對流行性感冒疫苗之中和抗體的誘導的影響。對照群與試驗群的患者背景如表1所示。以Students’t檢定(等分散)或Welch檢定(非等分散)分析，認為患者背景在群組間沒有顯著差異。

對照群與試驗群的患者背景

統計學上的顯著差異，以Students’t檢定(等分散)或Welch檢定(非等分散)分析。

對於各群組投予的流質食物如下。

對照群(11位)：一般組成的流質食物

試驗群(11位，但便性級數與菌叢的分析係以12位為對象進行)：將試驗的流質食物與丙酸菌培養物同時投予。

「一般流質食物」為含有乳蛋白質作為蛋白質，且不含乳發酵成分或丙酸菌培養物的流質食物。

另一方面，試驗的流質食物，為含有乳發酵成分(3.8g/100kcal)作為蛋白質的流質食物。試驗的流質食物中所含的乳發酵成分，係在利用保加利亞乳酸桿菌(L. bulgaricus )與嗜熱鏈球菌(S. thermophilus )使脫脂乳發酵並濃縮者，添加蜂蜜、維生素、礦物質、食用油脂、食物纖維、糊精並殺菌。

丙酸菌培養物為丙酸菌的費氏丙酸桿菌。又，丙酸菌的培養物中含有丙酸菌的培養物來源成分的DHNA(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid)。試驗的流質食物與丙酸菌培養物的同時投予，視為投予含有乳發酵成分與丙酸菌培養物的新穎營養組成物。寡糖使用半乳寡糖。

試驗的流質食物除了含有乳發酵成分以外，在一般流質食物與試驗流質食物之間本質上沒有不同。在實施例的最後，顯示這些流質食物的組成(平均)(表6)。以對照群(一般組成的流質食物投予群組)與試驗群(試驗的流質食物投予群組)在卡路里基礎上沒有顯著差異地投予各組成物。其結果，對於試驗群的患者，各別投予下列量的乳發酵成分與丙酸菌培養物。

乳發酵成分：平均33g/day

丙酸菌培養物：平均1g/day(換算為DHNA量，為約13μg/day，或每攝取100kcal卡路里的DHNA量為1.6μg)

對於各群組開始投予上述流質食物的日定為第-4週(分群時)，於4週之後(第0週)，在上腕皮下接種流行性感冒疫苗0.5mL(H1N1型、H3N2型、B型的疫苗)(化血研)(圖1)。於疫苗接種的4週前及4週後，計數糞便中的雙岐桿菌，比較腸內菌叢。以如下時程從各群組的所有受試者採血，測定對於疫苗的抗體價及血中的細胞激素濃度。為了測定血中的細胞激素濃度，依照以下時程採血。

分各群組之日(第-4週)、接種流行性感冒疫苗時(第0週)，及接種疫苗2週後(第2週)及6週後(第6週)中和抗體以紅血球凝集抑制試驗(HI法)測定，血中細胞激素的測定方法為ELISA，便中的雙岐桿菌數以即時PCR法測定。將測定結果於兩群組間、分群組前後，及接種疫苗第2週與第6週比較。此時，抗體價小於10，為5。

又，便性的級數值，係從分群組時(第-4週)起，依照布氏便形狀級別(表2)，每日記錄，以各患者1週的平均級數進行分析。布氏便形狀級別有1~7的7階段，1為最硬的便，7為水狀的便，3及4為正常便。

統計分析以如下方式進行。阻止感染抗體表現率在統計學上的顯著差異，以chi-square檢定分析。關於中和抗體力價，係計算log10(抗體價)後，兩群組間在統計學上的顯著差異以Mann-Whitney U檢定分析，疫苗接種後以Wilcoxon符號排序和檢定分析。關於腸內菌叢及血中細胞激素濃度，兩群組間在統計學上的顯著差異以Students’t檢定(等分散)或Welch檢定(非等分散)分析，試驗前與試驗中各週在統計學上的顯著差異以有對應的t檢定分析。

便性級數在統計學上的顯著差異，兩群組間以Mann-Whitney U檢定分析，試驗前與試驗中在統計學上的顯著差異以Wilcoxon符號排序和檢定分析。

[結果]

將阻止感染抗體價定為40以上(Kojimahara N,et al.,Vaccine. 2006;24:5966-9,Scharpe J,et al.,Am J Kidney Dis. 2009;54:77-85.)，以分群組(第-4週)與疫苗接種時(第0週)的平均值求取抗體價小於40的受試者的疫苗接種後第2週及第6週的阻止感染抗體表現率。以chi-square檢定分析獲得的結果。關於H1N1、H3N2的抗原，第2週及第6週的兩個時點均為試驗群較對照群達到阻止感染抗體價的受試者表現率較高。關於B-1抗原，第6週兩群組均有9%的表現率，但是，於第2週時，試驗群的表現率高於對照群。又，對兩群組間進行顯著差異檢定時，H3N2抗原於第6週時，試驗群組的阻止感染抗體價表現率顯著較高(表3)。

因此，由本次的比較實驗，瞭解藉由同時攝取乳發酵成分及丙酸菌培養物，使流行性感冒疫苗所產生的中和抗體的誘導增強。

阻止感染抗體的表現率

比較於第2週及第6週的流行性感冒疫苗接種後的中和抗體力價，抗H1N1與H3N2抗原的抗體力價，對照群中，第6週比起第2週顯著降低。另一方面，於試驗群中，於第2週及第6週之間，中和抗體力價未變化(圖2A、圖2B)。

其次，分析流行性感冒疫苗接種前後的腸內菌叢，於試驗群中，腸內雙岐桿菌數(log10(菌數/g糞便)從6.39+ 1.91增加到7.37+ 2.40，但是於對照群組，從6.65+ 2.97到6.18+ 2.80，未變化(表4)。腸內雙岐桿菌數的變化(單位：糞便重量每1g的菌數的對數值)

又，試驗群的第-1、0、1、2、6週的便性級數值，比起分群組時(第-4週)顯著下降，可見到便性的改善。另一方面，對照群在投予期間中的級數值，比起投予開始時未有顯著降低(圖3)。又，關於便性的級數，試驗群比起對照群，在第3週及第6週有顯著降低。

關於血液中的細胞激素的濃度變化，針對任一細胞激素，在試驗群與對照群之間未見到大的變化。但是，關於IL-7，試驗群中，第6週比起攝取前(第-4週)有顯著上升。此時的對照群，於第-4週及第6週未見到濃度有變化。

[IL-7]

試驗群中，第6週比起第-4週(分群組時或第1次採血時)，IL-7濃度顯著上升，但是，於對照群，比起第-4週未有顯著變化(圖4)。又，在對照群與試驗群之間也未見到顯著差異。

[IL-17]

試驗群、對照群均為，第6週比起第-4週(分群組時或第1次採血時)IL-17濃度降低(對照群：p<0.05，試驗群：p>0.05)(圖4)。在對照群與試驗群之間未見到顯著差異。

[TGF-β1]

兩群均為，血中TGF-β1濃度投予期間中相對於第-4週未見到顯著變化。另一方面，試驗群比起對照群，在第0週與第2週有顯著上升。但是，於分群組時(第-4週)，試驗群已經比起對照群的血中TGF-β1濃度有較高的傾向(p=0.074)，因此，可認為兩群組間對於血中TGF-β1濃度的影響沒有差異(圖4)。

由以上的結果可知，乳發酵成分與丙酸菌培養物複合投予時，對於流行性感冒疫苗接種時的中和抗體的誘導有專一性的增強作用。又，乳發酵成分與丙酸菌培養物的複合投予，顯示明顯的整腸作用。

實施例2：新穎流質食物的製造方法

調和步驟為，先將溫水在槽內攪拌好，考慮維生素混合(維生素的混合成分)以外的原料(表5)混合、擴散的容易度，依序投入油脂、乳發酵成分蛋白質、糖、礦物質、丙酸菌培養物。乳發酵成分，係使用以下微生物作為乳酸菌菌元利用乳酸發酵製備。

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )OLS 3059(FERM BP-10470)，及德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulfgaricus)OLL 1073R-1(FERM BP-10741)。

將該調和液，以蒸氣注入式加熱殺菌後，以均質機均質化(以二段壓力均質化)，作為殺菌液。對於該殺菌液添加維生素混合物(維生素的混合成分)、風味劑(香料)並混合，作為最終的殺菌液。將該最終殺菌液，再以蒸氣灌輸式加熱殺菌(二段殺菌)後，以均質機均質化(以二段壓力均質化)獲得組成物。該組成物的品質或風味良好。

實施例3：新穎流質食物的製造方法

使用以下微生物作為乳酸菌菌元利用乳酸發酵製備乳發酵成分，除此以外，與實施例2同樣進行，獲得組成物。與實施例2同樣，該組成物的品質或風味良好。

作為乳酸菌菌元利用的微生物：

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus ) OLS3294(NITE P-77)，及

德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)OLL 1255(NITE BP-76)

實施例4：新穎流質食物的製造方法

使用乳酸菌菌元(為了製造明治乳業公司製「明治Bulgaria yogurt」而接種保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus )與嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus ))利用乳酸發酵製備乳發酵成分，除此以外，與實施例2同樣進行，獲得組成物。與實施例2同樣，該組成物的品質或風味良好。

[產業利用性]

本發明所提供之含有丙酸菌培養物的組成物，藉由與乳發酵成分一起投予，可作為流行性感冒感染症的預防劑利用。本發明的組成物，增強已接種流行性感冒疫苗的動物中流行性感冒病毒的中和抗體的誘導。因此，對於接種流行性感冒疫苗的動物投予本發明的組成物，可提高疫苗的重症化或感染預防效果。本發明的組成物，調配於流質食物等營養劑或食品，可製成能期待流行性感冒預防作用的經口攝取用組成物。本發明的組成物可更含有額外的乳發酵成分與寡糖。藉由投予該組成物，也可期待整腸作用。

圖1顯示實驗流程(各流質食物的投予時間、疫苗接種及抗體測定時點，及腸內菌叢分析時點)。

圖2顯示乳發酵成分與丙酸菌培養物的投予對接種疫苗後的中和抗體價的影響。圖中，縱軸表示抗體力價的對數值(log10)，橫軸表示接種疫苗後的時間(週數)。對照群與試驗群2群間的統計學上的顯著差異，利用Mann-Whitney U檢定分析，接種疫苗後第2週及第6週之間的統計學上的顯著差異，利用Wilcoxon符號排序和檢定分析。*表示第6週相對於第2週在感染中和抗體價有顯著差異(p<0.05)。A：對於H1N1的中和抗體價，B：對於H3N2的中和抗體價，C：對於B1抗原的中和抗體價。

圖3顯示試驗期間中的糞便級數的變化。圖中，縱軸表示布氏糞便級別(1-7)，橫軸表示各流質食物的投予時間(週)。對照群與試驗群2群間的統計學上的顯著差異，利用Mann-Whitney U檢定分析，試驗前與試驗中各週的統計學上的顯著差異，利用Wilcoxon符號排序和檢定分析。*表示對照群與試驗群有顯著差異(p<0.05)，且a表示相對於分群時(-4週)有顯著差異(p<0.05)。

圖4顯示乳發酵成分與丙酸菌培養物對於流行性感冒疫苗接種時的血中細胞激素濃度的影響。圖中，縱軸表示A:IL-7濃度(pg/ml)、B:IL-17濃度(pg/ml)，及C:TGF-β1濃度(ng/ml)。橫軸表示以分群時定為-4時，採血時的時間(週)。對照群與試驗群2群間的統計學上的顯著差異以Students’t檢定(等分散)或Welch的檢定(非等分散)分析，試驗前與試驗中各週間的統計學上的顯著差異以對應的t檢定分析。

Claims (11)

1. 一種丙酸菌培養物在製備流行性感冒感染症的預防劑之用途，其中，該丙酸菌為費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )，而且，該丙酸菌培養物用於對欲接種流行性感冒疫苗之動物，在接種前、接種後或接種同時，進行至少一次的投予。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該流行性感冒感染症的預防劑更額外地包含乳發酵成分及寡糖的任一者或兩者。
3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中乳發酵成分係以乳酸桿菌屬(Lactobacillus )的乳酸菌及鏈球菌屬(Streptococcus )的乳酸菌的任一者或兩者使乳發酵的乳、或其混合物。
4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中乳發酵成分為非熟成乳酪。
5. 如申請專利範圍第2項之用途，其中構成該寡糖的糖之至少一種為半乳糖。
6. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該丙酸菌培養物及乳發酵成分兩者皆經過殺菌。
7. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該丙酸菌的培養物係對接種流行性感冒疫苗的動物經腸投予。
8. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該流行性感冒感染症的預防劑包含下述營養素：丙酸菌的培養物； 乳發酵成分；寡糖；蛋白質；糖；脂質；及食物纖維。
9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該流行性感冒感染症的預防劑更額外地包含選自由維生素類、礦物質類、有機酸及有機鹼所構成的群組中之至少1種營養素。
10. 如申請專利範圍第2項之用途，其中，該丙酸菌的培養物與該乳發酵成分及寡糖任一者或兩者用於對該欲接種流行性感冒疫苗之動物投予。
11. 一種丙酸菌培養物在製備流行性感冒病毒的中和抗體之誘導促進劑之用途，其中，該丙酸菌培養物用於對已接種流行性感冒疫苗的動物投予。